DK152058B - Fremgangsmaade til fremstilling af et insulinsekretionsfremmende stof - Google Patents

Description

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et insulinsekretionsfremmende stof kaldet ø-aktiverende protein og med de egenskaber/ der er angivet i krav l's indledning. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anført i krav 2 og 3.

Opfindelsen er baseret på, at man i celler af mikroorganismer, der hører til Bordetella pertussis (fase I eller II), og i supernatanten i disses dyrkningsmedium har påvist et stof, der er i besiddelse af overraskende god virkning til at fremme insulinsekretionen og opretholde det normale blodsukkerniveau, hvilket stof derfor kan forventes at få stor medicinsk anvendelse ved behandlingen af forskellig slags diabetes og som forebyggende middel mod denne sygdom. Det er også lykkedes at isolere og kemisk identificere det hidtil ukendte proteinstof» som en aktiverende faktor ved insulinsekretionen. Det omhandlede proteinstof er blevet kaldt det ø-aktiverende protein (IAP), og det fremviser en bemærkelsesværdig aktivitet til fremme af insulinsekretionen ved ekstremt små doser (ca. 0,1 pg/kg legemsvægt), og det har vist sig anvendeligt til behandling og forebyggelse af forskellige slags diabetes.

Fra S.I. og J.H. Morse, J. Exp. Med., 1976, 143, side 1483-1502 (nedenfor betegnet Mor se-artiklen) er det kendt, at man ud fra kulturer opnået ved dyrkning af en stamme af Bordetella pertussis i et egnet dyrkningsmedium kan udvinde et proteinstof» der betegnes LPF, som er en forkortelse for "leukocytosis» and lympho-cytosis-promoting factor". LPF har ligesom det her omhandlede IAP virkning på blodsukkerniveauet. Som det vil fremgå af de nedenstående sammenlignende data med hensyn til sammensætning, iso-elektrisk punkt og hypoglycæmisk virkning og toksicitet er de to proteinstoffer væsentligt forskellige, og det ses, at IAP har en væsentlig større hypoglycæmisk virkning og en væsentlig lavere toksicitet end LPF.

(1) IAP er sammensat af fem underenheder (polypeptider). Molekylvægtene af polypeptiderne bestemtes til at være 28.0.00, 23.000, 22.000, 11.700 og 9.300.

LPF er sammensat af fire polypeptider. Molekylvægtene af polypeptiderne bestemtes til at være 23.500, 19,300, 17.400 og 13.400.

(2) Aminosyresammensætningen af proteinkomponenten er som følger? _IAP_LPF__

Aminosyre μΜ pr. 100 μΜ μΜ pr. 100 μΜ

Lysin 3,3 5,0

Histidin 1,5 1,3

Arginin 6,4 6,2

Asparaginsyre 7,5 8,1

Threonin 7,3 6,5

Serin 6,4 6,7

Glutaminsyre 10,0 9,5

Prolin 5,8 7,0

Glycin 8,8 10,4

Alanin 9,3 12,2 1/2 Cystin 2,5 0,8

Valin 6,5 4,6

Methionin 2,8 2,4

Isoleucin 4,0 3,2

Leucin 7,8 8,1

Tyrosin 6,5 4,5

Phenylalanin 3,7 3,5 (3) Det isoelektriske punkt er

pH 8,9 for IAP pH 9,4-9,6 for LPF

(4) Elementæranalyse viser:

IAP

C 46,6% H 6,7% N 14,4% S 1;7% O resten LPF

C 47,9% H 6,5% N 14,5%

Hypoglycæmisk virkning

Dosis Hypoglycæmisk virkning _^g/rotte)_(enhed)______ IAP opnået 0,125 83 ifølge opfindelsen 0,25 161 0,5 279 1,0 445

Dosig Hypoglycæmlgfc virkning _ (yg/rottal- _(enhed)_

LPF ifølge Morse-artikXen 0,125 3S

0,2S 68 0,5 120 '_1^0_202_ ’ Akut toksicitet LD50 (vg/kg) ____(intravenøs injektion)_ IAP opnået ifølge opfindelsen 232 LPF ifølge Morse-artiklen <40

Opfindelsen beskrives nærmere i detaljer i det følgende.

Den ved insulinsekretionen aktive faktor (i det følgende blot betegnet som "aktiv faktor") opnås som nævnt ved dyrkning af mikroorganismer, som hører til Bordetella pertussis (fase I eller II), hvilke bakterier er kendt som patogene, fortrinsvis Bc pertussis (fase I), i fast eller flydende substrat, samt isolering og rensning af stoffet fra de dyrkede bakterieceller og fra dyrkningsmediet.

Isolering og rensning af den aktive faktor fra kulturen kan ske gennem en af flere metoder, som er kendt inden for teknikken, f.eks. ved udfældningsmetode, chromatografisk metode, molekylsi-metode, elektroforetisk metode og biologisk metode, idet disse metoder anvendes for sig eller i passende kombinationer.

En søjlechromatografisk fremgangsmåde foreslås som et eksempel på en meget fordelagtig fremgangsmåde til isolering og rensning af den aktive faktor. Ved denne fremgangsmåde passerer dyrkningsmediets supernatant gennem en søjle med en fyldning af f.eks. hydro-xyapatit (Bio-chemical Industry Ltd.), carboxymethyl-agarosegel (f.eks. CM-Sepharose^ C1-6B fra Pharmacia Fine Chemicals) eller con-canavalin A-bundet agarosegel (f„eks. Con A-SepharoslP-4B fra Pharmacia Fine Chemicals).

Den aktive faktor adsorberes til disse søjler på en meget selektiv måde, hvorefter den elueres med et egnet udvalgt eluerings-middel som f.eks. 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,0) indeholdende 0,5 M NaCl. Herefter dialyseres det rensede produkt for at fjerne unødige salte, hvorved man opnår den rene aktive faktor. Den aktive faktor findes også i de dyrkede bakterieceller, således at, dersom det Ønskes, denne faktor kan frigives fra disse ved hjælp af f.eks. tilsætning af NaCl til cellesuspensionen for derved at få den aktive faktor til at sive ud i opløsningen.

Den såkaldte ammoniumsulfatudfældningsmetode som sædvanligvis anvendes indenfor denne teknik er også anvendelig til fremstilling af den aktive faktor. I dette tilfælde tilsættes fast (NH^JjSO^ til dyrkningssupernatanten ind til et punkt, hvor man næsten har mættet opløsning, hvorefter pH indstilles til 6 til 7 ved tilsætning af fortyndet ammoniakvand. Herefter vaskes bundfaldet med vand, og den aktive faktor ekstraheres med 0,1 M trisbuffer (pH 8) indeho.' dende 0,5 M NaCl.

En hvilken som helst passende metode kan anvendes til dyrkning ved den foreliggende fremgangsmåde, men flydende rystekulturer foretrækkes af hensyn til aktivitet og udbytte.

Med hensyn til mikrobielle egenskaber og dyrkningsbetingelser for de mikroorganismer, der hører til Bordetella, se Bergy's Manual of Determinative Baceriology, Vol. 8, 1974, Baltimore, The Williams & Wilkings C.; J. Exp. Med. 129, p. 523-550 (1969); og Mycological Training Handbook, 3. udgave, p. 6 ff., 1972, Maruzen & Co.

De kemiske og fysiske egenskaber ved den aktive faktor, der er betegnet som IAP, beskrives nedenfor.

Fysisk tilstand og opløsningsegenskaber:

Pulveret af aktiv faktor, der var opnået ved hjælp af frysetørring efter udsaltning, er ikke smeltende, hvidt eller lysebrunt, og det kan opløses i vand ved stuetemperatur i koncentrationer indtil ca. 3-5 mg/ml. Dersom det kommes i 6 N HC1, danner det et uopløseligt hvidt bundfald. Det er opløseligt i pyridin, dodecyl-natriumsulfat, 2-mercaptoethanol og cystinopløsning. Tilsætning af en opløsning af kulsyreis og acetone eller éthanol, trichloreddikesyre eller zinkchlorid eller en opløsning indeholdende flere andre typer metalioner til opløsningen af det rene aktive materiale under af* køling (4°C) giver en uklar udfældning. Dersom den tilsættes en blandet opløsning af vand og chloroform eller N-butanol,viser den aktive faktor sig at være uopløselig i denne opløsning og samle sig om grænsefladen mellem de to væsker.

Dersom en vandig opløsning af den aktive faktor opvarmes til 80°C eller derover, bliver den uklar hvid. Ligeledes bliver den aktive faktor temporært uklar, når den opløses i 0,1 M phosphatbuf-fer (pH 7,0) indeholdende 0,5 M NaCl efterfulgt af dialyse ved hjælp af. destilleret vand som ydre væske. Dersom dialysen imidlertid fortsættes opløses den aktive substans atter fuldstændig,og den hvide uklarhed forsvinder. Dersom en opløsning med høj koncentration udsættes for fuldstændig dialyse ved hjælp af en 0,01 M acetatbuffer (pH 4,5) kan den aktive faktor få en lys brun farvetone og opløses.

Molekylvægt;

Den aktive faktors molekylvægt bestemt ved hjælp af gelfiltrering gennem en søjle (2,8 x 80 cm) bestående af polyac rylamid (f.eks. "Biogel” P-100 fra BIO.RAD-Corp.) i ligevægt med 0,1 M phosphat-buffer indeholdende 0,5 M NaCl var 77000 - 6400.

Sammensætning;

Proteinindholdet bestemtes ved hjælp af Lowrys-metode til over 95 vægt%; carbonhydratindholdet målt ved hjælp af phenol-H^SO^— metoden var ca. 1 vægt%. Lipidkoncentrationen var under den lavest påviselige grænse.

Følgende litteraturhenvisninger anvendtes til måling af de forskellige komponenter;

Protein

Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr og R.J. Randall: J. Biol. Chem. 193; 265, 1951.

Carbonhydrat

Pheno1-H2S04-metoder, Dobois, Mc, K.A. Giles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers og F. Smiths Anal. Chem. 28_ 3 50, 1956.

Lipid

Totalindholdet af lipid og lipidkonjugat måltes ved hjælp af metoden ifølge Marsh og Weinstein (J.B. Marsh og D.B. Weinstein: J. Lipid Res., 7, p. 574, 1966) ved ekstraktion af materialet før og efter hydrolyse i chloroform, chloroform-methanol og heptan.

Aminosyresammensætningen af proteinkomponenten (gennemsnitlig sammensætningsforhoId uM/100uM, 16 eller 24 timers hydrolyse ved 110°C i 6 NHC1):

Asparaginsyre, 7,5; threonin, 7,3; ser in 6,4; glutaminsyre, 10,0; prolin, 5,8; glycin, 8,8; alanin, 9,3; cystin/2, 2,5; valin, 6,5; methionin, 2,8; isaleucin, 4,0; leucin, 7,8; tyrosin, 6,5; phenylalanin 3,7; lysin, 3,3; histidin, 1,5 og arginin, 6,4. Iso-eléktrisk punkt; 8,4 - 0,5.

Pladeelektroforetisk mønster:

Acrylamid (polyacrylaminkoncentration, 7,5%; 1 N KOH-iseddi-kebuffer (pH 4,3)) pladeelektroforese under betingelserne 30 g prøve, strømtilførsel på 4 mA, tid i timer/gel, farvning ved hjælp af amidsort 10B og affarvning ved hjælp af 7% eddikesyreopløsning giver et meget skarp enkelt bånd på afstanden 2,221 - 0,061 cm (med spacer-gelenden som referens).

Biologiske egenskaber;

Den aktive faktor har en stimulerende virkning på insulinsekretionen ligesom en glucosetoleranceøgende indvirkning hos pattedyr, og disse virkninger vedvarer i en periode på flere uger til flere måneder med enkelt dosis. Akuttoxicitet (LD^) er ca. 200 yg/kg legemsvægt hos dyr af ddy-stammen (intravenøs injektion).

Eksempel

Fremstilling af aktiv proteinforbindelse.

1. Frysetørret konserveret Bordetella pertussis (stamme Tohamé fase I) (opnået fra Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) dyrkedes på plader i Bordet-Gengoi substrat ved 37°C i 2 døgn, hvorefter en platinøsken af nævnte bakterie udsåedes i en 500 ml rysteflaske i hvilken var afmålt 200 ml modificeret Cohen-Wheeler-substrat (CW-substrat) under tilsætning af en ionbytterharpiks. Substratets sammensætning er vist i tabel 1 nedenfor, hvorefter inkuberingen fulgte ved 37°C under omrystning i 20-22 timer. Bakteriekoncentrationen i dyrkningsopløsningen måltes ved hjælp af et spektrofotometer (bølgelængde 650 nm), og denne opløsning sattes til en 2 liters rysteflaske ,i hvilken var afmålt 1 liter CW-substrat med ionbytterharpikstilsætning, således

Q

at slutbakteriekoncentrationen blev ca. 0,1 x 10 celler/ml, hvorefter man inkuberede under omrystning i 48 timer (rystefrekvens 97 gange/minut) ved 37°C.

De bakteriologiske egenskaber af den ovenfor anførte stamme stemte overens med de egenskaber, som er beskrevet i den ovenfor anførte litteratur for Bordtella pertussis fase I.

Tabel 1 Sæmmensætning af modificeret Cohen-Whe eler-substrat Casaminosyre 10 g Gærekstrakt 1 g

Kaliumhydrogenphosphat 0,5 g

Opløselig stivelse 2 g 0,5% kobbersulfatopløsning 1 ml 1% kalciumchloridopløsning 1 ml 4% magnesiumchloridopløsning 1 ml

Polypepton 5 g 1% cystinopløsning 2,5 ml 0,5% jernsulfatopløsning 1 ml

Natriumchlorid 2,5 g.

Når man anvender dette flydende substrat /tilsættes det destilleret vand, således at hele rumfanget er 1000 ml, og efter indstilling af pH til 7,2 med 20% NaOH-opløsning tilsættes substratopløsningen yderligere 3 g ionbytterharpiks (Diaion-SA-20 AP, Mitsubishi Kasei Co.), hvorefter man autoklaverede i 15 minutter ved 121°C.

Den således opnåede 48 timers rystekulturopløsning opvarmedes i 30 minutter til 56^C, hvorefter man centrifugerede (med 15000 omdrejninger/minut) ved 4°C for at adskille opløsningen i super-natant og bakterieceller. Den således opnåede supernatant af dyrkningsopløsningen anvendtes som udgangsmateriale til rensning og isolering af den omhandlede aktive faktor.

10 Liter af denne supernatant hældtes, efter at pH-værdien var indstilles på 6,0 med 1 N HCl,på en hydroxyapatitkolonne (2,5 x 4 cm) med en tilførselshastighed på 200 ml/time som første rensningstrin.

Størstedelen af proteinet passerede søjlen uden at adsorberes til denne, og den omhandlede insulinsekretionsaktivitet (se den nedenfor beskrevne aktivitetsmålemetode) påvises knapt. Proteinkoncentrationen måltes ved hjælp af Lowry et al's metode, således som angivet nedenfor i tabel 2.

For at bestemme de adsorberede forbindelser vaskedes søjlen først med 0,01 M phosphatbuffer (pH 6,0) og derefter efter øgning af phosphatbufferens molære koncentration til 0,1 og indstilling af dennes værdi til pH 7,0 elueredes de adsorberede proteiner efter hinanden. Imidlertid elueredes den omhandlede aktive faktor ikke under disse betingelser. Derfor udførtes en yderligere eluering med phos=-phatbuffer med samme sæmmensætning, men indeholdende 0,5 M NaCl. Under disse betingelser kunne den omhandlede faktor genvindes med højt udbytte med det eluerede protein (fig. 1).

Den således opnåede aktive faktor koncentreredes og dialyseredes efter at være placeret i en dialysemembran (Thomas Cat.

No. 3787-F25) med maksimal permeabel molekylvægt 8000 to gange (ialt 12 timer) med destilleret vand og to gange (ialt 12 timer) méd 0,01 M phosphatbuffer (pH 6,0). For yderligere at rense lod man opløsningen indeholdende den dialyserede aktive faktor passere

dP

gennem en søjle (1,5 x 10 cm) bestående af carboxymethyl Sepharose^ CL-6B i ligevægt med 0,01 molær phosphatbuffer (pH 6,0). Det materiale, der ikke adsorberede til denne søjle havde ingen aktivitet. Efter forøgelse af den molære koncentration og pH af phosphatbuff eren til 0,1 henholdsvis 7,0 udførte man derefter en lignende eluering ved tilsætning af 0,5 M saltvand, hvorved den omhandlede aktive faktor blev udvundet i overensstemmelse med det eluerede protein (fig. 2).

Da dette produkt stadig indeholder en ringe mængde forureninger set ud fra et pladeelektroforetisk synspunkt koncentreres den aktive faktor yderligere og dialyseres, efter at man har anbragt den i en dialysemembran (af samme standard som nævnt ovenfor) to gange (ialt 12 timer) med destilleret vand og to gange (ialt 12 timer) med 0,01 molær phosphatbuffer (pH 7,0). Herefter lod man den dialyserede prøve passere gennem en søjle (1,5 x 8 cm) beståend« (g af Con A-Sepharose 4B‘ i ligevægt med 0,01 molær phosphatbuffer (pH 7,0).

Fortsættelse med samme buffer eluerer en spormængde protein, men denne proteindel havde ingen aktivitet. Fortsat eluering med 0,1 molær phosphatbuffer (pH 7,0) indeholdende 0,5 M NaCl gav aktivitetsfaktor i overensstemmelse med det eluerede protein (fig. 3) .

Da denne del endnu indeholder en ringe mængde forureninger set ud fra et pladeelektroforetisk synspunkt, opsamler man denne proteindel og kondenserer og dialyserer med 0,01 molær phosphatbuffer (pH 7,0) indeholdende 0,5 molær NaCl. Den dialyserede prøve bliver derefter gelfiltreret gennem en søjle (2,8 x 60 cm) beståendi af"BiogelMP-100 (BIO.RAD Co.) i ligevægt med samme bufferopløsning. Dette resulterer i ren aktiv faktor i overensstemmelse med den proteindel, der udviser top ved molekylvægtsniveau på omkring 80000 (fig. 4).

Det således opnåede omhandlede protein benævnes ø-aktiverende protein (IAP), således som beskrevet ovenfor.

Aktivitetsudbytte,; rensning og andre data opnået i dette rensningstrin er vist i tabel 2. Karakteriseringen af denne forbindelse er således som beskrevet ovenfor.

Tabel 2

Reningstrin Opløsnings- Protein- Total Specifik Aktivi- Rensning mængde koncentra- mængde aktivitet tetsud- (ml) tion protein (enheder/μg) bytte (yg/ml) (mg) (%)

Supernatant fra dyrkningssubstratet 10000 2000 22000 0,318 100 1

Hydr oxylapat i t-søjlechromato- grafi 125 159 19,9 193,0 55 607 CM-Sepharose-sø jlechromato- graf i 45 251 11,3 321,0 52 1009

Con-A-Sepharose- søjlechromatografi 50 176 8,8 380,0 48 1195

Biogel P-100 søjlechromato- grafi 40 168 6,7 429,0 41 1349

Fodnote:

Proteinkoncentrationerne måltes ved metoderne beskrevet af Lowry et al (Lowry, O.H., N.J. Rosenbrough, A.L. Farr and R.J,

Randall: J. Biol.Chem. 193 265, 1951) og bovintserumalbumin anvendt som standard.

Renheden af den forbindelse som opnåedes ved ovennævnte slut-trin, kaldet ø-aktiverende protein (IAP), bestemtes ved hjælp af pladeelektroforese med polyacrylamidgel (polyacrylamidkoncentration, 7,5%, 1 N KOH-iseddikebuffer (pH 4,3)).

Fremgangsmåden ifølge J.V. Maizel, Jr. (Biochem.Biophys.Res. Comm., 1963, 13, p„ 483) anvendtestil den eksperimentelle fremgangsmåde .

Mængdeprøve pr. gel var 30 ug (som protein), og eksperimentet udførtes ved at anvende en strøm på 4 mA i 2 timer, farvning med amidsort 10B og affarvning med 7% eddikesyreopløsning. De opnåede resultater er anført i fig. 5 (afsætning af gelbetingelser og elektroforetisk mønster med et dencitometer). Det fandtes, at den prøve, der opnåedes i dette sluttrin, er en eneste forbindelse helt fri for forureninger, og at den insulinsekretions= fremmende aktivitet . er som angivet nedenfor.

For at bestemme substrukturen af IAP behandledes den ved følgende SDS (natriumdodecylsulfat) -polyacryl-amid-gelelektroforese med metoder ifølge Shapilo et al (A.L.

Shapilo et al: Biochem. Biophys.Res. Comm., 1967, 28, p. 815).

50 yg/rør (som protein) IAP-prøve sattes til en blanding af 1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol og 4M urinstof, og efter 2 timers inkubering ved 37°C sattes blandingen til 10% polyacrylamidgel indeholdende 1% SDS. Efter 4 timers strømgennemgang med 8 mA/gel farvedes med "Coomassie Blue" og affarvedes med 7,5% eddikesyre. Resultatet er angivet i fig. 6 (afsætning af gelbetingelser og et elektroforetisk mønster ved hjælp af et dencitometer).

Farmakologiske virkninger af den aktive proteinsubstans 1. Bestemmelse af den insulinsekretionsfremmende aktivitet.

Den insulinsekretionsfremmende aktivitet af IAP kan bestemmes ved måling af dyrereaktioner over for for skellige slags stimuleringsmidler for insulinsekretion, og sædvanligvis anvendes glucose som stimuleringsmiddel til dette formål.

Forsøgsdyr

Hanrotter (Wistar) (med legemsvægt 130-140 g).

Forsøgsmetode

De groft rensede eller rensede aktive forbindelser med forskellige styrker opløses i fysiologisk saltvandsopløsning, og 0,2 ml af hver af disse opløsninger injiceres intravenøst under ether-anestesi i forsøgsrotternes lårben, hvorefter hver substans insulinsekretionsfremmende virkning måles tre døgn senere. Rotterne fastes 18-20 timer før eksperimentet. Til måling af aktiviteten opsamles 0,1 ml blod fra halevenen på hver rotte, efterfulgt umiddelbart af intraperitoneal injektion af en 30%'s glucoseopløsning i en mængde på en ml pr. 100 g legemsvægt. Nøjagtigt 15 minutter senere opsamles atter 0,1 ml blod på samme måde. Den insulinsekretions fremmende virkning bestemtes ved forskellen i blodglucoseindhold og insulinkoncentration i blodet før og efter glucosetilførsien. Blod-glucoseindholdet måles ved hjælp af glucoseoxidalmetoden, og insulinkoncentrationen måltes ved hjælp af dobbel antistofmetoden.

Den parenterale opløsning til intravenøs injektion, som anvendtes i det følgende farmakologiske forsøg, er sammensat som nævnt ovenfor. Målemetoderne, som anvendes til bestemmelse af blodglueose og plasmainsulin, er i overensstemmelse med følgende litteraturhenvisninger og under anvendelse af følgende apparatur.

Blodglueoseniveau: Glucose-oxidase-metoden

Bergmeyer, H.-U., og Bernet,E. i "Methods of enzymatic analysis", Bergmeyer, H.-U.,New York Academic Press s.123 (1963)

Glucostat

Insulinkoncentration: Dobbel-antistof-metoden

Morgan,C.R., og Razarow,A.: Diabetes, 12, s. 115 (1963) Insulirr-immunoassay-udstyr fra Dainabot Radioisotope Laboratories:

Beregningsmetode for insulinsekretionsaktiviteten.

Til at begynde med fås ΔΙ/ AG-værdierne for den gruppe, som har fået indgivet aktiv substans,og kontrolgruppen ud fra ligning:

Plasmainsulinkoncentration - Plasmainsulinkoncentration efter glueoseindgift før glueoseindgift ΔΙ/AG (μϋ/mg) = (yU/ml)_ (μϋ/ml)_

Blodglucosekoncentration -Blodglucosekoncentration efter glueoseindgift før glueoseindgift (mg/ml) (mg/ml)

Anvendelse af blodglucoseniveauet til beregning af aktiviteten udføres på gpand af,at mængden af secerneret insulin i høj grad påvirkes af blodsukkerindholdet.

Enheden af hver aktiv forbindelse angives Ved følgende ligning:

Middelværdi for ΔΙ/AG for -Middelværdi for ΔΙ/AG for behandlet gruppe kontrolgruppe

Enhed = - - x 100

Middeltal hl/LG for kontrolgruppe

Specifik aktivitet af hver forbindelse fås, ved at dividere enheden med proteinmængden (metoden ifølge Lowry et al.).

Forhold mellem dosis og respons

Enheden og dosis (som protein) af IAP fås fra eksempel 1-1 således som afbildet i tabel 6.

Tabel 6

Dosis (ng/rotte) Enhed55 8 62 16 53 32 54 63 81 125 104 250 129 500 208 1000 445 2000 571 xMiddelværdi af 5 forsøgsdyr

Renset IAP-prøve udviste et S-formet dosis-responsforhold; imidlertid udvalgtes en del så lineært som muligt (250 ng - 1000 ng) til beregning af enhed og rensningstrin af både IAP og ækvivalente heraf.

2. Sammendrag af farmakologiske virkninger af den aktive proteinforbindelse

Denne forbindelse er særlig bemærkelsesværdig på grund af dens enestående insulinsekretionsfremmende virkning, men den har også andre farmakologiske værdifulde virkninger som f.eks. forbedring af glucosetolerancen, Øgning af insulinsekretionsrespons, forbedring af helbredelsen af streptozotocin-induceret diabetes og forbedring af glucosetolerancen ved arvelig diabetes. Yderligere forbliver aktiviteten i adskillige uger til flere måneder efter en enkelt administrering af denne forbindelse. Når man tager i betragtning, at fuldstændig samme fænomen observeres i de undersøgte dyr, herunder mus, rotter og hunde, må man antage, at de farmakologiske virkninger af denne forbindelse ikke varierer i nogen væsentlig grad med de for skellige dyrearter.

Man antager, at denne forbindelse bedst anvendes som lægende medicin for diabetes. For øjeblikket afhænger medikamenteringen af diabetes *.af insulininjektion eller oral administrering af antidiabetiske lægemidler, men disse er kun en symptomatisk behandling, og sådan som situationen er nu, må diabetes siges at være en uhelbredelig sygdom. Yderligere er det nødvendigt,at patienten drager til hospitalet hver dag for at få insulininjektion, og desuden indebærer administreringen af antidiabeteslægemidler fare ' for at forårsage en unormal nedgang af blodglucoseniveauet. Den særlige fordel ved den omhandlede substans er, at den ikke blot i sig selv er i besiddelse af en enestående insulinsekretionsfremmen-de virkning, men at den også kan indvirke, på at øge insulinkoncentrationen i blodet, når blodglucoseindholdet er forhøjet under forskellige betingelser (hyperglycemiske betingelser, især v.ed glu-cosebelastning f.eks. under nedbrydningen af føden) og hurtigt omstille det forhøjede blodglueoseindhold til normalt niveau. En anden fremtrædende fordel ved den omhandlede substans er, at dens aktivitet vedvarer i et tidsrum på flere uger indtil flere måneder ved en enkelt indgift. Derfor frembringer i de tilfælde, hvor insulinsekretionsreaktionen på blodglucoseindholdet er formindsket, indgift af den omhandlede substans en normal insulinsekretionsaktivitet. Takket være disse egenskaber finder den omhandlede substans et bredere anvendelsesområde, dvs. den er ikke kun anvendelig som lægemiddel for diabetes,ved . komplikationer af denne sygdom og ved geriatriske sygdomme, som hører under diabetes, men den viser sig også effektiv til anvendelse ved før-diabetestilstandssygdomme eller som forebyggende middel, medicin eller diagnostisk medicin af juvenildiabetes, for hvilken man endnu ikke er i besiddelse af effektive lægemidler.

3. Insulinsekretionsfremmende virkning

Denne virkning er en af de mest bemærkelsesværdige virkninger ved den omhandlede forbindelse, hvorfor man udførte eksperimenter på rotter (rotter af hankøn af Wister-stammen) og hunde (hunde af såvel han- som hunkøn af Beagle-stammen).

Rotter

De eksperimentelle betingelser var de samme,som anvendtes ved måling af aktiviteten,og som er beskrevet ovenfor, men i dette forsøg måltes reaktionen over for de forskellige insulinsekre-tionsfremmende midler det tredie døgn efter indgift af IAP til rotter og sammenlignedes med normale rotter (kontrol) (tabel 7).

Ved glucosetilførsel, der er den mest fysiologisk faktor, iagttages en markant forøgelse af insulinkoncentrationen i blodet i sammenligning med kontrolgruppen, uafhængigt af forskellen i glucosens indgiftsmåde. En betydelig forøgelse iagttoges også i reaktionen over for hormonstimulerende midler som f.eks. glucagon (1 mg/kg) og epinephrin (200 yg/kg). Man fandt også forøget insulinsekretionsvirkning af tolbutamid (200 mg/kg) og glibenclamid (2 mg/kg), der for øjeblikket anvendes klinisk som antidiabetisk lægemiddel. Det fremgik af disse resultater, at indgiften af den omhandlede aktive forbindelse i betydelig grad forhøjede organismens reaktion over for de insulinsekretionsfremmende midler.

Tabel 7

Forøgelse af reaktionen over for forskellige insulinstimulerende midler hos rotter, der først er. behandlet med IAP

Kontrolgruppe Behandlet gruppe Før ind- Efter Forøgelse Før ind- Efter Forøgelse gift indgift gift indgift x 1 (μυ/ml) (μϋ/ml) (μϋ) ___

Glukose oralt 0,5 g 1S ± 4 90 ±- 4 74 25 ± 5 227 ± 47 202 x 3 15

Intraperitonalt ?'3 9 26 ± 3 68 ±12 42 55 ± 5 401 ±114 346

Id

Intravenøst n ης U£: g 16 ± 1 27 ± 3 11 25 ± 5 56 ± 6 31

Glucagon intravenøst 0,1 ng 24 + 3 56 ± 5 32 28 ± 4 115 ± 3 87 5

Epinephrin

Subkutant yg 22 ± 5 29 ± 4 7 30 ± 3 102 ± 15 72

Glibenclamid oralt 0,2 mg 13 + 4 52 ±16 39 25 ± 3 82 ± 11 57

Tolubutamid

Intraperitonalt 20 mg 23 ± 6 46 ± 8 23 55 ± 4 247 ± 73 192 x 1) Insulinkoncentration i plasma x 2) Dosis/100 g legemsvægt x 3) Tid (min.) for blodprøve efter indgift 1 μg IAP injiceredes intravenøst 3 døgn før eksperimentet. Tabellen viser middelværdien og standardafvigelserne hos 5 dyr i hvert tilfælde.

IAP-prøver med forskellige enheder administreredes intravenøst på hunde, og 3 døgn senere udførtes stimulering ved hjælp af glucagon (25 μg/kg legemsvægt, intravenøs injektion) eller glucose (0,3 g/kg legemsvægt, intravenøs injektion) for at undersøge den insulinsekretions fremmende virkning. Forsøgsdyrene fastede 18 timer før eksperimentet.

De eksperimentelle resultater ved glucagonstimulering er vist i tabel 8. Forøgelse, om end ringe, af insulinsekretionen iagttoges ved kontrolprøven 5 minutter efter glucagonindgiften ved en dosis på 50 ng (som protein, det samme gælder i det følgende medmindre andet er angivet) pr. kg legemsvægt, og insulinsekretio-nen fremmedes i forhold til dosisøgningen, idet i det væsentlige den højeste reaktion opnåedes ved doser på 1 yg/kg. Lignende forøgelse af den insulinse.cernerende virkning iagttoges med glucose (oral og intravenøs indgift) og med epinephrinindgift (tabel 9). Disse resultater viser en mærkbar forøgelse af reaktionen over for insulinsekretionsfremmende midler selv hos hunde ved indgift af IAP.

Tabel 8

Forøgelse af insulinsekretion efter indgift af glucagon hos hunde, der er forbehandlet med IAP

Tid (min.) efter glucagonindgift 0 5 15 30 45 60

Dosis___

Fodnote

Kontrolgruppe 3 31 32 16 10 8 0,05 yg/kg 2 50 43 18 17 6 0,1 3 73 37 9 5 2 0,5 3 196 100 24 11 5 1.0 2 360 230 10 13 7 2.0 2 320 60 19 6 8

Fodnote: yU/ml middelværdi af 3 dyr i hvert tilfælde.

Tabel 9

Forøgelse af insulinsekretionen efter glucoseindgift og epinephrinindgifthos hunde, der er forbehandlet med IAP

Før indgift af Efter indgift af stimulerings- stimulerings- _middel_middel_

Kontrolgruppe 6 ± 1 20 ± 9

Glucose(5 min. efter intravenøs injektion)

Behandlet gruppe 7 ± 1 89 ± 36

Kontrolgruppe 8 ± 1 8 ± 1

Epinephrin (5 min. efter intravenøs injektion) 18 ± 6 225 ± 28

Behandlet gruppe

Fodnote: μϋ/ml middelværdi ± standardafvigelse fra 3 forsøgsdyr i hvert tilfælde.

4. Glucosetoleranceforøgende virkning

Glucose tilførtes oralt til rotter og hunde, og formindskelsen af blodglucoseindholdet og insulinkoncentrationen i blodet efter glucoseindgiften måltes for at bestemme glucosetolerancen. Glucosen blev givet til rotter i en dosis på 0,5 g/100 g legemsvægt (rotter) og til hunde i en dosis på 15 g/hund efter 18-20 timers faste.

I gruppen af IAP-behandlede rotter og hunde var forøgelsen af glucoseindholdet i blodet mærkbart reduceret, medens en tydelig forøgelse af insulinkoncentrationen i blodet fandt sted, men insulinkoncentrationen indstilledes igen hurtigt til niveauet før glucoseindgiften, hvilket svarede til normalisering af blodglucoseniveau-et, og man iagttog ingen formindskelse af blodglucoseniveauet på grund af ekstra sekretion af insulin (tabellerne 10 og 11). Disse resultater fastslår en markant forøgelse af glucosetolerancen hos forsøgsdyr, som behandledes med IAP.

Tabel 10

Forandringer i koncentrationerne af blodglucose og plasmainsulin hos hunde efter glucoseindgift

Tid efter glucoseindgift 0 15 30 60 90 120 180 (min.)

Blodglucose (mg/dl)

Kontrolgruppe 125±9 177±14 123±9 118±4 111±19 113+13 109±1

Behandlet gruppe 97+3 117+ 9 108+7 118±4 96± 6 88+ 8 97±3

Plasmainsulin (uU/ml)

Kontrolgruppe 3±2 17± 2 23±15 8±2 12± 2 8± 3 8±1

Behandlet gruppe 9±5 63±10 16± 6 20±2 12+4 9± 1 10±1

Den behandlede gruppe injiceredes intravenøst med 1 ug (protein) af lAP/kg 3 døgn før eksperimentet.

Middelværdi ± standardafvigelse af 4 forsøgsdyr i hvert tilfælde.

Tabel 11

Forandringer i koncentrationen af blodglucose og plasmainsulin hos rotter efter glucoseindgift

Tid .efter glucoseindgift 0 30 60 90 120 180 (min.)

Blodglucose (mg/dl)

Kontrolgruppe 68±1 102+9 98+3 104+4 114±4 120±4

Behandlet gruppe 51±1 72±6 54±2 48+5 62±6 69±7

Plasmainsulin (μϋ/ml)

Kontrolgruppe 19+2 47±6 38± 4 41±2 41±5 55± 5

Behandlet gruppe 25±4 126+9 79±10 61+6 69±7 104±18

Den behandlede gruppe injiceredes intravenøst med 0,5 ug IAP 3 døgn før dette eksperiment.

Middelværdi ± standardafvigelse af 5 forsøgsdyr i hvert tilfælde.

5. Helbredelse af streptozotocininduceret diabetes ved forbehandling med IAP

Det er velkendt, at tilførslen af streptozotocin (i det følgende benævnt STZ) inducerer diabetes hos forsøgsdyr ved i betydelig grad at ødelægge B-celler i de Langerhanske øer. Imidlertid viste det sig hos IAP-behandlede rotter, at STZ-induceret diabetes lægedes umiddelbart, og at blodglucoseindholdet og blodtolerancen i ikke-faste-tilstand normaliseredes.

Forsøget udførtes på en sådan måde, at rotterne først indtog 1 Vg IAP, og derefter indtog STZ (5 mg/100 g intravenøs injektion) 3-5 døgn senere. 24 timer efter STZ-indgiften observeredes hy-perglycæmi såvel hos kontrolgruppen som hos den behandlede gruppe, men hos den behandlede gruppe nåede blodglucosen normalt cmråde gradvist på femte-og syvende-dagen efter STZ-indgiften, og koncentrationen af plasmainsulin var også væsentlig højere end hos kontrolgruppen (tabel 12).

På den syvende dag efter STZ-indgiften udførtes yderligere glucoseindgiftforsøg, og glucosetolerancen undersøgtes lige ledes (tabel 13). Dersom disse rotter fastede, blev blodglucose-koncentrationen tilsyneladende den samme såvel i kontrolgruppen (med kun STZ-indgift) som i den IAP-behandlede gruppe, men nedgangen i glucosetolerancen observeredes tydeligt i kontrolgruppen i forhold til den normale gruppe.

På den anden side forøgedes glucosetolerancen hos den behandlede ' gruppe i en sådan udstrækning, at den var sammenlignelig med den normale gruppe, og plasmainsulinindholdet, som svar på glucoseindgiften, var højere end hos kontrolgruppen. Ud fra disse resultater kan det antages, at STZ-induceret diabetes læges hos de forsøgsdyr, som er forbehandlet med IAP.

Tabel 12

Helbredelse af streptozotocindiabetes forbehandlet med IAP

Antal døgn efter STZ-indgift 0 2 3 5 7

Kontrolgruppe

Blodglucose (mg/dl) 94+3 375±20 360 ±16 355±8 352±4

Plasmainsulin (μϋ/ml). 20±2 30± 3 · 26± 4 - 24±2

Behandlet gruppe

Blodglucose (mg/dl) 98±2 358+19 250±35 199±41 145±22

Plasmainsulin (μϋ/ml) 63+5 69± 5 54± 6 - 62± 4

Middelværdi ±standardafvigelse fra 5 forsøgsdyr i hvert tilfælde.

Tabel 13

Forbedring af glucosetolerancen ved streptozotocindiabetes ved forbehandling med IAP

Tid efter glucoseindgift (min.) 0 15 30 60 90

Kontrolgruppe 83+7X 214 ±18 291+27 327±23 264±32 (18±2^ (22 ± 5)

Kontrolgruppe 82±6 159 ±16 177±14 173±10 141±13 (24±2) (49 ± 2)

Normal gruppe 82±3 130 ±11 161± 5 155± 4 138± 7 (17±1) (43 ± 4) x Blodglucose (mg/dl) xx Plasmainsulin (μϋ/ml)

Middelværdi ± standardafvigelse fra 5 forsøgsdyr i hvert tilfælde 6. Forbedring af glucosetolerancen ved hjælp af IAP-indgift til mus med spontan diabetes (KK-mus), der ligner human diabetes KK-mus anses for at være modeldyr ved en sygdom som diabetes hos mennesker, da musen får spontan diabetes, når den bliver ældre med arvelige og miljømæssige faktorer som baggrund. Om den terapeutiske effekt af IAP er virkningsfuld eller ikke over for disse forsøgsdyr, vil være en god vejledning til analogislutning for mennesker, ud fra de resultater man opnår ved dyreforsøg. Man udførte derfor følgende forsøg. De mus, som anvendtes til forsøget, var KK-mus, der oprindelig var kommet fra Faculty of Agriculture, Nagoya University, på hvilke man havde foretaget indavl og opformering. Forsøget udførtes på følgende måde. Glucosen tilførtes ved oral administrering (0,15 g/20 g legemsvægt) til 20-25 uger gamle mus, hvorefter man udvalgte 5 forsøgsdyr, der udviste en klar forværring i glucosetolerancen i forhold til normalgruppen (ddy-stammen). Således som angivet i tabel 14 iagttoges ikke,at glucosen forsvandt efter glu-cosetilførsel hos disse mus, og man antog derfor,at disse mus var i en diabetestilstand. Til denne gruppe KK-mus tilførtes atter glu-cose på det tredie døgn efter injektionen af den omhandlede forbindelse i halevenen. Som resultat heraf forøgedes glucosetolerancen i høj grad i forhold til tilstanden før tilførslen af den omhandlede forbindelse. Yderligere forøgedes glucosetolerancen på en meget bedre måde end hos den normale gruppe.Det må derfor antages,at tilførslen af IAP resulterer i denne tilfredsstillende terapeutiske virkning på spontan diabetes.

Tabel 14

Forbedring af glucosetolerancen hos KK-mus ved IAP-behandling

Tid efter glucoseindgift (min.) 0 30 60 120 180

Gruppe

Normal gruppe 98±7* 214±16 339±13 192± 9 144±14 (ddy-starmnen)

Diabetisk gruppe (KK-staransn) Før behandling 117±6 300±33 308±21 326±40 310±39

Efter behandling 72±3 150±11 118± 9 90± 8 63±11

Middelværdi * standardafvigelse fra 5 forsøgsdyr i hvert tilfælde.

x Blodglucose (mg/dl) 7. Varighed af den farmakologiske virkning

De farmakologiske virkninger af T&P manifesterer sig flere timer efter administrering og opnår sine højeste niveauer i løbet af 3=7 døgn, hvorefter virkningen gradvis aftager. Nedenfor vises resul= tater fra et forsøg udført med aktiviteternes varighed hos rotter (0,5 yg) og hunde (1,0 yg/kg).

Hos hunde udførtes undersøgelserne af glucosetolerancen som svar på glucoseindgift ved intravenøs injektion på den 15de dag efter ΙΑΡ-indgift og også insulinsekretionsaktiviteten som svar på epinephrininindgift og glucagonindgift på henholdsvis 29nde og 42nde dag efter ΙΑΡ-indgift. Som resultat så man endnu tilfreds-stillende virkning på den 42nde dag (tabel 15). Hos rotter sås omtrent 50% af den maksimale aktivitet (3 døgn efter indgiften) på det 28nde dag efter indgift.

Ud fra disse resultater sås, at de farmakologiske aktiviteter af IAP bibeholdes flere uger til flere måneder selv om styrken af disse aktiviteter er .usikre på grund af dosering.

Tabel 15

Forøgelse .af insulinsekretionen hos hunde ved glucagon-tilførsel 42 dage efter IAP-indgift

Tid efter glucagon- tilførsel (min.) 05 15 30

Kontrolgruppe 6±lx 14±1 9±2 8±1

Behandlet gruppe 6±1 71±9 28±8 7±1

Intravenøs injektion med 25 yg/kg glucagon

Middelværdi ± standardafvigelse fra 5 forsøgsdyr i hvert tilfælde x yU/ml 8. Effektiv dosis og administreringsmåde

Den effektive dosis af IAP til human brug er 10 ng/kg (legemsvægt) - 1 yg/kg (legemsvægt), når det drejer sig om en renset prøve. Det er imidlertid også muligt at administrere så høje doser som 2 yg/kg (legemsvægt) og derover på én gang. Den mest effektive metode til administrering er intravenøs injektion, men man kan også anvende andre administreringsmåder.

9. Aktivitetens stabilitet

Termisk stabilitet

Eksperimentel metode:

En forsøgsopløsning (40 Ug protein/ml, pH 7,0) udsattes for forskellige temperaturer fra 37°C til 100°C i 15 minutter, og man undersøgte forandringerne i den insulinsekretionsfremmende virkning. Som kontrolprøve anvendtes en prøve, der holdtes ved 4°C, og angivelse af aktivitet angaves scm den relative aktivitet af 4°C-prøven lig med 100 (tabel 16).

Tabel 16

Temperatur (°C) Relativ aktivitet 4 100 37 100 56 113 60 76 70 53 80 18 100 13

Selv om området for termisk stabilitet af IAP er under 56°C, sås endnu aktivitet i den opløsning, som udsattes for 80°C.

pH-stabilitet

Opløsningen af 40 ug protein/ml tilsattes 3 N HC1 eller 3 N NaOH for at indstille pH, og man holdt opløsningen ved 4°C i 24 timer. Herefter administreredes den resulterende opløsning til forsøgsdyr, efter at pH-værdien var indstillet til nær neutralitet. Man undersøgte forandringer i den insulinsekretionsfremmende aktivitet. Resultatet angives som den relative aktivitet ved pH 7,0 lig 100, således som vist i tabel 17.

Tabel 17 pH Relativ aktivitet 1 16 2 27 3 43 4 112 7 100 9 120 10 89 11 23 12 0

Selv om det stabile område er fra pH 4 til 9, fandtes aktiviteter i opløsninger på pH lavere end 3 og endog i de med pH 10 og 11.

10. Akut toksicitet Følgende forsøg viser den akutte toksicitet LD50 (yg/kg legemsvægt) af renset IAP-prøve, idet man anvendte mus af ddy-stammen som forsøgsdyr.

ddy-mus S ~Ύ~

Subkutan injektion 540 580

Intravenøs injektion 222 155 11. Farmaceutiske tilberedninger Således som beskrevet i detaljer ovenfor er de omhandlede proteinsubstanser særdeles anvendelige som lægemidler og præventive præparater ved diabetes. Den effektive dosis ved human anvendelse varierer afhængigt af den specifikke aktivitet af de aktive forbin= delser. Sædvanligvis administreres def når de skal anvendes til at fremme den insulinsekretionsfremmende virkning, i en mængde på 10 ng/kg (legemsvægt) til adskillige tifold yg/kg (legemsvægt).

Den mest effektive metode til administrering til patienter er intravenøs injektion, men der kan anvendes andre administreringsmåder som f.eks. interperitoneal, intramuskulær eller subkutan injektion, direkte administrering i fordøjelsesorganerne, peroral, intrarektal, sublingual, og nasal mucosal, intraarteriel, intra-lymfagiel eller intratracheal administrering.

Med hensyn til administreringsformer kan nævnes injektioner, suppositorier, enteriske eller gastriske overtrækslag, sublinguale tabletter og inhaleringsmidler. Et simpelt eksempel på en injektionskomposition er en 1-ml blanding af 10.000 enheder af insulinsekretionsaktiv forbindelse, 9 mg NaCl og sterilt destilleret vand.

Det vil være klart for fagmanden, at andre tilsætningsstoffer, der ikke har mulighed for at påvirke aktiviteten af den aktive forbindelse, kan iblandes ved fremstillingen af lægemidlerne.

c

Claims (1)

1. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den chromatografiske metode er en søjlechromatografisk fremgangsmåde, ved hvilken der anvendes mindst én søjle valgt blandt en hy-droxyapatit-søjle, en carboxymethyl-agarosegel-søjle og en concana-valin A-bundet agarosegel-søjle.