DK154321B - Tilsaetningsmiddel til levnedsmidler og drikkevarer til tilvejebringelse af levedygtige bifido-bakterier heri og fremgangsmaade til fremstilling af samme samt bifigo-bakterier til udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 154321B

i

Opfindelsen angår et tilsætningsmiddel til levnedsmidler og drikkevarer til tilvejebringelse af levedygtige bifido-bakterier heri.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af 5 dette tilsætningsmiddel.

Bifido-bakterier er kendt som de dominerende bakterier i et brysternæret barns tarmflora. Det er kendt om bifido-bakterier, at de har forskellige fysiologiske egenskaber, såsom evnen til at: 10 a) undertrykke forrådnelsesbakterier, b) inhibere dannelsen af toksiske aminer, c) fremme fordøjelsen af kvindemælk-kasein som følge af virkningen af phosphorproteinphosphatase, og 15 d) inhibere væksten af patogene bakterier i forbindelse med nedsættelse af pH-værdien i tarmene som følge af dannelse af mælkesyre, eddikesyre, myresyre, o.l.

Et spædbarn, som er kunstigt ernæret, har i tarmfloraen meget få 20 bifido-bakterier, hvilke, som tidligere nævnt, har forskellige virkninger med hensyn til at holde tarmene sunde. Dette anses for at være årsagen til, at et kunstigt ernæret spædbarn er mere modtageligt over for tarmlidelser end et brysternæret spædbarn. Med henblik på at bringe tarmfloraen hos et kunstigt ernæret spædbarn til at 25 svare til tarmfloraen hos et brysternæret spædbarn har man derfor forsøgsvis fremstillet modificeret mælkepulver til spædbørn indeholdende bifido-bakterier som erstatning for kvindemælk.

Imidlertid har der været knyttet en række vanskeligheder til den 30 sædvanlige fremgangsmåde til dyrkning af bifido-bakterier i et medium, såsom mælk, o.l., og denne fremgangsmåde er derfor ikke blevet bragt til udførelse i praksis i kommerciel målestok. Vanskelighederne (sammenlignet med fremgangsmåden for mælkesyrebakterier, som er almindeligt anvendt til forarbejdning af mælk) består i: 35 a) at betingelserne for dyrkning skal være strengt anaerobe, b) at næringskravene til dyrkningen er komplicerede og strenge, og bakterierne formerer sig derfor ikke i et

DK 154321 B

2 rent mælkemiljø, som ikke indeholder noget vækstfremmende stof, såsom gærekstrakt o.l., og c) at det er vanskeligt at holde bakterierne i live i lang tid ved en lav pH-værdi, såsom i et sædvanligt 5 fermenteret, mælkeprodukt som følge af, at bifido- bakteriernes syreresistens er lav.

Hvis der til et mælkemedium tilsættes et stof, som fremmer væksten af bifido-bakterier, kan bifido-bakterierne dyrkes under aerobe 10 forhold. Imidlertid har produktet fra en sådan dyrkning ofte forringet smag og aroma. Ud over denne ulempe er væsktfremmende stoffer sædvanligvis dyre og anvendes derfor ikke i praksis.

De ovennævnte ulemper gælder bl.a. for de fremgangsmåder til frem-15 stilling af surmælksprodukter og spædbarnsernæringsprodukter, som de kendes fra DE offentliggørelsesskrift nr. 1.952.361 og 6B patentskrift nr. 831.797 henholdsvis DE offentliggørelsesskrift nr. 2.057.906.

20 I forbindelse med studiet og dyrkningen af bifido-bakterier har opfinderne til nærværende opfindelse imidlertid opdaget nye stammer af bifido-bakterier med særlige egenskaber, hvilke bifido-bakterier kan opformeres aktivt under aerobe forhold i et rent mælkemedium, som ikke indeholder væsktfremmende stoffer eller reducerende midler.

25

Baseret på denne opdagelse tilvejebringes der derfor ved nærværende opfindelse et tilsætningsmiddel til levnedsmidler og drikkevarer til tilvejebringelse af levedygtige bifido-bakterier heri, hvilket tilsætningsmiddel er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ved 30 aerob propagering af en bakteriekultur af Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (dep.nr. FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (dep.nr. FERM-P 3371) i et rent mælkemedium.

En anden udførelsesform for tilsætningsmidlet ifølge opfindelsen er 35 ejendommelig ved, at tilsætningsmidlet foreligger i tør form.

Med opfindelsen tilvejebringes også en fremgangsmåde til fremstilling af tilsætningsmidlet ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en bakteriekultur af Bifidobacterium bifidum

DK 154321 B

3 YIT-4005 (dep.nr. FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (dep.nr. FERM-P 3371) propageres aerobt i et rent mælkemedium.

5 Endelig tilvejebringes der med opfindelsen hidtil ukendte Bifido-bakterier til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilke Bifido-bakterier er ejendommelige ved, at det er Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (deponeringsnummer FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifi dum YIT-4002 (deponeringsnummer FERM-P 3371).

10

Den foreliggende opfindelse vil blive forklaret nærmere i det følgende.

Først vil forskellige egenskaber af Bifidobacterium bifidum YIT-4002 15 og YIT-4005, som anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, blive beskrevet nedenfor.

Den nye stamme "Bifidobacterium bifidum YIT-4002" blev isoleret ved den successive overføringsdyrkning af bifidobakterier udtaget fra 20 fæces fra et sundt brysternæret spædbarn og har følgende egenskaber: (1) Væsentligste bakteriologiske egenskaber.

Denne stamme er en gram-positiv, ikke-sporedannende bacille (0,5 x 25 2-3 μ) og har granuler med affinitet til methylenblåt på cellens inderside. Ved mikroskopisk undersøgelse findes, at bakterien har forgrenede kanter med polymorf form, såsom Y-form, V-form eller bøjning. En koloni dannet ved dobbeltlagsplademetoden har en cylindrisk, konveks eller linseformet facon, og en koloni dannet ved 30 bunden af pladen har en variabel facon. Ved dyrkning i anaerobt VL-G væskemedium i 72 timer blev mol forhol det mellem dannet eddikesyre og mælkesyre 1,6 ± 0,5 (eddikesyre/mælkesyre). Den således dannede mælkesyre i førnævnte væskeformige medium undersøgtes med hensyn til optisk rotation, og resultaterne var som følger: 35

Specifik rotationsaktivitet: -0,038

Optisk aktivitet: L (+) 76% + DL 24%

Resultaterne af nedenstående prøver var følgende: Catalase (-),

DK 154321 B

4 carbondioxidgasdannelse (-), cysteinmælkekoaguleringsaktivitet (+), gelatinehydrolyse (-), nitratreducerende aktivitet (-), indoldannelse (-) og hydrogensulfiddannelse (-).

5 Ovenstående resultater opfylder definitionen af Bifidobacterium-slægten.

(2) Optimal propagennostemperatur oa pH.

10 Optimal propageringstemperatur: 36-38°C

Bakterierne formerer sig ikke ved en temperatur på under 25“C eller over 45eC.

15 Optimal propagerings-pH: 6-7

Bakterierne formerer sig ikke ved en pH-værdi under 5,0.

(3) Sukkerfermenteri na.

20

De bakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, har en positiv fermenteringsreaktion med hensyn til følgende sukkerarter: glucose, fructose, lactose og galactose.

25 Bakterierne har negativ fermenteringsreaktion med hensyn til følgende sukkerarter: arabinose, xylose, salicin, mannose, mannitol, melezitose, cellobiose, sorbitol, i nul i n, trehalose, rhamnose, maltose, ribose og sorbose.

30 Dette fermenteringsmønster svarer fuldstændigt til fermenteringsmønsteret for en bifidobakterie standardstamme (Bifidobacterium bifidum E 319).

(4) Oxvaenfølsomhed oo nærinaskrav.

35

De bakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, inkuberedes i et antal på 10 -10 /ml og dyrkedes aerobt ved 37°C i et reduceret skummetmælksmedium (mælketørstofindhold 12%, der ikke indeholdt noget vækstfremmende stof), men som var oxygenmættet (ca. 6,5 ppm).

DK 154321 B

5

Populationen nåede op på over 109/ml ved 24 timers inkubation.

Sædvanlige bi fidus-bakterier formerede sig næsten ikke under samme forhold som bekrevet ovenfor. Populationen var uændret eller 5 formindsket (se nedenstående eksempel 2).

Som ovenfor beskrevet svarer de bakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, fuldstændigt til Bifidobacterium bifidum med undtagelse af, at bakterierne ifølge opfindelsen formerer sig godt i et rent 10 mælkemedium under aerobe forhold, hvor sædvanlige bifidobakterier ikke kan formere sig. I lyset af disse egenskaber identificeredes bakteriestammen som en variant af Bifidobacterium bifidum og betegnedes "Bifidobacterium bifidum YIT-4002". Denne identifikation skete ifølge Bargey's Manual fra 1974). Den nye stamme deponeredes i 15 FERMENTATION RESEARCH INSTITUTE, Agency of Industrial Science & Technology, no. 8-1, Inage Higashi-5-chome, Chiba-shi, Chiba-ken,

Japan. Deponeringsnummeret er FERM-P nr. 3371.

Den nye stamme YIT-4005 i soleredes fra fæces af et sundt brysternæ-20 ret spædbarn ved adskillige ganges behandling i en pufferopløsning med lav pH-værdi.

(1) Taxonomiske egenskaber.

25 Denne stamme er en gram-positiv, ikke-sporedannende bacille og har intracellulære granuler med affinitet til methylenblåt. Mikroskopisk undersøgelse viste, at bakterierne er polymorfe med tofligede kanter med Y-form eller bøjning. En koloni dannet ved dobbeltlagsplademetoden er cylindrisk, konveks eller linseformet, og en koloni 30 dannet ved pladens bund har en variabel form. Ved dyrkning i et ikke-fedtholdigt mælkemedium (mælketørstofindhold 12%) i 72 timer bliver mol forholdet mellem dannet eddikesyre og mælkesyre 1,7 ± 0,5 (eddi kesyre/mælkesyre).

35 Resultaterne af nedenstående prøver var som følger: catalaseakti-vitet (-), mælkekoaguleringsaktivitet (+), gelatinehydrolyse (-), nitratreducerende aktivitet (-), indo!produktion (-) og hydrogensul f iddannelse (-).

DK 154321 B ; 6

De bakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, har en positiv fermenteringsreaktion over for følgende sukkerarter: glucose, fructose, lactose og galactose.

5 Bakterierne har en negativ fermenteringsreaktion over for følgende sukkerarter: arabinose, xylose, salicin, mannose, mannitol, melezi-tose, cellobiose, sorbitol, inulin, trehalose, rhamnose, maltose, ribose og sorbose.

10 Ud fra ovenstående egenskaber svarer den bakteriestamme, der anvendes ifølge opfindelsen, til Bifidobacterium bifidum ifølge Bargey's Manual fra 1974 men klassificeres som en variant af Bifidobacterium bi f i dum, som følge af, at den har nye egenskaber, som de kendte bifidobakterier ikke besidder, og denne variant betegnedes "Bifido-15 bacterium bifidum YIT-4005".

(2) Vækstbetingelser.

Temperatur: 25-45°C (Optimum 36-38°C) 20 pH: 5-7 (optimum pH 6-7) (3) Syreresi stens.

Stammen, der anvendes ifølge opfindelsen, og en standardstamme 25 (Bifidobacterium bifidum E 319, som i det følgende er betegnet "standardstamme") dyrkedes respektivt i et anaerobt VL-G væskemedium i 48 timer, og de dyrkede bakterier opsamledes aseptisk ved centrifugering. Vaskede cellesuspensioner (OD 660 m/i = 1,5) sattes til pufferopløsninger (pH 6,0: 1/100 M phosphorsyre, pH 5,0-4,0: 30 1/100 M eddikesyre) med forskellige pH-værdier som vist i tabel 1.

De fremkomne opløsninger blev holdt ved 5°C til bestemmelse af bifidobakteriernes levedygtighed med tiden.

Som vist i tabel 1 faldt optællingerne af levende bifidobakterier 35 hurtigt med faldende pH-værdi (specielt under 4,6). På den anden side var optællingerne af levende bifidobakterier fra stammen YIT-4005 meget stabile, selv ved lave pH-værdier nær 4,0, og bakterierne ifølge opfindelsen viste sig derved at have høj syreresistens (tallene i tabel 1 angiver optællinger af levende bakterier pr. ml).

DK 154321 B

7

Tabel 1

O

Stamme Dage 5 fiiL (*) 0_ 3_ 5_ 7_ 10_ 6.0 V 4,7xl08 3,8xl08 3,7xl08 4,0xl08 3,0xl08 S 4,5xl08 3,lxl08 6,8xl07 4,2xl07 2,lxl07 5.0 V 5,0xl08 3,8xl08 2,4xl08 3,0xl08 3,3xl08 10 S 4,9xl08 3,lxl08 5,5xl07 l,9xl07 2,lxl06 4,6 V 4,2xl08 5,lxl08 4,2xl08 2,0xl08 9,3xl07 S 4,5xl08 Ι,ΟχΙΟ7 3,6xl05 4,0xl03 <102 15 4,3 V 4,6xl08 4,0xl08 2,lxl08 6,9xl07 3,0xl07 S 4,2xl08 3,9xl06 2,lxl04 <102 <102 4.1 V 4,7xl08 9,5xl07 3,4xl07 5,6xl06 4,3xl05 S 4,5xl08 4,lxlO4 Ι,ΟχΙΟ3 <102 <102 20 4,0 V 5,0xl08 7,0xl06 8,0xl05 2,8xl05 2,9xl04 S 4,9xl08 l,2xl03 <102 <102 <102 (*) V: Bifidobacterium bifidum YIT-4005 25 S: Bifidobacterium bifidum E 319.

Samme tendens sås i mælkekulturen. De forskellige stammer af bifidobacterium dyrkedes som angivet i tabel 2 i et ikke-fedtholdigt mælkemedium (mælketørstofindhold 10%) indeholdende 0,3% gærekstrakt, 30 indtil pH-værdien for kulturerne nåede de i tabellen angivne værdi er. Kulturerne afkøledes derefter hurtigt og blev holdt ved 5eC til bestemmelse af bifidobakteriernes levedygtighed med tiden.

Tabel 2 35

Dage

Stamme pH (*) 0_ 3_ 5_ 7_ 10_ 4,61 V 4,lxlO9 3,lxlO9 2,0xl09 7,6xl08 4,3xl08 DK 154321 B j 8 4.61 S 6,8xl08 2,0xl07 4,3xl06 5,3xl05 l,6xl04 A 3,3xl09 5,6xl08 l,5xl07 4,3xl06 2,lxl05 4.61 B l,5xl09 2,7xl08 5,3xl07 9,6xl06 7,7xl06 5 C 8,8xl08 6,2xl07 2,5xl06 5,lxl05 2,9xl04 j D 4,3xl09 7,lxl08 7,9xl07 6,3xl06 4,4xl05 4.21 V l,8xl09 7,6xl08 9,8xl08 7,0xl07 2,4xl06 S 2,5xl08 2,0xl06 4,5xl04 <102 <102 10 A 9,9xl08 7,5x1O6 8,2xl05 2,3xl03 <102 4.21 B 4,2xl09 2,5xl07 4,9xl05 2,4xl03 <102 C 2,lxl09 l,5xl07 8,7xl04 <102 <102 D 7,7xl08 2,lxl07 6,3xl05 l,5xl04 <102 15 (*) V: Bifidobacterium bifidum YIT-4005 S: Bifidobacterium bifidum E319 A: Bifidobacterium bifidum B: Bifidobacterium bifidum YIT-4002 20 C: Bifidobacterium lonaum standardstamme D: Bifidobacterium lonaum (4) Vækst under aerobe forhold.

25

Et ikke-fedtholdigt mælkemedium (mælketørstofindhold 12%) steriliseredes ved opvarmning og afkøledes derefter til 37°C under gennem-ledning af luft gennem mediet. Stammen YIT-4005, der anvendes ifølge opfindelsen, og nogle af de i Tabel 2 viste sammenligningsstammer 30 dyrkedes hver for sig i det ovenfor fremstillede medium ved 37eC.

Ændringen i optællingerne af levende bakterier og surheden af kulturen (antal ml 0,1N natriumhydroxid nødvendig til neutralisering af 10 ml af kulturen) under dyrkningen er vist i fig. 3. Betegnelserne i fig. 3 angiver det samme som i Tabel 2.

35

Som det ses af figuren, formerede bakterien YIT-4005, der anvendes g ifølge opfindelsen, sig og nåede op på 10 levende celler/ml eller

7 R

derover fra begyndelsespopulationen på 10-10 celler/ml i løbet af 24 timer, medens standardstammen ikke formerede sig under disse

DK 154321B

5 9 forhold.

Denne formenngstendens af bakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, var stort set den samme som under anaerobe forhold.

Den nye stamme ifølge opfindelsen, "Bifidobacterium bifidum YIT-4005" deponeredes i FERMENTATION RESEARCH INSTITUTE, Agency of Industrial Science & Technology, no. 8-1, Inage Higashi-5-chome, Chibashi, Chiba-ken, Japan. Deponeringsnummeret er FERM-P nr. 3372.

10

Bifidobacterium bifidum YIT-4002 har omtrent samme egenskaber som Bifidobacterium bifidum YIT-4005, undtagen hvad angår syreresistens.

Skønt syreresistens ikke altid er påkrævet, alt efter produkternes 15 brug, er det til mange formål ønskeligt at populationen af levende 4 bifidobakterier er mindst 10 /ml efter 7 dages opbevaring ved pH 4,0 under de betingelser, som er anvendt ved tilvejebringelsen af de i ovenstående Tabel 1 viste data. Stammen YIT-4005 opfylder denne betingelse.

20

Som tidligere nævnt er fordelene ved at anvende de nye bifidobak-teriestammer følgende: (a) de dyrkes let uden anvendelse af særlige dyrkningsbetingelser, 25 dvs. at de opformeres let under aerobe forhold uden tilsætning af vækstfremmende stoffer, (b) problemet med, at aromaen forringes af vækstfremmende tilsætningsstoffer løses, og modningen af det dyrkede produkt er enkel, 30 (c) som følge af, at det dyrkede produkt ifølge opfindelsen ikke indeholder tilsætningsstoffer, såsom vækstfremmende stoffer, er det ønskeligt som tilsætningsmiddel til spædbørnsmad, og 35 (d) de nye stammer er stort set oxygenresistente, og de næringskrav, der stilles til dyrkningen, er enkle.

Som følge heraf bevarer det dyrkede produkt (eller forarbejdede dyrkede produkt) den høje levedygtighed af bakterierne under opbe-

DK 154321 B

10 varing og kan tilsættes til levnedsmidler og drikkevarer uden væsentlig nedsættelse af bakteriernes levedygtighed.

Ved at anvende de nye bifidobakteriestammer YIT-4002 og 4005 er det 5 derfor blevet muligt at-gennemføre en effektiv dyrkning, som ikke kunne gennemføres ved anvendelse af de sædvanlige kendte bifido-bakterier og at fremstille levnedsmiddel- og drikkevaretilsætningsstoffer indeholdende levende bifidobakterier.

10 Ved dyrkningen af de bifidobakterier, der anvendes ifølge opfindelsen, er det muligt at anvende aerobe forhold, som anvendes ved dyrkningen af sædvanlige mælkesyrebakterier, og som følge heraf er det muligt at gennemføre en blandet dyrkning af bifidobakterierne sammen med mælkesyrebakterier. Reducerende midler og vækstfremmende 15 stoffer, som er absolut nødvendige ved dyrkningen af sædvanlige bifidobakterier, er ik^ nødvendige ved dyrkningen af de nye bifido-bakteriestammer. Et vækstfremmende middel kan imidlertid anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til vækststimulering i et sådant omfang, at brugen af det dyrkede produkt ikke hindres.

20

De mælkekulturmedier, som anvendes til udøvelse af opfindelsen, er et lactoseholdigt medium, såsom genfortyndet mælk, mælkevalle, helmælk, skummetmælk og lignende fremstillet ud fra disse bestanddele.

25

Under sædvanlige dyrkningsforhold når populationen af levende bifidobakterier et maksimum i løbet af 18-24 timer, og pH-værdien af kulturen falder som følge af syreproduktionen under dyrkningen.

30 Hvis dyrkningen fortsættes yderligere, begynder populationen af levende bifidobakterier at falde, men syreproduktionen fortsætter endnu et stykke tid, og syren bliver mættet. Følgelig bringes dyrkningen til ophør på et passende tidspunkt, der afhænger af brugen af det dyrkede produkt. For bakterier af stammen YIT-4005 35 begynder eddikesyreproduktionen i begyndelsesstadiet af dyrkningen.

Mol forholdet mellem eddikesyre og mælkesyre forbliver stort set konstant under dyrkningen og er 1,7 ± 0,5 (eddikesyre/mælkesyre). Så længe der anvendes levende bifidobakterier, må populationen af levende bifidobakterier være mindst /m\. Ved anvendelse af

DK 154321 B

11 dyrkningsmetoden ifølge opfindelsen opnås let en population af g levende biiffi dobakterier af stammen YIT-4005 på mindst 10 /ml.

Det dyrkede produkt ifølge opfindelsen kan anvendes som til sæt-5 ningsmiddell til levnedsmidler og drikkevarer. F.eks. kan det dyrkede produkt nffiølge opfindelsen blandes med sødestoffer, frugtsaft, aromastoffer, vand og lignende. Omhyggeligt frysetørret eller spraytørrett materiale af det dyrkede produkt ifølge opfindelsen g indeholder 10 eller derover levende bifidobakterier pr. gram 10 tørvægt. .Det således tørrede, pulveriserede materiale er let at behandle og kan derfor anvendes til andet end ovennævnte anvendelser. For stammen YIT-4005 indeholder det dyrkede produkt et stort antal levende bifidobakterier med en særdeles god overlevelsesevne samt disses mælkemetaboliter, navnlig en blanding af organiske 15 syrer, som overvejende består af eddikesyre og mælkesyre, og det dyrkede produkt og det tørrede materiale heraf kan anvendes i forbindelse med levnedsmidler og drikkevarer med en pH-værdi på 4-7, og som ikke opvarmes til bifidobakteriernes drabstemperatur, såsom mælk, kondenseret mælk, mælkepulver, råfløde, mælk fermenteret med 20 mælkesyrebakterier, iscreme, smør, ost, grøntsagssaft, frugtsaft, sojabønnemælk, fermenteret søjabønnemælk, mayonnaise, dressing, ketchup, dej, syltetøj, fiskemel og andre specialiteter, såsom babymad og diætmad. Produktet, der indeholder de levende bifido-bakterier, blandes med disse levnedsmidler og drikkevarer 12 timer 25 inden servering eller kan iblandes under fremstillingsprocessen for disse levnedsmidler og drikkevarer, hvorved der tilvejebringes levnedsmidler og drikkevarer indeholdende levende bifidobakterier og med en behagelig aroma. Det tørrede produkt kan blandes med gærpulver, Chlorellapul ver, sukker og lignende efter ønske, eller 30 blandingen kan bringes på tabletform. Det kan også blandes med medikamenter, såsom fordøjelsesfremmende midler.

Produktet ifølge opfindelsen anvendes som tilsætningsstof til levnedsmidler og drikkevarer og medikamenter i en sådan mængde, at 35 der opnås mindst 10^ levende bifidobakterier pr. gram (eller ml) slutprodukt, f.eks. 0,1-5% på tørvægtsbasis.

Opfindelsen vil blive belyst nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler og under henvisning til tegningen, hvor:

DK 154321 B

12 figur 1 viser forholdet mellem dyrkningstid og population af levende bifidobakterier, aciditet og pH ifølge eksempel 1, figur 2 viser forholdet mellem dyrkningstid og population af levende 5 bifidobakterier, aciditet og pH ifølge eksempel 2, og figur 3 viser forholdet mellem dyrkningstid, population af levende bifidobakterier og aciditet ved en anden aerob dyrkning som omtalt under punkt 4, side 8.

10 I eksemplerne måltes antallet af levende bakterier ifølge en éndimensional diffusionsmetode under anvendelse af et modificeret Rogosa-dyrkningsmedium, og "aciditeten" angiver den mængde 0,IN natriumhydroxid i ml, som er nødvendig til at neutralisere dyrk-15 ningsopløsningen. "Variant 1" og "Variant 2" i eksemplerne betegner de nye stammer ifølge opfindelsen, d.v.s. "Bifidobacterium bifidum YIT-4002" henholdsvis "Bifidobacterium bifidum YIT-4005".

Eksempel 1 20 "Variant 1" og tre standardstammer af typiske bi fidusbakterier (sammenligningseksempler) dyrkedes anaerobt.

Podekultur fremstilledes ved at dyrke de ønskede bakterier i et 25 modificeret Rogosa-medium (der tilsattes 1 ml pyrudruesyre og 0,2 g reduceret glutathion pr. 1 væskeformigt medium uden agar) og suspendere de opsamlede og under sterile forhold vaskede, dyrkede bakterier i en puffer-opløsning i form af 1/100 M phosphat (pH 6,8) til tilvejebringelse af en suspension (OD 660 nm = 1,5).

30

Det til hovedpropageringen anvendte medium var reduceret ikke-fedtholdigt mælk (mælketørstofindhold 12%). Mediet steriliseredes og anbragtes i en anaerob beholder, hvis atmosfære var erstattet af en blanding af 95% nitrogengas og 5% carbondioxidgas til frembringelse 35 af den anaerobe tilstand. Mængden af opløst oxygen i mediet var 0,1 ppm ved dyrkningens begyndelse.

Fig. 1 viser sammenhængen mellem dyrkningstiden og variationerne i population af levende bifidobakterier, surhed og pH. For "Variant 1"

DK 154321 B

13 g nåeds populationen af levende bifidobakteriiær 6,5 x 10 /ml 24 timer efter inokulering, og under forøgelse af populationen af levende bifidobakterier dannedes en betydelig mængde syre, hvorved mediets pH-værdi sænkedes. På den anden side kunne der kun spores en ringe 5 grad af formering af sammenligningsstammearne, og dette viser, at sammenligningsstammerne ikke formerer sig ii væsentlig grad i et rent ikke-fedtholdigt mælkemedium, selv under amaerobe forhold.

Eksempel 2 10

Aerob dyrkning gennemførtes under anvendelse af samme podekultur og -medium som i Eksempel 1. Efter sterilisation af mediet blev oxygengas ledt gennem mediet til mætning af dette med oxygen (opløst oxygenmængde =6,5 ppm).

15

Resultaterne af dyrkningen er vist på fig. £. "Variant l·' propagerer på samme måde som ved ovennævnte anaerobe (dyrkning, og populationen

Q

af levende bifidobakterier nåede 5,0 x 10 //ml 24 timer efter inokulering. På den anden side sporedes ingen 'Væsentlig propagering for 20 sammenligningsstammerne, men i visse tilfælde faldt populationen af levende bifidobakterier endog straks efter inokuleringen.

Eksempel 3 25 I dette eksempel studeredes forskellige betingelser for dyrkning af "Variant 1" ifølge opfindelsen.

(I) Forhold mellem mængden af igangsætter og propagering.

30 Igangsætter fremstilledes ved dyrkning i reduceret, ikke-fedtholdigt mælkemedium (mælketørstofindhold 8¾) i 20 timer og opbevaredes ved lav temperatur i tre dage. Den således fremstillede igangsætter tilsattes til reduceret, ikke-fedtholdig mælk i forskellige mængder mellem 1 og 10% og dyrkedes aerobt. Når igangsætteren var tilsat i 35 en mængde på op til 3%, forøgedes mængden af syredannelse i forhold til forøgelsen i den tilsatte igangsættermængde. Også når igangsætteren ti Isattes i en mængde på over 3%, var mængden af syredannelse imidlertid stort set den samme. Ved et pilot-forsøg vedrørende mængden af tilsat igangsætter viste det sig, at 1-2% igangsætter er 14

DK 154321 B

tilstrækkelig. Ifølge de sædvanlige beretninger er igangsætteren almindeligvis blevet anvendt i en mængde på 5-10%. For at fremstille en så stor mængde igangsætter er en igangsætter til fremstilling af "igangsætteren" nødvendig.

5 (II) Forhold mellem temperaturen og progageringen af kulturen.

Reduceret, ikke-fedtholdig mælk (mælketørstofindhold 16%) fremstilledes, og mediet steriliseredes derefter. Det steriliserede medium 10 afkøledes derefter til 37eC under passage gennem steriliseret luft.

2,0% af den ovenfor fremstillede igangsætter inokuleredes i mediet og dyrkedes ved henholdsvis 30eC, 34eC, 37®C, 40eC og 43°C. Propagering af kulturen ved 37®C var bedst, og i kulturen ved 34®C og 40®C var propageringen god, medens propageringerne i kulturerne ved 15 30®C og 43®C var begrænset betrageligt.

(III) Forhold mellem opretholdelse af populationen af levende bifidobakterier og pH.

20 "Variant 1" inokuleredes i ikke-fedtholdige mælkemedier (mælketørstof indhold 12%) og dyrkedes, indtil pH-værdien for medierne nåede henholdsvis 5,0, 4,6, 4,3 og 4,1. De fire medier afkøledes hurtigt til 5®C og blev holdt herpå ved bestemmelse af variationerne i populationen af levende bifidobakterier med tiden. Resultaterne er 25 angivet i nedenstående Tabel 3 (disse talværdier er populationen af levende bifidobakterier pr. ml dyrkningsmedium).

30 35

DK 154321 B

15

Tabel 3

Dage g pH Surihed 0 3 5 7 10 5.0 9„© 4,4xl09 3,2xl09 9,6xl08 4,2xl08 6,8xl07 4,6 9.,S 5,4xl09 7,2xl08 2,3xl08 8,0xl07 l,2xl07 4,3 11.,:5 3,0xl09 1,7χ107 5,7xl05 2,6xl03 Ι,δχΙΟ1 4.1 13,,4 6,0xl08 8,5xl05 4,7xl03 dO1 <10* 15 Faldet i populationen af levende bifidobakterier med tiden varierer med mediets pH-værdi. I tilfælde af, at mediet har en pH-værdi på 4,3 eller derunder, falder populationen af levende bifidobakterier hurtigt med tiden, medens populationen af levende bifidobakterier ikke formindskes så hurtigt i tilfælde af, at mediet har en pH-værdi 20 på 4,6 eller derover. Ovenstående prøve er blevet beskrevet i forbindelse med reduceret, ikke-fedtholdig mælk, men samme resultater som ovenfor opnåedes i forbindelse med helmælk, ikke-fedtholdig mælk og blandet mælk heraf.

2g Eksempel 4

Til fremstilling af et medium opløstes 100 g skummetmælkspulver i 900 ml vand. Efter sterilisation inokuleredes mediet med 2% af igangsætterkul turen af "Variant 2" og inokuleredes ved 37°C i 24 g 30 timer. Det således dyrkede medium havde 2,8 x 10 levende bifido-bakterier/ml, en surhed på 10,5 og et molforhold mellem eddikesyre og mælkesyre på 1,7.

Kulturen blev nedfrosset direkte og tørredes i ca. 7 timer under 3g reduceret tryk ved 2 mm Hg eller mindre. Derved fremkom 105 g tørret materiale indeholdende 5,5 x 109 levende bifidobakterier/g.

Eksempel 5 3% Af igangsætterkulturen af "Variant 2" inokuleredes i et medium 16

DK 154321 B

med en pH-værdi på 6,8 og indeholdende 3% gærekstraktpulver, 5% majsstøbevæske, 0,5% citronsyre, 0,5% ammoniumsulfat, 1% lactose og 0,03% cysteinhydrochlorid. Dyrkningen gennemførtes ved 37°C i 72 timer. Kulturen centrifugeredes, og de opsamlede bakterier suspen-5 deredes i vand indeholdende 5% skummetmælksproteasehydrolysater, 5% sukker og 1% C-vitamin. Suspensionen frysetørredes derefter, hvorved der fremkom et tørret bakteriepulver.

10 Eksempel 6

Til fremstilling af 150 liter udgangsmateriale til iscreme opløstes 7 kg råfløde (fedtindhold 40%), 20 kg sødet kondenseret helmælk, 64 1 mælk, 2 kg skummetmælkspulver, 6 kg sukker og 0,3 kg stabilisator 15 i vand. Blandingen varmesterili seredes derefter, homogeniseredes og afkøledes til en temperatur på 40°C eller derunder.

Det i ovenstående eksempel 5 fremstillede tørre bakteriepulver sattes til blandingen i en mængde på 1%. Blandingen hældtes i kopper 20 og bragtes til at størkne ved -20°C, hvorved der fremstilledes

O

iscreme indeholdende 3,0 x 10 levende bifidobakterier/ml. Optællingerne faldt til 2,2 x 10^/ml i løbet af 3. måneds opbevaring.

25 30 35

Claims (4)

1. Tilsætniingsmiddel til levnedsmidler og drikkevarer til tilvejebringelse af levedygtige bi fi do-bakterier heri, kendeteg-5 net ved, at tilsætningsmidlet er fremstillet ved aerob propagering af en bakteriekultur af Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (deponerings nr. FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (deponerings nr. FERM-P 3371) i et rent mælkemedium.

2. Tilsætniingsmiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tilsætningsimidlet foreligger i tør form.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af et tilsætningsmiddel til levnedsmidler og drikkevarer til tilvejebringelse af levedygtige 15 bi fi do-bakterier heri, kendetegnet ved, at en bakteriekultur af Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (deponerings nr. FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (deponerings nr. FERM-P 3371) ipropageres aerobt i et rent mælkemedium.

4. Bifido-bakterier til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er Bifidobacterium bi f i dum YIT-4005 (deponeringsnummer FERM-P 3372) og/eller Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (deponeringsnummer FERM-P 3371). 25 30 35