DK154768B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af estere af 9-hydroxyalkylhypoxanthiner eller farmaceutisk acceptable salte heraf - Google Patents

Description

i

DK 154768 B

Den foreliggende opfindelse angår en ana 1 og i fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte estere af 9-hydroxyalkylhypox-anthiner med formlen

OH

5 nAvn.

N

10 HC -CH-CH3 R1 OR2 eller et farmaceutisk acceptabelt salt heraf, hvori Ri er en 15 alkylgruppe med 1-8 carbonatomer, og R2 er estergruppen af en usubstitueret, alifatisk monocarboxylsyre med 1-18 carbonatomer, eller en usubstitueret dicarboxylsyre med 2-6 carbonatomer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne. Forbindelserne er immunomodulato-20 rer, har antiviral virkning og antitumorvirkning, specielt an-tileukæmisk virkning og er også enzyminhibitorer. Forbindelserne kan også anvendes til at indføre den tilsvarende alkohol i biologiske systemer, i nogle tilfælde med forøget styrke.

25 Den sure del af estergruppen R2 kan f.eks. være fra en usubstitueret alifatisk monocarboxylsyre, som har 1-18 carbonatomer, såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, smørsyre, valerianesyre, isovalerianesyre, capronsyre, caprylsyre, laurinsyre, palmi ti nsyre, stearinsyre, oliesyre, eller den sure del 30 af en usubstitueret alifatisk dicarboxylsyre, f.eks. malonsy-re, fumarsyre, maleinsyre, ravsyre, glutarsyre og endog car-bonsyre. Med dicarboxylsyrerne dannes der sædvanligvis halvestere, f.eks. hemimalonat, hemifumarat, hemimaleat og hemisuc-cinat såvel som methylcarbonatet og ethylcarbonatet.

35

DK 154768 B

2 5 Estrene af de organiske syrer kan fremstilles på sædvanlig måde, f.eks. ved at anvende syreanhydriderne eller acylhalo-geniderne, f.eks. acylchlorider, såsom acetylchlorid. Carbon-syreestrene kan fremstilles f.eks. af chlormyresyreestere, f.eks. ethylchlorformiat, methylchlorformiat eller af phos= 10 gen.

Det er en vigtig kendsgerning, at mange infektiøse midler, såsom vira (influenzavirus, HSV, Friend leukemia-virus), bakterier og svampe bevirker en immunundertrykt tilstand 15 i værten, idet de svækker dennes modstand mod infektion ved hjælp af infektiøse midler. De fleste andre antivirale anti-metabolitstoffer,ligesom AraC, forårsager undertrykkelse af værtsimmunforsvarsmekanismer og viser sig derved i stand til at svække legemets egne naturlige forsvarsmekanismer og 20 fremme sekundær infektion.

En immunopotentiator eller immunomodulator er ethvert middel, som enten gengiver undertrykt immunfunktion eller forstærker den normale immunfunktion eller begge dele. Immunfunktion de- 2 5 fineres som udviklingen og ekspressionen af humoral (antistofmedieret) immunitet, cellulær (thymocyt-medieret) immunitet eller makrophagog granulocyt-medieret modstandsdygtighed. Indbefattet er logisk midler, der virker direkte på cellerne, som er involveret i ekspressionen af immunreaktionen eller på 3 Π cellulær- eller molekylærmekanismer, som igen bevirker modifikation af funktionen af celler, som er involveret i immunreaktion. Forstærkning af immunfunktion kan blive resultatet af et middels modvirkning af undertrykkende mekanismer afledt af negativ tilbagekobling indvirkende endogent eller eksogent 3 S · på immunsystemet. Således har immunpotentiatorer diverse virkningsmekanismer. Til trods for mangfoldigheden af immunopoten-tiatorers cellevirkningssted og biokemisk virkningsmekanisme er deres applikationer i alt væsentlig den samme, dvs. at forøge værtsmodstandsdygtigheden.

3 DK 154768 B

Anvendelser af immunopotentiatorer 1) Den principielle beskyttende funktion af immunsystemet hører sammen med modstandsdygtighed overfor invasion af patogener inklusive vira, rickettsia, mycoplasma, bakterier, svampe 5 og parasiter af alle typer. Forbedring af immunreaktion,specielt når den undertrykkes, regner man således sædvanligvis med vil forbedre modstandsdygtigheden overfor infektioner eller skadedyrsangreb af enhver af de ovennævnte patogener.

En immunopotentiator alene eller i kombination med anti-infektionsterapi kan anvendes til alle infektiøse sygdomme.

2) En anden beskyttende funktion af immunsystemet antages at være modstandsdygtigheden overfor indpodning af fremmed væv enten naturligt som i foster-moder-sammenhængen eller unaturligt som foretaget af transplantationslæger. Immunopotentiatorer kan også anvendes til at lette udstødningen af foster- eller placontavæv eller til at modificere ellérr indføre tolerance overfor podninger.

20 3) En tredje beskyttende funktion af immunsystemet antages at være modstandsdygtigheden overfor udviklingen af ondartede celler som i cancer. Anvendelsen af immunopotentiatorer kan foregå ved cancerbehandling til at forøge tumorafvisning og til at hæmme nye tumoranfald efter andre tera- 25 piformer.

4) En fjerde beskyttende funktion omfatter evnen til at genkende fremmedhed og at opretholde ikke-reaktivitet overfor selvet ved positive undertrykkelsesmekanismer. I autoimmune 30 og beslægtede lidelser ses immunreaktivitet, som er rettet mod selv-antigener eller overdrevne forøgede reaktioner, som er selvdestruktive. Immunopotentiatorer kan anvendes til at genvinde normale undertrykkelsesmekanismer, fremkalde tolerance eller på anden måde fremme en normal immunreaktion.

35

Hver af immunsystemets beskyttende funktioner kan modificeres ved hjælp af ikke-specifik terapi med immunopotentiatorer alene eller i kombination med andre midler, som anvendes til

4 DK 154768 B

at forbedre modstandsdygtigheden overfor eller til at udrydde det fremtrængende patogen. Specifik modstandsdygtighed kan desuden forøges ved anvendelse af immunopotentiatorer i forbindelse med en antigenform som i en vaccine under anvendelig se af f.eks. virus, tumorceller, etc. Denne anvendelse kan ske for at fremkalde enten specifik immunitet eller tolerance. Sidstnævnte kan eksemplificeres ved anvendelse af antigen ved allergi- eller auto-immune sygdomme. Anvendelsen af immunopotentiatorer kan enten være terapeutisk eller profylaktisk.

10 Sidstnævnte specielt hos ældre, hvor infektion,auto-immunitet og cancer er mere hyppig. Den tidsmæssige afpasning af administration og veje varierer og kan være afgørende for, hvorvidt der opnås en positiv eller negativ reaktion. Ethvert middel, som er i stand til at forøge immunreaktioneny kan haamme den 15 afhængig af timing og dosis. Under bestemte omstændigheder- kan der således anvendes en immunopotentiator. som immuno-undertrykkende middel i forbindelse med allergi, auto-immunitet og transplantation.

20 Når R1 er hexyl,'er stamalkoholen erythro-9-(2-hydroxy-3- nonyl)-hypoxanthin, der er blevet afprøvet under identifikationsnummeret NPT 15392. Blandt ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (identificeret som NPT 15458, se eksempel 1), 25 erythro-9-(2-succinoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (identificeret ' som NPT 15457, se eksempel 2) og erythro-9-(2-phosphat-3-nonyl)-hypoxanthin.

Det er tidligere blevet påvist, at NPT 15392 har antiviral, 30 immunomodulerende og anti-tumorvirkning.

De heri anførte resultater godtgør, at der (1) kan fremstilles hidtil ukendte derivater af NPT 15392, (2) i biologiske systemer kan omdannes til det virksomme stof (NPT 15392), 35 (3) bevirkes højere blodkoncentrationer af de aktive stof fer (NPT 15392) og således forøget potens af NPT 15322.

DK 154768 B

5 I den efterfølgende tabel er sammenfattet de kemiske egenskaber for nogle af de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser .

5

Kemiske egenskaber for repræsentative eksempler på de ifølge kravene fremstillede forbindelser

Smp. Analyse 10 teoretisk fundet

Erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)- hypoxanthin (NPT 15458)* 150-151°C C 59,97 59,83 H 7,55 7,42 15 N 17,48 17,39

Erythro-9-(2-succinoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT-15457)** 20 K A νη·3. λ .

_max/ m x 10_ mm_ pH 1,0 pH 7 pH 9,5 pH 1 pH 7 250/9,7 249,5/10,1 254/10,06 220 222,5 25 250/- 249/- 254/- 222 223 * HPLC - Enkelt ultraviolet spids på en søjle af 5 μ sfærosorb ODS.

2,1 x 250 mm under anvendelse af et opløsningsmiddel af 65% methanol: 35% 0,05 M HoPO.

30

Enkelt ultraviolet spids på en søjle af 5 μ ultrasfære ODS

4,6 x 250 mm under anvendelse af et opløsningsmiddel af 65% methanol: 35% 0,05 M H^PO^.

De ifølge opfindelsen opnåede immunopotentiatorer kan f.eks.

3 5 anvendes til at give modstandsdygtighed over for; invation af de i tabel A anførte vira.

DK 154768 B

6

TABEL A

Virus Klasse Sygdom

Arenavirus RNA Bjergkløftsyge

Influenza RNA Influenza 5 Rhinovirus RNA Almindelig forkølelse

Polie RNA Polie Mæslinger RNA Røde hunde

Newcastle-sygdomvirus RNA Newcastle-sygdom

Rotavirus RNA Mavetarmkatar hos småbørn 10 Hepatitis type A RNA Infektiøs leverbetændelse

Rabies RNA Rabies

Arbovirus RNA Hjernebetændelse

Vaccinia DNA Kobber

Herpes Simplex DNA Forkølelsessår, hjerne- 15 betændelse, veneriske sygdomme

Herpes Zoster DNA Helvedesild

Varicella Zoster DNA Skoldkopper

Adenovirus DNA Åndedrætsbesvær 20 Hepatitis type B DNA Kronisk leverbetændelse, alvorlig leverbetændelse

Mund- og klovsyge DNA Mund- og klovsyge • Machupo DNA Blødningsfeber

Forbindelserne er særligt nyttige mod RNA-vira.

25 De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser og produkter er nyttige til behandlingen af pattedyr (og celler fra pattedyr) inklusive mennesker, svin, hunde, katte, kvæg, heste, får, geder, mus, kaniner, rotter, marsvin, hamstere, aber, etc.

30 Med mindre andet er anført er alle dele vægtdele og alle procenter vægtprocenter.

Produkterne kan omfatte, bestå i alt væsentligt af eller

DK 154768 B

7 bestå i alt væsentligt af eller bestå af de trin, som er an- '· givet for sådanne stoffer. Produkterne kan administreres til pattedyrene på sædvanlig måde, f.eks. oralt, nasalt, rektalt, vaginalt eller parenteralt. De kan anvendes som injicerbare 5 opløsninger, f.eks. i vand eller som tabletter, piller, kapsler, etc.

Beskrivelse af foretrukne udførelsesformer Eksempel 1

Syntese af erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15458) 10 ("Acetyl-nonylhypoxanthin")

OH

u6

^ N H

E-C --C _CH3 (CH9i, (5 -c-CH,

If o CH3

Erythro-9--(2^hydroxy-3-nonyllhypoxanthin, NPT 15392 (2,78 g, 10 mmol),hlev opløst i pyridin' (120 ml),og eddikesyreanhydrid (3 ml, 30 mmol) blev tilsat, Opløsningen blev holdt ved 25°C 15 i 24 timer. Ethanol (50· ml) blev tilsat, og opløsningen inddampet til tørhed i vakuum. Denne behandling blev gentaget fire gange for at fjerne pyridinet. Ether (150 ml) blev sat til resten, og det resulterende faste blev filtreret fra. Bundfaldet blev vasket med ether tre gange. Der blev opnået et 2° hvidt krystallinsk stof. (2,51 g, 80%) smp. 150-151°C.

DK 154768 B

8 UV ' (H?0)' PH 5'5) 249 nm· K 10,1 x 103, IR 1700 cuf1 llldX L· lu (c=0).

Analyse for cigH24N403· Beregnet: C, 59,97; H, 7,55; N, 17,48. Fundet: C, 59,83; H, 7,42; N, 17,39.

5 Opadgående kromatografi (Whatman-papir nr. 1) Rf.-værdier: n-butanol/H20/AcOH (2:1:1) = 0,92: ethanol/1 M ammoniumacetat (14:6) = 0,88; isopropanol/koncentreret ammoniak/H20 (7:2:4) = 0,90.

Eksempel 2 10 Syntese af erythro-9-(2-succinoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (succinylnonylhypoxanthin) (NPT 15457)

OH

i T !>

\/\ff H

HC-C.-CH3

(ΟΗ2) 5 O--c--CH_---CH«-C_OH

L, I i 600 mg erythro-9-(2-hydroxy^3-^nonyl) -hypoxanthin (NPT 15392) (2,2 mol) og 1 q ravsyreanhydrid (10 mmol) blev opløst i en 15 ringe mængde pyridin under omrøring. Opløsningen blev opvarmet forsigtigt (ca. 30°C) med vedvarende omrøring i 10 dage.

Pyridinet blev fjernet under anvendelse af et roterende fordampningsapparat, og resten blev ekstraheret i 200 ml absolut ethanol i 48 timer. Denne opløsning blev centrifugeret, og

DK 154768 B

9 den overliggende væske renset ved præparativ tyndtlagskroma-tografi (2 inm silicagel 60, N-butanol: 2N NH^OH 10:2 volumen/ volumen). Båndet ved Rf = 0,17 blev elueret i absolut ethanol. Produktets renhed blev bestemt ved hjælp af tyndtlagskroma-5 tografi og ultraviolet spektrofotometri.

Kemisk stabilitet

De i krav 3 anførte data viser klart, at estrene, NPT 15458 og NPT 15457,er stabile, når de inkuberes ved 37°C og har neutral pH-værdi (7,0, fysiologisk værdi). Den kendsgerning, at basisk 10 hydrolyse ved pH-værdi 9,5 kan omdanne både acetyl- (NPT 15458) og succinyl- (NPT 15457) estrene til NPT 15392, er yderligere bevis for deres struktur.

TABEL· 3

Varierende pH-værdis indvirkning på den kemiske stabi-15 litet af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458) og succin= oxynonylhypoxanthin (NPT 15457)

Forbindelse (koncentration % NPT 15392* NPT 15392 (0,36 ym/ml pH 1,0 100 (kontrol) 2o pH 7,0 100 pH 9,5 100 NPT 15457 (0,36 ym/ml) pH 1,0 2 pH 7,0 0 pH 9,5 8 25 NPT 15458 (0,36 ym/ml) ' pH 1,0 8 pH 7,0 0 pH 9,5 28 £ 3,5 timers inkubation ved 37°C, bestemt under anvendelse af HPLC.

30 Antivirale egenskaber NPT 154571 s ner NPT 1 5458*5? ovne til at inhibere influenza-

DK 154768 B

10 prøven. Som det fremgår af tabel 4, har NPT 15458 pro-læge= middel,som næsten fuldstændigt spaltes til NPT 15392 (aktivt lægemiddel^ en lignende evne til at inhibere virusvækst som det aktive lægemiddel (NPT 15392). I virkeligheden ser det 5 ud som om NPT 15458 kan være lidt mere effektivt måske på grund af en større absorption af NPT 15458 intracellulært. Succinylderivatet, der er negativt ladet ved pH-værdi 7,2, vil ikke forventes at gå ind i cellen så let og vil være mindre effektiv i denne metode.

10 TABEL 4

Sammenligning af succinoxynonylhypoxanthins (NPT 15457) og acetoxynonylhypoxanthins (NPT 15458) antivirale egenskaber med NPT 15392 Lægemiddel (g/ml % inhibering- af influenzavirusvækst_ 15 0 0,36a 3,6a 10,8a 36a NPT 15392 (kontrol) 0 20 30 42 73 NPT 15457 0 18 0 18 13 • NPT 15458 0 26 40 80 88 20 a koncentration i nmol/ml.

Immunomodulerende aktivitet

Evnen af acetoxy-(NPT 15458) og succinoxy- (NPT 15457) estrene af NPT 15392 til at modulere immunsystemet både in vitro og in vivo blev målt under anvendelse af følgende systemer: 25 i. Mitogeninduceret lymfocyt-proliferation under anvendelse af miltceller fra dyr af musefamilien (in vitro).

2 o Mitogeninduceret lymfocyt-proliferation under anvendelse

DK 154768 B

11 3. Forøgelse af aktiv rosettedannelse (in vitro).

4. Forøgelse af IgM-antistofdannelse i mus, der er immunicerede med røde blodceller fra får (SRBC) (in vivo).

1. De i tabel 5 anførte data viser klart NPT 15458's evne til 5 at forøge PHA-induceret lymfocyt-proliferation målt ved inkorporeringen af tritieret thymidin. Der blev konstateret en forøgelse på ca. 25% v.ed en koncentration på 50 yg/ml NPT 15458. Der blev konstateret lignende forøgelse med 10 yg/ml NPT 15392.

2. De i tabel 6 anførte data viser klart, at ækvimolære koncentrationer af NPT 15457 og NPT 15458 effektivt kan forøge PHA-induceret lymfocyt-proliferation under anvendelse af HPBL. Dette er interessant på baggrund af de i krav 9 anførte data, som viser, at HPBL vil spalte begge estere til NPT 15392.

15 NpT 15458, som spaltes i større omfang end NPT 15457 (se tabel 9), er en mere effektiv potentiator (tabel 6, 1,48 mod 1,28) af den PHA-inducerede transformation.

3. Som det fremgår af tabel 7 er både NPT 15457 og NPT 15458 effektive med hensyn til modulerende aktiv rosettedannelse 20 i HPBL. Det er interessant at konstatere, at i forsøg nr. 1, hvor de placebo-behandlede lymfocyter har en meget lav koncentration af aktive rosetter (immunodeficient), er NPT 15457 og NPT 15458 lige så aktive som NPT 15392 med hensyn til at genetablere den undertrykte immunitet til normale størrelser.

25 I forsøg nr. 2 har placebo-behandlede kontroller unormalt høje værdier for aktive rosetter. I dette tilfælde er NPT 15392 og NPT 15458 i stand til at sænke normalværdiernes høje størrelser. Således godtgøres disse lægemidlers sande immuno-modulerende egenskaber.

30 4. NPT 15457 og NPT 15458 og det "aktive" lægemiddel NPT 15392 blev givet til Balb/c mus, som var blevet immuniceret med røde blodceller fra får,SRBC. Antistofproduktion til SRBC blev

DK 154768 B

12 målt. Det er interessant at konstatere, at NPT 15458 og NPT 15392 var meget effektive med hensyn til at modulere produktionen af IgM-antistoffer. NPT 15392 danner ved de undersøgte niveauer en 46% forøgelse i IgM-produktionen. Højere doser 5 af NPT 15392 vil give en mindre forøgelse eller formindskelse i forhold til kontrolværdier. Det er interessant at konstatere, at NPT 15458, som omdannes til NPT 15392 og fører til i det mindste ti gange større blodværdier af NPT 15392 (tabel 10), giver en inhibering af IgM-dannelse (tabel 8).

Dette må forventes, da NPT 15458 giver meget høje koncentrationer af NPT 15392, som højst sandsynligt inhiberer IgM-dannelse. De i tabel 8 anførte data viser den immunomoduleren-de aktivitet af NPT 15457 og NPT 15458. Det skal bemærkes, at NPT 15457's virkning er mindre end virkningen af NPT 15458, 15 0g at mindre NPT 15457 omdannes til NPT 15392 end NPTC 15458 (tabel 10) .

TABEL 5

Immunomodulerende egenskaber af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458): Stimulering af in vivo nitrogen-induceret 20 lymfocyt-proliferation i musemiltceller.

Cpm inkorp.

Forbindelse (koncentration ng/ml) -PHA +PHA S.I. D/C

0 (C) 137 64,647 471 NPT 15392 10 ng/ml (D) 117 68,804 588 1,25 25 NPT 15458 10 ng/ml (D) 153 66,800 436 0,93 NPT 15458 50 ng/ml (D) 138 81,297 589 1,25 S.I. er lig med stimuleringsindeks.

TABEL 6 1 3

DK 1 5476 8 B

Immunomodulerende egenskaber af succinoxynonylhypoxanthin (NPT 15457) og acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458)j forøgelse af mitogen^induceret lymfocyt-proliferation i humane 5 perifere blodlymf.oc.yter

Koncentration Cpm inkorp.

Forbindelse n mol/ml -PHA +PHA S.I. D/C

NPT 15392* O (C) 379 59,404 156 0,036 (D) 297 59,167 199 1,27 10 0,36 (D) 577 69,057 120 0,76 3.6 (D) 381 67,328 176 1,128 NPT 15457 0 (C) 277 54,015 195 0,036 (D) 240 59,569 250 1,28 0,36 (D) 228 59,689 261 1,33 15 3,6 . (D) 2.32 52,149 224 1,14 NPT 15458 0 0,036 (C) 277 54,015 195 0,36 (D) 214 59,898 280a 1,43 3.6 (D) 238 69,055 290a 1,48 20 * værdierne er middelværdier af tre forsøg a p <. 0,05 TABEL 7 i 4

DK 154768 B

/

Immunomodulerende egenskaber af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458) og succinoxynonylhypoxanthin (NPT 15457): Forøgelse af aktiv E-rosettedannelse

C

Koncentration S Aktive

Forbindelse (n mol/ml) E-rosetter. (x ± S.E.)

Placebo (0) 9,23 ί 2,9 34,2 ί 6,6 (Kontrol) NPT 15392 (3,6) 16,2 ±1,0 - 10 (Kontrol) (0,36) - 15,4 - 2,9 NPT 15457 (3,6) 24,8 ± 6a (0,36) - 22,6 ί 2,4 NPT 15458 (3,6) 19,4 ± l,0a - (0,36) - 23,25 t 1,24 15 a p < 0,05 mod placebo-kontrol TABEL 8 15

DK 154768 B

Iramunomodulerende egenskaber af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458) og succinoxynonylhypoxanthin (NPT 15457): Inhibering af IgM^-antistofdannelse i SRBC-immuniceret 5 Balb/c mus

Nr. IgM plaque % af

Nummer Stof (Dosis i.p.) (x i S.E.) kontrol 1 NPT 15392 (1/80 n mol/kg x 4) 41 ί 4 146a 2 (0,18 n mol/kg x 4) 68 ί 2 147a 10 1 NPT 15457 (1,8 n mol/kg x 4) 19 ± 3 68a 2 (0,18 n mol/kg x 4) 47 ί 3 102 1 NPT 15458 (1,8 n mol/kg x 4) 8 ί 1 28,5a (0,18 n mol/g x 4) 11 ± 1 23,9a 1 KONTROL (placebo x 4) 28 ± 2 100 15 (placebo x 4) 46 ί 2 100 p< 0,01 sammenlignet med placebokontrol .16

DK 154768 B

Metabolisk omdannelse

Som det fremgår af tabel 9, fører inkubation af "pro-lægemidler-ne" NPT 15457 og NPT 15458 med Vero-celler (nyreceller fra afrikansk grøn abe), leverhomogenat og humane perifere blod-5 lymfocyter (HPBL) til dannelsen af det "aktive" lægemiddel NPT 15392. Omdannelsen af NPT 15458 til NPT 15392 viser sig at finde sted i et større omfang end dannelsen af NPT 15457 til NPT 15392.

De i tabel 10 anførte data viser, at både NPT 15457 og NPT 10 15458 kan absorberes i blodet efter den intraperitoneale administration, og at administrationen af NPT 15458 fører til næsten 12 gange højere koncentrationer af NPT 15392 end,hvis NPT 15392 indgives alene. Dette beviser helt klart den kendsgerning, at NPT 15458 og NPT 15457 kan danne NPT 15392 in vivo, 15 og yderligere at mindst ét af disse derivater giver langt højere blodkoncentrationer, som tillader større aktivitet.

TABEL 9

Dannelse af NPT 15392 af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458) og succinoxynonylhypoxanthin (NPT 15457) ad bio-20 logisk vej % NPT 15392a på tidspunkt (timer Forbindelse 0_0,5_24_ NPT 15392 Vero-celler 100 - 100

Leverhomogenat 100 100 25 HPBL 100 - 100 NPT 15457 Vero-celler 0-0

Leverhomogenat 0 14 HPBL 0 - 18,2 NPT 15458 Vero-celler 0 - 50 30 Leverhomogenat 0 70 HPBL 0 - 100 TABEL 10 17

DK 154768 B

Dannelse af NPT 15392 efter I.P. administration til mus af acetoxynonylhypoxanthin (NPT 15458) og succinoxynonyl= hypoxanthin (NPT 15457) 3 5 Forbindelse Blodkoncentration (μηι/ml x 10 )

Administrerer dyr nr. NPT 15392 NPT 15457 NPT 15458 NPT 15392 1 0,22 - . - 2 0,68 NPT 1 0,47 1,4 10 2 0,22 0,57 NPT 1 8,2 - 0 2 2,7 - 0 £ (260 ym/kg)

Virkningen af erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin 15 på væksten af tumor-(leukæmi) celler in vivo

Forbindelse (Koncentration) % inhibering af vækst L1210 (mus) 8068 (human) NPT 15458 (10 yg/ml) 40 32

DK 154768B

TABEL 11 18

Oversigt over biologiske egenskaber

Egenskab NPT 15457 NPT 15458 NPT 15392.

Konvertibel 5 til NPT 15392

Kemisk pH 9f5 Ja Ja Ikke anvendelig pH 7,0 Nej Nej Ikke anvendelig

Biologisk HPBL 18 100 Ikke anvendelig 10 Lever 14 70 Ikke anvendelig

Vero 0 50 Ikke anvendelig

Mus 25 100 Ikke anvendelig

Biologisk aktivitet 15 Antiviral (in vitro) Meget svag Ja (88%) Ja (73%)

Immunomodu-lerende (in vitro) 20 Lymf. prolif. Ja (+14-28%) Ja (+43-48% Ja (+12-27%)

Immunomodu-lerende (in vitro)

Rosette Ja (+166%) Ja (+11%) Ja (+78) 25 Immunomodu- lerende (in vivo) SRBC-IgM Moderat (0-60) Ja (-72%) Ja (+46%) DK 154768 8 19 ° Følgende fremgangsmåde blev anvendt til at foretage bestem melsen af egenskaberne, som er nævnt ovenfor.

A. Cellekulturmetoder A. Hela-eller vero-cellepropagering 2 5 1. Cellekulturer i 120 cm kolber subkultiveres i monolag på følgende måde: 2. Medierne hældes af, og monolaget vaskes to gange med ca. 50 ml calcium- og magnesiumfri phosphatpufret saltvand (PBS) pr. vask ved en pH-værdi på 7,2.

10 3. 1 ml trypsin-EDTA-opløsning indeholdende 0,5 g trypsin (1:250) og 2,0 g EDTA/liter Hanks saltopløsning i ligevægt (HBSS) uden Ca++ og Mg++ sættes ved 37°C til hver kolbe og dispergeres over monolaget med forsigtig omrystning.

4. Kolberne placeres så i en inkubator ved 37°C i ca. 3-5 min. 15 afhængig af den tid, som er nødvendig til at flytte cellerne.

Det er nødvendig at omryste med hånden.

5. 10 ml plantemedium sættes til hver kolbe, og cellerne diigper-geres.ved opsugning og ved uddrivning af suspensionen fra pipetten. Dette sker 10 gange.

20 6. Indholdet af en række kolber blev forenet og cellerne i suspensionen blev fortyndet med plantningsmedium til 7-8,5 4 x 10 celler/ml.

7. Plantningsmediet havde følgende sammensætning: Minimum Essential Medium Eagles (MEM) med Earle's salte og HEPES 25 puffer suppleret ved tilsætning af følgende stoffer, som er angivet i forhold til 100 ml MEM:

DK 154768 B

20 10 ml føtal kalveserum (slutkoncentration = 10% 1 ml 1-glutamin (200 molær) 1 ml 10.000 enheder penicillin, 10.000 yg streptomycin og 10.000 neomycinblanding.

5 8. Cellerne subkultiveres i Costar vævskulturbakker bestående af 24 fladbundede beholdere hver med en kapacitet på 3 ml pr. beholder. Cellekultursuspensionen (1 ml) sættes til hver beholder.

9. Monolagene anvendes til forsøg, når de når næsten sammenløbende vækst (ca. 1-2 dage).

10 10. Der anvendes særskilte kolber til at opretholde celle linierne. Vedligeholdelsesmedier består af MEM plus tilsætninger (se trin 7) med FSC reduceret til 5% slutkoncen-tration.

B. Røde blodceller 15 1. Fuldblod opnås ved kardialpunktur fra hanmarsvin af Hartly- stammen.

3 2. Ca. 10 cm fuldblod blandes med 25 ml Alserver's opløsning og kan lagres ved 4°C i indtil 1 uge.

3. Netop før brug vaskes RBC tre gange i phosphatpufret salt-20 vand (PBS), pH-værdi 7,2.

4. Hver vaskning gennemføres ved centrifugering af RBC-suspensionen i 10 min. ved 450 g ved stuetemperatur.

5. En 0,4% volumen/volumen RBC-suspension fremstilles med Hanks saltopløsning i ligevægt.

21

DK 154763B

C. Ægpropagering af vira A. Infektion 1. 9-10 dage gamle befragtede hønseæg gennemlyses til bestemmelse af levedygtighed,og luftsækkens placering afmærkes på 5 skallen med en blyant. Tvivlsomme æg (mangel på bevægelse eller misfarvning) kasseres.

2. Skaloverfladerne desinficeres med 70% ethanol og får lov til at tørre.

3. Der prikkes et lille hul i skallen med en steril ægprikker 10 ca. 60 mm indenfor blyantcirkel til afmærkning^af hvert ægs luftsæk.

2 3 4. 1/10 ml af varierende virussuspension, 10 -10 fEID50/ml indpodes gennem hullet med en 1 cm3 Turberculin-sprøjte ved en 45° vinkel ind i den allantoiske hulhed. Det påses, 15 at hverken embryo eller blommesækken beskadiges.

6. Der anvendes 2,5 cm plastklæbestrimmel til at Ilukke hullet, og hvert æg afmærkes med den relevante virus, antail af ægpassager og dato.

7. Æggene inkuberes ved 35-37°C i 2-5 dage,afhængig af hvor 20 hurtigt virusvæksten finder sted. Inkubationstid og temperatur optegnes sammen med andre relevante data for hver passage.

B. Udbytte af allantoiske væsker 1. Efter inkubationsperiodens afslutning afkøles æggene i 3-4 timer til 4°C for at formindske udløbning i den allan- 25 toiske hulhed under virusudvindingen.

2. Skaloverflader desinficeres igen med 70% ethanol og får lov til at tørre.

DK 154768 B

22 3. Sterile sakse anvendes til at afskære toppen af skallen langs den med blyant afmærkede linie,og membranerne afrives med sterile pincetter.

4. Pincetterne indføres forsigtigt mellem embryo og skal- • 5 membran,og embryo skubbes til den ene side, idet der dannes en "lomme" af allantoisk væske. Det må påses, at amnion ikke punkteres (bortset fra de tilfælde, hvor fostervandet også skal udvindes), og at placenta-arterierne påvirkes mindst muligt.

10 5. En steril 10 ml éngangs-pipette med mekaniseret vakuum koble anvendes til at opsamle den allantoiske væske og overføre den til et sterilt éngangs-centrifugerør. Fra hvert æg kan udvindes ca. 5-8 ml.

6. Det udvundne materiale centrifugeres ved 1200 g i 10 min.

15 ved 4°C. De overliggende væsker overføres til sterile rør.

7. Der optages prøver fra hver portion til titrering og sterilitetsundersøgelse^ Den resterende suspension over- 3 føres til sterile 2 cm serumrør og mærkes med stamme, passageantal og dato·.

20 8. Prøverne fryses straks i flydende hitrogen og lagres ved -70°C i en ultrafryser eller flydende ^-kryofryser.

D. Viruspropagering i vævskultur A. Infektion 1. 24-48 timer monolagskulturer af den passende celletype, 2 25 sædvanligvis i 250 cm vævskultur-indgangskolber, vælges til brug, når de kun lige flyder sammen.

2. Al infektion og udvinding gennemføres i et biologisk sikkerhedsskab,og der anvendes kun mekaniske pipetterings-anordninger. Der arbejdes sterilt.

DK 154768 B

23 3. 25 ml opretholdelsesmedium anvendes til at erstatte vækstmedium i kulturer, der skal inficeres. Kontrolkulturer får også 25 ml opretholdelsesmedium.

4. Den anvendte virus fortyndes med serumfri MEM ifølge leve-5 randørens informationer eller fra titrering fra foregående passager, og 0,5 ml sættes til hver kultur (bortset fra kontroller) .

5. Kulturer inkuberes ved 37°C i en fugtig atmosfære af 5% CC>2 og 95% luft i 48-72 timer med daglig observation af -ud- 10 viklingen af cytopatiske virkninger (CPE), der er karakteristisk for hver virus.

B. Udvinding 1. Kulturer fjernes til udvinding, når CPE når en værdi på 3-4+.

15 0 - Ingen tilsyneladende cytopatiske virkninger 1+ - 25% af cellerne; viser cytopatiske virkninger 2+ - 50% af cellerne viser cytopatiske virkninger 3+ - 75% af cellerne viser cytopatiske virkninger 4+ - 100% af cellerne viser cytopatiske virkninger.

20 2. Kulturer fryses og optøes tre gange for at lyse og flytte cellelaget. Efter optøning den tredje gang overføres kulturvæsken til et sterilt éngangs-centrifugerør og centrifugeres ved 300 g i 30 min. for at fjerne nedbrudt cellemateriale.

Denne virussuspension undersøges for bakterieforurening.

. 3 25 3. Der overliggende væsker opdeles (0,5-1 ml) i 2 cm sterile serumrør og fryses i flydende nitrogen.

4. Til titrering fremstilles der monolagkulturer i 24 fladbundede vævskulturplader og der inficeres på følgende mådes 24

DK 154768 B

α a) Der foretages ti-fold seriefortyndinger af virussen i kold, 5% fetal kalveserum (FCS) opretholdelsesmedium (10-1 - 10~1).

b) 1 ml af hver fortynding sættes til individuelle brønde 5 i triplikat.

c) Kontrolkulturer, der kun indeholder opretholdelsesmedium, medtages.

5. Kulturer inkuberes i 48 timer ved 37°C i fugtig 5% CC^/ 10 95% luft, og cellelagene mærkes som tidligere beskrevet.

TCIDj-g-titer beregnet i overensstemmelse med Reed og Munch's titreringsmetode.

E. Hæmadsorptionsprøve 1. Umiddelbart før gennemførelse af HAd-prøver dekanteres 15 medier fra cellekulturbakker.

2. 1 ml opretholdelsesmedium sættes til hver kulturbeholder.

3. To serier af kontrolkulturer får udelukkende opretholdel-sesmedium.

4. Testkulturer og en af kontrolserierne podes straks med 20 o,l ml fortyndet viruspræparat. (Tilførte titere angives som ved tidligere HAdFFU-prøver). HAdFFU er hæmadsorptions-fukusdannende enheder.

5. De andre kontrolserier holdes uinficerede, idet der udelukkende tilsættes MEM som en blind-podning.

25 6. Kulturer inkuberes ved 37°C i 16-18 timer med mindre andet er anført.

Efter podningsperioden dekanteres medierne fra, og cellerne

DK 154768 B

25 vaskes én gang med PBS ved pH-værdi 7,2.

8. 5/10 ml af RBC-suspensionen tilsættes pr. beholder, og kulturerne holdes i 30 min. ved stuetemperatur, 9. RBC-suspensionen dekanteres så, og kulturerne vaskes 2-3 5 gange med PBS til fjernelse af alle men specifik bundne RBC.

10. Endelig sættes 1,0 ml Hanks saltopløsning i ligevægt (HBSS) til hver beholder.

11. Optælling af fokus af hæmadsorberede RBC'er iibegyndelsen 10 gennemføres under anvendelse af et Nikon omvendt .fasekontrast- mikroskop med et 4X objektiv.

12. I alle tilfælde vælges der et minimum på 5 tiilfældige områder pr. beholder til optælling.

13. Optællingen af HAd-fokus gennemføres på et Bausch & Lomb 15 Omnicon Alpha Image analyseapparat.

14. Billedet af mikroskopområdet projiceres på en Vidicon-skanner. Det vises også på en televisionsskærm, således at operatøren kan påvise og tælle fejl på grund af debris. Fokus påvises ved hjælp af gråhedsniveauet og billedstørrelse.

20 15. For at eliminere optælling af resterende uadsorberede RBC'er programmeres et tællemodul i overstørrelse-for at afskærme individuelle RBC’er.

16. Den statiske analyse omfatter analysering af de opnåede data under anvendelse af en analyse af variance nested design 25 model. Variationsårsag kan være behandlinger, beholdere, der er nestede i behandlinger,og en eksperimentel fejl på grund af områder i beholderne. Middel-inficerede celler pr. område oa standardfeil af middelværdien vil blive bereanet for hver 26

DK 1.54768 B

O

beholder. Middelværdier og standardfejl vil også blive beregnet for hver behandling ved at forene beholderne, som behandles sammen, ved hver behandling. De middel-inficerede celler pr. område til hver behandling vil blive sammenlignet med kontrol 5 under anvendelse af Dunnets1 multiple sammenligningstest uafhængig af den totale F-test for behandling. (Se nedenfor),.

_Kontrol_ _Behandling 1_

Beholder 1 Beholder 2 Beholder 3 Beholder 1 Beholder 2 Beholder 3 F 11* F 12 F 13 F' 11 F' 12 F' 13 10 F 21 F 22 F 23 F' 21 F' 22 F' 23 F 31 F 32 F 33 F' 31 F' 32 F' 33 % “ SEi *2 “ SE2 x3 " SE3 X1 “ SE1 X2 " SE2 X3 “ ^3

Forenet x ΐ SE„ x t SEm

C C rp T

n = 9 n = 9 * Fil repræsenterer område # F. Fremstilling af humane perifere blodlymfocytter (HPBL) A. Fremstilling af Ficoll-Hypaqye separeringsmedium 1. 22,5 g Ficoll 400 (Pharmacia, molekylvægt O£400.000) opløses i 200 ml destilleret H20. Når størstedelen af materialet er 20 i opløsning, indstilles volumenet til 250 ml med destilleret h2o.

2. 34 g Hypaque (natriumdiatrizoat, Sterling Organics, molekylvægt O? 636) opløses i 100 ml destilleret vand.

3. Opløsningerne filtreres så sterilt gennem et 0,45 μ millipore 25 filter og lagres i sterile beholdere ved 4°C uden adgang af lys.

4. Arbejdsopløsninger fremstilles ved at blande 10 ml Hypaque-opløsning med 24 ml Ficoll-opløsning. Blandingen varmes til 25°C

DK 154768 B

27 med konstant omrøring.

B. Separering af PBL1er fra komplet blod 1. Prøver af menneskeblod opnås ved venepunktur i hepariniserede 20 ml vaeutainerrør. 15-20 ml af det ufortyndede blod fordeles 5 forsigtigt over en tilsvarende volumenmængde Ficoll-Hypaque-opløsning i sterile 50 ml polycarbonat-centrifugerør under anvendelse af aseptiske betingelser.

2. Fremstillede prøver centrifugeres ved 25°C, 40.0 x g i 30 min. Det uregelmæssige hvide bånd ved grænsefladen suges 10 aseptisk ind i et 50 ml sterilt centrifugerør med “10-20 ml RPMI-1640. Cellerne vaskes én gang ved 25°C. 400 x g i 10 min. ved 25°C.

3. Pelletterede PBL1er resuspenderes i 1 ml RPMI for hver 8 ml komplet blod,der oprindeligt blev anvendt og optælles 15 med et Coulter-tælleapparat. Koncentrationen indstilles med RPMI-1640 suppleret med glutamin og antibiotika, dellerne opbevares ved stuetemperatur,indtil de anvendes.

G. Stimulering af HPBL med PHA og LPS

1. 10-40 ml fuldblod tappes fra sunde frivillige:! hepariniserede rør.

20 2, Lymfocyter skilles fra det ovennævnte blod under anvendel se af Ficoll-Hypaque-separeringsmetoder.

3. Der fremstilles forskellige koncentrationer af testforbindelse i RPMI-1640.

6 i 4. Koncentrationen af lymfocyter indstilles på 2.x 10 /ml 25 af RPMI-1640. fy / / j i 5. Lymfocvter inkuberes med testforbindelse i 90 min. ved / / ; 28 \

DK 154768 B

6. Røde blodceller fra får (SRBC.s) (1-2 uger gamle) vaskes tre gange med PBS og fortyndes til en slutkoncentration på 0. 5. inj RPMI-1640.

7. Der opstilles reaktionsrør indeholdende følgende: 5 0,2 ml lymfocytter (2 x 10^) 0,2 ml 9% Ficoll i RPMI-1640 0,2 ml SRBC’er (0,5% i RPMI-1640).

8. De ovennævnte reaktanter centrifugeres ved 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur.

9. Bundfaldet resuspenderes så forsigtigt, og en prøve på 10 liter anbringes i et hæmocytometer.

10. Under anvendelse af et mikroskop optælles så antallet af rosetter, idet enhver lymfocyt, som har tre eller flere vedhæftede røde celler, tælles som en rosette.

15 H. E-rosettedannende celler A. Fremstilling af mitogener 1. Lipopolysaccharid B eller Phytohæmaglutin P pulver afvejes og opløses i RPMI-1640 ved en koncentration på 1000 yg/ml (1 mg/ml), og filter . sterilleres gennem et 0,45 y millipore-20 filter.

2. Opløsninger opdeles ( 1 ml/rør) aseptisk i afmærkede sterile kryorør og fryses. Prøverne fryses ikke igen efter partiel anvendelse, men kan lagres en dag eller to ved 4°C. Lyofiliseret pulver opbevares afkølet til 4°C.

B. Fremstilling af kulturer 1. PBL’er fremstilles som i SOP 1-004 i serumfri RPMI-1640 suppleret med glutamin og antibiotikum-antimykotikum-opløsning

DK 154768B

29 (HIBCO). En 1/10 ml pr. beholder sættes til hver beholder af 96-beholder-mikrotest-kulturplader (CoStar Plastics) med 8-kanalautomatiske mikropipettorer (Flow Labs.) forsynet med sterile mundstykker.

5 2. Mitogenopløsninger optøs hurtigt og fortyndes til fire gange den ønskede koncentration med RPMI-1640.

3. Der fremstilles testforbindelser til anvendelse som ifølge SOP # C-002 under anvendelse af RPMI-1640 som fortyndingsmiddel og fortyndes til fire gange den til slut ønskede kon-centration.

4. 50 μΐ af hver fortynding af mitogen og/eller testforbindelse sættes til 6 replikatkulturer. Almindelig RPMI-1640 anvendes i de samme mængder i kontrolkulturer til et samlet volumen på 0,2 ml/beholder.

15 5. Kulturer inkuberes ved 37°C i en fugtig 95% luft, 5% CC^- atmosfære (pH-værdi 6,0 - 7,0) i 48 timer. Cellerne mærkes 3 så med 0,5 μCi/beholder H-TdR (thymidin) i yderligere 18 timer. Cellerne udvindes ved hjælp af en multiple automatic sample harvester (M.A.S.H.) maskine. Ikke-vedhæftende celler udtrækkes 20 på glåsfiberfilterstrimler med 0,9% saltvandsopløsning (10 beholderudskylninger),og cellerne lyseres med destilleret vand (20 beholderudskylninger). Strimlerne lufttørres omhyggeligt, resterende celleaflejringer udskæres fra strimlerne, og hver prøve anbringes i små scintillations-hætteglas. .Scintillatio'ns-25 væskekoncentrat (Scintiprep 1, Fisher Chemicals) fortyndes 1:50 med toluen af scintillationskvalitet (Packard),og 1 ml sættes til hvert hætteglas. Prøverne undersøges-ved hjælp af væske-scintillations-spektroskopi, og dataene udtrykkes som gennemsnittallene pr. min. pr. testgruppe.

30

DK 154768 B

30 I. Immunoplaque-prøve A. Fremstilling af NPT 15392 1. Der fremstilles en opløsning af 500 ug/ml NPT 15392 ved at sætte en forud afvejet mængde af lægemiddelpulveret til 5 sterilt PBS og lydbehandle opløsningen i 30 min.

2. Bølgelængden af GCA/McPherson dobbeltbølgespektrofoto-meteret sættes til 250 nm.

3. NPT 15392 fortyndes 1:10 til 0,1 normal HC1.

4. 15 ml 0,1 normal HC1 hældes i et bægerglas. Denne opløsning 10 anvendes til at skylle kuvetter. Begge kuvetter fyldes med 0. 1.normal HC1 og bølgelængden aflæses. Ekstinktionen bør være indenfor 0,001-0,005 fra nul-værdien.

5. Prøvekuvetten tømmes, og den fortyndede lægemiddelopløsning tilsættes.

15 6. Ekstinktionen bestemmes, og koncentrationen beregnes som følger:

Formel: _.A (ekstinktion) χ fortyndingsfaktor x atomvægt (278) = g/ml B. Før dag 0 1. NPT 15392 lægemiddelopløsning fremstilles ved at opløse 20 500 g NPT 15392 pr. ml PBS.

2. Koncentrationen kontrolleres ifølge afsnit A af denne SOP.

3. Portionen opdeles i 1 ml prøver og lagres ved -20°C i flere måneder.

4. Opløsninger optøs og fortyndes til den ønskede koncentration.

DK 154768 8 31 C. Agaros e-baseplader fremstilles på følgende måder: 1. En 1,4% suspension af agarose i PBS (7 g i 500 ml) autoklaveres i 15 min.

2. Under anvendelse af Cornwell-sprøjter overføres 3 ml volume-^ ner af smeltet agarose aseptisk i Falcon # 1006 petri-skåle og skvulpes til dannelse af et ensartet lag.

3. Disse plader kan lagres i indtil 1 uge ved 4°C før brug. Pladerne lagres i omvendt stilling (agar ovenpå plade)..

D. Fremstilling af marsvineserum 1. 10 ml blod fjernes ved kardialpunktur fra 2-6rmarsvin og anbringes i et 50 ml Falcon # 2070 centrifugerør ulden anti-koaguleringsmidler.

2. Disse rør inkuberes i 45 min. ved 37°C til dannelse af et koagulum.

15 3. Rør fjernes så fra inkubatoren og lægges på is i 30 min.

for at tilbagekalde koagulet.

4. Serummet hældes aseptisk ud af hvert rør, forenes, opdeles i 1 ml prøver og lagres ved -70°C indtil brug heraf.

E. Immunicerihg, dag 0 20 1. Mus immuniceres på følgende måde: Fåreblod (får #23) modtages hver uge fra Hyland Labs. Det opsamles aseptisk i 2 volumener Aiserviers til 1 volumen blod.

2. 5/10 ml af fåreblodet i Alseviers vaskes tre gange i sterilt PBS i en IEC klinisk centrifuge, indstilling # 4 25 (2800 omdrejninger/min.) i 10 min. ved stuetemperatur.

DK 154768 B

32 3. Massen resuspenderes i 1:10 i sterilt PBS.

4. En model Z Coulter-'tæller indstilles ifølge*Coulter Instruction Manual.

5. Der skal anvendes en 1:10.000 fortynding til en Coulter-5 tæller-celle-tælling, og dette opnås ved først at fremstille en 1:100 fortynding i PBS og derpå fortynde denne opløsning 1:10 i isoton. Coulter-tællergrænsen indstilles på indstilling ff5.

6. Celletællingen bestemmes,og lageropløsningen fortyndes til 4 x 10 celler/ml. Denne slutsuspension anvendes til immuni-cering.

7. Hver mus immuniceres ved intravenøs injektion i den laterale halevene (opvarmet i 50°C vandbad til venøs dilation) med 0,1 g ml SRBC suspension. Slutkoncentrationen af SRBC'er er 4 x 10 15 AJ pr. mus.

F. Behandling 1. Mus behandles ved intraperitoneal injektion på dagene 3 0, 1, 2 og 3. En sprøjte (1 cm ) forsynes med en 0,5 inch 26 gauge-nål. Nålen indføres i en vinkel på 45° langs højre 20 side af linea alba. Der gives et volumen på 0,2 ml til både lægemiddel- og kontrolbehandlede grupper.

2. Lægemiddelgrupper gives 0,2 ml af en ønsket koncentration NPT 15392 opløsning, som for 20 g mus er 5 yg/ml.

G. Miltprseparation, dag 4 25 1. Milte udtages aseptisk og anbringes individuelt i Falcon ff 2025 vævskulturrør indeholdende 3 ml MEM. Disse rør lagres så på is.

33

DK 154763B

2. Milte homogeniseres i det samme rør med en teflon-støder forbundet til en G.K. Heller reversibel motor, hvis hastighed kan reguleres, og som er forbundet til en motorregulator indstillet på #6.

5 3. Homogeniseringstiden og indvirkningen bør være ensartet fra prøve til prøve.

4. Prøver filtreres så gennem en 100 mesh 400 mikron rustfri stålsigte ind i et standard-vævskulturrør. Sigten skylles med 3 ml MEM, og cellesuspensionen lagres på is.

5. Der foretages en 1:1000 fortynding til en Couiter-tæller celletælling, og dette opnås ved først at fremstilles en 1:100 fortynding i PBS efterfulgt af en 1:10 fortynding i isoton.

6. Celletællingen opnås, og lagersuspensionen fortyndes til 7 1 x 10 celler/ml. Coulter-tællergrænsen sættes ved 10. Røde 15 celler lyseres med tre dråber Zap-isoton.

H. Fremstilling af top-^agar (0,7%) 1. 35/100 g agarose og 0,53 g MEM-pulver anbringes i en Erlenmeyer-kolber. 50 ml destilleret ^0 tilsættes så til kolben.

2. Opløsningen autoklaveres i.15 min. ved 121,1°C og 15 psi.

Den anbringes i et 45°C vandbad i 5 min. pH-værd'ien indstilles til omkring 7,2 ved tilsætning af natriumbicarbonat (0,1 ml) Na2C03).

3. 1 ml prøver dispenseres i 5 ml vævskulturrør, .som forud 25 er anbragt i et vandbad. Der skal sørges for adskillige ekstra-rør til erstatning i tilfælde af belægningsfejl.

34 DK 15476C Θ I. Fremstilling af 10% SRBC-opløsning 1. 5 ml fåreblod (samme charge, som blev anvendt til immuni-cering) vaskes tre gange i PBS under anvendelse af IEC klinisk standard-centrifuge, hastighed # 4 (2800 omdrejninger/min.

5 i 10 min.

2. Efter den tredje vaskning resuspenderes cellerne i et PBS-volumen,som er ti gange volumenet af de pakkede celler, dvs.

0,5 ml pakkede SRBC’er, Q,S. til 5 ml med PBS.

J. Belægning 10 1. Agarplader fjernes fra køleskabet og får lov til at antage stuetemperatur. Der afmærkes tre til hver forsøgsgruppe.

2. Agarfyldte rør fjernes fra vandbaddet. 1/10 af de 10% SRBC'er og 0,1 ml miltcellesuspension sættes til hvert agarrør. Rørene omrøres på et Vortex-blandingsapparat.

15 3. Rørenes indhold hældes straks i agarplader og skvulpes rundt, indtil der er dannet et glat lag. Pladerne anbringes på en lige overflade, indtil agaren størkner.

4. Pladerne inkuberes ved 37°C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 95% luft i 90 min.

2Q 5. Marsvinekomplement (se fremstilling, afsnit D) fjernes fra fryseren, optøs ved stuetemperatur og fortyndes 1:10 i PBS.

6. Plader udtages fra inkubatoren, og 1 ml fortyndet komplement sættes til hver plade.

7. Plader inkuberes så i yderligere 30-45 min. ved 37°C. Pla-25 der udtages så fra inkubatoren, og der optælles under anvendelse af indirekte lys.

35

DK 154763 B

8. Plader kan lagres ved 4°C i omvendt stilling og tælles indtil 24 timer senere.

Oversigt over terapeutiske anvendelser i udførelseseksemplerne

De omhandlede forbindelser, der kan fremstilles ifølge opfin-5 delsen, har vist sig at inhibere replikationen af en repræsentativ prøve af RNA-vira under anvendelse af standard-vævs-kulturmetoder. I tilfældet af RNA-vira viste det .sig, at influenzavirus, der hører til A-undertypen, blev inhiberet under anvendelse af hæmadsorptionsteknikken. Adskillige medlemmer 10 af rækkerne NPT 15457 og NPT 15458 viste sig at inhibere replikationen af influenzavirus ved et koncentrationsinterval fra 3,6 til 360 n mol/ml.

Andre medlemmer af RNA-klassen af vira er vist i .tabel 6 og er ansvarlige for de anførte sygdomme. Af alle sygdomme i verden 15 ved man, at mindst 25% er forårsaget af vira. Desuden er det blevet isoleret en række vira, som det er påvist fremkalder tumorer. Virusbekæmpende midler kan således forventes selv at have nogle tumormodvirkende, f.eks. antileukæniiske egenskaber .

20 Virkningen af et af disse midler, NPT 15458, som 'inhibitorer for væksten af unormale lymfocytter er blevet bestemt. Det er bemærkelsesværdigt,at NPT 15458 er i stand til-at inhibere proliferation af museleukæmiske lymfocytter (en lH1210-celle-linie) i vævskultur. En 40% irihibering af L-1210 celler blev, 25 bevirket af NPT 15458 ved 10 yg/ml.

De i tabel 3 anførte data viser, at forbindelser har god stabilitet ved normale legems-pH-værdier (7,2) men spaltes til det "aktive" stof NPT 15392 ved alkalisk ρΗ-værdi» Som anført i tabel IX, spaltes estrene, specielt NPT 15458, ved 3Q inkubation med animalske væv til NPT 15392. Dette er sand synligvis grund til, at de omhandlede forbindelser, "pro-lægemidler" har den anførte biologiske virkning. Desuden 36

DK 15476?B

i det mindste tolv gange så høje blodkoncentrationer af NPT 15392, det biologisk "aktive" stof, når NPT 15458 injiceres intraperitonealt end,når NPT 15392 selv administreres til mus.

Som det fremgår af tabel 9 kan desuden vero-celler (nyre), 5 lever og HPBL alle spalte "pro-værten" til det biologisk aktive NPT 15392.

Den heri omhandlede klasse af stoffer inhiberer specielt replikationen af vira, modulerer (potentierer eller inhiberer) immunreaktionen og inhiberer væksten af leukæmiske 10 lymfocytter. Baseret på in vitro forsøg og de højere blodkoncentrationer, der opnås med disse forbindelse i sammenligning med NPT 15392, hvilket godtgør aktivitet og et koncentrationsinterval fra 0,01 til 100 yg/ml, er forventede dosisintervaller, der er effektive i pattedyr, fra 0,005 15 til 50 mg/kg.

Præparater

Forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan gives til et pattedyr i en dosis fra 1-1000 mg/kg legemsvægt og . kan forventes at være virksomt ved koncentrationer helt ned 20 på 0,0005 mg/kg.

De kan administreres i tablet- eller kapselform til mennesker og dyr, og hvor opløseligheden tillader i form vandig sirupper, eller somopløsninger i olie eller hvor de er uopløselige som en suspension. Typiske farmaceutiske præparater er beskrevet 25 nedenfor.

Kapsel: NPT 15458 0,1-500 mg

Avicel pH 101 til fremstilling af 800 mg (mikrokrystallinsk cellulose)

DK 154768 B

37

Suspension

Vandige suspensioner kan fremstilles, og en række suspensionsmidler inkorporeres med de aktive lægemiddelbestanddele. Som suspensionsmidler indgår sådanne stoffer som 5 natriumcarboxymethylcellulose, natriumalginat, traganth,

Avicel RC-591 (mikrokrystallinsk cellulose), methylcellu-lose, Veegum, xanthangummi. Foruden et suspensionsmiddel kan der tilsættes sådanne stoffer, som sødemidler, aromastoffer, farvestoffer, konserveringsmidler, beskyttende 10 kolloider og dispergeringsmidler.

Sirup-præparat NPT 15458 0,05-250 mg éXler ved en maksimum størrelse for opløselighed) 15 Majssukker 3,25 g

Destilleret vand 0,05 g FD og C Red 40 0,00175

Natriumsaccharin 0,00250

Alkohol U.S.P. 0,08 g 20 Methylparaben U.S.P. 0,005 g

Glycerol 0,001 g

Kirsebæraroma 0,31225 g

Frugtaroma 0,00825 g

Destilleret vand indtil 5 ml 25 Tablet-præparat NPT 15458 0,1-500 mg

Avicel pH 101 130 mg

Stivelse, modificeret 20 mg

Magnesiumstearat U.S.P. 5,5 mg 30 Polyvinylpyrrolidon 22 mg

Stearinsyre U.S.P. . 30 mg

Claims (1)

1. 20 OH Cx> HC - CH - CH, 25 i1 Ah 3 hvori R1 har den ovenfor definerede betydning, omsættes med anhydridet eller halogenidet af en usubstitueret carboxylsyre med 1-18 carbonatomer, eller en usubstitueret dicarboxylsyre 30 med 2 til 6 carbonatomer, hvorefter den resulterende forbindelse med formlen I om ønsket til fremstillingen af et farmaceutisk acceptabelt salt behandles med en tilsvarende base eller med et tilsvarende salt. 35