DK157120B - Fremgangsmaade til fremstilling af et farmaceutisk praeparat med antibakteriel virkning - Google Patents

Description

DK 157120 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangs-mâde til fremstilling af et farmaceutisk præparat med antibakteriel virkning og det er formâlet med opfindel-sen at tilvejebringe mulighed for at fremstille et sâ-5 dant præparat som udover sin antibakterielle virkning i mave-tarmkanalen.

Det er i forvejen kendt at husdyrbestande, navn-lig unge dyr, er udsat for alvorlige infektioner i for-do jelseskanalen, som hovedsagelig beror pâ infektioner 10 af Escherichia coli og forskellige Salmonella-arter. De hidtil kendte fremgangsmâder til eliminering af sâdanne infektioner er bl.a. indgift af en terapeutisk mængde antibiotika, hvilket er forbundet med en risiko for at der dannes antibiotikaresistente bakteriestammer; og vac-15 cination af husdyrbesætningen, hvilket forer til hoje omkostninger fordi vaccine og vaccinationer er kostbare.

Det har nu overraskende vist sig at være muligt at undgâ de nævnte ulemper og at modvirke og/eller eli-minere sâdanne bakterieinfektioner ved anvendelse af et 20 farmaceutisk præparat med en antibakteriel virkning, som ifolge opfindelsen er fremstillet ved at man til en i og for sig kendt farmaceutisk bærer sætter et antibakterielt System indeholdende laktoperoxydase i en mængde pâ mindst 1 mg/kg produkt, tiocyanat i en mængde pâ mindst 15 ppm 25 udtrykt som natriumtiocyanat og en fast, vandoploselig peroxyddonor i en mængde pâ mindst 21 ppm udtrykt som natriumperkarbonat og udvalgt blandt alkalimetalperkar-bonater, jordalkalimetalperoxyder og karbamidperoxyd.

Man bor tilsætte tiocyanat i en mængde der i for-30 dojelseskanalen giver en koncentration deraf pâ mindst 0,1 mM, fortrinsvis 0,2-0,4 mM og den mâ ikke overskride den toxiske koncentration (10 mM). Mængden af fast vandoploselig peroxyddonor vælges pâ en sâdan mâde at der i fordojelseskanalen opnâs en ækvimolær mængde dvs.

35 at koncentrationen af dannet bliver mindst 0,1 mM

og fortrinsvis 0,2-0,4 mM.

2

DK 157120 B

Mængden af laktoperoxydase afhænger af enzymets. aktivitet men baseret pâ den antagelse at 1 mg indehol-der 50 enheder (U) bor der være mindst 1 mg enzym til stede pr. liter fordojelsesvæske. En enhed laktoperoxy-5 dase er den mængde laktoperoxydase der danner 1 mg puro-gallin fra purogallol pâ 20 sek. ved pH 6,0 og 20°C.

I en oplosning er koncentrationen af tiocyanat sâledes mindst 0,1 mM, fortrinsvis 0,2-0,4 mM, koncentrationen af peroxyddonor er sâledes at koncentrationen af 10 H2°2 er mMf f^t^insvis 0,2-0,4 mM og koncentratio nen af laktoperoxydase bor være 1-2 mg/1 (50-100 U/l).

Mængden af laktoperoxydase i oksevalle (upasteu-riseret) eller i ultrafiltreret valle varierer natur-ligt. Komælk indeholder ifolge litteraturen laktoperoxy-15 dase i en mængde pâ ca. 30 mg/1.

Ved klinisk anvendelse indgives systemet sædvan-ligvis oralt eller rektalt i form af et i henhold til opfindelsen fremstillet farmaceutisk præparat som indeholder et antibakterielt System i kombination med et 20 farmaceutisk bærestof.

Nâr der i nærværende beskrivelse og i kravene om-tales det ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen fremstil-lede antibakterielle System, sigtes der til en hvilken som helst peroxyddonor og et hvilket som helst tiocya-25 nat hvad enten forbindelserne er generelt eller specifikt beskrevet; med mindre den sammenhæng hvori sâdanne udr tryk anvendes, fx i eksemplerne, ikke stemmer overens med den brede betydning. Bærestoffet kan været et fast, halvfast eller flydende fortyndingsmiddel eller en kap-30 sel. I de farmaceutiske præparater udgor de aktive be- standdele mellem 0,1 og 99 vægt% af præparatet, hensigts-mæssigt mellem 2 og 50 vægt% i præparater til oral ind-gift.

Ved fremstilling af farmaceutiske præparater der 35 indeholder et antibakterielt System i form af en dosis-enhed til oral indgift kan de udvalgte bestanddele blan-des med en fast, pulverformig bærer, fx med laktose, 3

DK 157120 B

sakkarose, sorbitol, mannitol, stivelse sâsom kartoffel-stivelse, majsstivelse eller amylopektin, cellulosederi-vater eller gélatine, samt med et smaremiddel sâsom magniumstearat, kalciumstearat eller polyætylenglykolvok-5 ser, hvorpâ blandingen presse til tabletter. Hvis der onskes coatede tabletter kan den pâ den ovenfor beskrevne mâde fremstillede kerne belaegges med en oplasning af en poly-mer som oplases eller er permeabel i tarmkanalen. Til denne belægning kan der sættes et farvestof for at gare 10 det lettere at skelne mellem tabletter med forskellige aktive bestanddele eller med forskellige mængder af de tilstedeværende aktive bestanddele.

Til fremstilling af blade gelatinekapsler (perle-formede lukkede kapsler) som bestâr af gélatine og fx 15 glycerol, eller ved fremstilling af tilsvarende lukkede kapsler blandes de aktive bestanddele med en vegetabilsk olie. Hârde gelatinekapsler kan indeholde granulater af de aktive bestanddele i kombination med en fast, pulver-formig bærer sâsom laktose, sakkarose, sorbitol, manni-20 toi, stivelse (som fx kartoffelstivelse, majsstivelse eller amylopektin), cellulosederivater eller gélatine.

Dosisenheder til rektal indgift kan fremstilles i form af suppositorier, som indeholder den aktive forbin-delse i en blanding med en neutral fedtbase, eller de 25 kan fremstilles i form af rektalt indgivelige gelatinekapsler som indeholder de virksomme bestanddele i en blanding med en vegetabilsk olie eller paraffinolie.

Flydende præparater til oral indgift kan hâve form af sait eller suspension, fx en oplasning med 2-20 vægt% 30 af de aktive substanser beskrevet ovenfor, idet resten bestâr af sukker og en blanding af ætanol, vand, glyce-rol og propylenglykol. Om ansket kan sâdanne flydende præparater indeholde farvestoffer, smagsstoffer, sakka-rin og karboxymetylcellulose som fortykningsmiddel. Per-35 oxyddonoren er herved til stede i form af mikroindkaps-lede partikler.

Fremstilling af farmaceutiske tabletter til per- 4

DK 157120 B

oral anvendelse kan ske pâ folgende mâde:

De indgâende faste stoffer males eller sigtes til en bestemt partikelstorrelse. Bindemidlet homogeniseres og suspenderes i en bestemt mængde oplosningsmiddel. De 5 terapeutiske substanser og nodvendige hjælpestoffer blan-des under en kontinuerlig og konstant blanding med binde-middeloplosningen som kan bestâ af en polymer som er op-loselig eller permeable i tarmkanalen, og man befugter sâledes at oplosningen bliver ensartet fordelt i massen 10 uden at nogle af delene overbefugtes. Befugtningen af pulverblandingen med bindemiddeloplosningen far partik-lerne til at forenes til aggregater og den reelle gra-nuleringsproces gennemfores pâ en sâdan mâde at massen presses gennem en sigte i form af et net af rustfrit 15 stâl med en maskestorrelse pâ ca. 1 mm. Massen anbringes derpâ i tynde lag pâ en bakke til torring i et torre-skab. Denne torring foregâr i lobet af 10 timer og mâ . standardiseras omhyggeligt eftersom fugtighedsgraden af granulatet er af storste vigtighed for den folgende 20 fremgangsmâde til dannelse af tabletterne. Det er muligt at anvende torring i et fluidiseret leje. I dette til-fælde anbringes massen ikke pâ en bakke men udhældes i en beholder med en netbund. Efter torringstrinnet sigtes granulatet sâledes at man opnâr den onskede partikel-25 storrelse. Under visse omstændigheder mâ man fjerne stov.

Til den færdige blanding sættes desintegrerings-midler, smoremidler og antiklæbemidler. Efter denne blanding skal massen hâve sin rigtige sammensætning til tab-letteringstrinnet.

30 Den rengjorte tabletmaskine forsynes med et be stemt sæt stempler, hvorefter korrekt justering af tab-letvægt og kompressionsgrad afproves. Tablettens vaegt er bestemmende for dosisstorrelsen i hver tablet og beregnes ud fra mængden af terapeutisk middel i granulatet. Kom-35 pressionsgraden pâvirker tablettens storrelse, dens styr-ke og dens evne til sonderdeling i vand. Navnlig med hen-syn til de to sidstnævnte egenskaber er valget af kom- 5

DK 157120 B

pressionstryk (0,5-5 t) noget af en balancegang. Nâr den rigtige justering er indstillet, sættes tabletfrem-stillingen i gang og den gennemf0res med en hastighed pâ 20.000-200.000 tabletter i timen. Tabletpresningen kræ-5 ver forskellig tid og afhænger af portionsstorrelsen.

Tabletterne coates fortrinsvis med et overtræk.

Dette betyder at de belægges med et lag af en polymer der kan oploses eller er permeabel i tarmkanalen.

Tabletterne emballeres sædvanligvis ved hjælp af 10 maskiner med et elektronîsk tælleorgan. De forskellige emballagetyper bestâr af glas- eller plastkrukker men ogsâ æsker, ror og specielle dosistilpassede emballager.

Den daglige dosis af de aktive substanser varie-rer og afhænger af indgiftsvejen og den bakterielle in-15 fektion, men som almen regel er den 8-400 mg pr. dag Na-tiocyanat og 10-500 mg/dag Na-perkarbonat ved pérorai indgift.

Farmaceutiske præparater der indeholder et anti-bakterielt System fremstillet ved fremgangsmâden ifolge 20 den foreliggende opfindelse er beregnet til anvendelse ved behandling af bakterieinfektioner i mave-tarmkanalen frembragt af arter af fx Shigella, Salmonella, Escherichia coli, Vibero colera, Pseudomonas-arter (Pseudomonas pyo-cyanea), Staphylococcus-arter (Staphylococcus albus, Sta-25 phylococcus aureus), Streptococcus-arter (Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis og 0-Streptococcus) og Proteus.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen vil blive be-skrevet nærmere i det folgende ved hjælp af nogle ek-30 sempler.

35 6

DK 157120 B

Ëksempel 1 . Natriumperkarbonat-granulat indeholdende 10% aktivt oxygen 100 g

Natriumtiocyant 40 g 5 Laktoperoxydase (50 ü/mg) 2 g

Polyvinylpyrrolidon 10 g

Laktose 50 g

Magniumstearat 10 g 10 Laktoseperoxydasen blandedes med laktose og granu- leredes under anvendelse af en oplosning af polyvinylpyrrolidon.

Natriumperkarbonat blandedes med natriumtiocyanat og laktoperoxydasegranulatet. Der tilsattes magnium-15 stearat hvorefter der granulære blanding tabletteredes.

Der vandtes tabletter med en gennemsnitlig vægt pâ 212 mg og disse blev belagt med et mavesaftresistent lag bestâende af "Eudragit"®.

20 Ëksempel 2

Magniumperoxyd 50 g

Natriumtiocyanat 0f8 g

Laktoperoxydase (50 U/mg) 0,04g 25 Polyvinylpyrrolidon 5 g

Laktose 100 g

Magniumstearat 10 g

De tre aktive komponenter granuleredes hver for 3Q sig under anvendelse af polyvinylpyrrolidon som granule-ringsmiddel. Der tilsattes laktose og magniumstearat hvorpâ blandingen tabletteredes. De vundne tabletter (1000 stk.) med en gennemsnitlig vægt pâ ca. 155 mg blev belagt med en oplosning af celluloseacetatftalat som er 55 résistent overfor mavesaft, i en oplosningsmiddelblan- ding af lige dele acetone og isopropanol.

. DK 157120B

7

Eksempel 3

Karbamidperoxyd 50 g

Natriumtiocyanat 20 g

Laktoperoxydase (50.U/mg) 1 g 5 Laktose 100 g

Stearinsyrepulver 2 g

Karbamidperoxydet granuleres under anvendelse af en oplosning af "Eudragit"-' S. Laktoperoxydasen blande-10 des med laktose og tiocyanat og blandingen granuleredes under anvendelse af "Eudragit"® S. De to portioner gra-nulater forenedes og blandedes med stearinsyrepulver og den endelige blanding tabletteredes. Tabletterne havde en gennemsnitlig vægt pâ ca. 175 mg.

15

Eksempel 4 I Natriumperkarbonat 100 g

Mannitol 20 g 20 II Natriumtiocyanat 40 g

Mannitol 20 g III Laktoperoxydase 2 g 25 Mannitol 20 g

Der fremstilledes granulater ud fra hver sin af blandingerne I, II og III under anvendelse af en op-losning af "Eudragit"-' L. De forenede granulater blande-2Q des med et passende smagsstof sâsom sukker, kakao, mikro-indkapslede citrusaroma eller blandinger deraf.

Et doseringsorgan, fx en ske, soin giver en dosis pâ ca. 200 mg lægges ind i emballagen til den granulære blanding. Emballagen er fremstillet af fugtighedstæt 25 materiale som fx en lamineret aluminiumsfolie.

DK 157120 B

8

Biologiske fors0g A^_Sa|menlignin2_med_kendt_teknik

Fra Chemical Abstracts vol. 83, 1975, nr. 16231y (référât af en afhandling af B. Bjôrck et al. 9 Appl.

5' Microbiol. 30(2:), 199-204, 1975) er det kendt at pro- dukter af oxydation af tiocyanat med laktoperoxydase in-hiberer grampositive bakterier der danner peroxyd. Disse produkter var baktericide for sâdanne gramnegative bakterier sorti Pseudomonas ssp. og Escherichia coli under 10 forudsætning af at det exogent tilfortes glukoseoxydase og glukose. Det ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen frem-stillede System er ogsâ virksomt mod grampositive bakterier, se omstâende.

I en afhandling af Klebanoff et al, "The Peroxi-15 dase-Thiocyanate-Hydrogen Peroxide Antimicrobial System" i Biochim.Biophys. Acta 117, 63-72, 1966, er det beskre-vet at peroxydase (laktoperoxydase og myéloperoxydase), tiocyanat og er komponenter i et antimikrobielt System som er effektivt mod et antal organismer. kan 20 dannes endogent (antagelig ved mikroorganismers stof- skifte), kan tilsættes eller kan udvikles ved tilsætning af forskellige systemer der genererer hydrogenperoxyd, fx oxydation af askorbinsyre, oxydation af glukose med glukoseoxydase og oxydation af hypoxantin med xantinoxy-25 dase.

Der er gennemfort to forsog til pâvisning af at det ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen fremstillede System har bedre virkning end det fra Klebanoff et al. kendte.

30

Fors0g_A

Medium: En 10% oplosning af skummetmælkspulver indehol-dende 0,5 mM SCN tilsattes som natriumtiocyanat og 2 pg/ml laktoperoxydase.

35 9

DK 157120 B

Teststamme: Escherichia coli NCTC 9703.

Antibakteriel Test: Skummetmælksoplosningen inkuberedes pâ et vandbad ved 37°C og der tilsattes 0,5 mM H202 e-*--*-er 5 magnesiumperoxyd. Flasker der kun indeholdt mediet inkuberedes som kontrol. 15 minutter efter tilsætningen af pero-xydet syrnedes testoplosningerne ved tilsætning af 0,5M HCl til pH 5,0 for at simulere virkningen af mavesyre. Efter yderligere 15 minutter blev der udtaget prover pâ 10 ml 10 og de podedes med Escherichia coli NCTC 9703 og inkuberedes yderligere ved 37°C. Antallet af overlevende bakterier bestemtes umiddelbart efter podningen og efter 2 timers inkubering.

15 Résultat:

Tilsætning Overlevende bakterier, cfu/ml 0 time 2 timer 20 Ingen, kontrol 8,8 x 10~* 8,8 x 10^ 0,5 mM H202 8,8 x 1 O5 1,4 x 1 O'6 0,5 mM Mg02 8,8 x 105 3,5 x 102 2^ Det fremgâr af resultatet at antallet af bektterier var tidoblet i kontrolproven mens det var steget med 59% i proven med tilsætning af H202· I den prove til hvilken der var sat Mg02 var antallet af bakterier derimod gâet ned til mindre end halvt tusinde.

2Q Klebanoff et al. diskuterer som nævnt ovenfor ogsâ tilsætning af et H202-genererende System som fx et system bestâende af glukose og glukoseoxydase.

Fors0cj_B

35 Der er gennemfort forsog for at sammenligne et sâ- dant System med et system i overensstemmelse med fremgangs-mâden ifolge den foreliggende opfindelse.

10

DK 157120 B

Medium: Et halvsyntetisk medium bestâende af 1,0 g NH4C1, 1,0 g K2HP04, 0,2 g MgS04.7H20, 10 g FeS04.7H20, 10 mg CaCl2, 3,0 g gærekstrakt (Difco) og 1000 ml vand, tillige indeholdende 0,25 mM SCN tilsat som natriumtiocyanat, 5 0,5% glukose og 2 pg/ml laktoperoxydase.

Teststamme: Escherichia coli NCTC 9703.

Antibakteriel test: Forsoget blev gennemfort i et anaerobt 10 telt. Mediet podedes med teststammen og der tilsattes en vandig oplosning af natriumperkarbonat i en mængde svaren-de til 0,25 mM karbamidperoxyd i en mængde svarende til 0,25 mM H202 eller 0,1 U/ml glukoseoxydase til forskel-lige prover. ümiddelbart efter podningen og efter 2 timers 15 inkubering ved 37°C blev der udtaget prover og antallet af overlevende bakterier bestemtes.

Resultater: 20 Tilsætning Overlevende bakterier, cfu/ml 0 time 2 timer ' Έ n

Ingen,kontrol 1,4x10 2,5x10 0,1 U/ml glukoseoxydase 1,4 x 10** 1,4 x 10^ 25 0,25 mM Ho00 som Z Z g 1 natriumperkarbonat 1,4x10 <3,5x10

Ingen,kontrol 1,5 x 10** 2,7x10^ 0,1 U/ml glukoseoxydase 1,5 x 10** 1,7x10^ 0,25 mM H202 SOm karbamidperoxyd 1,5 x 10** 5,2x10^ 35 11

DK 157120 B

B. Uafhængige £orse)g

4 reagensglas indeholdende 10 ml valle med et ind-hold pâ 21 ppm (0,25 mM) NaSCN inkuberedes ved 30°C efter at vallen var blevet podet med Pseudomonas fluorescens EF

5 1998. Det ene reagensglas var en kontrolpr0ve. Natrxumper-karbonat svarende til henholdsvis 0,1, 0,2 og 0,3 mM H202 sattes til de respektive tre andre reagensglas. Mængden af bakterier bestemtes ved podning og efter 2 timers inku-bering. Laktoperoxydase er til stede i en mængde pâ 5 10 pg/ml. Resultatet fremgâr af tabel 1 : T a b e 1 1 . ς Na-perkarbonat Antal bakterier/ml svarende til 0 timer 2 timer mM H202 6 6

Kontrol (0,0 mM/ 2,1x10 2,1x10 0,1 mM 2,1x10e l,8xl05 20 0,2 mM 2,lxl06 2,8xl03 0,3 mM 2,1χ106 2,6xl03

Det fremgâr tydeligt af tabel 1 at der opnâs en markant forbedring af den antibakterielle virkning nâr der er 25 0,2 mM H202 eller mere til stede. Men allerede tilsætning af 0,1 mM H202 giver en markant baktericid virkning..

Pseudomonas fluorescens EF 1998 inkuberedes ved 30°C i to reagensglas 1) og 2), idet reagensglas 1) indeholdt 1 g kommerciel mælkeerstatning bestâende af 15% ultrafil-3^ treret vallepulver, 57% vallepulver, 8% fedt, 16% animalsk protein og 4% vitaminer og mineraler i 10 ml vand, idet proven indeholdt 50 pg laktoperoxydase og idet der tilsat-tes 27,5 ppm natriumperkarbonat og hvor reagensglas 2) indeholdt samme mængde erstatning (50 pg laktoperoxydase) og idet der til reagensglas 2)sattes 21 ppm natriumtiocya-nat og 27,5 ppm natriumperkarbonat.

35 12

DK 157120 B

Mængden af bakterier i de forskellige reagensglas er vist i tabel 2 nedenfor, hvor resultaterne efter 0, 2, 4 og 6 timers forlob er angivet.

5 T a b e 1 2

Pr0ve 0246 timer reagens- a a a a glas 1 4,5x10° 3,5x10 5,3x10° 6,0x10° reagens- 6543 glas 2 4,5x10° 3,5xl03 5,3x10 5,6x10 15 Det fremgâr af tabellen at bakteriemængden i rea gensglas 2) efter 6 timers forlob kun er 1/1000 af mængden i reagensglas 1) pâ samme tidspunkt, idet der i reagensglas 1) ikke eller kun i ringe grad er foregâet vækst mens bakterier pâ den anden side er dcde i betydeligt omfang 20 i reagensglas 2).

Virkningen af det antibakterielle System bestemtes in vitro. Herved inkuberedes forskellige Escherichia coli-stammer ved +37°C i en vandig oplcsning af 5 g vallepul-ver/100 ml, 21 ppm NaSCN og natriumperkarbonat svarende 25 til 0,25 mM î^C^. Antallet af dræbte celler af Escherichia coli efter 2 timer er vist i tabel 3.

30 35 13

DK 157120 B

T a b e 1 3

Escherichia staminé % dræbt coli 5 ___ 0-139 299/66 >99,98 0-149 853/67 >99,98 0-138 355/67 >99,95 10 0-8 915/66 >99,99 0-147 949/66 >99,99 0-141 220/65 >99,99 15

Flere af de ovenfor afprovede stammer af Escherichia coli er resistente mod antibiotika. Resultaterne viser sâ-ledes at systemet er meget anvendeligt. Den hoje anvende-lighedsgrad hænger ogsâ sammen med at systemet virker mod 20 grampositive bakterier.

25 30 35

Claims (4)

14 DK 157120 B

1. Fremgangsmâde til fremstilling af et farmaceutisk præparat med antibakteriel virkning, kendeteg- n e t ved at man til en i og for sig kendt farmaceutisk 5 bærer sætter et antibakterielt System indeholdende lakto-peroxydase i en mængde pâ mindst 1 mg/kg produkt, tio-cyanat i en mængde pâ mindst 15 ppm udtrykt som natrium-tiocyanat, og en fast, vandoploselig peroxyddonor ud-valgt i en mængde pâ mindst 21 ppm udtrykt som natrium-10 perkarbonat og udvalgt blandt alkalimetalperkarbonater, jordalkalimetalperoxyder og karbamidperoxyd.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendeteg- n e t ved at den faste, vandoploseligë peroxyddonor er natriumkarbonat.

3. Fremgangsmâde ifolge krav 2, kendeteg- n e t ved at natriumkarbonat i kornform overtrækkes med et i tarmkanalen oploseligt beskyttelseslag.

4. Fremgangsmâde ifolge krav 3, kendeteg- n e t ved at beskyttelseslaget er af celluloseacetat-20 ftalat. 25 30 35