DK157763B

DK157763B - Fremgangsmaade til fremstilling af celle- og vaevsregenererende stoffer

Info

Publication number: DK157763B
Application number: DK231683A
Authority: DK
Inventors: Wolfgang Fraefel; Roland Tschannen
Original assignee: Solco Basel Ag
Priority date: 1982-05-28
Filing date: 1983-05-24
Publication date: 1990-02-12
Also published as: HU189286B; DD209736A5; NO157144C; EP0095682A3; FI831827L; CA1202894A; FI831827A0; NO831894L; ES522758A0; ZA833446B; DE3373188D1; AR231231A1; ATE29137T1; AU551992B2; JPS58219120A; AU1499483A; DK231683A; DK231683D0; FI77373C; EP0095682B1

Description

, DK 157763 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af celle- og vævsregenererende stoffer af glycoli-pidrækken fra okse- eller kalveblod.

Fra EP-offentliggørelsesskrift nr. 0 038 511 5 kendes der visse forbindelser, der fordcommer i organer og legemsvæsker, og som kan ekstraheres derfra, og som udøver en fremmende virkning på sårheling. Ifølge det nævnte offentliggørelsesskrift synes de ekstraherede aktive stoffer især at have struktur. som et glycosteroid 10 eller et glycosphingolipid.

Glycosteroidet skulle svare til den følgende strukturformlen ” "γΛΛ^ - xu HO^ hvori R er en oligosaccharidgruppe bestående af fem sukkerenheder.

25 Glycosphingolipidet skulle for sin del have den følgende struktur:

OH

30 οη3-(οη2)13-οη CH2-0t-R

CH—(CHg ) 9—CH=CH—CH2—OC

35 hvori R er en oligosaccharidgruppe bestående af fem sukkerenheder.

Disse forbindelser er isoleret fra organer såsom 2

DK 157763 B

hjerte, lunge, muskler og milt og fra legemsvæsker såsom blod, plasma og serum. Pattedyr, der frembringer disse forbindelser er mennesker, svin, heste, får og kvæg.

Fremstillingsmetoden ifølge det nævnte offent-5 liggørelsesskrift omfatter især en adsorption på aktivt carbon (affinitetschromatografi) og ekstraktion med 10 til 30%'s eddikesyre, en anden chromatografering på en molekylsigte og eluering med fortyndet eddikesyre og en tredie chromatografering på kiselgel og eluering med en 10 blanding af ethanol og methylenchlorid eller på en med Cg-kæder overtrukket kiselgel og eluering med blandinger af eddikesyre, ethanol og vand.

Det har nu overraskende vist sig, at man ud fra de samme udgangsmaterialer, der er anført ovenfor, lige-15 ledes kan opnå glycolipider med celle- og vævsregenererende egenskaber, men dog i væsentlig højere udbytte, såfremt man først underkaster udgangsmaterialet en autolyse og dialyse mod et alkoholisk-vandigt medium. Herved får man i virkeligheden et råprodukt, hvori de ønskede 20 aktive stoffer er beriget i forbløffende større grad end tilfældet var efter den tidligere kendte fremgangsmåde.

Under alle omstændigheder viste det sig ved udviklingen af den omhandlede fremgangsmåde, at de tidligere nævnte glycosteroider ved deres terapeutiske an-25 vendelse har en bestandighed, der er utilstrækkelig til at gøre dem fortjent til yderligere interesse.

Endvidere fandtes det også, at man ud fra det nævnte råprodukt kan isolere glycolipiderne på betydeligt enklere vis ved, at man (A) udfælder dem fra en 30 ethanolisk opløsning ved lavere temperatur, f.eks. ved ca. -20°C, eller (B) ekstraherer dem med et organisk opløsningsmiddel, der ikke eller kun i begrænset grad er blandbart med vand, og chromatograferer produktet fra trin (A) eller (B) på kiselgel eller en ionbytter med et 35 lidet polært opløsningsmiddel. Tænker man på omkostningerne ved den chromatografiske isolering, ses fordelen

DK 157763 B

3 ved nødvendigheden af kun en enkelt chromatografering ved den nye fremgangsmåde i forhold til den kendte fremgangsmåde, især såfremt der er tale om industriel anvendelse.

I det hele taget egner den omhandlede fremgangs-5 måde sig i tydelig modsætning til den kendte metode fortrinligt til gennemførelse i industriel målestok ikke mindst derved, at de væsentlige trin autolyse og dialyse kan foretages samtidigt og kontinuerligt ved modstrømsmetoden .

10 Den omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at blodet først blandes med en lavere alifatisk alkohol og et bakteriostatikum og derefter underkastes en autolyse i et tidsrum fra flere timer til nogle dage ved en 0 temperatur på fra 4 C til stuetemperatur, og en dialyse 15 mod en blanding af vand og en lavere alifatisk alkohol, således at stofferne med en molekylvægt på under 10.000 befinder sig i dialysatet, hvorfra glycolipiderne udvindes .

I det følgende beskrives opfindelsen mere udfør- 20 ligt.

Blandt de ovennævnte udgangsmaterialer foretrækkes defibrineret blod og organhomogenisater fra pattedyr, såsom okse- eller kalveblod.

25 Som nævnt ovenfor gennemføres først en autolyse af udgangsmaterialet og en dialyse af autolysatet. Det er fordelagtigt for opløsningen af de under autolysen fremkomne stoffer først at tilsætte udgangsmaterialet en kortkædet alkohol, fortrinsvis methanol eller ethanol, i 30 en koncentration på 10 til 30%, og en bakteriostat, fortrinsvis 4-hydroxybenzoesyremethylester eller 4-hydroxy-benzoesyrepropylester i en koncentration på 0,1 til 0,0001%. Autolysen kan foregå ved at man overlader udgangsmaterialet til sig selv i et tidsrum på fra flere 35 timer til nogle dage, f.eks. 3 dage, ved en temperatur

DK 157763B

4 på fra 4°C til stuetemperatur. Det er dog fordelagtigere at gennemføre de to foranstaltninger samtidigt og kontinuerligt i modstrøm, eftersom ligevægten på udgangsmaterialesiden gennem den stadige fjernelse af autolysepro-5 dukterne til stadighed forskydes til gunst for autolysereaktionen. Under autolysen frigøres intracellulære ka-taboliske enzymer såsom lysosomer, f.eks. kathepsiner og andre proteaser, endvidere nucleotidaser, esteraser, phosphataser osv. X dialysatet befinder sig de stoffer, 10 der har en molekylvægt under 10.000, heriblandt de ønskede glycolipider. Dialysen bevirker således samtidig med en acceleration af autolysen en fjernelse af især sådanne proteiner, der ved produktets terapeutiske anvendelse kunne føre til frembrud af allergiske reaktio-15 ner. Som medium til optagelse af stofferne under dialysen er blandinger af vand og lavere alifatiske alkoholer, f.eks. methanol og ethanol hensigtsmæssige. Særligt egnede blandinger består af vand og 10 til 30 rumfangsprocent ethanol, f.eks. vand med 15 rumfangsprocent ; 20 ethanol.

Råproduktet beskyttes eventuelt mod de efterfølgende isolerings- og separeringsprocesser. Hertil egner sig helt alment de samme beskyttelsesgrupper, der i peptidkemien er kendte til dette formål. Ved selektiv 25 indføring af beskyttelsesgrupper blokeres således de ak- · tive stoffers funktionelle grupper, og de aktive stoffer bringes på en til ekstraktionen fra reaktionsblandingen gunstigere form. Efter udført isolering og rensning fraspaltes beskyttelsesgrupperne. Eksempler på egnede be-30 skyttelsesgrupper og metoderne til deres fraspaltning er benzoylgruppen/fraspaltning med fortyndet alkaliopløsning; benzyloxycarbonylgruppen/fraspaltning med hydro-genbromid i iseddikesyre, trifluoreddikesyre eller andre organiske opløsningsmidler, hydrogenchlorid i ethanol, 35 trifluoreddikesyre i varmen eller metallisk natrium i flydende ammoniak; benzyl- og p-toluensulfonylgruppen/

DK 157763B

5 fraspaltning med natrium i flydende ammoniak, tert.-bu-tylgruppen/ fraspaltning med hydrogenchlorid i organiske opløsningsmidler, hydrogenbromid i iseddikesyre eller trifluoreddikesyre. Tert.-butylgruppen kan på særlig 5 elegant måde indføres ved syrekatalyseret forethring med isobuten.

Til isolering og rensning af glycolipiderne fra det opnåede dialysat kan der anvendes (A) udfældning i kulden fra ethanolisk opløsning eller (B) ekstraktion 10 med visse organiske, f.eks. lipofile opløsningsmidler og derefter chromatografi på et uorganisk adsorptionsmiddel eller en ionbytter. Mellem ekstraktionen (B) og chroma-tograferingen kan der med fordel indføjes en yderligere rensning ved udfældning.

15 Udfældningen (A) sker fra en ethanolisk opløsning ved en temperatur i området fra -15 til -25°C. Der opnås bedre glycolipidudbytter jo højere ethanolslutkoncentra-tionen er. Dialysatet tilsættes hensigtsmæssigt så meget vandfri ethanol, at der opnås en koncentration på mindst 20 60 rumfangsprocent deraf; de bedste resultater opnås ved en slutkoncentration på 90 rumfangsprocent. Den dannede ethanoliske opløsning henstilles ved den nævnte temperatur i flere timer.

Fraskillelse af de faste stoffer kan ske ved fil-25 trering, centrifugering eller sedimentation og dekantering. Derefter tørres produktet under skånende betingelser, dvs. en temperatur på højst 37°C. Tørringen sker ved opvarmning eller i vakuum eller ved begge dele samtidig.

30 Ved ekstraktionen (B) anvendes dialysatet enten i tørret, fast form eller i form af en vandig opløsning eller en opløsning i et organisk opløsningsmiddel. Til ekstraktionen anvendes et organisk opløsningsmiddel eller opløsningsmiddelblanding, der ikke eller kun be-35 grænset er blandbar med vand. Hertil egner sig især ethere, såsom diethylether og tetrahydrofuran, carbon-

DK 157763B

6 hydrider, såsom pentan, hexan, petroleumsether og benzen, halogenerede carbonhydrider, såsom chloroform, di-chlormethan, carbontetrachlorid, 1,2-dichlorethan og blandinger af chloroform og methanol, alkoholer, såsom 5 butanol og amylalkohol, og carboxylsyreestere, såsom ethylacetat og butylacetat.

Ved denne ekstraktion opnås en opdeling af udgangsprodukterne i flydende/flydende faser eller i flydende/faste faser og dermed en opdeling af bestand-10 delene i lidet polære eller apolære og polære eller io-niske stoffer. De ønskede glycolipider går over i den organiske mindre polære fase. Efter fjernelse af den anden flydende fase eller den faste fase tørres den organiske fase forsigtigt som beskrevet ovenfor.

15 Efter ekstraktionen sker fortrinsvis en udfæld ning af glycolipiderne på grundlag af deres foreliggende opløselighed i en vandig opløsning af et metalsalt og enten acetone,diethylether, en blanding deraf eller ethanol ved en temperatur i området fra -15 til -25°C.

20 Den vandige opløsning indeholder saltet af et mono- til pentavalent metal, fortrinsvis metalsaltet af en uorganiske syre. Hertil egner sig især magnesiumchlorid, · , calciumchlorid, natriumchlorid, kaliumchlorid, ammoniumsulfat, natriumsulfat, kaliumsulfat, natriumnitrat, di-25 natriumhydrogenphosphat og natriumdihydrogenphosphat.

Den vandige opløsning kan have en vilkårlig koncentration op til mætning. I denne opløsning suspenderes eller opløses da den ved tørring tilbageblevne rest.

Skønt der kan anvendes blandinger af acetone og 30 diethylether, foretrækkes anvendelsen af acetone eller diethylether alene, eller af ethanol i kulden. Deraf tilsættes den forinden dannede suspension eller opløsning op til flere gange rumfanget og det hele blandes.

Det herved fremkomne udfældede stof indeholder glycoli-35 piderne; de adskilles fra den flydende fase, hvilket kan. ske ved filtrering, centrifugering eller sedimentation

DK 157763B

7 og dekantering. Derpå tørres produktet skånende. Denne fremgangsmåde udgør en første udførelsesform for udfældningstrinnet .

Når opløselighedsforholdene til udfældning af 5 glycolipiderne fra blandingen af acetone eller ether eller ethanol i kulden og den vandige metalsaltopløsning nås, sker den ønskede udfældning. Det ved faseadskillelsen opnåede produkt indeholder eventuelt en tilstrækkelig saltkoncentration - især såfremt det drejer sig om 10 blod som udgangsmateriale - således at udfældningen kan gennemføres alene ved tilsætning af acetone eller ether eller ethanol i kulden. Denne fremgangsmåde, ved hvilken der ikke finder nogen særlig tilsætning af et metalsalt eller en metalsaltopløsning sted, udgør en anden udfø-15 relsesform for udfældningstrinnet.

Ifølge en tredie udførelsesform kan man endog gennemføre ekstraktionen og udfældningen i samme arbejdsgang. Således kan man behandle dialysatet med en blanding af det omtalte med vand ikke eller kun begræn-20 Set blandbare organiske opløsningsmiddel og acetone eller ether i et rumfangs forhold til hinanden og i en mængde, der retter sig efter rumfanget og metalsaltkoncentrationen i dialysatet, og derved bevirke en udfældning, der indeholder glycolipiderne. Det udfældede stof 25 adskilles som angivet ovenfor fra de flydende faser og tørres varsomt.

I det sidste arbejdstrin renses det fra ethanol-udfældningen (A) eller ekstraktionen (B) opnåede produkt chromatografisk. Hertil egner sig uorganiske adsorp-30 tionsmidler, især kiselgel eller blandinger af kiselgel og et metaloxid eller et salt af en uorganisk syre, f.eks. de i handelen værende blandinger af kiselgel og aluminiumoxid, magnesiumoxid eller magnesiumsulfat, el-35 ler også ionbyttere, især basiske og sure cellulosederivater, såsom diethylaminoethan-cellulose, carboxyme-thylcellulose eller sulfopropylcellulose.

DK 157763B

8

Produktet opløses først i et lidet polært organisk opløsningsmiddel. Som opløsningsmidler egner sig især methanol, blandinger af methanol og chloroform og af ethanol og chloroform, endvidere ethylacetat og blan-5 dinger af methanol, chloroform og lidt vand. Opløsningen bringes på en chromatografisøjle, der vandfrit er fyldt med adsorptionsmidlet i det samme opløsningsmiddel eller et andet af de ovennævnte opløsningsmidler. Til eluering kan der anvendes samme opløsningsmiddel eller opløs-10 ningsmiddelblanding, der kan dog også benyttes en opløsningsmiddelblanding med tiltagende polaritet, hvilket opnås ved anvendelse af en lineær, konkav eller konveks eller tringradient af den kvantitative sammensætning.

Eluatfraktionerne kan undersøges for tilstede-15 værelsen af glycolipiderne samt deres indhold og renhed efter forskellige metoder. Hertil egner sig de i den eksperimentelle del beskrevne for glycolipider eller gly-cosphingolipider karakteristiske farvereaktioner og far-ningsmetoder. Fraktionerne kan også opdeles yderligere 20 på tyndtlagsplader eller -folier, der er overtrukket med kiselgel, C-18-alkanderivatiseret kiselgel, polyamid, cellulose eller polyacrylamid i et egnet flydemiddel. De adskilte stoffer elueres fra pladen eller folien med et ikke vandigt opløsningsmiddel, f.eks. en blanding af 25 chloroform og methanol, og undersøges ved hjælp af tyndtlagschromatografi, hydrolyse og analyse af hydrolyseprodukterne, gaschromatografi, massespektrometri, fastlæggelse af helingstidsforkortelsen af overfladelæsioner på pattedyr eller iagttagelse af opførselen af 30 cellekulturer, der har fået stofferne. Resultaterne viser, at det med hensyn til de aktive stoffer drejer sig om glycosphingolipider.

Ved de nedenfor beskrevne farmakologiske forsøg kunne det eftervises, at de opnåede aktive stoffer har 35 såvel en udpræget proliferationsfremmende indflydelse på forbeskadigede fibroblaster in vitro som en regenera-

DK 157763B

9 tionsfremmende virkning på tilsvarende cellepopulationer in vivo. At det herved ikke drejer sig om sædvanlige mi-totisk virkende stoffer er entydigt, eftersom normalt opbevarede sunde cellekulturer ikke viser nogen ændrin-5 ger ved tilsætning af de nævnte stoffer. I modsætning hertil bringes med forskellige beskadigende midler for-beskadigede kulturer med en unormal lav delingshastighed indenfor kort tid igen op på en normal delingshastighed, der praktisk taget er identisk med delingshastigheden i 10 en sund kultur.

På grund af det faktum, at reparationsmekanismerne i beskadigede cellepopulationer stimuleres såvel in vitro som in vivo med de ifølge opfindelsen fremstillede stoffer, er disse egnede til terapeutisk anvendelse især 15 ved langsomt eller dårligt helende sår eller ulceratio-ner, hvis reparationsevne er indskrænket.

Disse stoffers fremmende virkning på sårheling kan vises ved de følgende dyreforsøg.

20 Forsøg 1.

På narkotiserede rotter fjernedes pelshårene, og de fik på begge sider af kroppen ved pålægning af en messingskive med et tværsnit på 2 cm og en temperatur på 270°C i 30 sekunder et forbrændingssår. De aktive stof-25 fer oparbejdedes i en gelébasis, således at der fremkom en 20% behandlingsgelé. Som kontrol oparbejdedes vand eller fysiologisk kogsaltopløsning. 10 dyr med to sår behandledes dagligt lokalt to gange med geléen, og varigheden af sluthelingen konstateredes. Stoffet med den 30 i eksempel 2 beskrevne Rf-værdi 0,65 gav i forhold til kontrolgruppen en forkortelse i helingstiden på op til 21%.

DK 157763B

10

Forsøg 2.

Minipigs fik dorsalt hver fire brandsår som beskrevet i forsøg 1 og fire stansesår med et tværsnit på 2,5 cm med et hulcylinderbor. De aktive stoffer opar-5 bejdedes til et indhold på 20% i en gelébasis. Sårene påførtes geléen to gange daglig, og tiden til slutheling konstateredes. Stoffet med Rf-værdien 0,65 gav en forkortelse i helingstiden på 18%.

10 Forsøg 3.

Minipigs fik som beskrevet i forsøg 1 brandsår.

Efter 6, 12, 18 og 22 dages daglig sårbehandling fjernedes dyr fra behandlingsgrupperne og dræbtes i narkose.

Sårene blev udskåret, halveret og fikseret i 4% pufret 15 formalin. Disse vævsstykker oparbejdedes til 4 μπι tykke histologiske paraffinsnit. De følgende parametre bestemtes kvantitativt: 1. den epitelialiserede såroverflades længde 2. den ikke-epitelialiserede såroverflades længde 20 3. længden af stratum basale i epidermis 4. den nydannede epidermis' overflade 5. overfladen på hårfollikler og talgkirtler

Bedømmelsen af parametrene viste, at de i eksemplerne 2 til 6 beskrevne rensede stof fremmer dannelsen 25 af epiteltunger og deres indvandring til sårcentrum i forhold til kontroldyrene. Den fremmende virkning og sårhelingen viser sig overvejende i den tidlige fase af dannelsen af en stroma, stratum basale og papillerne.

30 Forsøg 4.

Narkotiserede rotter fik 1 cm brede og 5 mm dybe stansesår. I disse sårhuller anbragtes viskosecel-lulosehulcylindersvampe. I hulcylinderens indvendige udhuling anbragtes daglig 100 μΐ renset stof. 4, 10, 16 og 35 21 dage efter implantationen fjernedes svampene og undersøgtes for indholdet af hæmoglobin, desoxyribonu-

DK 157763B

11 cleinsyre og hydroxyprolin. Sårene, der behandledes med de rensede stoffer, havde 4 og 10 dage efter implantationen ikke højere indhold af hæmoblobin, desoxy-NS og hydroxyprolin i de implanterede svampe end kontroldy-5 rene, 16 og 21 dage efter implantationen havde svampene dog et signifikant højere hæmoglobin-, DNS- og hydroxy-prolinindhold. Angående metoden, se J. Niinikoski og S. Renvall, Acta Chir. Scand. 145 (1979), 287-291.

Med det rensede stof fra eksemplerne 2 til 6 10 fremmes sårhelingen i den tidligere dannelse at stroma og stratum basale med kapillarer.

Forsøg 5.

Cellekulturer, f.eks. voksende fibroblaster, kan 15 ved udeladelse af natriumhydrogencarbonat i næringsmediet hæmmes i deres vækst. Tilsætning af de i eksemplerne 2 til 6 beskrevne stoffer til næringsmediumet førte til, at cellerne kom sig hurtigere efter denne hæmning, og den normale delingshastighed opnåedes klart tidligere 20 end hos tilsvarende hæmmede, men ikke behandlede cellekulturer .

De talmæssige angivelser angående blandinger af opløsningsmidler i eksemplerne vedrører hver gang rumfang, f.eks. betyder "ether:ethanol = 3:1" en blanding 25 af 3 rumfangsdele ether og l rumfangsdel ethanol.

Eksempel 1

Kalveblod fra slagtedyr tilsattes på slagtestedet straks ethanol til en koncentration på 20% og behand-30 ledes med bakteriostatikaene p-hydroxybenzoesyremethyl-ester (methylparaben) og p-hydroxybenzoesyre-n-propyl-ester (propylparaben) til en koncentration på hver 0,02%. Blodet autolyseredes i 3 dage ved stuetemperatur, hvorved der fandt en kraftig hæmolyse samt en delvis 35nedbrydning af ikke stabile bestanddele sted, og hvorved membrankomponenter opløstes fra membranerne. Dette auto-

DK 157763B

12 lysat adskiltes ved dekantering fra sedimentet, og den ovenstående væske dialyseredes i 3 dage statisk eller dynamisk mod vand med 15 rumfangsprocent ethanol gennem en membran med afskæringsgrænse 10000. Ved den dynamiske 5 dialyse pumpedes dialysat og moddialysat i modstrøm i 3 dage gennem dialysemembranen, således at der til enhver tid bestod et størst muligt koncentrationsfald.

Det resulterende moddialysat havde en tørvægt på 5 til 80 mg/ml og indeholdt sårhelingsfremmende stoffer 10 i en mængde op til i mg/ml. Efter fremgangsmåden ifølge det tidligere nævnte europæiske offentliggørelsesskrift opnås tilsvarende glycosphingolipider i en mængde på 0,005 mg/ml.

15 Eksempel 2 2 Liter kalveblod blandedes med 300 ml ethanol og autolyseredes i 3 dage ved stuetemperatur. Autolysatet filtreredes gennem et ultrafilter med afskæringsgrænse 10000 (molekylvægt) og adskiltes derved fra cellebrud-20 stykker og store proteiner. Filtratet blandedes med 6 liter ethanol: ether i et forhold på 3:1, hvorved der fremkom en udfældning, der i hovedsagen bestod af glycosphingolipider. Det udfældede stof sedimenteredes ved centrifugering med 18000 g i 30 minutter og adskiltes 25 fra den flydende fase.

Det udfældede stof tørredes under vakuum ved 37°C og opløstes i 20 ml chloroform:methanol i forholdet 65:35. De opløste glycosphingolipider fordeltes chroma-tografisk på en Florisil-søjle (varenavn, magnesiumsi-30 likatgel, højselektivt adsorbens fra firmaet Floridin Corp., Pittsburg, PA, U.S.A.) med tværsnit 5,0 cm og længde 40 cm, der var bragt i ligevægt med chloroform: methanol i forholdet 65:35, og derved fjernedes resterende phospholipider. Glycosphingolipiderne eluere-35 des over en tringradient på hver 2 liter 35%, 50%, 75% methanol i chloroform og endelig med 100% methanol. De

DK 157763B

13 ved elueringstrinnene opnåede stoffer underkastedes de i indledningen beskrevne sårhelingsundersøgelser og herved blev det fastlagt, at den sidste med 100% methanol elu-erede fraktion indeholdt de stoffer, der fremmer sårhe-5 ling.

De i denne fraktion værende stoffer overførtes på præparative kiselgel-tyndtlagsplader med 2 mm's lagtykkelse og chromatograferedes i et flydemiddel chloroform: methanol: 0,1% CaCl2 i vand = 55:45:10 stigende over 10 en strækning på 18 cm. Pladerne tørredes efter chroma-tograferingen og stilledes kortvarigt ind i et kammer med mættet iodatmosfære. De herved gult farvede zoner markeredes efter sublimation af iodudkradset og elue-redes med chloroform:methanol = 50:50 fra kiselgelen.

15 Forsøg til fastlæggelse af helingstidsforkortelsen af brandsår på rotter forløber positivt med den fraktion, der i den nævnte tyndtlagschromatografiske adskillelsesmetode har Rf-værdien 0,65.

20 Eksempel 3 2 Liter moddialysat fra eksempel 1 tørredes i en rotationsfordamper eller ved lyofilisering og optoges i 4 liter tetrahydrofuran:0,01 M KC1 i forhold 4:1. Ikke opløst materiale fraskiltes på et papirfilter, og den 25 klare opløsning inddampedes i en rotationsfordamper til 500 ml. Hertil sattes 1 liter chloroform:methanol i forhold 2:1, og de organiske og vandige faser adskiltes ved tilsætning af 200 ml vand. Den øvre fase, der indeholdt glycolipiderne, fjernedes og inddampedes til tørhed. Det 30 tørrede stof opløstes i 10 ml chloroform:methanol:vand = 90:10:0,2 og anbragtes på en Bio-sil A-søjle med tværsnit 1,5 cm og længde 120 cm ekvilibreret i chloroform: methanol:vand = 90:10:0,2. Søjlen vaskedes med 1,5 liter af det samme flydemiddel, og glycolipidet elueredes der-35 efter med 1 liter chloroform:methanol:vand = 85:15: 0,2 fra søjlen. Det ved denne metode rensede stof er et gly-

DK 157763B

14 colipid, der forkorter helingstiden for brandsår.

Eksempel 4 2 Liter moddialysat fra eksempel 1 ekstraheredes 5 som i eksempel 2 med ethanol:vand i forhold 3:1, og det udfældede stof optoges i 20 ml chloroform:methanol = 2:8. Diethylaminoethyl-SephadejP* A50 i Cl“-formen bragtes ved vask med 0,1 N natronlud og 1 N eddikesyre på acetatformen, vaskedes med methanol og fyldtes på en 10 søjle med tværsnit 2,5 cm og længde 20 cm. Det i chloro-form:methanol = 2:8 opløste materiale anbragtes på søjlen, og denne vaskedes med hver gang 200 ml 0,01 M natriumacetat, 0,02 M natriumacetat og 0,2 M natriumacetat. Derefter elueredes glycolipidet med chloroform:me-15 thanol i forhold 2:8. Det ved denne metode eluerede gly-colipid forkorter helingstiden for brandsår.

Eksempel 5 200 ml moddialysat fra eksempel 1 inddampedes i 20 en rotationsfordamper eller ved en lyofilisering til tørhed og tørredes i en exsikator i mindst 3 timer over phosphorpentoxid. Det tørrede materiale tilsattes 15 ml friskt fremstillet 20%'s opløsning af benzoesyreanhy-drid i pyridin, derefter 15 ml 10%'s opløsning af p-25 dimethylaminopyridin i pyridin. Karret lukkedes tæt og inkuberedes i 2 timer ved 37°C. Karret afkøledes, og indholdet adskiltes på et filter eller ved centrifugering fra ikke opløst materiale.

Pyridinet fjernedes i en nitrogenstrøm, og det 30 tørrede materiale optoges i 30 ml hexan. Hexanet vaskedes tre gange med hver gang 18 ml alkalisk methanol-vandopløsning bestående af 0,4 g/100 ml natriumcarbonat i methanol:vand = 80:20. Hexanfasen tørredes tinder nitrogen og optoges i 4% ethylacetat i hexan.

35 Det per-O-benzoylerede glycolipid elueredes på en højtryksvæskechromatografi-kiselgelsøjle med en gra- 15

DK 157763 B

dient fra 4% til 45% ethylacetat i hexan. Det ved denne metode isolerede per-O-benzoylerede glycolipid hydrolyseredes til fjernelse af benzoylgrupperne i 0,6 N natronlud i 1 time ved 37°C. Hydrolysatet blandedes med 5 5 rumfang acetone, og det udfældede native glycolipid af-filtreredes eller centrifugeredes.

Det ved denne metode rensedes glycolipid forkorter helingstiden for brandsår.

10 Eksempel 6

Dialysatet tilsattes 9 rumfang ethanol og omrør-tes i 30 minutter ved 85°C. Det herved fremkomne bundfald fjernedes på filtrerpapir, og den klare opløsning opbevaredes i 3 dage ved -20°C. Det søgte stof fældede 15Ud og sedimenterede under dette tidsrum. Den ovenstående væske dekanteredes fra, og sedimentet optoges i chloroform: methanol = 2:1 og anbragtes på en diethylamino-ethyl-Sephacel®-søjle i acetatform. Søjlen elueredes med chloroform:methanol = 2:1, og eluatet samledes. Dette 20tørredes i en rotationsfordamper og opløstes i chloroform. Opløsningen anbragtes på en søjle, der var fyldt med aktiveret kiselgel i chloroform. Først skylledes med chloroform, derefter med chloroform:methanol = 9:1, og disse eluater bortkastedes. Derefter skylledes med ace-2Stone:methanol = 9:1, og denne fraktion indeholdt de ønskede glycolipider i ren form.

Karakterisering af stoffet.

Det fra eksempel 2 rensede stof opdel tes chro-30matografisk på kiselgel-tyndtlagsplader i flydemidlet methanol:chloroform:0,1% CaCl2 i vand = 55:45:10.

Som sammenligningsstoffer opdeltes en blanding af de følgende stoffer samtidig: asialogangliosidM1, i det følgende forkortet asialo-G^, asialo- GM2' asialo-Gj^, 35asialo-GD1A, cerebrosid og psychosin.

Pladerne farvedes med de følgende metoder:

DK 157763B

16 1. 20 mg kresylviolet i 1000 ml 1% eddikesyre; blåviolet farvning.

2. 1% Diphenylamin i 2 ml ethanol, 100 ml koncentreret saltsyre og 80 ml eddikesyre; rød farv- 5 ning.

3. Først sprøjtning med 5,25% hypochlorsyrling i 40 ml benzen og 5 ml eddikesyre, tørring, derefter 1% benzidin i 50% ethanol; blå farvning.

4. 0,1 g orcinol i 1 ml 1% jern(IIl)chlorid og 50 10 ml vand; brun farvning.

5. Tyndtlagspladerne anbringes i et ioddampkammer. Sammeniigningsstofferne samt det stof med Rf-værdien 0,65, der skal analyseres, farves gule.

6. Ved anvendelse af tyndtlagsplader med en fluo- 15 rescensindikator for bølgelængderne 254 nm og 366 nm svækkes fluorescensen ikke af det stof med Rf-værdien 0,65, der skal analyseres, ligesom sammenligningsstofferne ikke ændrer pladernes fluorescering.

20 7. 0,2% naphthoresorcinol i acetone og 10% phos- phorsyre som sprayreagens. De behandlede plader opvarmes i 5 minutter ved 90°C; blårød farvning.

8. 1 g p-anisidin i 100 ml 70% ethanol; blå farv- 25 ning.

Kvalitativ og kvantitativ bestemmelse.

1 ml af det fra eksempel 2 rensede stof tørres i en rotationsfordamper under vakuum ved 37°C eller ved 30 lyofilisering. Det tørrede stof optages i 0,8 ml 2 M svovlsyre og 0,4 ml dioxan og indsvejses i ampuller. Prøverne hydrolyseres i 3 timer ved 95°C og neutraliseres derefter ved tilsætning af 0,14 ml 10 N natronlud.

Det neutraliserede hydrolysat pufres med 1,66 ml 0,2 M 35 natriumboratpuffer med pH 8,0 og ekstraheres i en skilletragt med 2,0 ml diethylether i 5 minutter. Den nedre 17

DK 157763 B

fase bortkastes, og den øvre etherfase inddampes i et vandbad ved 37°C. Det tørre stof optages i 3 ml chloroform med 0,0025% fluorescamin - 4-phenylspiro-[furan-2(3H)-l,-phthalan]-3,3'-dion [m. Naoi, J.C. Lee og S.

5 Rosman, Anal. Biochem. 58 (1974), 571-577] - og blandes i 30 sekunder. Denne opløsnings fluorescens måles ved en exiteringsbølgelængde på 385 nm og emissionsbølgelængden 480 nm.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af celle- og vævsregenererende stoffer af glycolipidrækken fra okseeller kalveblod, kendetegnet ved, at blodet først blandes med en lavere alifatisk alkohol og et bak- 5 teriostatikum og derefter underkastes en autolyse i et tidsnam fra flere timer til nogle dage ved en tempera-0 tur på fra 4 C til stuetemperatur, og en dialyse mod en blanding af vand og en lavere alifatisk alkohol, således at stofferne med en molekylvægt på under 10.000 befinder -10 sig i dialysatet, hvorfra glycolipiderne udvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at dialysen gennemføres kontinuerligt ved modstrømsmetoden.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n -15 detegnet ved, at glycolipiderne udfældes fra det opnåede dialysat ved tilsætning af ethanol og henstand af den dannede ethanoliske opløsning ved en temperatur i området fra -15 til -25°C og fraskilles.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n -20 detegnet ved, at det opnåede dialysat opdeles i faste/flydende eller flydende/flydende faser ved tilsætning af et med vand ikke eller kun begrænset blandbart opløsningsmiddel valgt blandt ethere, carbonhydrider, halogenerede carbonhydrider, alkoholer, carboxylsyre-25 estere og blandinger deraf, idet glycolipiderne går over i den faste eller den organiske mindre polære fase, den glycolipidholdige fase fraskilles, og den organiske fase tørres under skånende betingelser.