DK158033B - Fremgangsmaade til afgiftning af e.coli neurotoxin og fremgangsmaade til fremstilling af en vaccine mod oedemsygdom hos smaagrise - Google Patents

Description

i

DK 158033B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til afgiftning af E. coli neurotoxin, og en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod ødemsygdom hos smågrise.

5 Det er kendt, at et specifikt toxin, der kaldes neurotoxin, og som udvikles af pathogene stammer af Escherichia coli, er det ætiologiske middel i en alvorlig smågrisesygdom, der kaldes smågrises ødemsygdom.

lø ødemsygdom hos smågrise, der også kaldes tarmødem eller enterotoxemi, er en akut sygdom der er vidt udbredt i de fleste lande og er ansvarlig for 5 til 80% af smågrisenes død. Sygdommen fremkommer inden for to uger efter svækkelse af smågrisen, og dens kliniske symptomer er ataxi, kramper, 15 delvis eller fuldstændig lammelse, ødem i subcutis i panden og øjenlågene, og anatomopathologiske træk er ødemer i forskellige organer, først og fremmest mavevæggen, spiraltyktarmens krøs og hjernen.

20 Neurotoxinet produceres af forskellige velkendte E. coli serotyper.

I Res. Vet. sci. 1:17-27, 1960 beskriver W.J. Sojka de mest almindelige E. coli serotyper, som er isoleret i tilfælde 25 af smågrises ødemsygdom, og i Zbl. Vet. Med. (B) 18:622-33, 1971 viser H. Schimmelpfennig, at neurotoxinet produceres af de dominerende E. coli serotyper, der er isoleret fra ødemsygdom hos smågrise, dvs. 0138, 0139 og 0141 serotyper-ne.

30

Efter infektion med en sådan E. coli stamme frigøres neurotoxinet og adsorberes i tarmen hos smågrisen og forårsager almen arteriopathi, som er ansvarlig for nervøse symptomer og ødemer.

Aktiv immunisering mod smågrises ødemsygdom er blevet forsøgt med forskellige E. coli præparater bestående af enten 35

DK 158033 B

2 hele E. coli organismer eller lysater deraf (W.J. Sojka, "E. coli in domestic animals and poultry" udgivet af the Commonwealth Agricultural Bureau, 1965, side 124, E. Kau-ker, Deuts. Tieraerzt. Wochenschrift 78:182-84, 1971 og K.

5 Lutter, Monatsh. Veterinaermed. 29:694-99, 1974), men disse præparater kan enten ikke beskytte smågrisene eller inducerer kun en serotypespecifik immunitet svarende til den E. coli serotype, der er anvendt til fremstillingen.

10 Amerikansk patentskrift nr. 4.136.181 angår vacciner, som er effektive mod smågr i ses ødemsygdom. Disse vacciner omfatter delvis renset neurotoxin suppleret med en adjuvant, og de administreres ad den intramuskulære eller subkutane vej. Toxinet anvendes som vaccine, men er ikke afgiftet og derfor potentielt 15 farligt.

I en artikel kaldet "Studies on the oedema disease producing toxin of Escherichia coli" (Advances in Vet. Med.

Suppl. to Sbl. Vet. Med. 29:25-32, 1978), rapporterer H.

20 Schimmelpfennig og R. Weber, at behandling af toxinerne med formaldehyd resulterede i fuldstændig afgiftning, men de formalinbehandlede toxiner udviste ikke en forbedret antistofreaktion, og disse forfattere konkluderer, at der ikke er noget bevis for, at der dannes et formol-toxoid. Endvi- 25 dere viser resultaterne, at sammenlignet med det naturlige neurotoxin, har det formalinbehandlede toxin i betydelig grad tabt evnen til at stimulere produktionen af neutraliserende antistoffer.

30 Amerikansk patentskrift nr. 3.983.229 angår en fremgangsmåde til fremsti 111 ing af vacciner, som består i at bringe et to-x1 sk produkt i kontakt med glutaraldehyd under milde betingelser og standse reaktionen, såsnart inaktiveringstrinnet er nået. Patentskriftet omtaler ikke specielt neurotoxinet.

Det har nu vist sig, at når E. coli neurotoxin behandles med glutaraldehyd under milde betingelser, dvs. f.eks. behandling 35 3

DK 158033 B

af en vandig opløsning af E. coli neurotoxin, som titrerer 57 mus ED5ø/-ml med en 0,01M vandig opløsning giutaraldehyd ved stuetemperatur, og reaktionen standses før et toxininaktive-ringsniveau på 90% er nået og fortrinsvis når et inaktiverings-5 niveau mellem 50 og 90% og endog mellem 70 og 90% er nået, dvs. i en periode mellem 5 minutter og 1 time, fås et produkt, der i den foreliggende beskrivelse kaldes afgiftet neurotoxin, som er i hovedsagen ugiftigt, men stadig meget immunogent og derfor værdifuldt til immunisering af unge (dvs. ca. 1 uge 10 gamle) smågrise mod ødemsygdomme. Udtrykket "titrerer 57 mus EDgø/ml" er EDsø/ml den dosis af toxinet, som er effektivt i 50% af tilfældene. Da denne værdi kan svinge fra et dyr til et andet, er det specificeret, at det drejer sig om "mus EDsg/ml. Mængden, der referes til her, er mængden af 57 sådanne doser.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er derfor ejendommelig ved, at reaktionen udføres ved stuetemperatur af en varighed, mellem 5 minutter og 1 time og ved en glutaraldehydkoncentration på 0,01M.

20 GIutaraldehyd er et middel, som allerede er kendt for at reagere med antigener, idet det med dem danner polymere tvær-bundne reaktionsprodukter, og teknikken til inaktiveringsbehandlingen med glutaraldehyd er også kendt og indbefatter fremgangsmåder til standsning af inaktiveringsreaktionen.

25 Disse metoder indebærer f.eks. tilsætning af et reaktionsblokeringsmiddel, såsom et uorganisk salt (f.eks. natriumbisul-fit) eller en aminosyre (fortrinsvis lysin eller glycin).

Det afgiftede E. coli neurotoxin fremstillet ved fremgangsmå-30 den ifølge opfindelsen er mere uskadelig end det rensede neurotoxin ifølge amerikansk patentskrift nr. 4.136.181, og det nævnte rensede neurotoxin kan anvendes som udgangsmateriale til fremstilling af det afgiftede neurotoxin fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

De immunogene egenskaber af det afgiftede neurotoxin fremstillet ifølge opfindelsen kontrasterer overraskende skarpt 35

DK 158033 B

4 med glutaraldehydbehandlede produkter, som udviser et inakti-veringsniveau højere end 90%, som ikke er immunogene.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling 5 af en vaccine mod ødemsygdom hos smågrise indeholdende et afgiftet E. coli neurotoxin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at afgiftet E.coli neurotoxin fås ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

10 Til at immunisere yngre smågrise mod ødemsygdom sammensættes det afgiftede neurotoxin til farmaceutiske midler til intra-muskulær eller subkutan indgivelse, fortrinsvis med en adjuvant og optimalt suppleret med et antiseptikum såsom thiomer-sal. Egnede adjuvanter er de af gruppen bestående af alumini-15 umhydroxid og aluminiumphosphat, f.eks. alhydrogel® (en alumi-niumhydroxidgel fremstillet og forhandlet af Superfos Export Co., København, Danmark) og forholdet mellem afgiftet neurotoxin og adjuvant beregnes fortrinsvis til maksimal adsorption på adjuvanten, som vist f.eks. i Symp, Series Immunobiol.

20 Standard. 6:177-180, 1967.

Opfindelsen illustreres af følgende eksempler. F.eks. anvendes i den beskrevne neurotoxinprodukt ion en E. coli serotype 0139 stamme isoleret fra et klinisk tilfælde, og det er klart, at 25 enhver anden E. coli stamme, der vides at være neurotoxinproducent, også kan anvendes til samme formål.

Eksempel 1.

30

Neurotoxinf remstillmg.

(a) Fremstilling af podestof.

En prøve af en E. coli stamme serotype 0139 isoleret fra et 35 typisk tilfælde af smågrises ødemsygdomme og opretholdt i frysetørret tilstand rehydratiseres med sterilt saltvand og inkuberes i 18 timer ved 37°C i Petriskåle, der hver

DK 158033 B

5 indeholder 20 ml tryptose-agar fast medium fremstillet ved at blande 26 g tryptosebouilion, 30 g agar Difco (tryptose-bouillon og agar Difco er produkter fremstillet og forhandlet af Difco Laboratories) og vand op til 1 liter, og blan-5 dingen opvarmes i 45 minutter til 115°C.

Et flydende kulturmedium fremstilles så som følger:

Proteosepepton nr. 3 (et produkt fremstillet og forhandlet 10 af Difco Labs) 30 g, gærekstrakt (4 g) og dextrose (5 g) opløses i 1 liter vand ved 60°C. Efter afkøling tilsættes NaCl (5 g), NaHPO^ (5,05 g) og ΚΗ2ΡΟ^ (1,2 g). Mediet, hvis pH-værdi er 6,9-7,0 filtreres på et Seitz EKS filter og fordeles i 100 ml kulturkolber.

15

Disse kulturkolber podes med kolonierne fremkommet på Petriskåle under anvendelse af én koloni pr. 20 ml af ovennævnte flydende medium og inkuberes i seks timer ved 37°C under rystning på rystehylder (22 til 24 rystninger pr.

20 minut).

(b) E. coli-produktion og neurotoxinekstraktion.

Portioner på 6 ml af det E. coli-holdige kulturmedium (dvs.

25 ca. 6 x 109 bakterier) podes i produktionskolber indeholdende 300 ml af samme flydende medium, og kulturerne inkuberes en dag under rystning på rystehylder (22 til 24 rystninger pr. minut).

30 Høsten fra fire produktionskolber (en række) samles, og hver række høstninger centrifugeres i 2 timer ved 2000 g, og sedimentet gensuspenderes i 150 ml destilleret vand.

Cellesuspensionen lydbehandles i 30 minutter i en Branson 35

Europa sonicator model J 22 (Branson Europa N.V., Soest, Holland), idet mediet holdes i et smeltende isbad.

DK 158033B

6

Efter sprængning af cellerne centrifugeres suspensionen i 2 timer ved’ 2000 g ved 5°C for at fjerne cellerester. Den overliggende væske føres gennem et 0,45 mikron Millipore steriliserende filter (Millipore er et varemærke for Milli-5 pore Corporation) og giver 100 ml filtrat, hvis titer (bestemt ved slutpunktsmetoden ifølge Reed og Muench) er 57 mus EDg g.

Eksempel 2.

10 ____.Afgiftning af neurotoxin og fremstilling af vaccine.

En portion på 900 ml af den ovenfor fremstillede neurotox- inopløsning inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med 4,8 15 ml af en opløsning af 25 g glutaraldehyd i 100 ml pyrogen- frit destilleret vand. Efter den reaktionstid standses reaktionen ved tilsætning af 1 ml af en opløsning af 48 mg L-lysinmonohydrochlorid i 10 ml pyrogenfrit destilleret 20 vand.

Det inaktiverede toxin suppleret med 446 ml 2% steril opløsning af aluminiumhydroxid (Alhydrogel, Superfos Export Co., København, Danmark), 446 ml Sørensens stødpude 25 (Na^PC^ M/10 : 22%, ΚΗ2ΡΟ^ M/10 : 78%) og 1,8 ml af en opløsning af 1 mg thiomersal i 10 ml destilleret vand. pH-værdien indstilles til 6,3 med steril IN HC1. Blandingen omrøres i 48 timer ved stuetemperatur og i mørke og bliver derefter centrifugeret.

30

Sedimentet fra centrifugeringen isoleres og fortyndes med overliggende væske til at give et' endeligt rumfang på 446 ml. Produktet fordeles i glasflasker indeholdende doseringsenheder (dvs. 256 ED50) af afgiftet neurotoxin eller 35 multipla heraf.

Til vaccinationsformål administreres produktet ad den in-tramuskulære eller subkutane vej, idet rumfanget af en doseringsenhed er 2 ml.

DK 158033B

7

Eksempel 3.

Relationen mellem neurotoxinets inaktiveringsniveau og 5 antigeniciteten.

Ved at følge teknikken i eksempel 2, men anvende forskellige mængder glutaraldehyd og ved at lade reaktionen mellem neurotoxinet og glutaraldehydet finde sted i forskellig 10 lang tid, fremkom produkter med forskellige resterende neurotoxintitere, dvs. inaktiveringsniveauer, som blev afprøvet for deres beskyttelse på mus.

Ved denne prøve blev inaktiveringsniveauerne af forskellige 1 5 produkter bedømt ved toksicitetsprøve (lammelse og dødelighed som følge af lammelse) på mus efter den teknik, der er beskrevet af H. Schimmelpfennig i Fortschr. Vet.

Med. 13:49-50, 1970, og deres respektive beskyttelsesniveau i mus blev bedømt ved intravenøs administration af en 20 enhedsdosis på 0,45 ED5Q pr. mus efterfulgt 6 dage efter af en intravenøs smittende administration af 2,8 ED

O U

neurotoxin pr. mus.

Resultaterne er angivet i tabel I og viser, at beskyttelse 25 står i forbindelse med et toxininaktiveringsniveau mellem ca. 50% og ca. 90%.

30 35

DK 158033 B

8 to ιηιηιηιηιηιηιηιηιηιηιηιηιηιηηιη Η \\\\\\\\\\\\\\\\ Φ to ^'tf^mininminooonjoooo •ρ ε x >i X 0000300000000003

i£ ip OOOVDOOOO

tø (0 )—I)—Ir—fi—Ir-ii—I I—I

Φ

CQ

C σ' H C X H o u • 4-> φ

3 0 > OOOOOOOOTTr-ioOOOOOOOCOO

(Ο Ρ ·Η («> 03 03 03 03 03 03 03 03inf-c000 LO

Φ 3 -Ρ ααααλααα > Φ Ji •Η 2 (Ο c c c tn ·η Φ σ--->

C -P S

Η Φ P

P H Cu Φ Ό

^ t—i C *H

•H O <0 ΙΠ -p -- ρ x: c - p Λ X +M) ·Η 03 00 >1 (G — C .Q X ro «5f · -0 C o I o c

•Η P φ +J OH

• φ Js£ -Η (G

H C -P M -Ρ -P

•H -1-1 -Η (C C

ιΗ X 4J--p m Φ O -P 4J \

13 -P C Φ tø P

(O O Η ιΗ ·Η 5>i

E-* P X Ό CO

3 OC roHiotor-r-r-ro -h Φ 4JjJ(0C ΕΦ C O ΜΛ-Η νννννννν{Ν'Φιηιη*^^'^'ψ ΌΌ Ρ φ φ X N H (C φ

• 3 P X! O B

t n Φ i -P t n S

> 2 H Q (G

U C H

-P φ

Φ ·Η > rH

p (G cd

•H · —- — P JJ

O -P c Η Ό X! X! ΐ £ Λ Xi X! X! C «3 C Ή — -» » " -Η ---

φ H -OiHCMinOi-HcvtOOtHCNinOiHCM

cn moo η ro ro · .ρ •H 4J pc C Φ--Κ...... — Λ-—t.-j Λ C -Ρ E-t Ν ' ^ ' Ύ ^ Υ* ^---- Υ => Ο C Ο u) Ρ Ο ~ C Q Οι i*! Ο Cd Τ5 Η -Η >1 -Ρ ·Η . X! «3 2 2 '2 2 -Ρ

Φ Ρ 4J

X3+J cn ιο ro in j*: >, Η C in CN ή to >, p

Π3Φ ο ο ο ο P4J

PO *· - - - +JT3 (OC ο ο ο o ’ "0 3 -P 0 3 C -X —

H --- X

03 XX

--1- — w

DK 158033 B

9

Eksempel 4.

Immunreaktion hos smågrise.

Doseringsenheder af vaccinen fra eksempel 2 (256 ED50 i 2

O

ml) blev administreret, enten ad den subkutane eller den intramuskulære vej til tre grupper på syv dage gamle smågrise (kaldet grupper la, Ib og II), og en ny forstærkende indsprøjtning med samme doseringsenheder blev administreret 2 uger senere ad den subkutane vej til gruppe la og ad den intramuskulære vej til gruppe Ib og 1 uge senere ad den intramuskulære vej til gruppe II.

Når grisene var 5 uger gamle, fik de en smittende ind-, _ sprøjtning af rå neurotoxin administreret ad den intravenø- se vej, idet den smittende dosis var 2,2 EDg Q pr. kg legemsvægt for smågrisene i gruppe la og 1,1 ED5Q pr. kg legemsvægt for smågrisene i gruppe Ib og II.

2Q Kontrolgrupperne kaldet kontrolgruppe la og kontrolgruppe

Ib/II med 5 uger gamle smågrise fik ad intravenøs vej samme smittende dosis som gruppe la, henholdsvis gruppe Ib og II.

Alle smågrisene blev kontrolleret for nervøse symptomer 2 5 (ataxi, kramper, lammelse) og dødelighed i 1 uge. Blodprøver blev taget før og efter vaccination, og påvisning af anti-neurotoxin-antistoffer blev udført ved seroneutralisa- tionsprøve i Vero-celler (dvs. en cellelinie af simian oprin-30 delse, som- er følsom for toxinet). Til dette formål opvarmes sera til 56°C i 30 minutter, og dobbelte rækkefortyndinger i vævskulturvedligeholdelsesmedium inkuberes ved 37°c i i time i nærværelse af et lige så stort rumfang af et standardneuro-toxin med en forudbestemt fortynding, som frembringer en cyto-35 toksisk virkning i mindst 50% Vero-celler.

Duplikerede 0,2 ml prøver af toxin-serumblandingerne inkuberes på cellemonolag i 24 timer ved 37°C, og slutpunktet 10

DK 158033 B

for antitoxintitrering udtrykkes som den reciprokke værdi af den sidste fortynding af serum, som hæmmer den cytotoks-iske virkning af standardtoxinet.

5

Resultaterne for hver smagris og for hver gruppe er anført i følgende tabel II. Ingen skadelige reaktioner blev påvist efter vaccination.

10 15 20 25 30 35

DK 158033 B

11

Tabel II.

Immunogenicitet af afgiftet neurotoxin over for ødemsygdom hos smågrise.

Sraågris Efter smitte Anti-neurotoxin

Gruppe nr. nervøse antistof titer (x) symptomer Dødelighed før efter ______vaccination__ la 234 - 0 1 235 -+ 0 1 236 -- 0 2 237 ++ 0 0 238 -- 0 2 239 ++ 0 0 240 __=__-__0_2

Hele 2/7 3/7 Serokonversion: gruppen (28%) (43%) 4/7 (57%)

Kon- 230 + + 0 0 trol 231 + + 0 0 la 233 + + 0 0 227 + + 0 0 228 ++ 0 0 23 + + 0 0

Hele 6/6 6/6 Serokonversion: gruppen (100%) (100%) 0/6 (0%)

DK 158033 B

12

Ib 266 O 2 267 - - O 4 268 - - O 2 269 - - O 1

270 + - O O

271 - - O O

272 O O

Hele 1/7 0/7 Serokonversion: gruppen (14%) (0%) 4/7 (57%) II 283 + 0 0 284 0 8 285 - - 0 0 286 - - 0 0 287 0 0 288 0 0 289 0 0

Hele 0/7 1/7 Serokonversion: gruppen (0%) (14%) 1/7 (14%)

Kon- 273 + - 0 0 trol 290 + - 0 0

Ib/II 51 + + 0 0 52 + - 0 0 53 - - 0 0 54 + - 0 0 55 + - 0 0 56 + + 0 0 275 + - 0 0 276 + - 0 0 277 + - 0 0 278 0 0 280 0 0 281 + - 0 0

Hele 11/14 2/14 Serokonversion: gruppen (79%) (14%) 0/14 (0%) (x) Reciproke værdi af sidste aktive serumfortynding.

DK 158033 B

13

Tallene i tabel II viser, at i meget unge smågrise fås en udmærket immunreaktion med et vaccinationsskema omfattende to injektioner af 256 ED5Q med 2 ugers mellemrum.

Den opnåede beskyttelse var 57% imod en dødelig dosis i 5 100% af de smittede kontroldyr og 82% imod en dosis som i to grupper smittede dyr inducerer en dødelighed og en sygelighed på henholdsvis 14 og 79%.

Det fremgår også af tabel II, at beskyttelsen imod ødemsygdom står i nøje sammenhæng med serokonversionsgraden (57%), 10 som er betydeligt forskellig fra serokonversionsgraden af kontroldyrene, og at vaccinationsskemaet, der indebærer to injektioner med en uges mellemrum er mindre effektivt.

Eksempel 5.

Immunreaktion tilvejebragt med afgiftet neurotoxin_i 5-8 15 uger gamle smågrise.

Doseringsenheder og underenheder af vaccinepræparatet fra eksempel 2 blev administreret ad den subkutane vej til to grupper på 5-8 uger gamle smågrise med en forstærkende administration 3 uger senere og to andre grupper på 5-8 20 uger gamle smågrise blev behandlet på samme måde med neurotoxin adsorberet på alhydrogel under samme betingelser.

Anti-neurotoxinantistoftiterne efter vaccination blev bestemt ved seroneutralisation i Veroceller 14 dage efter den forstærkende administration.

25 Vaccinationsskemaet og de opnåede resultater er opsummeret i tabel III, som viser et godt serokonversionsniveau efter administration af det afgiftede neurotoxin.

DK 158033 B

14 Φ 03 Ή ·Η Ε. Ό bQ β •tO ίΒ i S > O W Eh φ 3 ti X <1)

Ej o β <i-i Ej O. <k • β ·Ρ Cd φ Φ O

O E (D b0 (D S Ej C P Cd ·Ρ P -P C C >> Μ ω Λ! X Ό Ej --------CO Ej ·Η 1 ID ID E > Ρ Ό Φ • c φ C k ·Η a ·> Φ ^

•Ρ φ rp X 'tf EO O φ β CO

X PI Cd O ED O i-I CO β Φ ·Ρ

O UP C P ·· φ Η P

p O •’i O ^ ·· ** co cd r-c cd O P O k k ·· Φ Ej cd D, k co υ 3 Φ 3> oo vo cm ρφεηΟ

3 ·Ρ Cd φ P ·· ·· Ή bO CO P

Φ P > C ·η 'tf o \ ·· cd · >j

G C I ! P ·· CO _ β <k β O

Cd Ρ -P CM 'tf P Cd -H

p c tn p ω x c Φ -P O C Ρ β O Φ p X Pc cd φ Ρ Ό

P O ——-- C P

•η P I cd φ ω Ej

σι O O Φ M P 13 ID

H-l k k k ·Ρ φ β cd 3 φ φ p > p φ φ CO P Φ -H ep to

T5 C k _ T3 Ρ -Ρ -P

φ | rP φ Ή Ί* IH n Jtf 60H

S ·η cd > - cd ep cd P P C Ej Cd Ej P C C O t» G p φ < c ^ Ό -Ρ P 3 k X φ φ . (1)-------------- Cp O Ό β

H C H cd P

h -p cd o Ej a

MQpP __ Ρ β Φ O

CJ C >1 CM in CM en ID 3 ri ID

r-i Cd < Ό lp Φ lp Φ > rp C Φ *· ja — ----——----cd i bo cd φ to p ·ρ p c H co έ '* β p φ ·ρ •Ρφ „ ^ cd β β Ό k .X „° ° cd-Ρβ COCO οιη ο ιο βχ>ι oed ιο Q Jp Q φβΟΡ g c Q id a to Q oi Men meupp· coo a k k a k k -pcqop η φ ε Eo φ ε φ ε ed φ ε > ·ρ β «η φ

ιμ ρ If οι 3 in 51 3 CP 3 m σ' 3 > jj gH

cd cd id 3 k cm 3 k ιο 3 k CM 3 k ΦΡ3Η c ε ε ε , j= βΦβΕ,Φ 3 -η x en Φ X en φ x en φ X ro φ β β ® id ο

ΟΦ η Ή Η '“j Ο β CO I

•Η ο Ν Ό Ρ CM ό Η Ν d Η ΙΊ Ό Η Η Ο Ό Ο 10 cd φφ ΦΦ ΦΦ φφ Ο Ρ D) ID Ε k > · ε ε · ε ε · ε ε · ε = χ ο a ρ φ Φ --------—-- X 10 > > C G (1) Ρ Ό 3 "Ρ Ρ X) φ Φ ·Ρ ·Ρ ο X ΡΧ Ε -Ρ Ε Β ^φ ο φ ο φ ε φ ρ OC Ρ ΡΡ Ί-3 φ β β Φ k-p ο HPO (ριρ.ρφβ Φ ο k -ρ k υ ό ·ρ C0 Ο 3 ββυχ

Cd 0) ΡΦ (D φ ΙΟ Ει ο

I >_ c- cdC PQ>cdP

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til afgiftning af E. coli neurotoxin med 5 giutaraldehyd, kendetegnet ved, at reaktionen udføres ved stuetemperatur af en varighed mellem 5 minutter og 1 time og ved en g 1 utara 1dehydkoncentrati on på 0,01M.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod ødemsyg-10 dom hos smågrise indeholdende et afgiftet E. coli neurotoxin, kendetegnet ved, at afgiftet E. coli neurotoxin fås ved en fremgangsmåde ifølge krav 1· 20 25 30 35