DK158534B - Homogen kompetitiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en proeve af uekstraheret serum eller plasma med et tbp-blokerende middel samt reagensmiddel til anvendelse ved metoden - Google Patents
Homogen kompetitiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en proeve af uekstraheret serum eller plasma med et tbp-blokerende middel samt reagensmiddel til anvendelse ved metoden Download PDFInfo
- Publication number
- DK158534B DK158534B DK488682A DK488682A DK158534B DK 158534 B DK158534 B DK 158534B DK 488682 A DK488682 A DK 488682A DK 488682 A DK488682 A DK 488682A DK 158534 B DK158534 B DK 158534B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- iodothyronine
- conjugate
- labeled
- tbp
- antibody
- Prior art date
Links
- VSWSDTLXDWESGZ-AWEZNQCLSA-N (2s)-3-[4-(4-hydroxyphenoxy)phenyl]-2-(iodoamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC(C[C@@H](C(=O)O)NI)=CC=C1OC1=CC=C(O)C=C1 VSWSDTLXDWESGZ-AWEZNQCLSA-N 0.000 title claims description 72
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 50
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 title claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 9
- IDKAXRLETRCXKS-UHFFFAOYSA-N fenclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl IDKAXRLETRCXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 53
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 38
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 34
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 16
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 7
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 7
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 claims description 7
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 claims description 7
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 7
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004964 sulfoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 229950006236 fenclofenac Drugs 0.000 description 60
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 44
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 36
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 102000009488 Thyroxine-Binding Proteins Human genes 0.000 description 35
- 108010048889 Thyroxine-Binding Proteins Proteins 0.000 description 35
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 27
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 6
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- -1 imino compound Chemical group 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LQGKDMHENBFVRC-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentan-1-ol Chemical compound NCCCCCO LQGKDMHENBFVRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 102000006966 enzyme regulator activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040000578 enzyme regulator activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical class OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- URWRWKCHRRPXBQ-UHFFFAOYSA-M sodium;3,4-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonate Chemical compound [Na+].OC1=C(Cl)C(Cl)=CC=C1S([O-])(=O)=O URWRWKCHRRPXBQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YIFOZCDHLHUIJV-WUJWULDRSA-N (2s)-2,3-dichloro-2-(dichloroamino)-3-[4-(4-hydroxyphenoxy)phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(C(Cl)[C@@](Cl)(C(=O)O)N(Cl)Cl)=CC=C1OC1=CC=C(O)C=C1 YIFOZCDHLHUIJV-WUJWULDRSA-N 0.000 description 1
- YYNPMMANXKYXCN-LBPRGKRZSA-N (2s)-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-2-[(2,2,2-trifluoroacetyl)amino]propanoic acid Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)C(F)(F)F)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 YYNPMMANXKYXCN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDMFXJULNGEPOI-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroaniline Chemical compound NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl JDMFXJULNGEPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJNZAXGUTKBIHP-UHFFFAOYSA-N 2-iodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I CJNZAXGUTKBIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMZNXRYIFGTWPF-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoacetic acid Chemical compound OC(=O)CN=O RMZNXRYIFGTWPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOUSMGITTRHFHS-UHFFFAOYSA-N 3,4-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=CC=C1S(O)(=O)=O BOUSMGITTRHFHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000008458 Glucose Oxidase Reagent Methods 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 125000003963 dichloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- KPHWPUGNDIVLNH-UHFFFAOYSA-M diclofenac sodium Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KPHWPUGNDIVLNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 229950008325 levothyroxine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229960005222 phenazone Drugs 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 238000009601 thyroid function test Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/826—Additives, e.g. buffers, diluents, preservatives
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
DK 158534B
Den foreliggende opfindelse angår en homogen kompe-titiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en prøve af uekstraheret serum eller plasma, ved hvilken der dannes en reaktionsblanding ved kombination 5 af prøven med reagenser indeholdende et antistof for iodo-thyroninen, et mærket iodothyronin-konjugat og et TBP (thyroxin-bindende protein)-blokerende middel, og ved hvilken et spektrofotometrisk respons, fortrinsvis en fluorescensemission eller en absorbansændring forårsaget af en analyselo reaktion, frembringes i reaktionsblandingen ved en bølgelængde større end 300 nm, der er relateret til koncentrationen af iodothyroninen i prøven.
Opfindelsen angår også et reagensmiddel til anvendelse ved den omhandlede bestemmelse samt anvendelsen af bestemte 15 TBP-blokerende midler ved analysemetoden.
Iodothyroninerne har den almene formel:
hoocchch2—^2^10 H
DK 158534 B
2 risk som thyroxin-bindende protein (TBP) . Til måling af koncentrationen af den totale mængde af et iodothyronin i en blodprøve, f.eks. serum eller plasma, skal de TBP-bundne former være dissocieret i en analytisk signifikant grad, og 5 den resulterende totale frie iodothyronin bestemmes. Dissociationen af iodothyroniner fra TBP, især TBG, blev oprindelig udført ved en ekstraktionsproces, jfr. US-patentskrift nr. 3.414.383. Ved den i øjeblikket tilgængelige teknik kan iodothyroniner bestemmes ved immunoanalyse i uekstraherede 10 prøver ved anvendelse af forbindelser, der empirisk har vist sig at blokere og bevirke dissociation af TBP-bindingen. Ved gængse kompetitive bindings-iodothyronin-immunoanalyser kombineres en forsøgsprøve med reagenser, der omfatter et antistof til den iodothyronin, der skal bestemmes, en mærket 15 form, f.eks. radioaktivt mærket, af sådan iodothyronin samt ét eller flere THP-blokerende midler. Iodothyroninen i prøven kompleksbundet til TBP dissocieres derfra og konkurrerer med mærket iodothyronin om binding til antistoffet. Den mængde af mærket iodothyronin, der bliver antistof-bundet, sammen-20 lignet med den mængde, der forbliver ubundet til antistof, afhænger af den totale koncentration af iodothyroninen i prøven og kan måles på en række forskellige måder, afhængigt af den bestemte immunoanalyseteknik, som anvendes.
Forskellige forbindelser er blevet fundet at være 25 nyttige TBP-blokerende midler, herunder tetrachlorthyronin (Mitsuma et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33., 365 (1971)), diphenylhydantoin (Lieblich og Utiger, J. Clin. Invest., 50, 60a (1971)), salicylat (Larsen, Metab., 20.
976 (1971)) og de forskellige materialer, der er beskrevet 30 af Holander (US patentskrift nr. 3.928.553) og Chopra (US patentskrift nr. 3.911.096), især 8-anilino-l-naphthalensul-fonsyre (ANS). Strukturerne for og de generelle egenskaber af de kendte TBP-blokerende midler varierer over et yderst bredt område. De egenskaber, der er kritiske med hensyn til 35 operabiliteten som et TBP-blokerende middel ved immunoana-lyser, dvs. evnen til i tilstrækkelig grad at bevirke dis-
DK 158534B
3 sociation af iodthyroniner fra TBP ved koncentrationsniveauer, der er utilstrækkelige til at forårsage signifikant inhibering af antistof-bindingsreaktionen, betragtes generelt som uforudsigelige på basis af rent strukturelle sammenlig-5 ninger, omend nogle teorier vedrørende TBG-blokering er blevet fremsat (Brown og Metheany, J. Pharm. Sci., 63, 1214 (1974)) .
Fenclofenac (2-(2,4-dichlorphenoxy)-phenyleddikesyre) er en diphenylether, der har antirheumatisk aktivitet, og 10 som er blevet rapporteret at interferere med thyroidfunk-tionstests (Lancet, i, 267 (Feb. 2, 1980), Lancet l, 432 (Feb. 23, 1980), Lancet, 1, 487 (Mar. 1, 1980), Capper et al., Clin. Chim. Acta, 112. 77 (1981og Kurtz et al., Clin. Endocrinol., 15, 117 (1981). Efterfølgende forskere har rejst 15 spørgsmålet om, hvorvidt fenclof enac ville være egnet som et TBG-blokerende middel ved thyroidfunktion-radioimmunoanalyser (Ratcliffe et al., Clin. Endocrinol., 13, 569 (1980)). Capper et al., jfr. ovenfor, har også studeret virkningen af diclofenac (2-(2,6-dichlorphenylamino)-phenyleddikesyre).
20 I EP offentliggørelsesskrift nr. 51.213 er der be skrevet et testmateriale til udførelse af homogene immunoana-lyser. Materialet omfatter en bærermatrix, hvor der er inkorporeret antistof og mærket konjugat, hvilket udgør et homogent immunoanalysesystem. Der kan udføres iodthyronin-im-25 munoanalyser med et sådant materiale, men da der ikke benyttes noget TBP-blokerende middel, kan de fordelagtige resultater, der opnås ifølge den foreliggende opfindelse, og som fremgår nærmere af det følgende, ikke opnås med det kendte testmateriale.
30 I GB patentskrift nr. 1.308.327 er fremstillingen af bl.a. fenclofenac og beslægtede derivater samt disses anvendelse som lægemidler beskrevet.
I US patentskrift nr. 3.911.096 beskrives anvendelsen af en række forskellige forbindelser som TBP-blokerende 35 midler ved immunoanalyser til måling af mængden af iodothy-roniner i blodprøver, jfr. den allerede ovenfor givne omtale
DK 158534 B
4 af bl.a. dette patentskrift; ifølge patentskriftet anvendes der ikke noget mærket iodothyronin-konjugat.
I US patentskrift nr. 4.406.870 beskrives udførelsen af en immunobestemmelse af iodothyroniner, ved hvilken én 5 måling udføres på en prøve, hvortil der er sat et TBP-bloke-rende middel, og en anden måling udføres på en prøve uden tilsat blokerende middel.
I Clin. Chim. Acta, 112. 77-83 (1981) (Capper et al.), jfr. ovenfor, er det angivet, at fenclofenac og beslægtede 10 forbindelser inhiberer bindingen af thyroxin til serumproteiner.
Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at visse phe-nyleddikesyrer og dermed beslægtede forbindelser og salte deraf er særligt fordelagtige TBP-blokerende midler til an-15 vendelse ved iodothyronin-immunoanalyser af den allerede angivne art.
Bindings-immunoanalysemetoden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved, at der som det TBP-blokerende middel anvendes en forbindelse med den almene formel 20 Zx-Y-Z2 i hvilken Y betyder O, NH, S, CH2 eller C=0, og og Z2 betyder phenylgrupper, af hvilke mindst én er substitueret med én eller flere substituenter udvalgt blandt halogen, lavere alkyl og lavere alkoxy, idet Z2 er substitueret med 25 en carboxyalkyl eller en sulfoalkylgruppe, eller et salt deraf.
Blokeringsmiddelforbindelsen indføres i immunoanaly-se-reaktionsblandingen ved en koncentration, der er tilstrækkelig til frigivelse og blokering af bindingen af en analy-30 tisk signifikant procentdel af TBP-kompleksbundet iodothyronin, fortrinsvis mere end 50% og sædvanligvis mere end 70%, men utilstrækkelig til at interferere signifikant med bin-dinten af antistof med iodothyronin. skønt de nøjagtige koncentrationer af blokeringsmidlet, der ønskes til en be-35 stemt iodothyronin-immunoanalyse, vil variere alt efter den iodothyronin, der bestemmes, og den anvendte immunoanalyse-
DK 158534B
5 teknik, samt efter andre faktorer, anvendes forbindelsen normalt i koncentrationer i reaktionsblandingen på mellem ca. 0,1 millimolær (mM) og ca. 5 mM, især når den involverede iodothyronin er thyroxin. Blokeringsmidlerne, der anvendes 5 ifølge opfindelsen, sættes til analysereaktionsblandingen i form af syren eller en analytisk acceptabel saltform deraf, f.eks. natrium-, kalium-, lithium- eller ammoniumsalte.
Visse uventede egenskaber ved de her omhandlede blokeringsmidler, især fenclofenac, bevirker, at disse forbin-10 delser er særlig fordelagtige til anvendelse som TBP-bloke-rende midler ved homogene kompetitive bindingsimmunoanalyser, hvor et spektrofotometrisk respons, f.eks. en fluorescensemission eller lysabsorption, frembringes i analysereaktionsblandingen ved en bølgelængde større end ca. 300 nanometer 15 (nm) og sædvanligvis mindre end 700 nm, hvilket respons er en funktion af koncentrationen af iodothyroninen i forsøgsprøven. De omhandlede blokeringsmidler har vist sig at have praktisk taget ingen absorption ved bølgelængder større end 300 nm. Når således det spektrofotometriske respons er en 20 fluorescensemission eller initieres, omend ikke endeligt udtrykkes, som en fluorescensemmission, iagttages der ingen undertrykkelse af en sådan emission, når der anvendes de omhandlede forbindelser som det TBP-blokerende middel, medens der ved anvendelse af midler ifølge den kendte teknik, især 25 ANS, kan forekomme signifikant undertrykkelse, der resulterer i uønskelige eller uacceptable analyseresultatkarakteristika, f.eks. nedsat sensitivitet, reproducerbarhed og/eller nøjagtighed.
Ydermere vil specielt fenclofenac ikke udvise nogen 30 væsentlig inhiberende virkning på den katalytiske aktivitet af mange enzymer ved koncentrationer, i hvilke forbindelsen er et effektivt TBP-blokerende middel. Forbindelsen er således yderligere fordelagtig som et TBP-blokerende middel ved homogene kompetitive bindingsimmunoanalyser, hvor den 35 anvendte mærkning er en deltager i en enzymatisk reaktion, f.eks. et enzymsubstrat, en enzyminhibitor, en prosthetisk
DK 158534B
6 gruppe af et enzym, et coenzym eller et enzym i sig selv, eller et fragment deraf. Til den kendte teknik hørende TBP-blokerende midler, især ANS, kan bevirke signifikant inhi-bering af enzymreaktioner, hvilket igen resulterer i for-. 5 mindsket analyseeffektivitet.
De her omhandlede phenyleddikesyrer og dermed beslægtede forbindelser og salte deraf finder således en ny anvendelse som TBP-blokerende midler ved homogene kompetitive bindingsimmunoanalyser i almindelighed, og forbindelserne er 10 særligt fordelagtige, når de anvendes ved spektrofotometriske homogene immunoanalyser, især de, i tilfælde af fenclofenac, hvor den anvendte mærkning er en deltager i en enzym-katalyseret reaktion. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der også reagensmidler til udøvelse af de omhandlede, nye 15 immunoanalyser, især i form af testsæt, således som disse almindeligt anvendes i kliniske laboratorier. Det her omhandlede reagensmiddel er af den i krav 7's indledning angivne art, og det er ejendommeligt ved det, der er angivet i dette kravs kendetegnende del.
20 Som TBP-blokerende middel anvendes der ifølge opfin delsen fortrinsvis en forbindelse med formlen
Cl
V CHjCOOH
i hvilken Y er 0 eller NH, og én af substituenterne R1 og R2 er chlor, og den anden er hydrogen, eller et salt deraf, idet 30 disse forbindelser har vist sig at have uventet fordelagtige egenskaber som TBP-blokerende midler. Fenclofenac (Y = 0 og R1 = Cl) har vist sig at være særlig fordelagtig i denne sammenhæng ved homogene iodothyronin-immunoanalyser. En anden forbindelse af interesse er diclofenac (Y = NH og R2 = Cl).
35 Det vil imidlertid være åbenbart for enhver med almindeligt kendskab til den teknik, der her er tale om, at der kan fore-
DK 158534B
7 tages forskellige modifikationer ved den grundlæggende diphe-nyl-struktur i den angivne formel, uden at der derved gås uden for opfindelsens rammer. Analoge, der besidder de her omhandlede fordelagtige TBP-blokeringsmiddel-egenskaber, 5 skal betragtes som ækvivalenter med hensyn til nærværende opfindelses beskyttelsesområde. Som et ikke-begrænsénde eksempel kan det nævnes, at oxygen- eller iminoforbindelses--funktionen kan erstattes med et egnet analogt led, herunder sådanne forbindelsesled som f.eks. thio, methylen og keto.
10 Endvidere kan dichlor-substituenterne erstattes med enkelte eller multiple substituenter på hver af phenylringene, idet sådanne substituenter f.eks. kan udvælges blandt halogen, især chlor, brom og iod, alkyl, sædvanligvis lavere alkyl (Ci_4), f.eks. methyl og ethyl, og alkoxy, sædvanligvis 15 lavere alkoxy, f.eks. methoxy og ethoxy. Acetat-substituenten kan også være repræsentativ for en række syregrupper, f.eks. carboxylsyrer og sulfonsyrer og deres alkylhomologe, især de lavere alkansyre-homologe, og sådanne grupper kan være bundet til en phenylring i enten meta- eller para-stilling udover 20 ortho-stillingen i den viste formel, se også US patentskrift nr. 3.766.263.
Den foreliggende opfindelse kan anvendes i forbindelse med homogene kompetitive iodothyronin-immunoanalyser i almindelighed. En immunoanalyse skal i den givne sammenhæng betyde 25 enhver analyse baseret på antigen-antistof-interaktioner, og antistof skal forstås som helt, konventionelt antistof eller monoklont antistof, f.eks. af typerne IgG, IgM eller IgA, eller et effektivt fragment deraf, f.eks. Fab, F(ab') etc. fragmenter af IgG. Den type immunoanalyse, ved hvilken opfin-30 delsen anvendes, er som nævnt den kompetitive bindings-im-munoanalyse. Ved en sådan immunoanalyse til bestemmelse af en iodothyronin kombineres en forsøgsprøve af uekstraheret serum eller plasma med et antistof til den iodothyronin, der bestemmes, en mærket form af iodothyronin samt et blokerings-35 middel for TBP-binding. Den andel af mærket iodothyronin, der bliver bundet til antistoffet i konkurrence med ethvert
DK 158534 B
8 iodothyronin i prøven, sammenlignet med den andel, der forbliver ubundet, står i relation til koncentrationen af io-dothyroninen i prøven.
Ved homogene immunoanalyser ifølge den foreliggende 5 opfindelse udtrykker den antistof-bundne form af den mærkede iodothyronin en egenskab, der er forskellig fra den ubundne form, og det adskillelsestrin, der kræves ved heterogene analyser, kan således undgås. Der kendes i teknikken et bredt udvalg af homogene immunoanalyse-metoder. Især foretrækkes 10 de metoder, hvor den mærkning, der konjugeres kemisk med iodothyroninen, er et enzym eller et enzymfragment, f.eks. en prosthetisk gruppe, eller er en deltager i en enzym-katalyseret reaktion, f.eks. et substrat, et coenzym, en inhibitor eller en aktivator.
15 Den foreliggende opfindelse er især anvendelig i for bindelse med homogene kompetitive bindings-immunoanalyser, hvor et spektrofotometrisk respons frembringes i analysereaktionsblandingen ved en bølgelængde større end ca. 300 nm og sædvanligvis mindre end 700 nm, hvilket respons er in-20 dikativt for iodothyronin-koncentrationen i forsøgsprøven.
De omhandlede blokerende midler har vist sig at have praktisk taget ingen absorption ved sådanne bølgelængder. Ved spektrofotometrisk respons menes der et optisk detekterbart signal, der almindeligvis måles ved en udvalgt bølgelængde 25 eller -længder. Eksempler på sådanne signaler er lysemissioner, f.eks. kemoluminiscens, herunder bioluminiscens, og fluorescens, samt lysabsorptioner eller -reflektioner, f.eks. farveændringer eller -dannelser, og målelige absor-bans- eller reflektansændringer i det synlige spektrum. I 30 det følgende angives der eksempler på sådanne analysetyper: 1. Fluorescens-undertrykkelse eller -forøgelse
Det mærkede konjugat i dette system er i dets mærkningsdel sammensat af et fluorescerende stof, hvis fluor-35 escens undertrykkes eller forøges i nogen målelig grad, når det mærkede iodothyronin-konjugat bindes af antistof. Den
DK 158534B
9 fluorescerende mærkning måles almindeligvis direkte, idet dens fluorescens er det detekterbare signalt. Analysesystemer af denne type er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.160.016 og nr. 3.940.475, i GB patentskrift nr. 1.583.869 5 og i J. Clin. Path, 30/ 526 (1973).
2. Fluorescens-polarisation Mærkningen i dette system er også et fluorescerende stof, men det påvirkede karakteristikum er imidlertid pola-10 risation af fluorescens på grund af binding af det mærkede konjugat med antistof. Analysesystemer af denne type er beskrevet i J. Exp. Med., 122. 1029 (1975).
3. Enzvmsubstrat-mærkninasteknik 15 I dette system er mærkningen valgt således, at det mærkede konjugat er et substrat for et enzym, og at enzymets evne til at virke på det substrat-mærkede konjugat påvirkes, enten i en positiv eller negativ forstand, ved binding af det mærkede konjugat med antistof. Indvirkning af enzymet 20 på det substrat-mærkede konjugat frembringer et produkt, der kan skelnes ved hjælp af et eller andet træk, sædvanligvis en kemisk eller fysisk egenskab, f.eks. kemisk reaktivitet ved en indikatorreaktion eller f.eks. en fotometrisk egenskab såsom fluorescens eller lysabsorption (farve).
25 Analysesystemer af denne type er beskrevet på almen måde i GB patentskrift nr. 1.552.607, samt i Anal. Chem., 48, 1933 (1976), Anal. Biochem., 77, 55 (1977) og i Clin, Chem., 2Ά, 1402 (1977). Ved sådanne metoder under anvendelse af enzym-substrat-mærkninger vil det mærkede konjugat, f.eks. et 30 substrat-analyt-konjugat, have den egenskab, at der kan indvirkes på det med et enzym ved spaltning eller modifikation til dannelse af et produkt, der har en detekterbar egenskab, som bevirker, at det kan skelnes fra konjugatet. Eksempelvis kan konjugatet være ikke-fluorescerende under 35 analysebetingelser, men der kan dannes et fluorescerende produkt ved reaktion med enzym.
DK 158534 B
10
Forskellige fluorogene substrat-mærkede konjugater ligger lige for til anvendelse ved sådanne metoder. Eksempelvis kan det mærkede konjugat have formlen G-D-R-L, 5 hvor G er en spaltelig gruppe såsom phosphat, carboxylat eller glycon, D er en fluorogen farvestof del, der efter fjernelse af G giver et fluorescerende produkt, og D kan f.eks. være tambel lif er on, fluorescein, rhodamin eller derivater deraf, R er en forbindende gruppe, og L er bindings-10 komponenten, sædvanligvis analytten, f.eks. en iodothyronin, eller et derivat deraf. Enzymatisk spaltning, f.eks. med phosphatase, carboxylase eller glycosidase, af det mærkede konjugat påvirkes ved binding, f.eks. med antistof, til L--delen af konjugatet, jfr. US patentskrift nr. 4.279.992.
15 Ved en særlig foretrukken substrat-mærknings-analysemetode anvendes der et mærket konjugat af typen:
CH20H
"tox 1 hvilken R er en forbindende gruppe, og L er bindingskom-25 ponenten, f.eks. analyten eller en dermed analog, hvorved enzymet /9-galactosidase' s evne til at spalte konjugatet til dannelse af et produkt, der er skelneligt ved dets fluorescens, inhiberes ved binding af konjugatet med antistof.
Andre nyttige substrat-mærkede konjugater er kon-30 jugaterne med formlen
D-R-L
hvor R er en enzym-spaltelig forbindende gruppe, f.eks. phosphat, carboxylat eller lignende, L er bindingskomponenten som ovenfor, og D er en fluorogen farvestofdel som ovenfor, 35 der ved spaltning af R frigører en fluorescerende indikator.
DK 158534B
11
Ved .en særlig foretrukken teknik anvendes der et mærket konjugat af typen: hvor R1 er en binding eller kæde, der forbinder den mærkede 10 komponent L til den spaltelige phosphatgruppe, og R2 er hydrogen eller en substituentgruppe såsom lavere alkyl, f.eks. methyl eller ethyl, N-alkylamido eller N-(hydroxy--substitueret lavere alkyl)-amido, f.eks. -C0NR-f-CH2— hvor n = 2-6, jfr. US patentskrift nr. 4.273.715. Umbel-15 liferon-resten kan bære andre eller yderligere substituenter, se Anal. Chem., 40, 803 (1968). Spaltning med phosphodiesterase påvirkes ved binding af antistof til L-delen af kon-jugatet.
20 4. Energioverførsel I dette system er mærkningen den ene del af et ener-gioverførings-donor-acceptor-par, og antistoffet konjugeres med den anden del af dette par. Når det mærkede konjugat således bindes med antistof, ændres energiudtrykket for 25 donorkomponenten i parret ved overføring til acceptorkom-ponenten. Sædvanligvis er donoren et fluorescerende stof, og acceptoren er et undertrykkende middel derfor, hvilket middel samtidig eventuelt også kan være et fluorescerende stof. I en sådan udførelsesform er det detekterbare signal 30 fluorescens, men andre detekteringssystemer er også mulige. Sådanne analysesystemer er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.996.345, nr. 4.174.384 og nr. 4.199.559 samt i GB patentskrift nr. 2.018.424.
DK 158534B
12 5. Kemisk exciteret fluorescens I dette system er mærkningen atter et fluorescerende stof, men evnen for den fluorescerende mærkning til at blive kemisk exciteret til en energitilstand, ved hvilken den 5 fluorescerer, påvirkes ved binding af det mærkede konjugat med antistof. Kemisk excitation af mærkningen opnås almindeligvis ved udsættelse af den fluorescerende mærkning for en in situ dannet forbindelse med høj energi. Analysesystemer af denne type er beskrevet i US patentskrift nr. 4.238.195.
10 6. Sterisk hindring med dobbelt antistof
Et andet analysesystem er det dobbelt antistof-im-munoanalysesystem, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.935.074 og nr. 3.998.943. Det mærkede konjugat omfatter 15 to epitoper, af hvilke den ene deltager i den immunologiske reaktion med liganden og anti-ligand antistof, og af hvilke den anden kan bindes med et andet antistof, men med den restriktion, at de to antistoffer er hindrede i samtidig binding til det mærkede konjugat. Den anden epitop kan være 20 et fluorescerende stof, hvis fluorescens undertrykkes af den anden antistof-binding, eller den kan deltage i en støttende kompetitiv bindingsreaktion med en mærket form af den anden epitop til binding til det andet antistof. Forskellige detekteringssystemer er mulige i et sådant system som be-25 skrevet i de ovennævnte patentskrifter. Beslægtede analysesystemer er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.130.462 og nr. 4.161.515 samt i GB patentskrift nr. 1.560.852. 1
Anvendelse af mærkning med prosthetisk gruppe 30 I dette system er mærkningen en prosthetisk gruppe af et enzym, og evnen for et katalytisk inaktivt apoenzym til kombination med den prosthetiske gruppe-mærkning til dannelse af et aktivt enzym (holoenzym) påvirkes ved binding af det mærkede konjugat med antistof. Resulterende holoen-35 zymaktivitet kan måles med konventionelle detekteringssystemer til opnåelse af et endeligt detekterbart signal.
DK 158534B
13
Analysesystemer af denne type er beskrevet i US patentskrift nr. 4.238.565. Ved en særlig foretrukken prosthetisk grup-pe-mærknings-analysemetode anvendes der flavin-adenin-dinu-cleotid (FAD) som mærkning og apoglucoseoxidase som apoen-5 zymet. Resulterende glucoseoxidase-aktivitet kan måles ved hjælp af et kolorimetrisk detekteringssystem indeholdende glucose, peroxidase og et indikatorsystem, der frembringer en farveændring som respons på hydrogenper oxid. Fluorometrisk detektering af hydrogenperoxid er også mulig under anvendelse 10 af et egnet fluorogent substrat.
8. Anvendelse af coenzvm-mærkninq
Det mærkede konjugat i dette system er i dets mærkningsdel sammensat af en coenzym-aktiv funktionalitet, og 15 evnen for en sådan coenzym-mærkning til at deltage i en enzymatisk reaktion påvirkes ved binding af det mærkede konjugat med antistof. Hastigheden af den resulterende enzymatiske reaktion kan måles med konventionelle detekteringssystemer til opnåelse af et endeligt detekterbart signal.
20 Analysesystemer af denne type er beskrevet i GB patentskrift nr. 1.552.607, og i Anal. Biochem., 12, 271 (1976), i Anal. Biochem., 22, 283 (1976) og i Anal. Biochem., 7j5, 95 (1976).
9. Anvendelse af enzym-modulator-mærkning 25 Det mærkede konjugat i dette system er i dets mærk ningsdel sammensat af en enzym-modulerende funktionalitet såsom en enzyminhibitor eller -stimulator, og evnen for en sådan modulator-mærkning til modulering af aktiviteten af et enzym påvirkes af bindingen af det mærkede konjugat med 30 antistof. Hastigheden for den resulterende enzymatiske reaktion kan måles med konventionelle detekteringssystemer til opnåelse af et endeligt detekterbart signal. Analysesystemer af denne type er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.134.792 og nr. 4.273.866. Særlig foretrukken er anvendelsen 35 af methotrexat som mærkning med dihydrofolat-reduktase som det modulerede enzym.
DK 158534 B
14 10. Anvendelse af enzvm-mærkninq I dette system er mærkningen et enzym, og aktiviteten af enzym-mærkningen pÅvirkes ved binding af det mærkede 5 konjugat med antistof. Resulterende enzymaktivitet kan måles med konventionelle detekteringssystemer til opnåelse af et endeligt detekterbart signal, f.eks. absorption eller fluorescens. Analysesystemer af denne type er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.817.837 og nr. 4.043.872.
10 Andre homogene kompetitive bindings-immunoanalyseme- toder kan anvendes, uden at der derved gås uden for nærværende opfindelses rammer.
Eftersom især fenclofenac også vil have en uvæsentlig inhiberende virkning på den katalytiske aktivitet af mange 15 enzymer ved koncentrationer, i hvilke forbindelsen er effektiv som et TBP-blokerende middel, er den foreliggende opfindelse yderligere fordelagtig ved homogene immunoanalyser involverende enzymatiske reaktioner. Sådanne analyser omfatter de ovenfor beskrevne anvendelser af enzymsubstrat-mærk-20 ning, prosthetisk gruppe-mærkning, coenzym-mærkning, enzym-modulator-mærkning og enzym-mærkning. Med uvæsentlig inhiberende virkning på enzymatisk aktivitet menes der, at hastigheden for katalyse ikke nedsættes mere end ca. 70%, sædvanligvis mindre end 50% og fortrinsvis mindre end 30%.
25 Den biologiske væske, der skal testes, kan være en vilkårlig væske, i hvilken den eller de iodothyroniner, der er af interesse, uønsket kan associeres med bindingsproteiner. Ifølge opfindelsen er den biologiske væske uekstraheret serum eller plasma.
30 Reagensmidlerne ifølge den foreliggende opfindelse om fatter alle de essentielle kemiske bestanddele, der kræves til udførelse af en ønsket iodothyronin-immunoanalysemeto-de som omfattet af opfindelsen. Reagensmidlerne er til stede i en kommercielt pakket fonn som en komposition eller en 35 blanding, såfremt reagensernes kompatibilitet tillader det, i en testmaterialekonfiguration eller i form af et testsæt,
DK 158534B
15 dvs. en pakket kombination af én eller flere beholdere, der indeholder de fornødne reagenser. Inkluderet i reagensmidlerne er de reagenser, der er egnede til det ønskede bindingsreaktionssystem, og som omfatter en af de her omhandlede 5 forbindelser, f.eks. fenclofenac, som et TBP-blokerende middel. Sådanne bindingsreaktions-reagenser omfatter almindeligvis ud over det blokerende middel et mærket iodothyronin--konjugat, antistof til den iodothyronin, der skal bestemmes, og eventuelt andre TBP-blokerende midler, såfremt dette 10 ønskes. Reagensmidlerne kan naturligvis omfatte andre materialer, der er kendte i teknikken, og som kan være ønskelige set fra et kommercielt eller fra et anvendelsesmæssigt synspunkt, f.eks. puffere, fortyndingsmidler eller standarder.
Især foretrækkes et testsæt til den homogene kompetitive bin-15 dings-immunoanalyse ifølge opfindelsen indeholdende (a) et antistof til den iodothyronin, der skal bestemmes, (b) et mærket iodothyronin-konjugat, der har en detekterbar egenskab, som ændres ved binding med antistoffet, og (c) en forbindelse ifølge opfindelsen som et TBP-blokerende middel.
20 Den specifikke mærkning, der anvendes, vil afhænge af den teknik, der benyttes, jfr. ovenfor. Der foretrækkes også et testmateriale indeholdende en reagenskomposition indeholdende et iodothyronin-antistof, et mærket iodothyronin-konjugat, der har en detekterbar egenskab, som ændres ved binding med 25 antistoffet, og en forbindelse ifølge opfindelsen som et TBP-blokerende middel, samt et fast bæremateriale, der er inkorporeret i reagenskompositionen. De forskellige former for et sådant testmateriale er beskrevet i den europæiske patentansøgning, der er publiceret under nr. 51213, hvortil 30 der henvises.
Opfindelsen skal illustreres nærmere i de følgende eksempler, der ikke skal opfattes som begrænsende.
DK 158534B
16
Eksempler
Eksempel 1
Dissociation af thvroxin fra humant serum med fenclo- fenac oct diclofenac 5 En mængde på oa. 3 ml humant serum får lov at ækvi- librere med radioaktivt mærket thyroxin (125I-thyroxin fra Amersham-Searle, Arlington Heights, Illinois, USA) i ca. 8 timer.
Derpå kombineres 100 microliter (μΐ) aliquoter af 10 dette serum med 300 pi aliquoter af 0,1 M natriumphosphat-puffer, pH = 6,5, indeholdende forskellige koncentrationer af fenclofenac (GB patentskrift nr. 1.308.327, eksempel 6). Derefter sættes 180 μΐ aliquoter af hver af disse blandinger til 2 ml kolonner af Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemi-15 cals, Piscataway, New Jersey, USA) ækvilibreret med 0,1 M natriumphosphatpuffer med pH = 6,5. Radioaktiviteten på kolonnerne måles, og kolonnerne vaskes med 5 ml af pufferen. Radioaktiviteten af hver kolonne måles igen, og resultaterne, der er vist i tabel I, anvendes som mål for thyroxin, der er 20 dissocieret fra serumproteiner.
Tabel I
Fenclofenac Procent thyroxin 25 (mM) dissocieret 0 19 0,25 50 0,50 72 30 1,0 79 2.0 98 5.0 100 17 DK 1585348
Der udføres et andet forsøg til sammenligning af dissociationsegenskaberne for fenclofenac og diclofenac.
Med radioaktivt iod mærket thyroxin (125I-thyroxin fra Amers-ham-Searle, Arlington Heights, II, tJSA) ækvilibreres med 5 5 ml normalt humant serum i 48 timer ved 4°C. Aliguoter af dette serum sættes til 300 μΐ af 0,1 M natriumphosphat, pH = 7,0, indeholdende forskellige koncentrationer af fenclofenac eller diclofenac (se eksempel 11) til opnåelse af de slutkoncentrationer, der er angivet i tabel IA. Efter 5 10 minutters inkubation ved stuetemperatur sættes en 165 μΐ aliquot til en Sephadex®-kolonne fra et Seralute®-thyroxin--analyse-sæt (Miles Laboratories, Inc., Ames Division, Elkhart, IN, USA), der er blevet ækvilibreret med 0,1 M natriumphosphat, pH = 7,0. Den totale radioaktivitet, der til-15 føres kolonnerne, måles, og det udissocierede materiale vaskes gennem kolonnen med 3 ml puffer. Der foretages tællinger i kolonnerne til bestemmelse af den procentdel af thyroxin, der er dissocieret fra serumproteinerne.
20 Tabel IA
Koncentration af Procent dissocieret Procent dissocieret dissocierings- (Fenclofenac) (Diclofenac) middel (mM) 25 0 9 9 0,25 40 48 0,50 61 61 1.00 71 73 2.00 75 77 30 4,00 79 80 8.00 81 82 0,25 mM fenclofenac i en iodothyronin-immunoanalysere-aktionsblanding kan således forventes at frigøre og blokere 35 bindingen af ca. 40-50% af den protein-bundne iodothyronin, og 0,50 mM kan forventes at blokere ca. 60-70%. Det andet
DK 158534 B
18 forsøg viser, at begge dissocieringsmidler er lige effektive til dissociering af iodothyronin fra serumproteiner ved en immunoanalysereaktion.
5 Eksempel 2
Virkning af fenclofenac på bindingen af thvroxin med antistof
En række antistof-bindingsreaktioner bringes til udførelse i 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH = 6,5, til opnåelse 10 af slutrumfang på 0,6 ml indeholdende forskellige koncentrationer af fenclofenac. Hver reaktionsblanding indeholder 125I-thyroxin, 20 μΐ normalt kanin-immunoglobulin og 2 μΐ antistof til thyroxin. Blandingerne inkuberes ved stuetemperatur i ca. 3 timer, hvorpå der tilsættes 400 μΐ 50%'s 15 (vægt/rumfang) polyethylenglycol. De fældede proteiner opsamles ved centrifugering, og radioaktiviteten i hver fældning måles. Resultaterne fremgår af tabel II som procent af radioaktiviteten i fældningen uden fenclofenac.
20 Tabel II
Fenclofenac Procent 125I-thvroxin (mM) i fældning 0 100 25 0,2 97 0,5 80 1.0 69 2,5 61 5.0 43 30
De angivne data viser,at koncentrationer af fenclo-feriac under ca. 5 mM inhiberer antistof-bindingsreaktionen kun ca. 50%, og at koncentrationer under ca. 2,5 mM kun inhiberer ca. 60%. På basis af disse data og de i eksempel 1 35 angivne data vil foretrukne fenclofenac-koncentrationer i en thyroxin-immunoanalyse-reaktionsblanding ligge i området fra 0,25 til 1,0 mM.
19
DK 158534B
Eksempel 3
Radioimmunoanalvse for thvroxin
En radioimmunoanalyse for thyroxin i serum udføres 5 under anvendelse af fenclofenac som det TBP-blokerende middel. Serum-standarder i 100 μΐ aliquoter indeholdende kendte koncentrationer af thyroxin kombineres med 290 μΐ 0,1 M na-triumphosphatpuffer, pH = 6,5, en mængde fenclofenac, der giver en koncentration på 0,67 mM i den endelige analyse-10 blanding, 2 μΐ kanin-antistof til thyroxin og en fikseret mængde 125I-thyroxin (ca. 34.000 tællinger pr. minut pr.
100 μΐ i det endelige rumfang). Efter inkubering ved stuetemperatur i 2 timer tilsættes der 400 μΐ 50%'s (vægt/rum-fang) polyethylenglycol, og de fremkomne fældninger opsamles 15 ved centrifugering. Derefter måles radioaktiviteten af hver fældning. Resultaterne er vist i tabel III (μg/dl betegner mikrogram pr. deciliter).
Tabel III
20 Thyroxin Tællinger pr. minut (/ig/dl) i fældning 0 23.700 1,0 21.800 25 2,5 17.300 5,0 14.400 10,0 10.000 20,0 7.500 30 Disse data viser, at når thyroxin-niveauet i serumprø ven forøges, formindskes mængden af mærket thyroxin bundet til antistof. Det er således påvist, at fenclofenac kan anvendes effektivt ved kompetitive bindings-immunoanalyser for iodothyroninen thyroxin i serum.
35
DK 158534B
' ' . 7 - — - ' ' " 20
Wrawpel A
Optiske absorptionsspektre for fenclofenac ocr diclofenac
Der fremstilles en 50 mM opløsning af fenclofenac i 5 fortyndet natriumhydroxidopløsning, og denne iagttages ikke at have nogen synlig farve. Det optiske absorptionsspektrum for en 0,5 mM opløsning i 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH = 6,5, undersøges og udviser ingen signifikant absorption over 300 nanometer (nm). Fenclofenac kan således ikke have nogen 10 signifikant virkning på spektrofotometriske signaler fremkommet over denne bølgelængde.
I modsætning hertil har det konventionelt anvendte blokerende middel ANS en signifikant absorption over 300 nm. En 50 μΚ opløsning af ANS i 0,1 M phosphatpuffer, pH = 15 7,0, viser et bredt absorptionsbånd fra 300 til 400 nm med en top på 0,5 ved ca. 350 nm. ANS giver således signifikant absorption ved meget lave koncentrationer, nemlig koncentrationer, der ligger langt under de, ved hvilke ANS normalt anvendes som et blokerende middel (omkring 1 mM).
20 Ved et andet forsøg fremstilles der opløsninger af fenclofenac og diclofenac ved opløsning af disse i 0,1 M natriumhydroxidopløsning, og spektrene optages under anvendelse af et Bausch & Lomb Spectronic 2000 dobbeltstråle-scan-nings-spektrofotometer.
25
DK 158534B
21
Tabel IIIA
Fenclofenac * Diclofenac *
Xmax 275 275 5 269
NaOH
2,06 X 103 11,8 X 103 emax 2,05 x 103
Xmin 257 248 10 NaOH 1,52 X 103 6,4 x 103 emin * Bølgelængde i nanometer (nm) og extinktionskoefficient i M"1 x cm-1.
15 Omend begge forbindelser har et absorptionsspektrum nær ved UV-området, har ingen af dem en absorbans over 320 nm. Ingen af forbindelserne vil bidrage med nogen interferens med spektrofotometrisk frembragte signaler over denne bølgelængde .
20
Eksempel «Ϊ
Virkning af fenclofenac på aktiveringen af apoaluco-seoxidase med FAD-mærkede koniugater Der udføres en række apoenzym-reaktiveringsmålinger 25 under anvendelse af forskellige koncentrationer af fenclofenac. Analyserne udføres ved 37°C, og de endelige reagenskoncentrationer i 0,1 M phosphatpuffer med pH = 7,0 er 1,0 nanomolær (nM) FAD-mærket konjugat (et FAD-theophyllin-kon-jugat som beskrevet i US patentskrift nr. 4.238.565), 50 30 nM apoglucoseoxidase (US patentskrift nr. 4.268.631), 2,5 μΐ/ml anti(glucoseoxidase)-antiserum, 2 mM natriumdichlor-hydroxybenzensulfonat (DHSA), 0,2 mM 4-amino-antipyrin, 0,1 M glucose, 20 /ig/ml peroxidase og 0,1% (vægt/rumfang) okse-serumalbumin. Apoenzymet og anti(glucoseoxidase) for-inkube-35 res, hvorpå reaktionen påbegyndes ved indblanding af de øvrige reagenser. Reaktionsblandingen inkuberes i 5 minutter, hvopå absorbansen ved 520 nm aflæses. Resultaterne i tabel
DK 158534B
22 IV relaterer fenclofenac-koncentration til dannelse af aktiv glucoseoxidase.
Tabel IV
5 Fenclofenac Procent apoglucose- (mM) -oxidase-aktivitet 0 100 0,5 81 10 1,0 66 1.5 61 2,0 54 2.5 47 15 Disse data viser, at fenclofenac-koncentrationer under 2,5 mM tillader rekombinationen af apoglucoseoxidase og FAD--mærkede konjugater at foregå med en hastighed, der er tilstrækkelig til anvendelse af en immunoanalyse med en pro-sthetisk gruppe-mærkning (US patentskrift nr. 4.238.565).
20 Til sammenligning udføres der en række apoenzym-reaktive-ringsmålinger med forskellige koncentrationer af det konventionelt anvendte blokeringsmiddel ANS. Der fremstilles følgende reagenser; 25 Reagens A 0,105 M kaliumphosphatpuffer, pH = 7,0 0,105 M glucose
2,2 mM DHSA
21 Mg/ml peroxidase 1,1% (w/v) okseserumalbumin 30 5,26 nM FAD-mærket konjugat, jfr. ovenfor.
Reagens B 4 μΜ apoglucoseoxidase, jfr. ovenfor 30% (w/v) glycerol 50 mM phosphatpuffer, pH = 7,0 35 8 mM 4-aminoantipyrin.
DK 158534 B
23 ANS opløses direkte i særskilte aliquoter af reagens A i de i tabel V angivne koncentrationer. Apoenzym-aktivitet bestemmes ved anbringelse af 50 μΐ af reagens B i en kuvette og påbegyndelse af reaktionen ved tilsætning af 1,90 ml af 5 reagens A. Analysereaktionsblandingerne inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, og absorbanserne ved 520 nm aflæses. Resultaterne fremgår af tabel V.
Tabel V
10 ANS Procent apoglucose- (mM) -oxidase-aktivitet 0 100 0,1 64 15 0,2 46 0,5 13 1,0 0
Disse data viser, at ANS-koncentrationer over ca.
20 1,0 mM totalt inhiberer rekombinationsreaktionen. Eftersom ANS-koncentrationer omkring denne koncentration kræves til blokeringsmiddelformål, kan ANS ikke anvendes ved immunoana-lysen.
Ved et andet forsøg undersøges virkningen af fenclo-25 fenac på aktiveringen af apoglucoseoxidase med et FAD-iodo-thyronin (T-4)-konjugat. Aktiveringen af apoglucoseoxidase udføres med forskellige koncentrationer af fenclofenac og gennemføres ved 37°C. Til to sæt analyser indeholdende 96 mM natriumphosphat,pH =7,0, 95 mM glucose, 1,0 mM natrium-30 dichlorhydroxybenzensulfonat (DHSA), 19 μg/ml peroxidase og forskellige koncentrationer af natrium-fenclofenac sættes der apoglucoseoxidase, 4-amino-antipyrin og anti(glucoseoxi-dase) i slutkoncentrationer på henholdsvis 100 nM, 100 μΜ og 5 μΐ/ml, eller 2,1 nM slutkoncentration af et FAD-thyrox-35 in-konjugat. Efter for-inkubering af analysemedierne i 5 minutter ved 37°C sættes FAD-thyroxin-konjugatet eller apo-glucoseoxidase-reagenset til det ønskede analysesæt. Absor-
DK 158534B
24 bansen ved 520 nm aflæses efter en inkubering på 330 sekunder. De fremkomne data angives som en procent af den absor-bans, der aflæses, når der ingen fenclofenac er til stede.
5 Tabel TVA
Fenclofenac Begyndt med Begyndt med (mM) apoenzym-tilsætning konjugat-tilsætning 0 100 100 10 0,16 100 97 0,31 98 92 0,63 97 94 1,25 93 95 2,5 90 85 15 5,0 78 74 10,0 53 54
Det kolorimetriske respons formindskes med kun 8-10% ved ca. 2 mM fenclofenac, når der anvendes et FAD-thyroxin-20 -konjugat til at aktivere apoglucoseoxidasen under de betingelser, der anvendes til en virkelig iodothyronin-immunoana-lyse.
Rlrs<a»pgl 6 25 Undersøgelse af fluorescens-undertrykkelse med fen clofenac
Der udføres fluorescensmålinger i 50 mM bicinpuffer (N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-glycin, Calbiochem-Behring, La Jolla, California, USA), pH = 8,3, under anvendelse af et 30 Aminco Bowman fluorometer (American Instruments, Silver Springs, Maryland, USA), idet excitation fastæægges ved 400 nm og emission ved 450 nm, hvilket er fluorescensbetingelserne for den /?-galactosyl-umbelliferon-enzymsubstrat-mærkede fluorescens-immunoanalyse (SLFIA), der er beskre-35 vet i US patentskrift nr. 4.279.992. Under disse betingelser udviser 10 mM fenclofenac ikke nogen fluorescens.
DK 158534B
25
Der udføres undertrykkelses-undersøgelser ved måling af fluorescensen af en 1,3 μΜ opløsning af 2-(7-hydroxy-3-carboxamidocoumarin)-ethanol (US patentskrift nr. 4.273.715) i nærværelse af forskellige niveauer af fenclo-5 fenac. Forholdene mellem iagttaget fluorescens (F) og fluorescens i fraværelse af fenclofenac (Fo) versus fenclofenac--koncentration beregnes og fremgår af tahel VI.
Tabel VI
10 Fenclofenac (mM) F/Fo 0 1,00 0,2 1,00 15 1,0 1,01 2,0 1,00 5,0 1,00 10,0 1,02 20 Disse data viser, at fenclofenac praktisk taget ikke udviser nogen undertrykkelse af det umbelliferon-fluores-cerende middel, der anvendes ved SLFIA-teknikken, og derfor er velegnet til anvendelse som et TBP-blokerende middel ved en sådan homogen immunoanalyse-teknik (US patentskrift nr.
25 4.279.992).
Eksempel 7
Virkning af fenclofenac på aktiviteten af enzymet dihvdrofolat-reduktase 30 Der fremstilles analyseblandinger, der skal indeholde forskellige koncentrationer af fenclofenac, samt, i et 1 ml slutrumfang ved 37°C, 0,3 mM thiazoylblåt, 0,115 M dihy-drofolat, 0,5 mM NADPH og 0,012 enheder pr. ml af dihydrofo-lat-reduktase. Absorbansen for hver reaktionsblanding aflæses 35 ved 560 nm over en 10 minutters inkubationsperiode ved 37°C. Resultaterne er angivet i tabel VII.
DK 158534B
26
Tabel VTT
Fenclofenac Absorbansændring, (mM) i løbet af 10 minutter 5 o 0,360 0,1 0,359 0,2 0,365 0,5 0,355 1.0 0,332 10 2,5 0,273 5.0 0,118
Disse data viser, at fenclofenac ikke bevirker væsentlig inhibering af enzymaktivitet ved koncentrationer under 15 1,0 mM, der er effektive til dissociering af thyroxin fra serumproteiner og således er velegnet til anvendelse som et TBP-blokerende middel ved enzymmodulator-mærket homogen im-munoanalyse (US patentskrift nr. 4.134.792).
20 McsgaapAl «
Enzyminhibitor-mærket immunoanalvse for thvroxin
En enzyminhibitor-mærket immunoanalyse (US patentskrift nr. 4.134.792) for thyroxin i serum udføres under anvendelse af fenclofenac som det TBP-blokerende middel.
25 Serum-standarder i 40 μΐ aliquoter indeholdende kendte koncentrationer af thyroxin kombineres med 0,2 ml af et antistof-reagens hestående af 21 μΐ kanin-antiserum til thyroxin i 1 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH = 6,5, indeholdende 0,3 M kaliumchlorid, 0,05% natriumazid og 0,5 mM fenclofenac.
30 Efter en inkubation på 30 sekunder sættes der til hver blanding 0,2 ml af et konjugat-reagens bestående af 0,63 mg/ml NADPH (0,65 mM), 0,0175 μΜ af et methotrexat-thyroxin-kon-jugat (fremstillet som beskrevet i en samtidig hermed indleveret US patentansøgning med benævnelsen "Methotrexate-35 -Labeled Iodothyronine Conjugates" (Docket No. MS-1210)) i 10 mM natriumcarbonatpuffer, pH = 9,5. Efter yderligere 30 sekunders inkubation sættes der til hver blanding 0,2 ml
DK 158534B
27 af et enzymreagens bestående af dihydrofolat-reduktase ved en koncentration på 27,5 nM methotrexat-bindingssteder i 0,1 M tris-HCl-puffer (tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hy-drochloridsalt, Calbiochem-Behring, La Jolla, California, 5 USA), pH = 8,5, indeholdende 0,5% (vægt/rumfang) gelatine og 0,005% (vægt/rumfang) chlorhexidin (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, USA). Efter yderligere 5 minutters inkubation sættes der til hver blanding 50 μΐ af 2,5 mM dihydro-folat i 0,1 M tris-HCl, pH = 8,5. 45 sekunder senere aflæses 10 absorbansen for hver opløsning ved 340 nm over et tidsrum på l minut. Resultaterne fremgår af tabel VIII.
Tabel VIII
Thyroxin Absorbanæændring 15 (Mg/dl) pr. minut 0 0,1682 1,0 0,1659 2,5 0,1648 20 10,0 0,1571 20,0 0,1498
Det ses således, at når thyroxin-niveauet i serumprøven forøges, forøges omfanget af enåyminhibering med inhibi-25 tor-thyroxin-konjugatet. Fenclofenac interfererer ikke væsentligt med hverken det spektrofotometriske respons ved 340 nm eller med den enzymatiske reaktion.
DK 158534B, 28
Htsone] 9
Enzvmsubstrat-mærket jirnnunoanalvse for thyroxin A. Syntese af mærket konjugat - 5- (thyroxinamido) -pentyl, 4-methyl-umbelliferon, hydrogenphosphat.
.5 H(Æ)-0-S)^HorawH-fCH^ofo^-'1^ I % 10 ^H3
En opløsning af 8,73 g (10 mmol) N-trifluoracety1-L--thyroxin, 1,133 g (li mol) 5-amino-l-pentanol og 2,7 g (20 mmol) 1-hydroxybenzotriazol i 125 ml tørt dimethylform-15 amid (DMF) afkøles til -5°C under omrøring under argon.
Hertil sættes der 2,28 g (11 mmol) dicyclohexylcarbodiimid. Kølebadet fjernes, og reaktionsblandingen får lov at komme op på stuetemperatur, og den omrøres i 3 timer. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum. Remanensen optages i 250 ml ethyl-20 acetat, filtreres og vaskes med 150 ml mættet vandig natrium-bicarbonatopløsning og 5% vandig citronsyreopløsning. Denne remanens renses ved præparativ væskechromatografi i en sil-icagelkolonne ved eluering med methylenchlorid og acetone i rumfangsforholdet 5:1. Herved fås der 6,5 g (67%'s udbytte) 25 af N-(5-hydroxypentyl)-amidet af N-trifluoracetylthyroxin i form af et hvidt, fast stof med smp. 202-203°C.
Analyse, beregnet for C22H21F3I4N2O5: C = 27,58%, H = 2,21%, N * 2,92% fundet: C = 27,89%, H = 2,18%, N 3,36%.
30 N-(5-hydroxypentyl)-amidet (5,75 g eller 6 mmol) og 2,01 g (6 mmol) af pyridinsaltet af 4-methyl-umbelliferon--monophosphat suspenderes i 75 ml tørt DMF. Blandingen koncentreres til ca. 25 ml·s rumfang på en rotationsfordamper tilsluttet en vakuumpumpe. Yderligere 20 ml tørt DMF tilsæt-35 tes, efterfulgt af 30 ml tør pyridin. Der tilsættes derpå 2,48 g (12 mmol) fast dicyclohexylcarbodiimid, og reaktions- 29 DK 1585348 blandingen omrøres under argon ved stuetemperatur i 24 tbner. Opløsningsmiddel fjernes under vakuum, og remanensen omrøres med 300 ml 0,1 M vandig triethylammoniumbicarbonatopløsning i 1 time. Den hvide fældning skilles fra ved filtrering, og 5 den omrøres derpå i 30 minutter i 300 ml ether og filtreres. Herved efterlades der 8 g af det ønskede produkt forurenet med dicyclohexylurinstof. Denne remanens (1,6 g) optages i methanol (noget uopløseligt materiale fjernes ved filtrering) og chromatograferes på Sephadex LH-20 (60 cm x 5 cm), idet 10 der elueres med methanol. Strømningshastigheden er 0,5 ml pr. minut, og der opsamles fraktioner på 10 ml.
Fraktionerne nr. 69-76 slås sammen og inddampes, hvorved der i form af et hvidt, glasagtigt fast stof fås 390 mg 5-(N-(trifluoracetamido)-thyroxinamido)-pentyl, 4-15 -methy1-hydrogenphosphat, triethylammoniumsalt.
Analyse, beregnet for C3gH43F3l4PN30ioi C = 35,18%, H = 3,34%, N = 3,24% fundet: C = 37,01%, H = 3,63%, N = 3,36%.
En portion på 200 mg af den N-trifluoracetamido-be-20 skyttede phosphodiester opløses i 50% vandig methanol, pH = 12, i 3 timer. Reaktionen undertrykkes med 0,5 ml eddikesyre, og der koncentreres derpå til tørhed under vakuum. Remanensen optages i methanol indeholdende en lille mængde ammonium-hydroxid, der tilsættes 2,5 g silicagel, og opløsningsmidlet 25 fjernes. Den imprægnerede adsorbent anbringes på toppen af en kolonne af 25 g silicagel i en blanding af chloroform, methanol og koncentreret ammoniumhydroxidopløsning i rumfangsforholdet 10:5:1. Kolonnen elueres med dette opløsningsmiddel, og der opsamles fraktioner på 9 ml.
30 Fraktionerne nr. 10-21 slås sammen og inddampes, hvorved der fås 100 mg 5-(thyroxinamid)-pentyl, 4-methyl--umbelliferon, hydrogenphosphat, i form af et hvidt, mikro-krystallinsk fast stof med smp. 191-192°C (bliver mørkere fra 188°C).
DK 158534B
30
Analyse# beregnet for C30H29I4PH2O9.H2O: C = 32,22%, Η = 2,79%, N = 2,50% fundet: C = 32,37%, H = 2,71%, N = 2,46%.
5 B. Analysemetode.
Der tilvejebringes de følgende reagenser:
Reagens A 50 mM bicinpuffer med 0,1% natriumaåid, pH = 8,5.
Reagens B 60 mM fenclofenac i 0,5 N natriumhydroxid.
10 Reagens C Thyroxin-standarder med koncentrationer på 0,2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 og 20 μg/dl, fremstillet ved at sætte thyroxin (Sigma) til thyroxin--frit serum.
Reagens D Antistof/enzym-reagens indeholdende 50 μΐ 15 antiserum pr. ml og 0,12 enheder pr. ml af phosphodiesterase (Sigma, Type VII) i bicinpuffer.
Reagens E 1,24 μΜ af det mærkede konjugat (afsnit A ovenfor) i 5 mM formiat, 0,1% natriumazidpuf-20 fer, pH = 3,5.
Analyseforskriften involverer tilsætning af 75 μΐ af reagens B og 0,5 ml af reagens A til en kuvette, efterfulgt af 75 μΐ af et egnet reagens C og yderligere 0,5 ml af reagens A, samt til slut 75 μΐ af reagens D og en tredie portion 25 på 0,5 ml af reagens A. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur påbegyndes analysereaktionen ved tilsætning af 75 μΐ af reagens E og 0,5 ml af reagens A til kuvetten. Fluorescensen (excitation = 360 nm, emission = 450 nm) måles 20 minutter efter tilsætning af reagens E.
30 C. Resultater.
Analysen gennemføres for hvert reagens C, og der opnås de i tabel IX viste resultater.
DK 158534B
31
Tabel IX
Thyroxin Fluorescens- (Mg/dl) enheder 5 0 24,9 2 25,5 4 26,4 6 27,2 8 26,7 10 10 27,1 12 30,0 16 30,1 20 30,8 15 Når thyroxin-koncentrationen forøges, forøges også fluorescens-emissionen, og der tilvejebringes således en analysemetode for thyroxin.
Klccjempel 10 20 Anvendelse af fenclofenac eller diclofenac i et apoenzvmreaktiverinas-immunoanalvsesvstem for serum--thvroxin
Standardkurver for serum-thyroxin frembringes under anvendelse af en halvautomatisk analyseforskrift i et Gil-25 ford Clinical Chemistry Analyzer System 203-s (Gilford Instrument Laboratories, Oberlin, OH, USA). Pufferen indeholdende 96 mM natriumphosphat, pH = 7,0, 2,1 mM dichlorhydroxy-benzensulfonat (DHSA), 21 Mg/ml peroxidase, 105 mM glucose og 2 mM natrium-fenclofenac eller natrium-diclofenac forvar-30 mes til 37°C, inden der sættes 0,8 ml til reaktionsbægeret sammen med 0,05 ml af 200 μΐ/ml thyroxin-standarder i T4,T3--fri humant serum (AMF Biological and Diagnostic Products, Sequin, Tx, USA), 100 μΐ/ml anti(glucoseoxidase)-antiserum, 15 μι/ml anti(thyroxin)-antiserum og 0,03 M natriumphos-35 phat, pH = 7,0. FAD-thyroxin-konjugatet (40 nM i 0,1 M natriumphosphat, pH = 7,0, 0,01% Triton X-100) som en 0,05 ml aliquot sættes til reaktionsbægeret og får lov at ækvilibrere
DK 158534B
32 i 30 sekunder. Reaktionen initieres ved tilsætning af 0,10 ml 1,0 μΜ apoglucoseoxidase, 2 mM 4-amino-antipyrin, 12% glycerol og 80 mM natriumphosphat, pH = 7,0. Absorbansen ved 520 nm måles efter en inkubationstid på 8 minutter.
5
Tabel X
Thyroxin- standard Absorbans Absorbans (μg/l) (med fenclofenac) (med diclofenac) 10 - - - 0 0,797 0,619 25 0,823 0,620 75 0,893 0,647 125 0,965 0,678 15 200 1,078 0,719
Med fenclofenac eller diclofenac som det iodothyronin--dissocierende middel kan der iagttages en korrelation mellom ahsorbans-af læsningen og koncentrationen af thyroxin i serum 20 under anvendelse af et homogent apoenzym-reaktiverings-im-munoanalysesystem.
Eksempel 11
Virkning af pH på dissociationen af iodothvronin fra 25 serumproteiner
Under anvendelse af den kolonne-metode, der er beskrevet i forbindelse med den anden undersøgelse i eksempel 1, varieres pH-værdien af den 0,1 M natriumphosphat, og koncentrationen af dissociationsmidlet holdes konstant ved 30 2,0 mM. Kolonnerne ækvilibreres med puffer indeholdende det dissocierende middel ved den givne pH-værdi, og 165 μΐ af det serum, der anvendes, fortyndet i puffer ved den givne pH-værdi (som beskrevet ovenfor) tilføres kolonnen. De totale tælleværdier måles, hvorpå kolonnerne vaskes med puffer 35 ved den givne pH-værdi. De tælleværdier, der tilbagebliver på kolonnen, repræsenterer procentmængden af dissocieret iodothyronin.
DK 158534 B
33
Tabel XI
Procent dissocieret Procent dissocieret pH med fenclofenac med diclofenac 5 - - - 6.0 84 86 6.5 84 86 7.0 86 86 7.5 85 85 10 8,0 83 85
Dissociationen af iodothyronin fra serumproteiner med fenclofenac eller diclofenac er uafhængig af den pH-værdi (i området fra 6,0 til 8,0), ved hvilken inkuberingen af 15 immunoanalysen udføres.
Eksempel 12
Fremstilling af diclofenac
Under anvendelse af den metode, der er beskrevet i 20 japansk patentpublikation nr. 80-79.352 (Chem. Abs., 94, 121132u), behandles 2-iodbenzoesyre med thionylchlorid og dimethylamin til dannelse af N,N-dimethyl-2-iodphenylacet-amid. Ved omsætning efter opvarmning med 2,6-dichloranilin i nærværelse af kaliumcarbonat under anvendelse af den me-25 tode, der er beskrevet i japansk patentpublikation nr. 80-87.748 (Chem. Abs., 94, 30378q), fås der N,N-dimethyl-o--(2,6-dichlorphenylamino)-phenylacetamid. Ved hydrolyse med 15% kaliumhydroxid (britisk patentansøgning nr. 2.027.028) fås der diclofenac (o-(2,6-di-chlorphenylamino)-phenyled-30 dikesyre).
Claims (8)
1. Homogen kompetitiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en prøve af uekstraheret 5 serum eller plasma, ved hvilken der dannes en reaktionsblanding ved kombination af prøven med reagenser indeholdende et antistof for iodothyroninen, et mærket iodothyronin-kon-jugat og et TBP-blokerende middel, og ved hvilken et spek-trofotometrisk respons, fortrinsvis en fluorescensemission 10 eller en absorbansændring forårsaget af en analysereaktion, frembringes i reaktionsblandingen ved en bølgelængde større end 300 nm, der er relateret til koncentrationen af indothy-roninen i prøven, kendetegnet ved, at der som det TBP-blokerende middel anvendes en forbindelse med den 15 almene formel Zi-Y-Z2 i hvilken Y betyder o, NH, S, CH2 eller C=0, og Z^ og Z2 betyder phenylgrupper, af hvilke mindst én er substitueret med én eller flere substituenter udvalgt blandt halogen, 20 lavere alkyl og lavere alkoxy, idet Z2 er substitueret med en carboxyalkyl- eller en sulfoalkylgruppe, eller et salt deraf.
2. Immunoanalysemetode ifølge krav 1, kende-25 tegnet ved, at der som det blokerende middel anvendes en forbindelse med formlen ^C1 r1~©~ 30 ^R2 cli^COOH DK 158534B
3. Metode ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som det blokerende middel anvendes 2-(2,4-dichlor-phenoxy)-phenyleddikesyre eller et salt deraf.
4. Metode ifølge ethvert af kravene 1-3, kende tegnet ved, at det mærkede konjugat indeholder en deltager i en enzymatisk reaktion, der frembringer et detek-terbart produkt, som tilvejebringer det spektrofotometriske respons. 10
5. Metode ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det mærkede iodothyronin-konjugat indeholder et fluorogent enzymsubstrat, der frigører et fluorescerende produkt ved interaktion med et enzym, idet enzymets evne til at frigøre 15 det fluorescerende produkt ændres ved binding af antistoffet til det mærkede konjugat. 1 2 Metode ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det mærkede iodothyronin-konjugat omfatter en enzym-pro- 20 stethisk gruppe, der kombineres med et apoenzym til dannelse af et aktivt enzym, hvis aktivitet måles ved dets evne til at katalysere en reaktion, der frembringer et produkt med en karakteristisk fluorescens eller absorbans ved den nævnte bølgelængde større end ca. 300 nm, idet det mærkede konjugat 25 fortrinsvis indeholder flavin-adenin-dinucleotid, som kombineres med apoglucoseoxidase til dannelse af aktiv glucose-oxidase, idet apoenzymets evne til kombination med den pro-sthetiske gruppe i det mærkede konjugat ændres ved binding af antistoffet til det mærkede konjugat. 30 2 Reagensmiddel til homogen immunoanalysebestemmelse af en iodothyronin i en prøve af uekstraheret serum eller plasma, omfattende et antistof for iodothyroninen, et mærket iodothyronin-konjugat, der som en detekterbar egenskab har 35 evnen til at frembringe et spektrofometrisk respons, fortrinsvis en fluorescensemission eller en absorbansændring DK 158534B forårsaget af en enzymatisk reaktion, ved en bølgelængde større end ca. 300 nm, idet denne detekterbare egenskab ændres, når konjugatet bindes til antistoffet, samt et TBP--blokerende middel, kendetegnet ved, at det TBP-5 -blokerede middel er en forbindelse som defineret i ethvert af kravene 1-3.
8. Reagensmiddel ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det mærkede iodothyronin-konjugat er som 10 defineret i ethvert af kravene 4-6.
9. Reagensmiddel ifølge krav 7 eller 8 i form af et testmateriale indeholdende reagenserne ifølge krav 7 eller 8 og en fast bærer, hvori reagenserne er inkorporeret, eller 15. form af et testsæt.
10. Anvendelse af en forbindelse som defineret i ethvert af kravene 1-3 som et TBP-blokerende middel ved en homogen kompetitiv bindings-immunanalysemetode.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31802781A | 1981-11-04 | 1981-11-04 | |
| US31802781 | 1981-11-04 | ||
| US06/414,934 US4468469A (en) | 1981-11-04 | 1982-09-03 | Substituted phenylacetic acids and salts as TBP blocking agents in iodothyronine immunoassays |
| US41493482 | 1982-09-03 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK488682A DK488682A (da) | 1983-05-05 |
| DK158534B true DK158534B (da) | 1990-05-28 |
| DK158534C DK158534C (da) | 1990-11-05 |
Family
ID=26981273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK488682A DK158534C (da) | 1981-11-04 | 1982-11-03 | Homogen kompetitiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en proeve af uekstraheret serum eller plasma med et tbp-blokerende middel samt reagensmiddel til anvendelse ved metoden |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4468469A (da) |
| EP (1) | EP0078477B1 (da) |
| AU (1) | AU558510B2 (da) |
| CA (1) | CA1208547A (da) |
| DE (1) | DE3273222D1 (da) |
| DK (1) | DK158534C (da) |
| ES (1) | ES517079A0 (da) |
| IE (1) | IE53981B1 (da) |
| IL (1) | IL67020A0 (da) |
| NO (1) | NO161287C (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4622293A (en) * | 1983-07-05 | 1986-11-11 | Miles Laboratories, Inc. | Iodothyronine immunoassays employing HMS as TBP blocking agent |
| GB8404843D0 (en) * | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
| EP0165669A1 (en) * | 1984-05-04 | 1985-12-27 | Corning Glass Works | Improved method of measuring free ligand |
| DE3650691T2 (de) * | 1985-10-04 | 1998-12-10 | Diagnostic Products Corp., Los Angeles, Calif. | Verfahren zum Messen von Freitestosteronen in biologischen Flüssigkeiten |
| US5102786A (en) * | 1987-05-21 | 1992-04-07 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Biological diagnostic assay system |
| SE8703682L (sv) * | 1987-09-24 | 1989-03-25 | Wallac Oy | Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner |
| EP0312897A1 (en) * | 1987-10-21 | 1989-04-26 | Abbott Laboratories | Thyroid hormone assay and reagent system employing furosemide |
| US5256575A (en) * | 1988-12-22 | 1993-10-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Geminal diphenyl derivatives and their use in immunoassays |
| US5145790A (en) * | 1990-05-04 | 1992-09-08 | Abbott Laboratories | Reagents and method for detecting polychlorinated biphenyls |
| US5965106A (en) * | 1992-03-04 | 1999-10-12 | Perimmune Holdings, Inc. | In vivo binding pair pretargeting |
| US5578289A (en) * | 1992-03-04 | 1996-11-26 | Akzo N.V. | In vivo binding pair pretargeting |
| US5538852A (en) * | 1992-10-02 | 1996-07-23 | Ecochem Research, Inc. | Immunoassay for polychlorinated biphenyls |
| EP0880704B1 (en) * | 1996-07-18 | 2003-09-24 | Dade Behring Marburg GmbH | Reagents for assays for mycophenolic acid |
| US7141436B2 (en) * | 1999-11-03 | 2006-11-28 | Science And Technology Corp. | Immunoassay and reagents and kits for performing the same |
| RU2278612C2 (ru) * | 2000-07-14 | 2006-06-27 | Лайфскен, Инк. | Иммуносенсор |
| US20060134713A1 (en) | 2002-03-21 | 2006-06-22 | Lifescan, Inc. | Biosensor apparatus and methods of use |
| US20030180814A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-09-25 | Alastair Hodges | Direct immunosensor assay |
| CA2587945A1 (en) * | 2004-11-17 | 2007-04-12 | Bioveris | Electrochemiluminescent assay |
| US20060275841A1 (en) * | 2004-12-20 | 2006-12-07 | Martin Blankfard | Assay method and apparatus with reduced sample matrix effects |
| CN108490166B (zh) * | 2018-02-28 | 2020-10-09 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种改良实验缓冲液及其应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1308327A (en) * | 1970-04-14 | 1973-02-21 | Reckitt & Colmann Prod Ltd | Phenylalkane derivatives and processes for the preparation thereof |
| US3928553A (en) * | 1972-03-23 | 1975-12-23 | Univ New York | Radioimmunoassay method for triiodothyronine and thyroxine |
| US3911096A (en) * | 1972-06-23 | 1975-10-07 | Professional Staff Ass Of The | Radioimmunoassay for measurement of thyroxine (T{HD 4{B ) and triiodothyonine (T{HD 3{B ) in blood serum |
| US4018883A (en) * | 1975-03-10 | 1977-04-19 | Nichols Institute For Endocrinology | Thyroxine (T4) radioimmunoassay |
| CA1050425A (en) * | 1975-06-26 | 1979-03-13 | Mallinckrodt | Radioimmunoassay methods for the determination of l-triiodothyronine and thyroxine |
| DE2528958A1 (de) * | 1975-06-28 | 1977-01-13 | Merck Patent Gmbh | Araliphatische dihalogenverbindungen und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4151302A (en) * | 1975-06-28 | 1979-04-24 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Araliphatic dihalogen compounds composition and method of use |
| US4066410A (en) * | 1975-09-15 | 1978-01-03 | Nuclear-Medical Laboratories, Inc. | Thyroid hormone assay |
| US4046870A (en) * | 1976-06-30 | 1977-09-06 | Corning Glass Works | Assay for free thyroid hormones |
| US4052504A (en) * | 1976-06-30 | 1977-10-04 | Corning Glass Works | Assay for thyroxine binding globulin |
| US4108974A (en) * | 1976-08-27 | 1978-08-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Radioimmunoassay for thyroid hormone |
| US4307071A (en) * | 1977-08-02 | 1981-12-22 | Kallestad Laboratories, Inc. | Analytical reagent and method |
| US4206220A (en) * | 1978-07-13 | 1980-06-03 | Interx Research Corporation | Prodrugs for the improved delivery of non-steroidal anti-inflammatory agents |
| US4225576A (en) * | 1978-11-20 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Combined radioimmunoassay for triiodothyronine and thyroxine |
| CA1183450A (en) * | 1980-10-30 | 1985-03-05 | Alfred C. Greenquist | Homogeneous specific binding assay device and method |
-
1982
- 1982-09-03 US US06/414,934 patent/US4468469A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-10-19 IL IL67020A patent/IL67020A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-10-20 AU AU89640/82A patent/AU558510B2/en not_active Ceased
- 1982-10-25 EP EP82109830A patent/EP0078477B1/en not_active Expired
- 1982-10-25 DE DE8282109830T patent/DE3273222D1/de not_active Expired
- 1982-11-03 IE IE2628/82A patent/IE53981B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-11-03 DK DK488682A patent/DK158534C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-11-03 ES ES517079A patent/ES517079A0/es active Granted
- 1982-11-03 CA CA000414812A patent/CA1208547A/en not_active Expired
- 1982-11-03 NO NO823658A patent/NO161287C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK158534C (da) | 1990-11-05 |
| IL67020A0 (en) | 1983-02-23 |
| EP0078477B1 (en) | 1986-09-10 |
| AU558510B2 (en) | 1987-01-29 |
| IE53981B1 (en) | 1989-05-10 |
| ES8500452A1 (es) | 1984-10-01 |
| CA1208547A (en) | 1986-07-29 |
| DE3273222D1 (en) | 1986-10-16 |
| DK488682A (da) | 1983-05-05 |
| US4468469A (en) | 1984-08-28 |
| AU8964082A (en) | 1983-05-12 |
| EP0078477A2 (en) | 1983-05-11 |
| IE822628L (en) | 1983-05-04 |
| NO823658L (no) | 1983-05-05 |
| ES517079A0 (es) | 1984-10-01 |
| NO161287B (no) | 1989-04-17 |
| NO161287C (no) | 1989-07-26 |
| EP0078477A3 (en) | 1983-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4468469A (en) | Substituted phenylacetic acids and salts as TBP blocking agents in iodothyronine immunoassays | |
| US5445944A (en) | Methods for determining peroxidately active substances | |
| US4380580A (en) | Heterogenous chemiluminescent specific binding assay | |
| US4230797A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a coenzyme as label | |
| US4318980A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label | |
| US9212385B2 (en) | Fluorinated resorufin compounds and their application | |
| US4492751A (en) | Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label | |
| JP3611579B2 (ja) | 抗体検出用化学発光イムノアッセイ | |
| JPH0145027B2 (da) | ||
| JP4074335B2 (ja) | 電子数の多い化学発光性アリール置換１，２−ジオキセタン | |
| JPS63112564A (ja) | 化学発光性アクリジニウム塩 | |
| IE52423B1 (en) | A method for carrying out non-isotopic immunoassays,labeled analytes and kits for use in such assays | |
| NO314946B1 (no) | Fremgangsmåte og analysesett for analyse av homocystein | |
| JP2010237226A (ja) | 化学発光性アクリジニウム化合物を使用するヒドリドの測定 | |
| NO163586B (no) | Immunologiske jodtyroninanalyser hvor hms brukes som tbp-blokkerende middel. | |
| US6673560B1 (en) | Measurement of hydride using chemiluminescent acridinium compounds and applications thereof | |
| US5597702A (en) | Automated lead assay | |
| JPH0133781B2 (da) | ||
| JP2510369B2 (ja) | ジフェニルメタン誘導体類、その製造方法およびそれを含有するヨ―ドチロニン類を結合する蛋白からヨ―ドチロニン類を置換するための試薬 | |
| JPH0354938B2 (da) | ||
| WO2005047242A2 (en) | Compounds containing thiosulfate moieties | |
| EP0079489A1 (en) | Methotrexate-labeled iodothyronine conjugates and method, reagent means and test device for the determination of iodothyronine in or iodothyronine uptake of a liquid sample | |
| JP3471874B2 (ja) | 化学発光によるホスファターゼの酵素活性測定法 | |
| JPH0638757B2 (ja) | ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |