DK159160B - Nitroaryl-malto-n-osider samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Nitroaryl-malto-n-osider samt fremgangsmaade til fremstilling deraf Download PDF

Info

Publication number
DK159160B
DK159160B DK315877A DK315877A DK159160B DK 159160 B DK159160 B DK 159160B DK 315877 A DK315877 A DK 315877A DK 315877 A DK315877 A DK 315877A DK 159160 B DK159160 B DK 159160B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
oac
mixture
malto
nitronium
ch2oac
Prior art date
Application number
DK315877A
Other languages
English (en)
Other versions
DK315877A (da
DK159160C (da
Inventor
Richard Charles Burns
Alexander Lawrence Johnson
William Brown Farnham
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of DK315877A publication Critical patent/DK315877A/da
Publication of DK159160B publication Critical patent/DK159160B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK159160C publication Critical patent/DK159160C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DK 159160 B
i
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte nitroaryl-malto-n-osider af matotetraose, maltopentaose og maltohexaose, som er anvendelige som standardsubstrater til bestemmelse af a-amylaseaktiviteter i serum og andre biolo-5 giske væsker, og opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af disse nitroaryl-malto-n-osider.
Fra beskrivelsen til US patent nr. 3.879.263 er det kendt at foretage bestemmelse af a-amylaseindholdet i biologiske prøver ved at sætte maltotetraose eller maltopentaose 10 til en prøve ved konstant temperatur og konstant pH-værdi. Fremgangsmåden tillader en hurtig bestemmelse af a-amylaseak-tiviteten og kan anvendes til differentiering mellem sali-va-a-amylase og pancreas-a-amylase. Sidstnævnte forbindelse danner glucose, hvilket ikke er tilfældet med førstnævnte 15 forbindelse. Den dannede glucose kan bestemmes spektrofotome-trisk, f.eks. ved hjælp af absorption af nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduceret form) (NADH) ved 340 mm. Da denne bestemmelsesmetode afhænger af glucose, er en glucosepåvis-ningsreaktion nødvendig. Såfremt endvidere glucose forekom-20 mer i prøven, må den enten fjernes, eller der må kompenseres derfor. De her omhandlede forbindelser afviger fra dette, idet 4-nitrophenol eller derivater deraf frigøres som stoffet, som derpå kan relateres til α-amylase. Dette gør bestemmelsen uafhængig af glucosepåvisningstrinet.
25 A.P. Jansen og P.6.A.B. Wydeveld anfører i Nature, 162, 525 (1958), at a-(p-nitrophenyl) -maltosid kan være egnet som substrat til amylase-aktivitetsbestemmelsen.
I Chemical Abstracts, 70, 44365x (1969) beskrives anvendelsen af p-ntirophenyl-a-maltosid til undersøgelse af 30 inhiberingen af α-amylase med anomere sukkerarter såsom maltose, glucose, mannose og xylose.
Den foreliggende opfindelse angår nitroaryl-malto-n-osider med den almene formel ch2oh " ch2oh Ί ch2oh
OH OH OH
-½
DK 159160 B
2 hvor konfigurationen af substituenten -OR på det anomere carbonatom er a- eller β-, n er det hele tal 2, 3 eller 4, og R er en substitueret aromatisk gruppe med den almene formel 5 10 i hvilken Y hver gang betyder H, N02/ halogen, C^-C4-alkyl, OR1 eller COOR1, hvor R1 betyder en C^-Cg-alkylgruppe.
Der anvendes fortrinsvis en blanding af isomere a-og /3-glycosider, da de for det første er lette at fremstille og vanskelige at adskille, og for det andet kan begge isomere 15 anvendes ved α-amylase-bestemmelsen. Endvidere foretrækkes forbindelser, hvor R betyder 4-nitrophenyl, og n er 2 eller 3.
Forbindelserne ifølge opfindelsen er anvendelige som standardsubstrater til forsøg med serum-a-amylase ved under-20 søgelsen af pancreasfunktionen.
De her omhandlede nitroaryl-malto-n-osider kan fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at man på i og for sig kendt måde omsætter (a) peracetylerede malto-n-osider med den almene formel 25
CH-OAc Γ CH^OAC Ί CH^OAC
OH h|_ 0 Ή hJ-0 H
KOAC /__0_hOAc )L_0_KOAc /0Ac
AcoT-r N—r >-r 3Q OAc ^ OAc-*n OAc 35 · hvilken Ac betyder en acetylgruppe, og n er det hele tal 2, 3 eller 4, med en phenol med den almene formel
DK 159160 B
3 i hvilken Y har den ovenfor angivne betydning, i nærværelse af en katalysator ved en temperatur i området ca. 80-120°C, (b) nitrerer det i trin (a) dannede produkt, idet man bringer dette produkt i kontakt med 5 (1) saltpetersyre i en blanding af eddikesyre og svovlsyre, eller (2) en nitroniumforbindelse valgt blandt nitroniumtetrafluor-borat, nitroniumhexafluorphosphat og nitroniumtrifluormethan-sulfonat indeholdt i dichlormethan, chloroform eller 1,2-10 dichlorethan, og (c) deacetylerer det i trin (b) fremstillede produkt, idet man bringer det i kontakt med (1) en katalytisk mængde af et alkalimetal-(lavere alkoxid) indeholdt i den tilsvarende alkohol, eller 15 (2) en opløsning af vandfri ammoniak eller HC1 i methanol.
Nitroaryl-malto-n-osiderne ifølge opfindelsen er afledt af en række oligomere og polymere af glucose, som er a[l -> 4] sammenknyttede. Denne række glucosider har den nedenfor anførte almene formel. Gn-nomenclaturen er en hen-20 sigtsmæssig forkortelse for de η a[l -> 4] sammenknyttede glucoseenheder.
ch9oh ch9oh ch9oh ch9oh
Elo Ilo Elo Eio 25 ηοΤ_Λ
OH OH OH OH
n α-D-glucose (G^) n = 0 maltose (G2) 30 n = 1 maltotriose (G3) n = 2 maltotetraose (G4) n = 3 maltopentaose (G5) n = 4 maltohexaose (Gg) n ~ 2000 amylose 35 I forbindelse med opfindelsen vil der for nemheds 4
DK 159160 B
skyld blive anvendt de i den efterfølgende tabel I anførte forkortelser og trivialnavne. Disse referer til de systematiske navne anført i tabel I. Reglerne herfor er anført i "Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical 5 Abstracts During the Ninth Collective Period (1972-1976)", Chemical Abstracts Service, Columbus, Ohio (1973).
i
DK 159160 B
I 1 — '
H ri O
tn tn 1 i, °
O OH Η 'I
Q © ό I C) I <5 mi g Si? I JL JL? A? £ Hp ^ -tf — 'tf— DjTd Dj tn ro U) Oo Λ ft A "tf ♦'tf OH OO N fl n T I T* I* o tn od >< d i — o) η η η T h r so d <d Oimta'tf
rjj —- — '-'H"— Η H d Η P O^OA
H I I I — I'- tn <ΰ tn >ϊ 0>,d)l μ Η H HI HI I P I Dj ^ H ΌΗ (ti >i >) >iH >iH Q >i DO ^ ° Ηγ _£ tn tn ω >i tn >i i ft 10 o p i o o o otn otn a o ad * d Η h o d d do do to ih 9 h i >j irs o) to dd to d od otn ' tn - £ h tn p P P td P td ih il il'Qfi1 O >1 >1 >i P >i P — tn — D lo ' S n
tn Dj Dj Dj tP D. >j -tf i 'tf · ° ^ ^ O
H O O O Dj O Di a o a a 9 - p £ r—i o o oo oo li li τ' 1 - ^ o pddOdonaHo fro - Dj p H HQ) H d H 3 (D Ή — I ^ I " O fr ^ tn tn tn tnH tnn tn i — i — ® —» "tf o Dj i loitn itnOH'tf h -tf o -tf * d o * Λ O OOOI Ω I O >1 i >1 A |Α"^0 T d 01 1 d l Ω 1 Ω d tn T in 1 il-tnd h > tn a anal ainon oh td h - i h — ns 01 itnia 1 a tn d ^ C-' o - o ω tn
c! 3 O O OlOI O 1 I tti 1 tti I (Dl “II
31 I Q IO I O Ω P H PH Td h - a Q
Η Q) At Η — —I — I — I I >1 >1 >1 >1 1 I I
tn tn tri'tf *tf — — Dj tn D<tn rtn-oa
r—1 o H I Λ AH <\ *tf ft'tf'tfOO 00 ^ o η I I
o) o -μ ω T Ta i a , t f « £ R £ _^ £ 9 o 3 td ih 1—1 Γ η T hi! d (d dtd - td-'tfi (ti g H ^ H ^ H '— 1—I H r—ID r—I P "tf P t-D A ·—·
En tn <d >1 1 i—i'-' 1 — ^ tn >1 tn >1 * fr " f 4J tnH HI HI Hil I Dj ID. r Dj = Η Λ
p tn O >1 >1H >ιΗ >1H Η Ω O Ω O T) ro O
O >1 dtn tn >~t tn >1 tn >1 >1 1 o 1 o η w o » i h tw to itio o in o tn otntnad adtn = a = h "" u c do do dOOiH iho <n h in >1 i o >, cd tddidd tdddotn o ind * m * tn h a DjM p rd p td P td td 1 1 iitd - 1 - O >1 £> O >1 >, P !p P >1 P P Η Ω Η Ω P Ω <£> d tn
td O Dj Λ >1 Dj >1 Dj>i>i >i I > ' fr '· - « O
h do o Dj o Dj OD1D1 da da Dj - o - p d V HO OOOO 0000)1 (DIO h | ro tP tti d o)tnd dodo aoox:o ,d o o *0 > Dj p 0) ω 1 HtDHdHdtDHdd Dii Djid - 1 - o >1
g 0Ω tn tn tnH tnn to tnHH o— o — η n ^ o) o D
o 01 loitnitnoitntnD'tf m 'tf tn *"tf *· d o
'z d a ω o ω 1 ωιοωιι -Pa -p a t ^ ^ tL R
Hl Ι3ΙΩΙΩ3ΙΩΩ·ηΙ Η I Ω k ‘D^d tnoanai ainaii dH dni ohoih i 1 itniaiatniaai'·" 1 w a * ω tn Ω η o I 01 oil 011 η 1 *tf 1 1 m 1 cnii
I t iH i—I
Q) 0) n O fr to tn a) R -P * 1-1 +1 |5 d 0)00 tn 1 ,_i Ih h j>i o) o > tnttitd o o^o^>itnord
id 0) o p -p nJ nS-dPS'd-Pq ? H
d tn H -P d X -P 1 H -P j H OH 1 -P
H O 0) P 0) 0) 0) H — tn H — tn O P tdd)
td o tn D +J Dj Λ dHOdHOd-P o-P
h doo o o o i>,tdi>j(diq <do > h+j-p +J -p -P •tfdP'tfd-Ptd+i Ό-Ρ
H Di HH Η Η H —'(D+J'-'OdOH HH
u ifdtd td td a 1 i o) 1 £ οι ¢5 pd
E-lOSSSS S o Dj-P a Dj Dj Ω g E-I E
O CO
- I 1—F r—t HQ) Dj Dj “o *0 n ti) 2 |Z <C j< PH O. ft - OO) HCNH'tfin <tf to m "tf |P Ti OODOØO OD 0 0 0 0
DK 159160 B
$
De som udgangsmaterialer anvendte malto-n-osider, dvs. maltotetraose, maltopentaose og maltohexaose, kan fremstilles ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af enten R.L. Whistler et al. i J. Amer. Chem. Soc., 76, 1671 (1954) 5 og 77, 1017, 5761 (1955) eller Thomas John Pankratz i beskrivelsen til US patentansøgning nr. 675.649, indleveret den 9. april 1976. De foretrukne nitroaryl-malto-n-osider af G4 og G5 kan fremstilles ud fra rent G4 og G5, fremstillet ved chromatografering af amylosehydrolysatet som beskrevet af 10 W. Pigman, "The Carbohydrates", Academic Press, New York, 1957, side 678-679. I det nedenstående skema II illustreres en fremgangsmåde til fremstilling af de foretrukne, forbindelser ifølge opfindelsen. Detaljerne i hver enkelt trin beskrives nærmere i det følgende.
15
Skema I i Synteseskema CH20H CH2OAc J—\ Ac2Q,NaOAc J~\ 20 n° OH n OAc
Gn = G3 eller G4 Gn = G3(Ac)10 eller G4(Ac)13 c6h5oh,z ci2
25 A
Ψ CH2OAc CH2OAc ^ .ni.trering
30 C \-rs / OAC
Gn = G3(Ac)10 eller G4(Ac)!3 Gn = G3(Ac)10 eller G^Ac^
NaOCH3 CH3OH - ' CH OH ^ ,2 G = malto-N-osid-rest a[l—>4] 03 1_o n / V Ac = CH3C0 KOH λ --. G3(Ac)10 = decaacetylmaltotriosyl
Gn0 1 i o—^_N02 G4 (Ac) 13 = tridecaacetylmaltotetraosyl G = G0 βΐίει Gm n 3 4
DK 159160B
7
Detaljerne i hvert enkelt trin i fremgangsmåden til fremstilling af de omhandlede forbindelser er som følger:
Acetvlerinasreaktion 5 Acetyleringen af glucoseoligomere med en blanding af eddikesyreanhydrid og vandfrit natriumacetat ved forhøjet temperatur er kendt, jfr. W.J. Whelan og P.J.P. Roberts, J.
Chem. Soc., 1298 (1953), W.J. Whelan, J.M. Bailey og P.J.P. Roberts, J. Chem. Soc., 1293 (1953), A. Thompson og M.L.
10 Wolfrom, J. Amer. Chem. Soc., 74, 3612 (1954), M.L. Wolfrom, L.W. Georges, A. Thompson, og I.L. Miller, J. Amer. Chem.
Soc. 71, 2875 (1949). Herved fås de peracetylerede derivater med substituenten ved det anomere carbonatom i ^-konfigurationen. Ved anvendelse af zinkchlorid eller syrer som kataly-15 sator i stedet for natriumacetat begunstiges α-konfigurationen i denne stilling, jfr. W. Pigman, loc. cit., side 140-142, men ifølge opfindelsen foretrækkes jS-konfigurationen, således at phenolen i det næste trin kan fortrænge den anomere acetoxygruppe ved en inversionsmekanisme og danne en a-20 phenylglycosidbinding. Acetyleringen gennemføres i eddikesyreanhydrid som opløsningsmiddel og reaktant, idet mængden af eddikesyreanhydrid som opløsningsmiddel og reaktant, idet mængden af eddikesyreanhydrid er fra 5 til 50 gange vægten af G4 eller G5. Den foretrukne mængde er 5 - 10 gange 25 vægten af G4 eller G5 for at tilvejebringe tilstrækkeligt reagens til at holde reaktanterne i opløsning og for at muliggøre isolering af produktet, når reaktionsblandingen hældes i vand. Den anvendte mængde vandfrit natriumacetat kan være 1-10 molækvivalenter pr. molækvivalent G4 eller 30 G5, fortrinsvis 5-6 molækvivalenter.
Reaktionstemperaturen kan være fra 100°C til 140°c, dvs. ved tilbagesvalingstemperaturen for eddikesyreanhydrid, fortrinsvis mellem 110 og 120’C. Under 100"C forløber acetyleringen meget langsomt og ufuldstændigt, og over 140“C, 35 f.eks. i en trykbeholder, er reaktionen meget voldsom og fører til et mørkfarvet produkt.
DK 159160 B
8
Reaktionstiden kan være fra 1 til 6 timer og er fortrinsvis ca. 2 timer. Ved mere langvarig opvarmning ved forhøjede temperaturer fås også et mørkf arvet produkt. Starten af reaktionen kan konstateres ved, at reaktionsblandingen 5 bliver en homogen opløsning, og ved, at reaktionen bliver svagt eksoterm.
Det peracetylerede produkt isoleres ved at hælde den afkølede reaktionsblanding i isvand i en mængde på 5 - 25 gange rumfanget af eddikesyreanhydrid, blandingen omrøres 10 kraftigt i nogle minutter, hvorefter den henstilles ved 0— 5°C i mindst 24 timer. Det faste produkt, hvis krystallisation om ønsket kan forbedres og fremskyndes ved podning, frafiltreres, lufttørres og omkrystalliseres fra et passende opløsningsmiddel såsom methanol eller ethanol·.
15 Identiteten af dette produkt og andre mellemprodukter fastlægges ved hjælp af de gængse spektralegenskaber og -analyser. Det anomere carbonatoms stereokemi kan let fastlægges ved protonkernemagnetisk resonansspektroskopi (1H-NMR), især ved høje frekvenser såsom 220 MHz, og om ønsket ved 20 undersøgelser at den optiske drejningsevne. I NMR-spekret for aldopyranoseacetater kan en anomer proton i α-konfigurationen (Hla) skelnes fra en anomer proton i /3-konfigurationen (Hijø) · i NMR-spektret for aldopyranoseacetater har en anomer proton i α-konfigurationen (Hla) en kemisk forskydning (5) 25 nær 5,75 ppm ved anvendelse af tetramethylsilan som intern standard, og signalet fremkommer som dublet med en aksial-aksial koblingskonstant (J) på 7-9 Hz. En anomer proton i ^-konfigurationen (¾^) giver en med 0,2-0,65 ppm til det nedre felt forskudt dublet med en aksial-ækvatorial eller 30 ækvatorial-ækvatorial koblingskonstant på 3-4 Hz, jfr. f.eks.
L.M. Jackman, "Applications of NMR Spectroscopy in Organic Chemistry", Pergamon Press (London), (1959), side 86 og 116.
Acetatudbvtninqsreaktion 35 Udbytningen (fortrængningen) af den anomere acetat gruppe i en peracetyleret sukkerart forløber lettere end
DK 159160 B
9 udbytningen af de andre acetatgrupper. Dette er en nyttig egenskab til synteseformål, da den muliggør en foretrukken reaktion i denne stilling. Når f.eks. tetradecaacetylmaltote-traosid eller heptadecaacetylmaltopentaosid omrøres med 5 phenol og vandfrit zinkchlorid (ZnCl2) ved forhøjede temperaturer, erstattes den anomere jS-acetoxygruppe med en a-pheno-xygruppe. Selv om der kræves mindst 1 molækvivalent phenol pr. molækvivalent acetylforbindelse for at opfylde de støkiometriske forhold ved reaktionen, kan reaktionen gennemføres 10 med fra 3 til 20 molækvivalenter phenol, fortrinsvis 4 til 8 molækvivalenter, til tilvejebringelse af tilstrækkeligt materiale til dannelse af en homogen opløsning. Zinkchlorid-mængden kan være 0,25-5 molækvivalenter pr. molækvivalent acetylforbindelse og er fortrinsvis i området 0,5-1,5 mol-15 ækvivalenter. Denne reaktion kan gennemføres i temperaturområdet fra 80°C til 120°C, idet temperaturer i området 100-110° C foretrækkes af de samme grunde som anført for det første trin af fremgangsmåden. Reaktionstiden kan være fra 0,25 til 6 timer, idet 1-3 timer sædvanligvis er tilstræk-20 keligt. Zinkchlorid opløst i en blanding af eddikesyre og eddikesyreanhydrid, f.eks. en 95:5-rumfangsblanding, er en fordelagtig modifikation af det ovenstående opløsningsmiddel-og katalysatorsystem til indføringen af a-phenoxygruppen.
Den vandfri zinkchloridkatalysator kan erstattes med 25 syrer såsom p-toluensul fonsyre og med andre vandfri covalente metalchlorider såsom titan (IV) chlorid (TiCl4), tin(IV)chlorid (SnCl4) og jern(III)chlorid (FeCl3).
Udbytningsreaktionen forløber uden anvendelse af opløsningsmiddel, da phenols lave smeltepunkt (43°C) sikrer, 30 at når der anvendes overskud af phenol for at tvinge reaktionen til at løbe fuldstændig til ende, forbliver blandingen en homogen opløsning ved reaktionstemperaturen. Tilsvarende reaktioner forventes også at forløbe med godt resultat, når overskud af phenoler, som er flydende ved reaktionstempera-35 turen, anvendes såvel som opløsningsmidlet som reaktanten.
Med højere smeltende phenoler såvel som med de flyden-
DK 159160 B
10 de phenoler er det også muligt at gennemføre reaktionen i et opløsningsmiddel såsom benzen (kp. 80°C), toluen (kp.
110°C) eller heptan (kp. 98“C). Med højeresmeltende phenoler såsom 3-nitrophenol (smp. 96°C), 4-nitrophenol (smp. 114"C), 5 2,4-dinitrophenol (smp. 113eC), 1-naphthol (smp. 94"C) og 2-napthol (smp. 122°C) bevirker opløsningsmiddelmetoden, at blandingen bliver homogen, og hindrer, at acetylderivatet forkuller. Opløsningsmidlet kan også være en af de ovennævnte katalysatorer, som er flydende ved reaktionstemperaturen, 10 f.eks. titan(IV)chlorid (kp. 136°C) eller tin(IV)chlorid (kp. 114°C). Eventuelt kan produktet fra reaktionen med phenolen reacetyleres under anvendelse af fremgangsmåden i det første trin for at beskytte eventuelle frie hydroxylgrup-per, som kan være dannet ved deacetyleringsbireaktioner 15 under indførelsen af phenoxygruppen.
N itrerinasreaktion
Selv om den direkte anvendelse af 4-nitrophenol til fremstilling af 4-nitrophenylglycosider er beskrevet og kan 20 anvendes (T.D. Audichya, T.R. Ingle og J.L. Bose, Indian J. Chem., 9, 315 (1971); A.P. Jansen og P.G.A.B. Wydeveld, loc. cit.), er fremgangsmåden vist i skema II til dannelse af a-(4-nitrophenyl)tridecaacetylmaltotetraosid og a-(4-nitrophenyl) hexadecaacetylmaltopentaosid foretrukken på 25 grund af den lette gennemførelse. Nitreringen kan foretages enten i en blanding af eddikesyre og svovlsyre med salpetersyre eller i dichlormethan med en nitroniumforbindelse såsom nitroniumtetrafluorborat (N02+BF4"), nitroniumhexafluor-phosphat (N02+PF6“) eller nitroniumtrifluormethansulfat 30 (N02+CF3S03"). Alle disse fremgangsmåder er beskrevet af L.F. Fieser og M. Fieser i "Reagens for Organic Synthesis",
5, 477 (1975), Wiley-Interscience, New York. Nitroniumtetrafluorborat foretrækkes og vil blive anvendt til at beskrive dette trin af fremgangsmåden. Ved den første fremgangsmåde 35 behandles en opløsning af det phenylacetylerede malto-n-osid i en blanding af svovlsyre og eddikesyre ved 0-25°C
11
DK 159160 B
med et 5-30 dobbelt molært overskud af 70%'s salpetersyre opløst i eddikesyre. Den foretrukne mængde salpetersyre er fra 10 til 20 molækvivalenter pr. molækvivalent acetylderivat. Reaktionstemperaturen er mellem 0 og 25°C, fortrinsvis 5 ca. 00C, til i vidt omfang at udelukke en yderligere nitre-ring af den aromatiske ring og spaltning af ester- og glyco-sidbindingerne. Selv om reaktionstiden kan være fra l til 10 timer, fortrinsvis ca. 4 timer, bør nitreringen få lov til at forløbe så fuldstændigt som muligt uden dannelse af 10 de ovennævnte biprodukter. Nitreringen af de aromatisk substituerede acetylerede malto-n-osider dannet ud fra de ovenfor i forbindelse med udbytningsreaktionen anførte phenoler følger det sædvandiige ortho-para-substitueringsmønster, hvor para-stillingen er begunstiget, med mindre den er bloke-15 ret af en anden gruppe, som i 4-cresylderivatet. Graden af meta-substituering er ubetydelig.
Ved nitroniumtetrafluorborat-fremgangsmåden er den foretrukne reaktionstid fra 0,25 til 1 time, og den foretrukne reaktionstemperatur er ca. 25°C. Molforholdet mellem 20 nitroniumtetrafluorborat og peracetyleret malto-n-osid kan være mellem 1:1 og 20:1, idet 10:1 er det foretrukne forhold til sikring af fuldstændig indførelse af en nitrogruppe. Foruden det foretrukne opløsningsmiddel dichlormethan kan chloroform og 1,2-dichlorethan anvendes. Nitroniumtetra-25 fluorborat-fremgangsmåden foretrækkes på grund af dens lette gennemførlighed.
Det dannede nitrerede produkt fra den første fremgangsmåde kan isoleres fra blandingen af salpetersyre, eddikesyre og svovlsyre ved at hælde reaktionsblandingen i vand, 30 sædvanligvis ca. 5-20 gange reaktionsblandingens rumfang, hvorefter råproduktet enten frafiltreres eller ekstraheres med chloroform. Ved nitroniumtetrafluorborat-fremgangsmåden sættes dichlormethanopløsningen til kold mættet natriumchlo-ridopløsning, hvorpå der tørres over natriumsulfat og inddam-35 pes til isolering af det rå nitroaryl-malto-n-osid.
DK 159160 B
12
Deacetvlerinqsreaktion
Den selektive fjernelse af O-acetylgrupper fra et acetyleret polyolderivat gennemføres fortrinsvis enten med en katalytisk mængde natriummethoxid, sædvanligvis 0,01-0,1 5 molækvivalenter, i methanol, eller ved hjælp af en opløsning af vandfri ammoniak i methanol. Foruden det foretrukne natri-ummethoxid kan der anvendes andre alkalimetal-lavere alkoxi-der såsom kaliummethoxid, natrium- og kaliummethoxid og kalium-tert.butoxid i den tilsvarende alkohol. Disse deace-10 tyleringsreaktioner forløber let ved temperaturer på 0-25°C i løbet af 12-24 timer. Det deacetylerede produkt isoleres ved fordampning af alkoholen, befries om ønsket for uorganiske ioner ved passage gennem en sur ionbyttersøj le og omkrystalliseres fra et passende opløsningsmiddel såsom methanol 15 eller ethanol. Ved en alternativ deacetyleringsfremgangsmåde anvendes en 3%'s opløsning af hydrogenchlorid i methanol (L.F. og M. Fieser, "Reagents for Organic Synthesis", Wiley, N.Y., 1967, side 11) ved temperaturer på 0-25’C i et tidsrum på 4-24 timer. Denne fremgangsmåde er særlig fordelagtig 20 til dinitroforbindelser.
Ved en alternativ syntese anvendes en af phenolerne til at udbytte eller fortrænge halogenet fra tridecaacetyl-maltotriosyl- eller hexadecaacetylmaltopentaosylchlorid eller -bromid med følgende formel: 25 CH20Ac Γ CH20Ac Ί CH20Ac L_o 1—_o Lio x f\0Ac A__0_i\0Ac /i--0—\0Ac ) acoW N—r w
30 AcO _ AcO Jn AcO
n = 2 eller 3 X = Cl eller Br 35 Disse halogenider kan fremstilles enten ved at be handle det peracetylerede oligosaccharid med vandfrit hydro- 13
DK 159160 B
genhalogenid, opløsninger af hydrogenhalogenid i blandinger af eddikesyreanhydrid og eddikesyre, opløsninger af alumi-niumchlorid og phosphorpentanchlorid eller af titantetrachlo-rid i chloroform, eller ud fra oligisaccaridet selv ved 5 behandling med acetylchlorid, jfr. W. Pigman, loc. cit., side 150-151.
Halogenatomet udbyttes enten med phenol eller en substitueret phenol i nærværelse af en halogenaccept or såsom sølvoxid (Ag20), sølvcarbonat (Ag2C03), mercuriacetat 10 (Hg(CH3COO)2) eller med ferrichlorid (Koenigs-Knorr-reak-tion), eller med natrium- eller kaliumsaltet af phenolen, jf. W. Pigman, loc. cit., side 194-198. Resten af syntesen er den samme som beskrevet ovenfor.
Forløbet af enhver af de ovenfor beskrevne reaktioner 15 kan følges ved hjælp af tyndtlagschromatografi (TLC) på silicagel i et egnet opløsningsmiddelsystem og ved hjælp af NMR-spektroskopi. Renheden af produkterne fra disse reaktioner kan bestemmes ved højeffektiv væskechromatografi (HPLC), ved polarimetri og ved ultraviolet spektroskop! og 2 0 høj frekvens(220 MHz)-NMR-spektroskopi.
Det har vist sig, at nitroaryl-malto-n-osideme ifølge opfindelsen er fordelagtige som substrater til bestemmelse af a-amylase i serum. Denne bestemmelsesmetode er illustreret i skema I for de foretrukne omhandlede forbindelser, isomere 25 a- og jS-(4-nitrophenyl)maltotetraosider og a- og 0-(4-nitro-phenyl)-maltopentaosider. Serum-a-amylase omdanner disse forbindelser til en blanding af G2 eller G3 og isomere (4-nitrophenyl) mal tos ider. Sidstnævnte forbindelser hydrolyseres derpå til glucose og 4-nitrophenol af α-maltase eller en 30 blanding af α-maltase og β-maltase. α-Maltase er sensitiv og specifik for spaltning af den α-nitroaromatiske maltosid-binding, medens yø-maltase er tilsvarende sensitiv og specifik for spaltningen af den /?-nitroaromatiske maltosidbinding.
Ved således at anvende en blanding af begge maltaseenzymer 35 kan blandede isomere a- og /3-nitroaromatiske glycosider udnyttes helt, hvorved opnås maksimal sensivitet ved bestem- 14
DK 159160 B
melsen. Ved behandling af hydrolysatet med fortyndet base dannes 4-ntirophenolatanionen, som kan identificeres ved spektroskop! og skelnes fra eventuelt uomsat glycosid, og som kan sættes i relation til a-amylasekoncentrationen i 5 serum.
Skema II : Bestemmelse af a-amylase i serum ch2oh Γ ch2oh Ί ch2oh i——O l_—o 1 o
10 [\QH —O K^OH ^)L ,o K^QH OR
OH OH OH
u J n X 290-305 nm max 15 R = 4-02NC6H4 n = 2 a- og β- (4-nitrophenyl)maltotetraosid n = 3 tt- og β- (4-nitrophenyl)maltopentaosid ]/ a-amylase ch2oh Γ ch2oh Ί ch2oh
G2 eller G3 + .0_J\0^ OR
OH OH OH
u -*n R = 4-02Ν06Η4 n = 0 a- og /?-(4-nitrophenylmaltosid 25 a-maltase 4 eller 5 G-j^ + ΗΟ_^~~^_ N02 o Π 4-nitrophenol 0H~ v 2 4-nitrophenolatonion λ maY 410 nm 35 15
DK 159160 B
Nitroaryl-malto-n-osiderne ifølge opfindelsen har følgende fordele ved bestemmelsen af a-amylaseaktivitet i serum. Fra beskrivelsen til US patent nr. 3.879.263 er det kendt at sætte a-amylaseaktiviteten i serum i relation til 5 glucosen dannet ud fra G4 eller G5. Følgelig må serumglucosen fjernes chromatografisk fra prøven inden bestemmelsen, hvilket kræver tid til fremstilling af prøver og ekstra apparatur. Ved at anvende de her omhandlede forbindelser sættes α-amylaseaktiviteten i serum i relation til nitrophenolerne 10 dannet af nitroaryl-malto-n-osiderne af G4, G5 eller Gg, som er uafhængige af indholdet af serumglucose. Denne fremgangsmåde overflødiggør ikke blot chromatograferingssystemet til fjernelse af serumglucosen, men også påvisningssystemet simplificeres, idet hexakinase-ATP-NADP-enheden erstattes 15 med fortyndet base (ATP-NADP står for adenosintriphosphat og nicotinamid-adenindinucleotidphosphat).
I de følgende eksempler illustreres flere udførelsesformer for opfindelsen. Alle dele og %-angivelser er på vægtbasis, og alle temperaturer er i "C, med mindre andet 20 er anført. Protonkernemagnetisk resonans (¾ NMR) (kemiske forskydninger) er i ppm, beregnet på den interne standard tetramethylsilan i CDC13, med mindre andet er anført. Kvalitative % NMR-resultater er optaget ved 60 MHz, og mere nøjagtige målinger er foretaget ved 220 MHz. Tyndtlagschroma-25 togrammer (TLC) er gemmenført på silicagel under anvendelse af 250 nm plader til analytisk arbejde og 2 nm plader til præparativt arbejde. Høj effektive væskechromatogrammer (HPLC) er optaget på et apparatur fra Du Pont (Du Pont® 830) til analytiske formål og på et apparatur fra Du Pont (Du Pont® 30 841) til præparative formål.
35
DK 159160 B
16
Eksempel l (Al Fremstfi 11 inq af maltotetraose-fl-tetradecaacetat
CH2OH CH2OH CH20H
5 ,/A, '°\ Na0Ac/Ac20 „Q- ~—k
OH OH OH
2 10 CH^OAc CHpOAc CH2OAc ] -n 1 O J-O OAc
y N r N r N
15 *αογ_|4- - JY_r ' OAc OAc OAc 2
En blanding af 10,0 g (15,0 mmol) maltotetraose med 20 analytisk bekræftet struktur, 10,0 g (0,15 mol) vandfrit natriumacetat og 50 ml eddikesyreanhydrid omrøres ved 100° i 2 timer, hvorpå blandingen hældes i 300 ml isvand. Efter 48 timer ved 5° frafiltreres den farveløse krystallinske masse og lufttørres, og der fås 20,96 g råmateriale. Dette omkry-25 stalliseres fra 40 ml methanol, og der fås i alt 18,18 g (14,49 mmol, 96%) krystallinsk maltotetraose-Ø-tetrådecaace-tat i to ombytter på 2,98 g og 15,20 g. Materialet i det første udbytte har smp. 124-126°, og dets struktur bekræftes af følgende data: v max (CHC13) 1750, 1370, 1230 og 1030 i 55° 30 cm"1; λ max (EtOH) 210 nm (e 740); [a]£ + 104° (c, 1,03 CHC13) ; l-H NMR (220 MHz), S 5,76 (d,J = 7) (Hla) , 5,43-5,25 (flere grupper af multipletter) 27H (OCH, OCH2) og 2,19- 2,00 (række af singletter) 42H (COCH3).
Analyse: 35 Beregnet for C52H70O35: C = 49,76%; H = 5,62%;
Fundet: C = 49,08%; 49,24%; H = 5,76%; 5,73%.
DK 159160 B
17 I flere yderligere forsøg med op til det dobbelte af ovenstående skalaforhold opnås produktudbytter på 72-77% efter omkrystallisation, og smeltepunkterne ligger fra 122 til 128°.
5 (B) Fr-CTncrhtllinq af a- og fl-phenvltridecaacetvlmaltotetra-osideme CH2OAc OAc ch2oac OAc OAc OAc L J2 15 η 1 CHo0Ac CH2OAc CH2OAc lLo lLo j—°, _
\OAc /1 \OAC ) \0AC
AooH—Ko--f0- Jvj-r
20 OAc OAc OAC
L J2
En blanding af 11,0 g (8,77 mmol) maltotetraose-yø-tetradecaacetat fremstillet ovenfor under (A), 8,0 g (85 mmol) phenol og 2,0 g (14 mmol) vandfrit zinkchlorid opvarmes 25 forsigtigt, indtil der er dannet en flydende fase, hvorpå denne omrøres mekanisk ved 100° i 3 timer. Blandingen fortyndes med vand og benzen og adskilles. Benzenlaget ekstra-heres med 3 x 50 ml 5%'s natriumhydroxidopløsning, derpå med 2 x 50 ml mættet vandig natriumchloridopløsning, hvor-30 efter det tørres og inddampes, og der fås 10,09 g (7,8 mmol, 89%) af det rå phenylderivat i form af et gult krystallinsk fast stof. Dette materiale renses ved præparativ tyndtlags-og højeffektiv væskechromatografi på følgende måde: I alt 3,06 g af det rå phenylderivat anbringes på 14 35 2-mm præperative tyndtlagschromatograferingsplader og frem kaldes 3 gange med en blanding af benzen og methanol (95:5).
18
DK 159160 B
Båndene med Rf-værdien 0,13-0,27 ekstraheres med chloroform og methanol, hvorved fås 0,90 g (29%) af et materiale, som omkrystalliseres af ethanol, og der genvindes 0,58 g af en blanding af a- og j8-phenyl-tridecaacetylmaltotetraos ider.
5 Analytisk HPLC (polære siliciummikrokugler) viser produkt med retentionstid på 8,99 minutter og en mindre urenhed (2,4%) ved 8,23 minutter. Strukturen af det krystallinske phenyltridecaacetylmaltotetraosid bekræftes af følgende data:
Umax (CHC13) 1745, 1595, 1585, 1365, 1225 og 1030 cm"1; 10 Xmax (EtOH) 273 nm (e 800), 266 (960), 260 (730), 210 (7860); * [a]p5 + 1328 (c 1,00 CHCI3)? % NMR (220 MHz), S 7,37-7,25 (m) 2H, 7,14-6,95 (m) 3H (C6H5) , 5,00-3,86 (m) 28H (OCH, 0CH2) og 2,19-1,97 ppm (række af singletter), 39H (C0CH3).
Analyse: 15 Beregnet for Cs6H72034: C = 52,17%; H = 5,63%;
Pundet: C = 51,44%; 51,94%, 51,60%, H = 5,35%; 5,60%; 5,39%.
I alt 4,25 g af det rå phenylderivat renses også ved præparativ HPLC på en 1 m x 23 mm Spherosil® (44-50)-søjle 20 elueret med 1:1 blanding af pentan og dioxan (indeholdende 1,5% vand), hvorved fås 1,07 g (25% genvinding) af farveløst krystallinsk phenyltridecaacetylmaltotetraosid med smp. 82-83°, som ved spektralanalyse og chromatografering viser sig at være identisk med materialet, som er renset ved TLC.
25 Analytisk HPLC viser, at materialet har en renhedsgrad på 99,7%.
(C) Fremstilling af a- og jø-phenyltridecaacetylmaltotetra-osider (alternativ fremgangsmåde)_ 30 CH-OAC OAc CH20Ac
2 I
η i_O __Q OAC
lÆ~ \J l/ \ \| + /771 OH ZnCl2/acOH/Ac2Q
ΑΟΟΥΙΚΟ- -fO- JX(~f OAc OAC OAc 35 : :2 CH-OAc CH.OAc CH^OAc J_L o Lie ^ \| Γ \ Γ Vv°<0>
Ac0\j-_|/0- JY—j/θ- ->Ν(.-17 OAc OAc OAc 2 19
DK 159160 B
2,75 g (2,19 mmol) maltotetraose-/3-tetradecaacetat og 2,27 g (24,2 mmol) phenol blandes i en trehalset kolbe under nitrogen. Der tilsættes 0,55 g zinkchlorid opløst i 2,0 ml af en 95:5 blanding af eddikesyre og eddikesyreanhydrid, og 5 reaktionsblandingen opvarmes langsomt. Når blandingen bliver homogen (temperatur ca. 45°), formindskes det indre tryk gradvist til 23 mm Hg, og reaktionsblandingen omrøres ved 100° i 2,5 timer. Materialet overføres til en skilletragt under anvendelse af 200 ml varm benzen, og den afkølede 10 blanding vaskes to gange med 18%'s vandig natriumchloridop-løsning, to gange med 50 ml 2,5%'s natriumhydroxidopløsning og to gange med 30 ml mættet natriumchloridopløsning. Det organiske lag tørres over natriumsulfat, inddampes, og remanensen behandles med 3,0 g vandfrit natriumacetat og 15 ml 15 eddikesyreanhydrid. Den fremkomne blanding opvarmes til 120“ i 1,0 timer, afkøles og behandles med 200 ml isvand.
Ved denne fremgangsmåde reacetyleres alle ubeskyttede hydro-xylgrupper, som er dannet ved behandlingen med phenol. Det faste stof, som dannes ved henstand ved 0°, frafiltreres og 20 tørres, og der fås 2,_85 g. Dette materiale chromatograferes på silicagel ("SilicAR® CC-7"). Ved eluering med en 97:3 blanding af benzen og methanol fås i alt 2,07 g (71%) rent phenyltridecaacetylmaltotetraosid efter omkrystallisation fra ethanol. Dette materiale har smp. 112-117°, og dets 25» 25 struktur bekræftes af følgende data: [<*]D +135° (c 1,0, CHC13) XH NMR (220 MHZ) δ 7,38-6,96 (m) 5H (C6H5) , 5,77 (dd,J = 9,5 Hz) (Hla) og 5,61 (d,J = 4 Hz) (H1B) IH, 5,45-3,82 (række af multipletter) 27H (OCH, 00¾) og 2,24-1,95 ppm (række af singletter) 39H (COCH3). Integrationen er i 30 overensstemmelse med en 75:25 blanding af a:/3-phenyltrideca-acetylmaltotetraosider.
(D) Fremstilling af a- og jS-(4-nitrophenyl) tridecaacetyl-maltotetraosid (salpetersyrefremqancrsmåden)_ 35
DK 159160 B
20 CH2OAc CH2OAc ch2oac hno3, h2so4 i
5 OA c OA c OA C
2 ch2oa ch2oac ch2oac 10 r\ /-V-<p>--2 OAc OAc OA c L J2 15 En blanding af 2,0 ml eddikesyre, 1,0 ml eddikesyrean- hydrid og 0,38 g (0,29 mmol) a- og β-phenyltridecaacetylmal-totetxaosidblanding renset ved præparativ TLC fremstillet ovenfor under (B) afkøles til 0" og behandles med en blanding af 1,0 g svovlsyre og 2,0 g eddikesyre, hvorpå der behandles 20 med en blanding af 0,5 g 70%'s salpetersyre og 1,0 ml eddikesyre. Blandingen omrøres ved 25° i 4 timer, hvorpå den hældes i 25 ml isvand og filtreres, hvorved fås 0,40 g nærmest farveløst fast stof. Denne prøve indeholder omtrentlig 50% 4-nitrophenylderivat, hvilket indiceres ved λ max (EtOH) 25 290 nm (e 3100).
Omsætningen gentages i større målestok (5 g råt phe-nyltridecaacetylmaltotetraosid), og der fås 4,35 g (84%) af den rå nitroforbindelse, som chromatograferes på 200 g sili-cagel ("SilicAR® CC-7"). Produktet (2,27 gudvundet) elueret 30 med 4% methanol i benzen har også en renhedsgrad på ca. 50%.
2,6 g af den rå fældede nitroforbindelse renses ved præparativ HPLC-seperation under anvendelse af en 2 m x 2,3 cm "Spherosil®1· (44-50)-søjle elueret med 1:1 blanding af pentan og dioxan (indeholdende 1,5% vand). Fraktionerne 35 underkastes TLC og UV, og fra de midterste fraktioner isoleres 0,2557 g (0,19 mol, 8%) rent or- og /3-(4-nitrophenyl)tri- DK 159160 B.
21 decaacetylmaltotetraosid. Efter omkrystallisation fra 5 ml ethanol smelter materialet ved 112-114°. Materialets struktur bekræftes af følgende data: v (CHCI3) 1745, 1580, 1520, 1420, 1370 og 1220 cm-1, λ max (EtOH) 290 nm (e 7180), [a]p5° 5 + 156° (C 0,525, CHC13), ΧΗ NMR (220 MHz), & 8,26 (d,J = 8) og 7,26 (d, J - 8) 4H (C6H4), 5,75 (m) , IH (Hla og Κ1β) , 5,52-3,95 (række af multipletter) 27H (OCH, OCH2), og 2,25- 2,01 ppm (række af singletter) 39H (C0CH3).
Analyse: 10 Beregnet for CsgHyjNC^g: C = 50,41%; H = 5,36;
Fundet: C = 49,95%; H = 5,54%.
(E) a- og β-(4-nitrophenyl)tridecaacetylmaltotetraosid (ni-15 troniumtetrafluorboratfremgancfsmåden)_ CH2OAc CH2OAc CH20Ac OAc OAc OAc 2 CHo0Ac CH-OAc CH-OAc 25 LLo jJLo J— 0 m ψ \ ]A \| r X^.s0—/o)-m 2 \0AC ) \0AC .) s OAC /- NX/ 2
Aco\_(/o- f .
OAc OAc OAc 2 30
En opslæmning af 1,91 g (14,5 mmol) nitroniumtetra-fluorborat i 8 ml tør methylenchlorid behandles med en opløsning af 1,24 g (0,96 mmol) phenyltridecaacetylmaltotetraosid fremstillet ovenfor under (C) i 10 ml dichlormethan, og den 35 dannede blanding omrøres i 20 minutter under en argonatmosfære. Blandingen sættes til 60 ml isvand, isoleres og vaskes med kold mættet vandig natriumchloridopløsning. Den organiske
DK 159160B
22 fase tørres over magnesiumsulfat og inddampes under formindsket tryk, hvorved fås 1,30 g af et gult glasagtigt fast produkt af a- og /?- (4-nitrophenyl) tridecaacetylmaltote-traosid. Halvdelen af dette produkt omkrystalliseres fra 5 ethanol, hvorved fås 0,48 g (75%) af et cremefarvet fast stof med smp. 116-119°. Produktets struktur bekræftes ved hjælp af følgende data: % NMR (220 MHz), δ 7,75 (AA'BB1) 4H (C6H4), 5,75 (d,J = 4Hz) (Hlj8) og 5,81 - 3,86 (række af multipletter) 28H (Hia, OCH, OCH2) og 2,25-1,95 (række af 10 singletter) 39H (COCH3) , λ max (EtOH) 288 nm (e 5840), [a]^5 + 152° (c 0,5, CHC13).
(F) Fremstilling af α- oa B-(4-nitrophenvl)maltotetraosid
15 CH^OAc CH^OAc CHo0Ac ’ NaOCH-^/CH^OH
]!io j-io j_Lo - OAc OAc OAc 20 L J2 CH20H ch2oh ch2oh 'oh 1 oh oh 1 2
En blanding af 6,76 g (5,1 mmol) søjlechromatograferet 30 4-(nitrophenyl) tridecaacetylmaltotetraosid fremstillet ovenfor under (D), 50 ml methanol og 50 mg natriummethoxid henstilles natten over ved 25°. Blandingen filtreres til fjernelse af en lille mængde gult fast stof, og filtratet inddampes til tørhed, hvorved der fås 3,17 g (4,02 mmol, 79%) af 35 et gult fast stof. 3 g af dette stof renses ved præparativ TLC på 11 plader ved fremkaldelse med en blanding af chloro-
DK 159160 B
23 form:eddikesyre:vand = 3:3,5:0,5. 0,5027 g materiale fra båndet med Rf-værdi 0,16-0,29 er en blanding af a- og /3-(4-nitrophenyl)maltotetraosid, som har en renhed på ca. 50% påvist ved UV-spektroskopi. Produktet er et gult fast stof 5 med smp. 68-70°, og dets struktur bekræftes af følgende data: max (nujol) 3300 og 1020 cm""1, λ max (H2O) 305 nm (e 3740), [α]^5° + 104° (C 1,06, H20) 1H NMR (220 MHz) δ 8,25 (d,J = 10) og 7,35 (d,J = 10) (C6H4) , 7,91 (t, J = 7) og 7,70 (t, J = 7) (andet aromatisk materiale), 5,88-5,79 (m) 10 (Hltt og ΗΧβ) , 5,30 (rn) (OCHO) , 4,98 (s) (HOD) og 4,02-3,48 ppm (m) (0CH,0CH2).
(G) (4-Nitrophenvl) maltotetraosid falternativ fremgangsmåde 15 CH20Ac CH20Ac CH20Ac ,_0 ,-0 I-o
KoAc )| KoAc )| KoAc \ NaOCH3/CH3OH
AcO _Y0- —I \|_|/o- -1 _[/o—/p VN02 OAc OAc OAc / 20 L J2
CH2OH ch20H CH2OH
-0 I /--0\ J-—-O
\0H /1 \0H / \0H l/5! /—\ 25 HOM_/0---/0--1 N-KO—/q)- N02 OH OH OH / m> mm 2
En blanding af 250 mg (0,19 mmol) (4-nitrophenyl)tri-30 decaacetylmaltotetraosid fremstillet ovenfor under (E) i 2,5 ml methanol behandles med 3,3 ml 7,8 x 10“3 M opløsning af natriummethoxid i methanol, og der omrøres i 17 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk, og remanensen opløses i minst mulig methanol (2 35 ml), hvorefter opløsningen dråbevis sættes til 40 ml ether.
Det dannede gule pulver isoleres, opløses i methanol og 24
DK 159160 B
ledes gennem en 2,5 x 20 cm søjle af "Sephadex"® LH-20, idet methanol anvendes som elueringsmiddel. Der fås 134 mg (90%) af et fast produkt, som rechromatograferes til dannelse af en midterfraktion (90 mg, 60%), hvis struktur bekræftes 5 af følgende data: λ max (H2O) 303 nm (e 6350), 217 (e 5000), % NMR (220 MHz), δ (CD3OD) 7,77 (AA'BB·, JAB = 9,5Hz) 4H (C6H4), 5,69 (d, J = 4Hz) IH (Hø) , 5,27 = 5,09 (m) , 3H (OCHO), 4,87 (s), 13H (HOD), 4,20-4,05 (m) (mindre urenhed), og 4,01-3,40 ppm (m) (OCH, 00¾) .
10 (H) (4-Nitrophenvllmaltotetraosid (alternativ fremgangsmåde^ Analogt med den ovenfor under (G) beskrevne fremgangsmåde fremstilles råt (4-nitrophenyl)maltotetraosid, λ max (H20) 302 nm (e 5900), 217 (4650), [<*]g5 + 158eC (c 1,1, 15 CH3OH). En del af dette stof renses ved fraktionering på en Waters Associates μ Bondapak®/carbonhydratsøjle, idet der elueres med en 87:13 blanding af acetonitril og vand. den rensede hovedkomponent i prøven, som isoleres efter frysetørring, har λ max (H20) 302 nm (e 9425), 220 (6500).
20
Eksempel 2 (A) Fremstilling af maltopentaose-B-heptadecaacetat
CH20H ch2oh CH20H
25 1—-0 . - l__. Na0Ac/Ac90
QH OH OH
J3 30 CH20Ac CH20Ac CH20Ac __0 -0 __0 OA c \ OA c y \ OAc ) \ OA c ) 35 J Y-r°- JY-r OAc OAc OAc 3
DK 159160 B
25
En blanding af 2,00 g (2,41 mmol) maltopentaose, 2,0 g (30 mmol) natriumacetat og 20 ml eddikesyreanhydrid opvarmes til 130° i 2,0 timer. Den afkølede blanding sættes til 75 g is og henstilles ved 0°. Det dannede faste stof pulveri-5 seres og filtreres, hvorved fås 3,35 g (90%) af et gråhvidt fast stof, som omkrystalliseres fra 40 ml ethanol, hvorved fås 3,16 g (85%) maltopentaose-/3-heptadecaacetat med smp. 117-120°, hvis struktur bekræftes af følgende data: [a]§5° + 122°C (c 0,7, CHC13), % NMR (60 MHz) δ 5,85-3,78 (m) 35H 10 (OCH, OCH2)/ og 2,34-1,83 ppm (række af singletter) 51H (COCH3), % NMR (220 MHz) S 5,76 ppm (d,J = 8 Hz), IH (Hla). Analyse:
Beregnet for C64H35O43: C = 49,80%; H = 5,62%;
Fundet: C = 49,11%; 49,28%; H = 5,54%; 5,71%.
15 (B) Fremstilling af a- oa fl-phenvlhexadecaacetvlmaltopenta-osid CH20Ac CH20Ac CH20Ac ·
-Kr^o- -fpY
OA C OA c OA c J3 25 CH2OAc CH2OAc CH2OAc
Aoo^lfi- j4l|X 4^-<o> 30 OAc OA c OAc 3
En blanding af 3,00 g (1,95 mmol) maltopentaose-/?-heptadecaacetat fremstillet som anført ovenfor under (A), 35 1,95 g (20,8 mmol) phenol og 0,46 g (3,38 mmol) vandfrit zinkchlorid opvarmes til 100° i 3 timer under en argonatomos- 26
DK 159160 B
fære. Den afkølede blanding optages i 200 ml dichlormethan og vaskes med 2 x 30 ml vand, 2 x 25 ml 5%'s natriumhydroxidopløsning og 2 x 25 ml saltvand. Den organiske fase tørres over magnesiumsulfat og koncentreres under formindsket tryk, 5 hvorved fås et gult pulver, som behandles med 3,0 g natriumacetat og 15 ml eddikesyreanhydrid, hvorpå der opvarmes til 125° i 2,0 timer for at reacetylere eventuelle frie hydroxyl -grupper. Den afkølede blanding sættes til 125 g is og henstilles ved 5e. Det dannede faste a- og /3-phenylhexadecaace-10 tylmaltopentaoseprodukt pulveriseres, adskilles og lufttørres, hvorved fås 2,45 g af et gråhvidt pulver. Dette pulver chromatograferes på 150 g silicagel, idet der elueres med en 97:3 blanding af benzen og methanol. Remanensen fra en midterfraktion udviser følgende % NMR (220 MHz)-data: δ 15 7,38-7,27 (m), 2H og 7,17-6,97 (m), 3H (C6H5), 5,77 (dd,J = 9,5 Hz), 5,63 (d, J = 4 Hz) (H^), 5,82-3,83 (række af multipletter) 35H (OCH, 00¾) og 2,23-1,93 ppm (række af singlet-ter) 48H (CH3C0).
Rent phenylhexadecaacetylmaltopentaosid fås fra det 20 ovenfor fremstillede faste produkt ved HPLC, idet der anvendes søjler pakket med silicagelkugler > 40 μ med en mobil fase af 1% methanol, 49% pentan og 50% dichlormethan. Integrering af 220 MHz -^H NMR-spektret viser, at dette materiale består af ca. 75% a-phenylhexadecaacetylmaltopentaosid og 25 25% j9-phenylhexadecaacetylmaltopentaosid.
30 35
DK 159160 B
27 (C) Fremstilling af or- og θ-phenvlhexadecaacetvlmaltopenta-osid (alternativ fremgangsmåde CH20Ac CH20Ac CH20Ac 5 __0 J__0 _0 /Γ \ / \ / \ - ZnCl9/Ac0H/Ac90
*<§>'"-L
OA c ' OA C OA C
J3 10 • CH20Ac CH2OAc CH20Ac (\0AC / \0Ac /| V OAc \
AcoY_j/0- —I Ko- -ίγ_ l/p /q\ 15 ! OAc OAC 1 OAc ^ 3
En blanding af 3,00 (1,95 mmol) maltopentaose-Ø-hexa-decaacetat fremstillet ovenfor under (A) og 1,95 g (20,8 20 mmol) phenol i en trehalset kolbe under nitrogen behandles med en opløsning af 0,49 g zinkchlorid i 2,0 ml af en 95:5 blanding af eddikesyre og eddikesyreanhydrid, og reaktionsblandingen opvarmes langsomt. Når reaktionsblandingen bliver homogen, formindskes det indre tryk gradvist til 23 mm Hg, 25 og blandingen omrøres ved 100° i 2,5 timer. Remanensen behandles med 200 ml benzen og 18%'s vandig natriumchloridop-løsning. Den organiske fase vaskes to gange med 50 ml 2,5%'s natriumhydroxidopløsning og to gange med 50 ml mættet natri-umchloridopløsning. Det organiske lag tørres over natri-30 umsulfat, inddampes, og remanensen behandles med 3,0 g vandfrit natriumacetat og 15 ml eddikesyreanhydrid. Blandingen opvarmes til 120°C i 1,0 time, afkøles og behandles ved 200 ml isvand. Det faste produkt, som dannes ved henstand ved 0°C, pulveriseres, frafiltreres og lufttørres, hvorved fås 35 2,97 g af et gråhvidt pulver. Dette materiale chromatografe res på en silicagelsøjle, idet der elueres med en 97:3 bian-
DK 159160 B
28 ding af benzen og methanol. Der fås i alt 2,00 g (65%) ren a- og /3-phenylhexadecaacetylmaltopentaosid med smp. 119-125°, [a]g5 + 137° (c 1,0, chloroform).
Analyse: 5 Beregnet for C68H88°42: C = 51,77%; H = 5,62%;
Fundet: C « 51,62%; 51,13%; H = 5,70%; 5,47%.
fD) Fremstilling af (4-nitrophenvl) hexadecaacetvlmaltopentao-sid 10 CH20Ac CH20Ac CH20Ac S^ i/ —^\j \j/ ^ \0Ac /1 \0Ac y (oAc /j —. + N0-+BF.- CH,C1, acQxL_- |/q--J \ „ Yn--Nj / ό / q \ 2 4 —2—2> 15 OAc OA c OAc J3 CH2OAc CH2OAc ch2oac 20 M r°N ( Ni
JpYo- -fc_|4 ηο>--2 OAc OAc OAc '—' J3 25
En opslæmning af 0,85 g (6,4 mmol) nitroniumtetra-fluorborat i 10 ml tør dichlormethan under en argonatmosfære behandles med en opløsning af 1,00 g (0,64 mmol) phenylhexa-decaacetylmaltopentaosid fremstillet ovenfor under (C) i 12 30 ml dichlormethan. Den fremkomne blanding omrøres i 20 minutter ved stuetemperatur, hældes i 70 ml omrørt, kold, mættet natriumchloridopløsning, og det udskilte organiske lag tørres over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet fordampes under formindsket tryk, hvorved fås 1,05 g af et gult fast stof, som 35 omkrystalliseres fra 30 ml ethanol, hvorved fås 0,87 g af et gråhvidt pulver. Produktets struktur bekræftes af følgende
DK 159160 B
29 data: λ c$[|gH 290 ran (e 5550), 210 ran (e 7750), % NMR-spektrum (220 MHz) δ 7,75 (AA'BB*, JAB = 9,5 Hz) 4H (C6H4), 5,75 (d, J = 4 Hz) (Hiø), 5,78-3,85 (række af multipletter) (OCH, OCH2), og 2,22-1,93 ppm (række af singletter) 48H (CH3CO).
5 Ved omkrystallisationer af det rå (4-nitrophenyl)- hexadecaacetylmaltopentaosid fra ethanol fås en prøve med λ max (CH3OH) 290 nm (e 6650) og 212 (7700).
(El Fremstilling af (4-nitrophenvllmaltopentaosid 10 CH0OAc CH„0Ac CH~0Ac ·
Lio i-io 1-i.o
ι/l \j /' \. i/1 \ NaOCH3/CH3OH
K OAc /1 \ OA c 1 X \0Ac / \ -►
AcO\|_ lO--^ j- |' 0--\|_.._)/ O —\Q/ N02 15 OAc OAc OAc 3
CH-OH CH_OH CH0OH
l_lo jJ.o Li-o ” LT )l i N jJTn HO _Y O-- N--YO--\-Y o —) N02
OH OH OH W
“3 25
En opløsning af 430 mg (0,27 mmol) (4-nitrophenyl)he-xadecaacetylmaltopentaosid fremstillet som ovenfor under (D) i 5 ml ethanol behandles med en opløsning af 4,7 ml 7,8 30 x ίο-4 M natriummethoxidopløsning i methanol, hvorefter der omrøres i 17,5 timer ved stuetemperatur. Opløsningen koncentreres under en tør nitrogenstrøm, og den omrørte remanens behandles med 40 ml ether til fældning af et fast stof, som frafiltreres og lufttørres, hvorved fås 247 mg (98%) af et 35 svagt gult pulver, λ max (H2O) 303 nm (e 5980), 215 (5530).
Ved HPLC (Waters Associates μ Bondapak®/Carbonhydrate, 80%
DK 159160 B
30 acetonitril/vand, 254 nm, UV-detektor) af produktet fås to toppe med samme intensitet om med retentionstider på 10,9 og 12,3 minutter svarende til 4-(nitrophenyl)maltopentaosid og et uidentificeret materiale.
5 (ΓΪ Fremstilling af q- οσ B-(4-nitrophenvlΪmaltonentaosid CH-OAc CH-OAc CH9OAc ·
l_Lo i—o J—O
I λ \ A \, / \| NaOCH,/CH,OH
KoAc J (oAc J \OAc /1 -2-2-► 10 aco\i—|/o—IN—j/o——|/o—<n\ no2 OAc OAc OAc J3 15 ch2oh ch2oh ch2oh ΙχΟΗ ) KoH \ ((oh” > ho\_fo—JNp^/o-sX)) no2
OH OH OH
20 3 6,1 g (3,8 mmol) (4-nitrophenyl)hexadecaacetylmalto-pentaosid fremstillet som ovenfor under (D) blandes med 150 ml methanol og behandles med 4,1 ml 0,15 M natriummethoxid i 0,62 mmol methanol. Den fremkomne gule opløsning omrøres 25 i 22 timer ved stuetemperatur. Opløsningen neutraliseres emd 1%'s methanolisk saltsyre, og opløsningsmidlet fjernes delvis under formindsket tryk til initiering af fældning.
Den resterende opløsning sættes langsomt til 370 ml diethyl-ether under kraftig magnetisk omrøring. Blandingen omrøres 30 i yderligere 1 time til fuldstændig fældning. Ved filtrering og tørring under en nitrogenatmosfære fås 3,24 g (90%) cremefarvet fast stof. λ max H20 303 (e = 7310) 217 (e = 5385).
Ved HPLC (propylethylendiaminmodificeret siliciumdioxid (8 μ partikler) 4,1 mm i.d. x 25 cm, 25/75 H2O/CH3CN, 254 nm-35 detektor) fås to hovedkomponenter, 56% og 30% der identificeres som a- og ^-isomere af (4-nitrophenyl)maltopentaosid i DK 159160 B .
31 forholdet 65:35.
En portion af dette materiale chromatograferes på "Sephadex"® G-15 og elueres med vand, hvorved der fås en midterfraktion, som lyofiliseres. Der fås et cremefarvet 5 fast stof. Denne prøve udviser λ H2O max. 303 (e = 9160), 219 (€ =6590) . Ved HPLC fås to hovedkomponenter, 66% og 30%. l-H NMR (220 mHz) målt i D20: 7,72 (centrum for aryl, AA'BB' mønster, J^b = 9/5 Hz), 5,76 (d, J = 4Hz, Hlf af a-isomer), 5,45-5,27 (m, HC(OR) (OR')), 4,23-3,32 (m, CH og 10 CH2). Forholdet α:β er ca. 62:38.

Claims (2)

1. Nitroaryl-malto-n-osider, kendetegnet ved, at de har den almene formel CH0OH Γ CHpOH Ί CH20H 5 ^0 Jlo i-lo OH L 0H Jn °H 10 hvor konfigurationen af substituenten -OR på det anomere carbonatom er a- eller /?-, n er det hele tal 2, 3 eller 4, og R betyder en substitueret aromatisk gruppe med den almene formel A 15 no2—P 4} Y i hvilken Y hver gang betyder H, N02f halogen, <^-04-alkyl, OR1 eller COOR^, hvor R1 betyder en C^-C6-alkylgruppe.
2. Fremgangsmåde til fremstilling af nitroaryl-malto-20 n-osider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man på i og for sig kendt måde omsætter (a) peracetyllerede malto-n-osider med den almene formel CH2OAC " CH20AC ‘ ch2oac 1—Q H hL—OH hJ-OH PaT ^L.O—Ι(οαΓ ^0AC OAc *- 0Ac-*n OAc 30. hvilken Ac betyder en acetylgruppe, og n er det hele tal 2, 3 eller 4, med en phenol med den almene formel 35. hvilken Y har den ovenfor angivne betydning, i nærværelse af en katalysator ved en temperatur i området ca. 80-120°C, DK 159160 B 33 (b) nitrerer det i trin (a) dannede produkt, idet man bringer dette produkt i kontakt med (1) saltpetersyre i en blanding af eddikesyre og svovlsyre, eller 5 (2) en nitroniumforbindelse valgt blandt nitroniumtetrafluor- borat, nitroniumhexafluorphosphat og nitroniumtrifluormethan-sulfonat indeholdt i dichlormethan, chloroform eller 1,2-dichlorethan, og (c) deacetylerer det i trin (b) fremstillede produkt, idet 10 man bringer det i kontakt med (1) en katalytisk mængde af et alkalimetal-(lavere alkoxid) indeholdt i den tilsvarende alkohol, eller (2) en opløsning af vandfri ammoniak eller HC1 i methanol.
DK315877A 1976-07-13 1977-07-12 Nitroaryl-malto-n-osider samt fremgangsmaade til fremstilling deraf DK159160C (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70497576A 1976-07-13 1976-07-13
US70497476A 1976-07-13 1976-07-13
US70497576 1976-07-13
US70497476 1976-07-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK315877A DK315877A (da) 1978-01-14
DK159160B true DK159160B (da) 1990-09-10
DK159160C DK159160C (da) 1991-02-18

Family

ID=27107418

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK315877A DK159160C (da) 1976-07-13 1977-07-12 Nitroaryl-malto-n-osider samt fremgangsmaade til fremstilling deraf

Country Status (9)

Country Link
CA (1) CA1096376A (da)
CH (1) CH630096A5 (da)
DE (1) DE2731372A1 (da)
DK (1) DK159160C (da)
FR (1) FR2358419A1 (da)
GB (1) GB1570152A (da)
IE (1) IE45357B1 (da)
LU (1) LU77750A1 (da)
NL (1) NL188646C (da)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1104912A (en) * 1976-07-13 1981-07-14 Robert C. Menson Method and test kit for serum amylase assay
AT362526B (de) * 1977-09-13 1981-05-25 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase
CA1190223A (en) 1977-11-01 1985-07-09 National Research Development Corporation Substrates for enzymes
JPS60997B2 (ja) * 1978-01-31 1985-01-11 東洋紡績株式会社 アミラ−ゼ活性測定法

Also Published As

Publication number Publication date
GB1570152A (en) 1980-06-25
IE45357L (en) 1978-01-13
LU77750A1 (da) 1978-02-02
FR2358419B1 (da) 1982-06-25
CA1096376A (en) 1981-02-24
NL188646B (nl) 1992-03-16
FR2358419A1 (fr) 1978-02-10
DK315877A (da) 1978-01-14
IE45357B1 (en) 1982-08-11
DE2731372A1 (de) 1978-01-19
CH630096A5 (en) 1982-05-28
NL7707683A (nl) 1978-01-17
DE2731372C2 (da) 1988-02-25
DK159160C (da) 1991-02-18
NL188646C (nl) 1992-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4145527A (en) Nitro aromatic glycosides
Williams et al. Selective acylation of pyranoside—i.: Benzoylation of methyl α-D-glycopyranosides of mannose, glucose and galactose
HAYAKAWA et al. Direct C-8 lithiation of naturally-occurring purine nucleosides. A simple method for the synthesis of 8-carbon-substituted purine nucleosides
JPS6127000B2 (da)
GB2058780A (en) Maltoheptaoside derivatives
JP3725198B2 (ja) ピリピロペン誘導体
US4147860A (en) Process for preparing nitroaromatic glycosides
Mishra et al. Synthesis of the hyper-branched core tetrasaccharide motif of chloroviruses
Sakata et al. Synthesis and reactions of glycosyl methyl-and benzyl-xanthates: A facile synthesis of 1-thioglycosides
DK159160B (da) Nitroaryl-malto-n-osider samt fremgangsmaade til fremstilling deraf
Barros et al. Fast galloylation of a sugar moiety: preparation of three monogalloylsucroses as references for antioxidant activity. A method for the selective deprotection of tert-butyldiphenylsilyl ethers
Krag et al. Direct chemical glycosylation with pentenyl-and thioglycoside donors of N-acetylglucosamine
US9481701B2 (en) Method for 2-sulfation of glycosides
CA1096377A (en) Nitro aromatic glycosides
Binkley et al. Reactions of per-O-acetylated carbohydrate triflates with halide ions
CN113185501B (zh) 一种天然产物夏佛塔苷的高效全合成方法及应用
Yamazaki et al. Synthesis of type 2 Lewis antigens via novel regioselective glycosylation of an orthogonally protected lactosamine diol derivative
CN110003291A (zh) 一种氟代糖基修饰的紫杉醇类化合物及其合成方法和应用
CN114671849A (zh) 一种吡喃糖环的开环方法及其产品和应用
CA2343803A1 (en) Synthetic method for the preparation of the antineoplastic agent etoposide
CN114478659B (zh) 一种二糖化合物的制备方法
JP3101002B2 (ja) α−Ｄ−グルコピラノシド誘導体の製造方法
US6420552B1 (en) Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
US5300634A (en) Process for producing maltooligosaccharide derivative
Nishino et al. Regioselective (phenylcarbamoyl) ation of polyhydroxy compounds by phenyl isocyanate-zinc naphthenate

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired