DK159162B - Analogifremgangsmaade til isolering af en endogen, anorexogen substans, kaldet satietin. - Google Patents

Description

i

DK 159162 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til isolering af en endogen, anorexogen substans, kaldet satietin, med mæthedsvirkning på fødeindtagelsens centralregulering. Substansens specifikke virkning skyldes 5 den selektive inhibering af fødeindtagelsen, og samtidig har substansen ingen anden virkning på centralnervesystemet, der kan hverken iagttages depressiv virkning eller nogen anden virkning, der inhiberer motorisk aktivitet.

Blandt lægemidlerne og medicinerne anvendes først og 10 fremmest amphetamin-lignende substanser for tiden til reducering af appetit, den anorexogene virkning er slet ikke specifik, disse forbindelser har også andre uønskede central-og perifer-sympathomimetiske eller -serotonergiske virkninger. En yderligere ulempe ved dem er udviklingen af tolerance 15 over for den anorexogene virkning, hvilket interfererer med deres effektivitet i betydelig grad. Cholecystokinin, et formodet mæthedssignal ved modulerende fødeindtagelse, er kun af teoretisk interesse, eftersom det har direkte virkninger på mave- og tarmområdet, og det er et anorexogen af 20 lav styrke.

Der er således ingen exogen eller endogen, anorexogen substans til rådighed, der selektivt påvirker centralreguleringen af fødeindtagelse uden uønskelige bivirkninger, og som har en ønsket styrke til terapi.

25 Det er derfor, at den her omhandlede erkendelse, at der fra human- og dyreplasma kan isoleres en hidtil ukendt forbindelse, kaldet satietin, der har en selektiv og yderst stærk virkning som mæthedssignal, idet den inhiberer fødeindtagelse hos rotter, der ikke har fået føde i 96 timer, har 30 stor betydning også med henblik på medicinsk behandling af en hvilken som helst type hyperphagia og ledsagende obesitas. Opfindelsen har i overensstemmelse hermed til formål at tilvejebringe en metode til isolering af satietin fra human-og dyreplasma. Satietinet synes at have en molekylvægt på 35 over 60.000. I dets hydrolysat kan findes aminosyrer og carbonhydrater, og blandt aminosyrer foreligger asparagin, 2

DK 159162 B

leucin, glutaminsyre og lysin i den største mængde, threonin, glycin, cysteinr tyrosin-, phenylalanin, arginin, histidin, prolin, serin, alanin, valin, methionin, isoleucin og tryptophan kan findes i mindre mængde, og hvad angår carbon-5 hydrater, kan glucose, galactose, mannose, rhamnose og ara-binose findes foruden andre reducerende substanser i mindre mængde. Identifikationen af dens kemiske struktur er beskrevet i detaljer nedenfor. Undersøgelserne af dens molekylstruktur er under udførelse.

10 Opfindelsens formål opnås ved den her omhandlede analogifremgangsmåde, som er karakteriseret ved, at human-eller-dyreserum filtreres gennem et membranfilter, der lader substansen med en molekylvægt på under 50.000 dalton passere, filtratet inddampes til tørhed og opløses i vand, der gen-15 nemføres en adskillelse ved gelchromatografi på en gel med et hulrumsvolumen på under 50.000, elueres fraktioneret med ------en neutral, vandig opløsning indeholdende mindst 0,1% salt, de biologisk aktive fraktioner opsamles og inddampes til tørhed, opløses i vand, adskilles yderligere ved gentagen 20 chromatografi på en gel med et hulrumsvolumen på under 50.000 og elueres fraktioneret med destilleret vand, og de biologisk - aktive fraktioner frysetørres.

Det første trin af den her omhandlede fremgangsmåde er ultrafiltreringen af human- og dyreserum gennem et filter, 25 der lader substansen op til en molekylvægt på 50.000 passere. "Amicon UM 10" eller andre membraner af "Amicon"-typen eller en "Sartorius"-membran med en lignende porestørrelse kan anvendes. Erfaringsmæssigt har membraner af typen "Amicon UM 05", "UM 2”, "DM 5", "UM 10", "PM 10", "UM 20", "PM 30" 30 og "XM 30" eller "Sartorius 121 33", "121 34" og "121 36" vist sig at være egnede til dette formål.

Membranfiltrering gennemføres under tryk, fortrinsvis på 3 atm, under konstant omrøring. Serummet opdeles i to fraktioner ved membranfiltreringen. De molekyler, der er 35 større end membranens porestørrelse, skilles fra de mindre.

Ved denne fremgangsmåde fremkommer- den- her omhandlede sub- O 3

DK 159162 B

stans, satietinet, overraskende i total mængde i den fraktion, der indeholder substanser med ringe molekylvægt (under 10.000 daltons), til trods for, at filtreringen gennemføres med et membranfilter, der lader substanser med en molekylvægt 5 på under 50.000 passere, samt at satietin som omtalt ovenfor antages at have en molekylvægt på mellem 60.000 og 100.000 dalton. Denne atypiske adfærd af den hidtil ukendte substans er fordelagtig set ud fra den foreliggende opfindelse, fordi den i væsentlig grad letter fraskillelsen af den hidtil ukendte substans fra andre substanser, der er tilsvarende store molekyler. Den hidtil ukendte substans kan således findes i filtratet fra membranfiltreringen i en 10 - 20 gange så stor koncentration i sammenligning med det oprindelige tørsubstans-indhold i serummet sammen med andre substanser med meget 15 mindre molekylvægt.

Den andet trin af fremgangsmåden er opløsningen i destilleret vand af den tørre remanens, der er fremkommet ved inddampning af filtratet, hvorpå den chromatograferes på en gel med et hulrumsvolumen på ca. 50.000. Med gode resulta-20 ter kan der først og fremmest anvendes "Sephadex G-15"-gel og dernæst geler af typen "Bio-Gel G-10", "G-25", "G-50", "G-75" og "Bio-Gel P-2”, "P-4", "P-6", "P-10", 't>-30" og "P-60".

Søjlen elueres raed fysiologisk natriumchloridopløsning eller med andre opløsninger indeholdende mindst 0,1% natriumchlorid 25 eller et andet salt, der sikrer en neutral pH-værdi. Under elueringen fremkommer den hidtil ukendte substans i eller nær hulrumsvoluminet [det er kendt, at ved gelchromatografiske adskillelser er "hulrumsvoluminet" af gelen et betydningsfuldt, karakteristisk træk: alle de molekyler, der ligger nær 30 ved eller over den øvre grænse for gelens selektive fraskil-lelsesvolumen (ved en "Sephadex G-15"-gel er det 1500) eluerer nær ved hulrumsvoluminet ved elueringsvoluminet, hvilket betyder 25 - 35% af søjlens volumen], medens de ledsagende substanser med mindre molekylvægt, der er til stede selv efter 35 merabranfiltrering, fremkommer senere ved større eluerings-volumen, adskilt i flere spidser. Biologisk aktive fraktioner opsamles og frysetørres.

4

O

DK 159162 B

På tredje trin af isoleringen fraktioneres denne tørre remanens indeholdende den multikoncentrerede, aktive substans igen ved gelchromatografi. Som resultat af dette trin kan der opnås et rent, effektivt produkt, der er egnet til 5 terapeutiske formål, ved eluering med destilleret vand. Denne anden chromatografiske rensning gennemføres ligeledes på en søjle med et hulrumsvolumen under 50.000. Den tørre remanens, der er fremkommet ved den første fraktionering, opløses i destilleret vand- -i den minimale, nødvendige mængde og adskilles 10 på en søjle af "Bio-Gel P-30"-gel samt elueres med destilleret vand. De biologisk aktive fraktioner opsamles og lyofi-liseres.

På denne måde få‘s et rent, homogent produkt, men hvis den elektroforet!ske undersøgelse af produktet viser til-15 stedeværelsen af nogle forureninger, kan den aktive substans renses yderligere ved chromatografi på en diethylaminoethyl--cellulose-søjle. Substansen ledes til diethylaminoethyl--cellulose-søjlen i destilleret vandopløsning, søjlen vaskes med destilleret vand, hvorpå den elueres med 0,1 N phosphat-2o -puffer-opløsning (pH-værdi 6,5) - 0,1 N phosphat-puffer-op- løsning (pH-værdi 6,5) indeholdende 5% NaCl-opløsningsgradient. Den rene og biologisk aktive substans elueres fra søjlen med 0,1 N phosphat-puffer-opløsning (pH-værdi 6,5) + 0,5 - 0,7% NaCl, den eluatfraktion,· der indeholder den rene substans, lyo-25 filiseres, hvorefter substansen afsaltes fra de uorganiske syrer på "Bio-Gel P-30"-gel og elueres med destilleret vand.

Homogeniteten af den rene substans kan undersøges ved elektroforese på en polyacryramidger indeholdende 15% acrylamid med en pufferopløsning med en pH-værdi på 4,5 ved 30 100 V og en strøm på 4 A pr. rør.

Den hidtil ukendte substans, satietinet, er en hvid, bomuldsagtig substans, dens kemiske analyse viser, at det er et glycopeptid, og efter dets sure hydrolyse kan aminosyrer og carbonhydrater påvises. Resultaterne af de undersøgelser, 35 der sigter mod en definition af den kemiske sammensætning og struktur af satietin, der er udvundet fra humanserum, er angivet nedenfor:

O

5

DK 159162 B

Aminosyre- og saccharid-sammensætningen af produktet fremkommet ved hydrolyse_____________

Aminosyrer: lysin 6,0% 5 histidin 1,6% arginin 3,0% cystein 2,3% asparaginsyre 7,0% threonin 3,1% 10 glutaminsyre 9,6% serin 1,7% prolin 2,2% glycin 1,2% alanin 3,8% 15 valin 3,6% methionin 1,3% isoleucin 1,0% leucin 6,0% tyrosin 1,8% 20 phenyl-alanin 3,5% tryptophan 1,9% totalt aminosyreindhold 60,6% (vægt/vægt) I produktet er der 13% reducerende substanser, først og fremmest carbonhydrater 25 glucose 2,8% galactose 2,9% mannose 2,0% rhamnose 1,9% arabinose 1,1% 30 totalt carbonhydratindhold 10,7% (vægt/vægt)

Vandindhold: Produktet indeholder også fysisk bundet vand i en mængde på 10%.

Analyse af N-afsluttet sekvens:

Under yderligere undersøgelse af produktet anvendes 35 de gængse metoder til analyse af N-afsluttet remanens, dvs. med dansyIderivater og spaltning med aminopeptidase M-enzym, og der kan ikke påvises nogen remanens, hvilket betyder til- 686

O

6

DK 159162 B

stedeværelsen af en maskeret N-afsluttet remanens.

Enzymatisk hydrolyse med trypsin Satietin kan praktisk talt ikke digereres med trypsin i løbet af 2 timer i en ammonium-hydrogencarbonat-5 -puffer med en pH-værdi på 8,3. Farveintensiteten af de fremkommende peptid-zoner er svag.

Virkning af carboxymethylering på strukturen Satietin, der synes at være en homogen substans med en molekylvægt på ca. 68..0.00 under polyacrylamidgel-elektro-10 forese efter binding af SH-grupperne med bromeddikesyre, synes at have 4 komponenter i det elektroforetiske billede, ~~ der fås ved elektroforese med natrium-dodecyl-sulfat: kom ponenten med en molekylvægt: på car. 68". 000" er til stede, men der er en anden med en molekylvægt på 18.000 og to, lige mo-15 bile, men godt adskilte komponenter méd en molekylvægt på ca. 28.000.

— Virkning af carboxymethylering på aktiviteten

Satietin mister sin biologiske aktivitet, hvis det carboxymethyleres med bromeddikesyre.

20 UV-spektrum

Det ultraviolette absorptionsspektrum af satietin viser ikke absorptionsmaksimum, der viser sig et "plateau" ved ca. 275 - 280, der kan være et karakteristisk- træk for protein-peptid. Ahsorptionsspek.tret. er illustreret i fig. 2. 25 Molekylvægt

Det interessante, karakteristiske træk ved satietin er dets ovenfor omtalte, særlige adfærd under de forskellige måling-er at molekylvægten: - — 1) Under ultrafiltrering på membran ser det ud til at have 30 en molekylvægt på under 10.000.

2) Ved gelchromatografisk undersøgelse ser det ud til at have en molekylvægt på over 40.000, mellem 60.000 og 100.000.

3) Ved polyacrylamid-gel-elektroforese går det parallelt 35 sammen med molekyler med en molekylvægt mellem 65.000 og 68.000.

.686

O

7

DK 159162 B

4) Ved ultracentrifugering ser det ud til at have en molekylvægt på under 10.000.

Den hidtil ukendte substans, der kan fremstilles ved den her omhandlede fremgangsmåde, kan ikke alene udvin-5 des fra humanserum, men serummet fra forskellige dyr kan også anvendes. Selv om de substanser, der er opnået fra serummet fra forskellige pattedyr, såsom kvæg, hunde, katte, heste, marsvin, kaniner og forskellige rotte-stammer (Wistar, CFY, SHR og Long Evans), ved samme metode, frembyder forskel 10 i styrke, er virkningens specifikke egenskaber, dvs. den selektive inhibering af fødeindtagelse, den samme ved hvert produkt.

Produktets virkning på fødeindtagelsen undersøges på CFY-hunrotter, der vejer 200 - 240 g. Dyrene har ikke 15 fået føde i 96 timer før forsøgene, vand er givet ad libitum. Under hensyntagen til den aggressivitet, der følger af ud-hungring, anbringes dyrene hver for sig i enkeltbure. Hvert dyr indgives intravenøst en dosis på 10 mg/kg satietin opløst i 0,5 ml fysiologisk saltopløsning. Dyrene i kontrolgruppen 20 får kun injiceret 0,5 ml fysiologisk saltopløsning uden substans intravenøst. 1 time efter behandlingen tilbydes dyrene føde, de gængse fødepellets indeholdende albumin, fedt, carbon-hydrat og vitaminer, i ubegrænset mængde. Fødekonsumeringen måles 1, 5 og 24 timer efter, at foderet er givet (eller 2, 6 25 og 25 timer efter behandlingen). Resultaterne er angivet i fig. 1. Den første kolonne repræsenterer den mængde af føden, der ædes på 1 time, den skraverede fødemængden på 5 timer, og den tredje fødemængden på?24 timer, og under kolonnerne er de dyr angivet, ud fra hvis serum satietinprøven er eks-30 traheret. De fremkomne resultater godtgør den ekstreme effektivitet af det her omhandlede produkt. Dets virkning overgår virkningen af de hidtil kendte substanser med samme virkning, og samtidig har cholecystokinin og arentenin, som produceres fra ekstrakt fra tolvfingertarmen som beskrevet af Ugolev et 35 al. overhovedet ingen virkning på dyr, der ikke har fået føde i 96 timer. Det,forhold, at den hidtil ukendte substans har totalvirkning selv i dette tilfælde, beviser dens enestående, høje aktivitet.

—» coe

O

8

DK 159162 B

Til påvisning af den specifikke og selektive virkning af den hidtil ukendte substans undersøges denne med henblik på de bevirkninger, der iagttages ved substanser med lignende virkning (amphetamin-lignende substanser). Ved det 5 modificerede springforsøg, der er metoden til undersøgelse af den centraldepressive virkning [J. Knoli og B. Knoll, Arch, int.Pharmacodyn. 148, 200 - 217 (1964)] påvirker den hidtil ukendte substans ikke undvigelsesadfærden selv i en dosis, der er den dobbelte af den, der inhiberer fødeindtagelse. Ved 10 det forsøg, der gennemføres med et motimeter [J. Knoll, Arch.

int.Pharmacodyn., 130, 141 - 154 (1961)] har end ikke de store intravenøse doser af den hidtil ukendte substans nogen som helst virkning med hensyn til inhibering eller forøgelse af motiliteten. Det er kendt, at substanser med depressiv virk-15 ning påvirker de betingede reflekser stærkt, og det er grunden til, at lignende forsøg gennemføres med den hidtil ukendte substans på rotter ved springforsøget [J. Knoil og B. Knoil, B. Arzneimittel-Forsch. 8, 330 - 333 (1958)], der er egnet til undersøgelse af betinget undvigelsesadfærd. Satietin har 20 også vist sig at være ineffektivt i denne henseende. I betragtning af det forhold, at cholecystokinin har en karakteristisk kontraherende virkning på længdemusklen i ileum hos marsvin [Knoil et al., Pharmacology, 12, 283-289 (1974)], undersøges den hidtil ukendte substans også i denne henseende på dette 25 isolerede organ, og den viser sig at være ineffektiv sammenlignet med cholecystokinin. Alle disse forsøg godtgør de fordelagtige, karakteristiske træk ved satietin, som kan opsummeres som følger: a) Satietin er en endogen substans af naturlig oprindelse, 30 b) det har ingen væsentlig toksicitet, c) dets virkning er selektiv, idet det inhiberer centret for fødeindtagelse ved indvirkning på fødeindtagelsens centralregulering, d) dets aktivitet er forskellig fra aktiviteten af andre ano- 35 rexogene substanser, idet det er fri for depressive eller stimulerende virkninger,

Bl. nr. 686

O

9

DK 159162 B

e) det er meget kraftigt, eftersom det er i stand til at in-hibere fødeindtagelse hos rotter, der ikke har fået føde i 96 timer, f) dets virkning er dosisafhængig, en maksimal inhibering 5 af fødeindtagelse nås med 200 - 300 μg/rotte ved intra- cerebroventriculær indgift, g) spidsvirkningen nås på 5 timer efter den intracerebro-ventriculære indgift af satietin, og virkningen er langvarig, den fortsætter i 24 timer, 10 h) virkningen er reversibel.

Den praktiske gennemførelse af den her omhandlede fremgangsmåde illustreres ved nedenstående eksempel.

100 liter humanserum ultrafiltreres gennem en "Amicon UM 10M-membran. Der opnås 700 ml filtrat, der fryse-15 tørres, og remanensen opløses i 30 ml destilleret vand. Opløsningen adskilles på en "Sephadex G-15"-søjle (diameter 5 cm, længde 90 cm), der elueres med 0,9% vandig NaCl-opløs-ning. Der opsamles fraktioner på 10 ml hver. Fraktionerne mellem 50 og 60 (mellem 500 og 600 ml) viser sig at være bio-20 logisk aktive. Disse fraktioner opsamles, frysetørres og opløses i 10 ml destilleret vand. Opløsningen adskilles på en "Bio-gel P-30"-gelsøjle med dimensionerne 2,5 x 90 cm, der elueres med destilleret vand. Der opsamles fraktioner på 10 ml. Fraktionerne mellem 11 og 15 viser sig at være biolo-25 gisk aktive. Disse fraktioner opsamles og lyofiliseres. Afhængigt af kvaliteten af det oprindelige serum opnås 200 - 240 mg tørt produkt, der er en snehvid, bomuldsagtig, homogen og ren substans, der er egnet til terapeutisk anvendelse.

30 35

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåde til isolering af en endogen, anorexogen substans, kaldet satietin, med mæthedsvirkning på fødeindtagelsens centralregulering, kendeteg- 5 net ved, at human- eller dyreserum filtreres gennem et membranfilter, der lader substansen med en molekylvægt på under 50.000 dalton passere, filtratet inddampes til tørhed og opløses i vand, der gennemføres en adskillelse ved gel-chromatografi på en gel med et hulrumsvolumen på under 10 50.000, der elueres fraktioneret med en neutral, vandig opløsning indeholdende mindst 0,1% salt, de biologisk aktive fraktioner opsamles og inddampes til tørhed, opløses i vand, adskilles yderligere ved gentagen chromatografi på en gel med et hulrumsvolumen på under 50.000 og elueres fraktioneret 15 med destilleret vand, og de biologisk aktive fraktioner frysetørres.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en vandig NaCl-opløsning som elueringsmiddel ved den første gelchromatografiske frak- 20 tionering.

3. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de biologisk aktive fraktioner af elu-atet opsamles under den anden gelchromatografiske fraktionering og, om ønsket, lyofiliseres efter en yderligere chroma- 25 tografisk rensning.