DK159168B - Testmateriale med poroes baerematrix til bestemmelse af naervaerelsen af en ion i en vandig testproeve samt materialets fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

DK 159168 B

o

Den foreliggende opfindelse angår målingen af ioner, især ioner i vandig opløsning, samt et testmateriale eller -middel til udførelse af sådanne målinger. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en hurtig og let meto-5 de til bestemmelse af sådanne ioner, hvorved resultaterne bliver tilgængelige for den, der udfører analysen, øjeblikkeligt efter blot at have tilvejebragt kontakt mellem test-prøveopløsningen og testmaterialet eller -midlet. Der er intet behov for besværligt anvendeligt og dyrt elektronisk 10 udstyr såsom ionspecifikke elektroder, flammefotometre eleller atomabsorptions-spektrofotometre. Det er heller ikke nødvendigt at tage tilflugt til tidsrøvende vådkemiske metoder, f.eks. titrering eller andre laboratoriemetoder. Opfindelsen sætter den, der foretager en analyse, i stand til 15 blot at tilvejebringe kontakt mellem testprøven og et strimmelmateriale eller lignende testmateriale og iagttage ethvert detekterbart respons.

Bestemmelsen af vandig ionkoncentration finder anvendelse inden for talrige områder af teknikken. Ved vand-20 rensning må calciumkoncentrationen styres omhyggeligt til fastlæggelse af graden af mætning af et ionbytterharpiks--afioniseringsmateriale. Måling af natriumioner og andre ioner i havvand er af betydning ved fremstillingen af drikkevand om bord på et skib i søen. Måling af kaliumniveauet 25 i blod hjælper lægen ved diagnose af betingelser, der fører til muskelirritabilitet og excitatoriske ændringer i den myocardiale funktion. Sådanne betingelser omfatter oli-gori, anuri, urinobstruktion og renalsvigt på grund af chok. Måling af lithiumniveauer i blodet er særligt vigti-30 ge, eftersom de toksiske dosisniveauer kun er lidt højere end de terapeutiske niveauer, der anvendes ved psykiatrisk behandling.

Det skulle være overflødigt at anføre, at en hurtig og let gennemførlig metode til bestemmelse af ionkoncentra-35 tion i høj grad vil forøge disse tekniske områders stade

O

DK 159168 B

2 samt andre områder, hvor sådanne hurtige og nøjagtige bestemmelser vil være en fordel. Hvis således f.eks. en tekniker i et medicinsk laboratorium nøjagtigt kan måle ionniveauet af natrium, lithium, kalium eller calcium i en 5 prøve af serum eller helblod i løbet af sekunder eller minutter, vil sådanne hurtige resultater assistere lægen ved diagnose og forøge laboratorieeffektiviteten flere gange.

Tidligere metoder til bestemmelse af ioner i opløsning omfatter flammefotometri, atomabsorptionsfotometri, 10 anvendelse af ionspecifikke elektroder og teststrimmel-metoder. Anvendelsen af visse forbindelser og sammensætninger, der selektivt isolerer visse ioner fra en prøveopløsning, er blevet populære i ionspecifikke elektroder. Disse stoffer, der kendes som ionophorer, har den evne, at de 15 selektivt kan isolere ioner fra deres modioner, hvorved der bevirkes en ladningsadskillelse og en tilsvarende ændring i elektrisk ledningsevne i den fase, der indeholder ionophoren. Illustrerende for ion/ionophor-fænomenet er ionbestemmelser, ved hvilke der anvendes membranelektroder, 20 væske/væske-fordeling og fluorescens.

Ionspecifikke elektroder Når to opløsninger7 der har forskellige koncentrationer af ioner, adskilles ved hjælp af en elektrisk le-25 dende membran, frembringes der elektrisk potential (EMK).

Den i et sådant system udviklede EMK er en funktion af koncentration eller ionisk aktivitet. Dette fænomen udtrykkes matematisk ved hjælp af den velkendte Nernst-ligning: 30 RT γι°ι £ = — ln - (1) 1 hvilken £ er det foreliggende systems EMK, F er Faraday's 35 konstant (23.062,4 - 0,003 kalorier (volt-ækvivalenter) *") ,

O

DK 159168 B

3 R er gaskonstanten, T er temperaturen i °C, In er den naturlige logaritme, og γ og c betegner henholdsvis aktivitetskoefficienterne og de molale koncentrationer af den ion, der er tale om, idet tallet 1 betegner opløsningen på den ene 5 side af membranen, tallet 2 betegner opløsningen på den anden side, og n er det antal elektroner, der overføres ved reaktionen.

I sådanne membran-adskillelsesceller kan membranen være en simpel barriere af frittet glas, der tillader en lil-10 le, men målelig grad af iondiffusion fra én opløsning til den anden. Alternativt kan der anvendes en ikke-porøs, elektrisk ikke-ledende film, f.eks. af polyvinylchlorid, der er imprægneret med en ionophor. I fraværelse af ionophoren er filmen en isolator, og der kan ikke måles nogen EMK. Når den er 15 blandet med en ionophor, bindes der ladede ioner til filmen, og en lille, målelig strøm kan induceres til at løbe. Eftersom ionophoren er selektiv med hensyn til dens affinitet og således kun vil binde visse specifikke ioner, er sådanne celler ion-selektive. Enhver målelig EMK skyldes udelukkende 20 nærværelsen af disse ioner.

En celle til bestemmelse af kaliumioner (K ) kan således fremstilles ved anvendelse af en ionophor, der er spe-cifik for K , f.eks. valinomycin. I nærværelse af kalium tilvejebringer valinomycin en ledende bane tværs over en 25 membran ved binding og transport af K+, hvorved en lille strøm tillades at løbe. En referencekoncentration af K+ anbringes på den ene side af membranen, og testprøven anbringes på den anden side. Den udviklede EMK måles og anvendes til beregning af den ukendte koncentration ud fra ligningen 30 (1). Eftersom K+ bindes til valinomycin-membranen, fremkom mer den ledende bane kun for K+. Den udviklede EMK kan derfor udelukkende tilskrives K+-koncentrationsgradienten tværs over membranen.

Den strøm, der løber tværs over membranen, er så lil-35 le, at der ikke transporteres nogen signifikant mængde K+

O

DK 159168 B

4 eller modion gennem membranen. Elektrisk neutralitet af membranen opretholdes enten ved en omvendt strøm af hydrogenioner eller ved en parallelstrøm af OH -ioner. Denne anioneffekt kan formindske elektrodens specificitet mod 5 den tilsigtede ion og er en interferens, der skal gøres så lille som mulig.

En væsentlig vanskelighed ved anvendelsen af sådanne ionselektive elektroder har været den mærkbare formindskelse af nøjagtigheden og hastigheden for respons igen-io nem tiden. Endvidere producerer små ændringer i ionkoncentrationen sådanne små ændringer i EMK, at der kræves et kompliceret voltmeterudstyr.

Det har også vist sig, at visse antibiotika, f.eks. valinomycin, har en virkning på de elektriske egenskaber 15 af phospholipid-tolagsmembraner (biologiske membraner), således at disse antibiotika opløseliggør kationer inden i membranen i form af mobile ladede par, hvorved der tilvejebringes en "bærer"-mekanisme, ved hjælp af hvilken kationer kan krydse det isolerende carbonhydrid-indre af mem-20 branen. Sådanne komplekser har det ene formål at bære ladningen af komplekset gennem membranen således, at der kan bestemmes en spændingsdifference mellem opløsninger på hver side af membranen.

I CH-A-479870, der er indleveret den 9. august 1966, 25 beskrives anvendelsen af porøse membraner imprægneret med makrocycliske derivater af amino- og oxy-syrer i ionselektive elektroder. Materialer, der anvendes til fremstilling af membranen, er glasfritter og andre porøse membraner. Sådanne elektroder angives at være effektive til måling af 30 ionaktiviteter.

I USA-patentskrift nr. 4.053.381 (Hambien et al.) beskrives der en lignende teknologi, og der anvendes en ionspecifik membran med ionmobilitet tværs over denne.

I USA-patentskrift nr. 3.957.607 (Simon et al.) be-35 skrives der en fremgangsmåde til elektrokemisk bestemmelse

O

DK 159168 B

5 af kationer under anvendelse af en elektrode, der har en membran indeholdende neutrale ionophorer, der er i stand til at danne lipidopløselige komplekser med kationerne.

5 Væske/væske-fordeling

En anden kendt anvendelse af ionophorer ved ionbestemmelse er ved hjælp af væske/væske-fordeling. Ved denne metode opløses en hydrofob ionophor i et organisk opløsningsmiddel, der ikke er blandbart med vand. Eisenman 10 et al., J. Membrane Biol., 1,294-345 (1969), beskriver den selektive ekstraktion af kationer fra vandige opløsninger til organiske opløsningsmidler via makrotetralid--actin-antibiotika. Denne teknik indebærer blot, at man omryster en organisk opløsningsmiddelfase indeholdende 15 de pågældende antibiotika med vandige opløsninger inde holdende kationiske salte af lipidopløselige, farvede anio-ner, f.eks. picrater og nitrophenolater. Intensiteten af den organiske fases farve måles derpå spektrofotometrisk til angivelse af den mængde salt, der er blevet ekstrahe-20 ret. Faseoverføring er også blevet studeret af Dix et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 17,857 (1978) og i oversigter omfattende Burgermeister et al., Top. Curr. Chem., 69,91 (1977), Yu et al., "Membrane Active Complexones", Elsevier, Amsterdam (1974) samt Duncan, "Calcium in Bio-25 logical Systems", Cambridge University Press (1976).

Sumiyoshi et al., Talanta, 24, 763-765 (1977) beskriver en anden metode, der kan anvendes til bestemmelse af K+ i serum. Ved denne metode deproteiniseres serum ved hjælp af trichloreddikesyre, og der tilsættes et indika-30 torfarvestof, og der omrystes med et opløsningsmiddel såsom chloroform indeholdende valinomycin.

Fordelingen af en forbindelse er hurtig og effektiv mellem væsker, således som dette er påvist af Eisen-man, på grund af mobiliteten af ionophor-bæreren og ioner-35 ne, der tillader de transporterede arter at diffundere hur-

DK 159168B

O

6 tigt bort fra grænsefladen. En sådan mekanisme er normalt ikke mulig i den faste fase på grund af stivheden, immobiliteten og den praktisk taget manglende diffusion af materialer i en fast fase.

5

Fluorescerende anioner

Ved et andet forsøg på måling af ionaktivitet i vandige opløsninger anvendes der fluorescerende anioner, jfr. Feinstein et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 68, 2037-2041 10 (1971). Det angives, at tilstedeværelsen af kation-ionophor- -komplekser i organiske opløsningsmidler er kendt, men at kompleksdannelse i rent vandige medier tidligere ikke er blevet påvist. Feinstein et al. har vist eksistensen af sådanne komplekser i vand ved anvendelse af de fluorescerende 15 salte l-anilino-8-naphthalen-sulfonat og 2-p-toluidinyl-sul-fonat.

Det viste sig, at interaktion mellem ionophor-kation--komplekserne og de fluorescerende farvestoffer frembragte forøget fluorescens-emission, forøget levetid og polarisa-20 tion samt signifikant blåskift ved fluorescensspektrets emissionsmaksima. Ved konstante koncentrationer af ionophor og fluorophor viste intensiteten af fluorescens-emission sig at være en funktion af kationkoncentrationen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Chromophor-mærket ionophor 2

En ionbestemmelse er beskrevet i USA-patentskrift nr.

3 4.367.072, hvor der gøres brug af et konjugat af en iono 4 phor, der er covalent bundet til et chromophor-materiale.

5

Ved anvendelsen sættes konjugatet til en flydende prøve, 6 og fremkomsten af farve i opløsningen styres spektrofoto- 7 metrisk.

8

Den pågældende beskrivelse er begrænset til en op 9 løsningsbestemmelse, og det viser sig, at utilstrækkelig 10 farve udvikles til at muliggøre direkte visuel iagttagelse.

11

Endvidere er det støkiometriske forhold mellem chromophor

O

DK 159168 B

7 og ionophor fikseret i et sådant system på grund af den direkte binding mellem disse molekyler. På grund af denne direkte binding er det umuligt at regulere farveintensiteten, idet forholdet mellem ionophor og chromophor er fikseret.

5

Udformning af teststrimmel EP-A-41175 angår en ikke-porøs bærematrix, der er inkorporeret med en ionophor. Bæreren kan yderligere være inkorporeret med et reporter-stof, eller reporter-stoffet 10 kan sættes til testprøven. Ionophoren (og reporter-stoffet) inkorporeres på den ikke-porøse bærematrix som en film.

Ifølge den foreliggende opfindelse inkorporeres der ikke nogen ikke-porøs bærematrix, men tværtimod skal bærematrixen nødvendigvis være af porøs natur.

15 EP-A-125555 vedrører ligeledes en ikke-porøs bære matrix, der er inkorporeret med en ionophor og et reporter--stof. Den pågældende ansøgning afviger således fra den foreliggende opfindelse på tilsvarende måde som beskrevet i det foregående afsnit.

20 I EP-A-125554 er der beskrevet en hydrofil bærema trix inkorporeret med findelte småkugler af et hydrofobt medium. Småkuglerne (eller dråberne) indeholder en ionophor og et reporter-stof. De dannes ved fremstilling af en emulsion af den hydrofobe blanding og af en blanding af 25 vand og en hydrofil polymer, f.eks. gelatine. Emulsionen overtrækkes derpå på et bæremateriale, og vandet fordampes, hvorved der efterlades den hydrofile polymer og de findelte småkugler eller dråber. Emulsionen kan overtrækkes på papir, afdampes og bæreren kan fastgøres til en un-30 derstøtning. Under alle omstændigheder indeholder testmaterialerne findelte småkugler eller dråber af hydrofobt medium indeholdende en ionophor og et reporter-stof i en matrix af hydrofilt medium. Den foreliggende opfindelse afviger fra beskrivelsen i den sidstnævnte ansøgning 35 derved, at ionophoren og reporter-stoffet inkorporeres i

O

DK 159168 B

8 en porøs bærematrix direkte i form af en homogen hydrofobkomposition. Der er ikke involveret nogen emulsion.

Sammendrag 5 På baggrund af de teknologiske udviklinger, der har ført til den foreliggende opfindelse, må det nævnes, at der kendes mange metoder til bestemmelse af ioner i opløsning. Instrumentmetoder omfatter sådanne komplicerede metoder som ionspecifik potentiometri, flammefotometri og 10 atomabsorptionsfotometri. Anvendelsen af ionophorer, der selektivt danner komplekser med specifikke ioner, har ført til fem grundliggende måder at gå frem på: ved hjælp af ionselektive elektroder, ved hjælp af væske/væske-fordeling, ved hjælp af fluorescens-forøgelse, ved hjælp af 15 chromophor-mærkede ionophorkonjugater og ved hjælp af teststrimler .

I modsætning til tidligere testformuleringer tilvejebringes der med den foreliggende opfindelse et stabilt ensartet testmateriale (eller testmiddel) ved inkorporering 20 af et homogent, hydrofobt materiale på en porøs bærematrix.

Resultat-data, der viser dosis-respons for et testmateriale ved respons på nærværelsen af kaliumioner, er vist grafisk på tegningen i fig. 1. De angivne data er opnået ved anvendelse af testmaterialer fremstillet i over-25 ensstemmelse med den i det følgende beskrevne fremgangsmåde. Kurven viser de beregnede K/S-værdier afsat mod koncentrationen af kaliumioner (K+) i millimol liter eller i millimolær koncentration (mM). Sammensætningen af et kalium--responsivt testmateriale er en foretrukken udførelsesform 30 for opfindelsen.

Fig. 2 viser reflektansspektre opnået 30 sekunder efter dypning af testmaterialer, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 2, i urin indeholdende 30 eller 120 millimolær natriumion. Den lille ændring i spektret for materia-35 ler udsat for stress ved 1 måneds opbevaring ved 40°C (punk-

O

DK 159168 B

9 teret linie) i forhold til rumtemperatur-spektret (optrukken linie) viser stabiliteten over for temperatur-stress for det materiale, der giver respons på natrium på en pa-pirmatrix, der er fremstillet med inkludering af puffer.

5 Procentmængden af reflektans (%R) er afsat mod bølgelængden (X) i nanometer (nm) for de testmaterialer, der giver respons på natrium.

Den foreliggende opfindelse er baseret på tilvejebringelsen af et nyt testmateriale til detektering af nær-10 værelsen af en ion i en vandig testprøve og bestemmelse af dens koncentration. Testmaterialerne omfatter en porøs bærematrix, der på i det væsentlige ensartet måde er inkorporeret med a) en homogen, hydrofob blanding indeholdende tre hovedbestanddele: en ionophor, der kan danne et kom-15 pleks med ionen, et hydrofobt medium og et reporter-stof, der kan reagere med komplekset af ionophor og ion til frembringelse af et detekterbart respons, og b) et pufferstof, der kan tilvejebringe en pH-værdi i området fra ca. 5 til ca. 10.

20 Et testorgan omfatter testmaterialet fastgjort til en øvre plan overflade af en aflang understøtning. Ved anvendelsen bringes den vandige testprøve i kontakt med testorganet eller -materialet. Nærværelsen og/eller koncentrationen af ionen i testprøven bestemmes derpå ved iagtta-25 gelse af ethvert frembragt detekterbart respons.

Testmaterialet og -organet ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringer hurtige resultater, idet et tilstrækkeligt detekterbart respons i de fleste tilfælde frembringes i løbet af i det mindste nogle få minutter.

30 De i det følgende angivne definitioner tilvejebrin ges til klarlæggelse af opfindelsens omfang og for at lette dens formulering og anvendelse.

Udtrykket "ionophor" omfatter molekyler, der er i stand til at danne et kompleks med en bestemt ion, i nog-35 le tilfælde til den væsentlige udelukkelse af andre. Ek-

DK 159168 B

10 o sempelvis bindes den cycliske polyether 2,3-naphtho-l,4,-7,10,13-pentaoxacyclopentadeca-2-en (også kendt som 2,3--naphtho-15-krone-5 og her benævnt kalium-ionophor I) selektivt til kaliumioner i opløsning til dannelse af et 5 kationisk kompleks. Omfattet af udtrykket er koronander, kryptander og podander.

Et "reporter-stof" er et sådant, der er i stand til at reagere med et ionophor-ion-kompleks til frembringelse af et detekterbart respons, f.eks. en farveændring.

10 Reporter-stoffet kan således være et farvestof, der er i stand til at reagere med ionophor-ion-komplekset, hvorved reporter-stoffet mister en proton og bliver ladet, idet der fremkommer en ændring i elektronfordelingen. Ændringen i elektronfordelingen tilvejebringer et detekterbart 15 respons. Udtrykket "reporter-stof" omfatter phenoliske forbindelser, f.eks. p-nitrophenol, der er forholdsvis farveløs i den ikke-ioniserede tilstand, men som farves ved ionisering, samt fluorescerende forbindelser, der frembringer mere eller mindre fluorescens ved en ændring 20 i elektronfordeling. Reporter-stoffet kan også være et sådant, der kan fremkalde et detekterbart respons sammen med andre bestanddele. Eksempelvis kan ændringen i elektronfordelingen i reporter-stoffet, der er forårsaget ved interaktion med komplekset, igen lette interaktionen af 25 reporter-stoffet med en anden bestanddel, som derefter kan tilvejebringe et detekterbart respons.

Ved "interaktion" menes der enhver samvirkning eller reaktion mellem et reporter-stof og et ionophor--ion-kompleks, der fører til et detekterbart respons.

30 Udtrykket "detekterbart respons" skal her betegne en ændring i eller fremkomsten af en parameter i et testmaterialesystem, der kan iagttages, enten ved direkte observation eller instrumentelt, og som er en funktion af tilstedeværelsen af en specifik ion i en vandig testprøve.

35 Nogle former for detekterbart respons er ændringer i el-

O

DK 159168 B

11 ler fremkomsten af farve, fluorescens, reflektans, pH, kemiluminescens og infrarørde spektra.

Ved udtrykket "intermediært alkyl" som her anvendt skal der forstås en alkylgruppe med fra ca. 5 til ca. 15 5 carbonatomer. Gruppen omfatter normale og forgrenede isomere. Den kan være usubstitueret eller substitueret, forudsat at en sådan substitution ikke interfererer med virkningen af det omhandlede testmateriale eller -organ med hensyn til dettes evne til detektering af ioner.

10 Udtrykket "lavere alkyl" som anvendt i den fore liggende beskrivelse betegner en alkyldel indeholdende fra ca. 1 til ca. 4 carbonatomer. Omfattet af betegnelsen "lavere alkyl" er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n--butyl, sek.butyl og tert.butyl. Disse grupper kan være 15 usubstituerede, eller de kan være substituerede, forudsat at substituenterne ikke interfererer med virkningen eller funktionen af det her omhandlede testmateriale eller -organ med hensyn til dettes evne til detektering af ioner.

Ved betegnelsen "pseudohalogen" skal der forstås 20 atomer eller grupper af atomer, som, når de bindes til en umættet eller aromatisk ringsystem, påvirker elektrofili-teten eller nukleofiliteten af ringsystemet og/eller har en evne til at influere på fordelingen af en elektrisk ladning ved delokalisering eller resonans på lignende måde som 25 halogenerne. Medens halogenerne betegner atomer fra gruppe VII i det periodiske system, f.eks. F, Cl, Br og I, omfatter pseudohalogenerne sådanne grupper som -CN, -SCN, -0CN, -n3, -cor, -coor, -conhr, -cf3, -cci3, -no2, -so2cf3, -SO CHj, -S02-CgH5, -S02C6H4CH3, -SOC^ og -S0CF3, hvor R 30 betegner alkyl eller aryl.

Det her benyttede udtryk "porøs" refererer til forekomsten af mellemrum i bærematrixen, der giver en vandig testprøve let adgang til det hydrofobe materiale indeholdende ionophoren og reporter-stoffet. Eksempelvis er pa-35 pir en porøs bærematrix, der opretholder en åben gitter-

O

DK 159168 B

12 struktur, selv efter at det er blevet inkorporeret med det homogene, hydrofobe materiale og med pufferstoffet og tørret. Ved kontakt med det dobbelttørrede og inkorporerede papir strømmer den vandige prøve let ind i dette åbne net-5 værk. Kontaktarealet mellem det hydrofobe materiale og den vandige prøve er således meget stort.

Ved betegnelsen "homogen" menes der en ensartet dispersion af materialet gennem hele dette, således at enhver tilfældig udvalgt del deraf vil indeholde den samme mængde 10 af hver af materialebestanddelene.

Det homogene, hydrofobe materiale inkorporeres med den porøse bærematrix uden nogen tilsigtede diskontinuiteter. Den porøse natur af matrixen opretholdes imidlertid selv efter inkorporeringen. Udtrykket "i det væsentlige 15 ensartet" anvendes derfor med hensyn til den kendsgerning, at matrixen bibeholder åbninger efter tørring, hvori en vandig testprøve kan strømme, når den bringes i kontakt med testmaterialet eller testorganet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Testmaterialer 2

Det her omhandlede testmateriale omfatter tre grund 3 læggende elementer: (a) en porøs bærematrix, (b) et homo 4 gent, hydrofobt materiale indeholdende en ionophor, et hy 5 drofobt medium og et reporter-stof og (c) et pufferstof.

6 Når en vandig testprøve indeholder en ion, der er i stand 7 til at danne kompleks med ionophoren, kan ionen reagere 8 med ionophoren, der er indeholdt i den homogene, hydrofobe 9 komposition, til tilvejebringelse af et ionophor-ion-kom- 10 pleks, som igen reagerer med reporter-stoffet til frembrin- 11 gelse af et detekterbart respons. Et pufferstof, der inkor 12 poreres direkte i den porøse bærematrix, tilvejebringer 13 den rette pH-værdi til reaktion mellem ionophor-ion-komplek 14 set og reporter-stoffet. Eftersom testmaterialerne inkorpo 15 reres med pufferen, er manipulation af testprøven til ind- 16 stilling af pH-værdien unødvendig.

O

13

DK 159168 B

Et system til fjernelse af interferens og et fugte-middel kan sættes til testmaterialet eller testorganet. Andre bestanddele omfattende stabilisatorer, konserveringsmidler, fortykkelsesmidler (f.eks. polyvinylmethylether, 5 kommercielt tilgængelig som Gantrez ^M-154 fra GAF Corp.,

New York, New York, polystyren-sulfonsyre eller agarose), fotokemiske stabilisatorer etc., kan tilsættes, forudsat at de ikke interfererer med dannelsen af det detekterbare respons. På baggrund af den foreliggende beskrivelse vil val-10 get af sådanne bestanddele ligge inden for fagmandens formåen. Enhver bestanddel, der sættes til det hydrofobe materiale, bør ikke ændre dets essentielle homogene hydrofobe karakter. Desuden bør bærematrixen bibeholde sin porøse natur efter inkorporering af alle bestanddelene og tørring.

15 Det her omhandlede materiale kan inkorporeres med bærematrixen på et stort antal måder. Bestanddelene kan opløses i et egnet opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler som her beskrevet. En sådan opløsning kan anvendes til at imprægnere bærematrixen ved neddypning el-20 ler som en tryksværte, hvor reagenserne trykkes på en egnet matrix, eller bærematrixen kan overtrækkes med materialet, f.eks. med en rakel. Den foretrukne metode er beskrevet i et følgende afsnit i forbindelse med den generelle fremgangsmåde .

25 Bærematrix

Den bærematrix, med hvilken det homogene, hydrofobe materiale inkorporeres, skal være i stand til at understøtte en hydrofob fase på en sådan måde, at der forefindes væ-30 sentlige åbninger efter tørring, hvori en vandig testprøve let kan bevæge sig, dvs. at den skal være porøs.

Egnede materialer omfatter papir, træ og andre cel-luloseholdige materialer, sintrede keramiske fritter og polymere porøse materialer, forudsat at matrixens dimensionel-35 le integritet opretholdes ved en inkorporering af det hydro-

O

DK 159168 B

14 fobe materiale og ved påfølgende kontakt med den vandige prøve. Desuden kan matrixmaterialet ikke reagere med det hydrofobe materiale på en sådan måde, som vil tilvejebringe interferens med tilvejebringelsen af et detekterbart 5 respons.

En foretrukken bærematrix er papir. Eksempelvis kan filtrerpapir inkorporeres med et homogent, hydrofobt materiale og tørres. Papiret kan også inkorporeres med et pufferstof. Ved kontakt mellem testmaterialet og en van-10 dig testprøve kan ionen let nå den hydrofobe fase ved at strømme ind i det åbne netværk i papiret. Eftersom pufferen inkorporeres direkte med testmaterialet, kræves der ingen prøvefortynding til tilvejebringelse af den korrekte pH-værdi.

15

Hydrofobt medium

Den primære funktion af det hydrofobe medium er at forøge testmaterialesystemets detekterbare respons. Mediet kan således være en væske eller et fast stof, forudsat 20 at det forøger evnen hos ionophor-ion-komplekset og reporter-stoffet til at sameksistere i det homogene, hydrofobe materiale. Der må drages omsorg for at vælge et medium, der ikke interfererer med interaktionen mellem ionophor--ion-komplekset og reporter-stoffet.

25 Stoffer, der kan anvendes som hydrofobe medier, om fatter væsker, der er uopløselige i basiske opløsninger, og som er i stand til at opløse en ionophor og et reporter-stof. De er fortrinsvis forholdsvis ikke-flygtige, dvs. at de har et kogepunkt på mindst ca. 150°C, ideelt på mindst ca.

30 200°C. Mediet er normalt en oxygendonor, der indeholder funktionelle grupper såsom ether-, ester-, amid- og lignende grupper og kombinationer deraf.

Typiske væsker, der falder i denne kategori, er tri-cresylphosphat, dioctylphthalat, tris-2-ethylhexylphosphat, 35 di-2-ethylhexylsebacat, n-butylacetyl-ricinolat og nitro-

O

15

DK 159168 B

phenylethere såsom 2-nitrophenyl-octylether, 2-nitrophenyl--butylether, dibenzylether og o-nitrophenyl-2-(1,3,3)-tri-methyl-butyl-5,7,7-triethyl-octylether. Der kan også anvendes blandinger af disse væsker. Faste stoffer, der kan an-5 vendes, omfatter bis-Ν,Ν,Ν',N1-tetraisobutyl-1,2-cyclohexan--dicarboxamid og IS^N'-diethylether-lS^N'-diheptyl-S^'-dime-thyl-3,7-dioxanonan.

Det er muligt for én forbindelse i det homogene, hydrofobe materiale at tjene både som ionophoren og det hydro-10 fobe medium. Eksempelvis er cis-Ν,Ν,Ν',N1-tetraisobutyl- -1,2-cyclohexan-dicarboxamid (her betegnet CDA) med formlen

XX

15 L^-f=o x1^ dprindelig anvendt i præparater til en lithiumiontest som det hydrofobe medium. Det blev senere opdaget, at CDA ale-25 ne kunne fungere såvel som ionophor som det hydrofobe medium.

Ionophorer

Ionophor-elementet ifølge den foreliggende opfin-30 deIse er et begreb, der har et bredt omfang, som karakteriseres ved definitionen af dette udtryk i det foregående. Udtrykket omfatter multidentate cycliske forbindelser, der indeholder donoratomer i deres cycliske kæder. Sådanne multidentate cycliske forbindelser kan være monocycliske 35 eller polycycliske. Alternativt kan ionophoren være en åben

O

DK 159168 B

16 kæde indeholdende donoratomer. Omfattet af ionophor-begre-bet er således monocycliske systemer, der er ionspecifikke og betegnes koronander, polycycliske, ionspecifikke forbindelser, der betegnes kryptander, og åbenkædede strukturer, 5 der betegnes som podander, og som er i stand til selektivt at danne komplekser med ioner.

Koronander

Koronander er monocycliske forbindelser, der inde-10 holder donoratomer, som er elektronrige eller -deficiente, og som er i stand til at danne kompleks med bestemte kationer og anioner på grund af deres unikke strukturer. Omfattet af dette udtryk er krone-ethere, i hvilke den monocycliske kæde indeholder oxygen som donoratomet. Andre ko-15 ronander er forbindelser, der indeholder en samling elektronrige atomer såsom oxygen, svovl og nitrogen. På grund af de unikke størrelser og geometriske forhold for bestemte koronander er disse egnede til kompleksdannelse med forskellige ioner. Ved en sådan kompleksdannelse orienteres 20 de elektronrige atomer, f.eks. oxygenatomerne i en krone--ether, mod den elektron-deficiente kation. Carbonatom--segmenterne i kæden projiceres samtidig i en retning udad fra ionen. Det fremkomne koronand-ion-kompleks er således ladet i centret, men hydrofobt ved dets perimeter.

25

Kryptander

Kryptander er polycycliske analoge til koronander.

De omfatter således bicycliske og tricycliske multidentate forbindelser. Det cycliske arrangement af donoratomer er 30 tredimensionelt i rummet i modsætning til koronandernes i det væsentlige plane konfigurantion. En kryptand er i stand til faktisk at indeslutte ionen på tredimensionel måde og er således i stand til at danne stærke bindinger til ionen ved dannelsen af komplekset. Ligesom i koronanderne kan do-35 noratomerne omfatte sådanne atomer som oxygen-, nitrogen- og

O

DK 159168 B

17 svovlatomer.

Podander

Ioner kan også danne komplékser med ikke-cycliske 5 forbindelser. Eksempelvis har en lineær kæde, der indeholder en regulær sekvens af elektronrige atomer, f.eks. oxygenatomer, evnen til at associere sig med positivt ladede ioner til dannelse af komplekser, ikke ganske uligt ko-ronanderne og kryptanderne. Hovedstrukturforskellen mellem 10 podander og de to andre ionophorer er strukturens åbenhed. Podander kan således underopdeles i monopodander, dipodan-der, tripodander etc. En monopodand er således en enkelt organisk kæde indeholdende donoratomer, en dipodand er to sådanne kæder, der er sammenkoblet ved et boratom eller en 15 gruppe af atomer, der kan danne en variabel rumlig orientering, og en tripodand er tre kæder knyttet til et centralt atom eller en central gruppe af atomer. Simon et al. beskriver i USA patentskrift nr. 3.957.607 dipodander, der er særligt egnede til bestemmelse af calcium- eller barium-20 ioner. Ifølge den foreliggende opfindelse er en foretrukken ionophor tripodanden l,l,l-tris-[l,-(2,-oxa-4,-oxo-5,-aza--5'-methyl)-dodecanyl]-propan, der her betegnes som natrium--ionophor I, der har vist sig at være særlig anvendelig i et testmateriale til bestemmelse af natriumioner. I virke-25 ligheden er natrium-ionophor I 90 gange mere selektivt fra natriumioner end dipodanden, N,N'-dibenzyl-Ν,Ν'-diphenyl--1,2-phenylendioxydiacetamid, jfr. M. Guggi, M. Oehme, E.

Pretsch og W. Simon i Helv. Chim. Acta. 59, 2417 (1976). 1 2 3 4 5 6

Specifikke ionophorer 2

Nogle af de ionophorer, der har vist sig at være 3 særligt anvendelige, når de benyttes i forbindelse med nær 4 værende opfindelse, er angivet i det følgende sammen med 5 de kationer, med hvilke de er i stand til selektivt at dan- 6 ne komplekser.

18

DK 159168 B

O

Kemiske betegnelser for de foretrukne ionophorer er angivet i forbindelse med disses strukturer. Gængse betegnelser, der anvendes i denne beskrivelse, er angivet i parentes .

5

Ionophor Kation 1,1-Tris-[1'-(2'-oxa-4'- Na+ -oxo-51-aza-51-methyl)--dodecanyl)-propan 10 Λ S) (Natrium-Ionophor I) 25 1 35

DK 159168 E

O

19

Ionophor Kation N,N'-Dibenzyl-Ν,Ν1-diphe- Na+ nyl-1,2-phenylendioxydi- acetamid

5 O

o;^

15 1 JL\ U

(Natrium-ionophor II) 20 6,7,9,10,18,19-Hexahydro-17- Na+ -n-butyldibenzo[b,k][1,4,7,-10,13]pentaoxacyclohexadecin--18-y1-oxyeddike syre 25 o (Natrium-ionophor III) 35 0

DK 159168 B

20

Ionophor Kation 2,3-Naphtho-l,4,7,10,13- K+ -pentaoxacyclopentadeca- -2-en

fYY I

UA j 10 '-f (Kalium-ionophor I)

NfN,-Diheptyl-N,N',5,5-te- Li+ 15 tramethyl-3,7-dioxanonan- -diamin

20 L

XI

V

25 j (Lithium-ionophor I) 30 35

O

DK 159168 B

21

Ionophor Kation N,N'-Diheptyl-5,5-dimethyl- Li+ -N,N'-di-(3-oxapentyl)-3,7--dioxanonan-diamin )c; (Lithium-ionophor II) 20 ++

Diethyl-Ν,Ν-[(4R,5R)-4,5-dimethyl- Ca -l,8-dioxo-3,6-dioxaoctamethylen]- -bis-(12-methylaminododecanoat)

X

30 i

C

35 (Calcium-ionophor)

O

22

DK 159168 B

Andre ionophorer, der kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, omfatter de nedenfor angivne : 5 Ionophor Kation 15-Krone-5 Na+ K+ +

Valinomycin K

4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-l,10-di- K+ azabicyclo-T8,8,8]hexacosan (Kryptofix © 222) 10 +

Dibenzo-18-krone-6 K

Dicyclohexano-18-krone-6 I<+ 4,7,13,18-Tetraoxa-l,10-diaza-bi- Li+ cyclo-[8,5,51eicosan (Kryptofix © 211) • *!* 15 12-Krone-4 Lx (r)

Kryptofix wer et varemærke tilhørende E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland.

Omend disse specifikke ionophorer anvendes med for- 20 del i testmaterialerne ifølge opfindelsen, kan der også anvendes andre ionophorer eller blandinger deraf. Navnlig kan der i formuleringen anvendes ionophorer, der indeholder ioniserbare grupper, f.eks. natrium-ionophor III, blot disse ionophorer har en tilstrækkelig analyt-ion-specificitet.

25

Reporter-stof Når den ion, der har interesse, er til stede i testopløsningen, er det reporter-stoffet, som tilvejebringer det detekterbare respons ved reaktion med ionophor-ion-komplek- 30 set. Reporter-stoffet kan variere i sammensætning fra en enkelt forbindelse, der kan ionisere som respons på dannelsen af ionophor-ion-komplekset, til en blanding af reaktive materialer, der kan tilvejebringe et detekterbart produkt, når deres reaktionskæde initieres ved nærværelsen af komplekset.

35 Det vil således ses, at når der ikke er nogen analytion til

O

23

DK 159168 B

stede, forbliver reporter-stoffet inaktivt, og der iagttages ikke noget detekterbart respons. Når alternativt den bestemte ion, der overvåges, er til stede, dannes der et kompleks, som reagerer med reporter-stoffet og inducerer 5 det til at undergå en detekterbar ændring.

I det tilfælde, hvor reporter-stoffet er en enkelt forbindelse, kan den omfatte en dissocierbar gruppe, således at der ved dissociation dannes en farvet ion. Eksempelvis er phenoliske forbindelser såsom p-nitrophenol forholds-10 vis farveløse i den ikke-ioniserede tilstand, men er farvede ved ionisering. Andre forbindelser, f.eks. de, der producerer mere eller mindre fluorescens ved en ændring i elektronfordelingen, kan også anvendes. Klasser af fluorescens--indikatorer og deres derivater, der kan anvendes i forbin-15 delse med den foreliggende opfindelse, omfatter derivater af fluorescein, især fluorescein-estere, 7-hydroxy-cumariner, resorufiner, pyren-3-oler og flavoner.

Reporter-stoffet kan også være et stof, der kan udløse et detekterbart respons sammen med andre bestanddele. Ek-20 sempelvis er et reaktionssystem, der kan anvendes som reporter-stof, et -sådant, der involverer dissociation af en proton fra en phenol, hvorved der initieres en koblingsreaktion til dannelse af et farvet produkt. Den såkaldte Gibbs-reak-tion er typisk for en sådan reaktionssekvens, hvor en 2,5-25 -cyclohexadien-l-on-2,6-dihalogen-4-haloimin (I) kobles med en phenol (II) til dannelse af et farvet reaktionsprodukt (III)· X i i (I> <n> (III)

35 Rn~twJ

0'

DK 159168B

=7 24

O

I denne reaktionssekvens kan de enkelte substituen-ter R, der kan være ens eller forskellige, være enhver 2,3,5- og/eller 6-substituent(er), der ikke hindrer den samlede reaktionssekvens. Hvert R betegner således en lavere 5 eller intermediær alkyl- eller arylgruppe, eller én substituent R kan danne et kondenseret ringsystem ved enten 2,3-eller 5,6-stillingen. X er et halogen eller pseudohalogen, og n har en værdi fra 0 til 4. Denne type reporter-stof anvendes ved inkorporering af forbindelser med strukturerne 10 (I) og (II) med det hydrofobe medium.

En yderligere anvendelse af Gibbs-kemien involverer forbindelser med en struktur såsom (III) på dens ikke-ioni-serede form. Dannelsen af ion-ionophor-komplekset resulterer i en sådan interaktion, at reporter-stoffet (III) giver 15 en iagttagelig farve i og af sig selv. Dette fænomen kan betegnes som at gå frem i overensstemmelse med den følgende reaktionssekvens og resonansstrukturer: 20 25 1 35 25

DK 159168 B

- xx *4^ ° ^ l· 15 ^ \l . *-φ ^-y N " «γΧ o 30 hvor hver substituent R, der kan være ens eller forskellige, betyder lavere eller intermediært alkyl, aryl eller et kondenseret ringsystem ved 2,3- eller 5,6-stillingerne og n har en værdi fra 0 til 4. Særlig foretrukken er en forbindelse med strukturen 35

DK 159168 B

26 o

As. .R' Λ

O

i hvilken R' betyder hydrogen eller lavere alkyl, og X betyder halogen eller pseudohalogen som defineret i det fo-15 regående. Det tilfælde, hvor R1 betyder methyl, og X er et chloratom, har vist sig at være særlig interessant i forbindelse med nærværende opfindelse.

Endnu et foretrukkent reporter-stof er en forbindelse med strukturen 20 OH

R* A\ R' Ί®οΓ

25 N

Λ n i] 1 2 3 4 5 6 o 2 i hvilken Rx betegner intermediært alkyl, dvs. en gruppe 3 med 5-15 carbonatomer, og i hvilken R' betyder hydrogen 4 eller lavere alkyl, og X betegner halogen eller pseudohalo- 5 gen. Forbindelser såsom disse har vist sig at være særligt 6 resistente mod mulig interferens, der skyldes nærværelsen

O

27

DK 159168 B

af serumalbumin i testprøven. Foretrukkent blandt disse typer reporter-stoffer er 7-(n-decyl)-2-methyl-4-(3',51-di-chlorophen-41-on)-indonaphthol (i det følgende betegnet 7--decyl-MEDPIN), hvor Rx betyder n-decyl, X er chlor, og R' 5 er methyl. Mere detaljerede opløsninger vedrørende anvendelsen og fremstillingen af sådanne forbindelser kan findes i USA-patentansøgningerne nr. 493.951 og 493.981, hvortil der henvises.

10 Pufferstof

Pufferstoffet kan være enhver puffer eller kombination af puffere, der er i stand til at tilvejebringe en pH--værdi i området fra ca. 5 til ca. 10. Pufferen vælges til lettelse af samvirkningen mellem ionophor-ion-komplekset og 15 reporter-stoffet, idet denne samvirkning fører til et detek-terbart respons.

Egnede puffere omfatter bis-[2-hydroxyethyl]-imino--tris-[hydroxymethyl]-methan, 1,3-bis-[tris-(hydroxymethyl)--methylamino]-propan, N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-glycin, tris-20 -(hydroxymethyl)-aminomethan, N-[2-acetamido]-2-iminodied- dikesyre, N-2-hydroxyethylpiperazin-N1,3-propansulfonsyre, 3-[N-tris-(hydroxymethyl)-methylamino-2-hydroxypropansulfon-syre, tetramethylammoniumborat og tetramethylammoniumphos-phat.

25 Det foretrukne pH-område afhænger af reporter-stof fet. Valget af puffere bestemmes derfor af det anvendte reporter-stof og i nogen grad af det ønskede detekterbare respons. Når der eksempelvis anvendes 7-decyl-MEDPIN som reporter-stof, ligger det foretrukne pH-område fra 6 til 8,5.

30 Når der imidlertid anvendes et reporter-stof med en højere pKa-værdi for den dissocierbare proton, foretrækkes der et højere pH-område. Når der tilsvarende anvendes et reporter--stof med et lavere pKa-værdi for den dissocierbare proton, foretrækkes der et lavere pH-område. Når det detekterbare 35 respons er en farveændring, kan pufferen øve indflydelse på

DK 159168 B

28

O

graden af et sådant detekterbart respons, og der kan vælges en bestemt puffer til optimering af farveintensiteten. Eksempelvis fremkommer det nyttige farveområde for reporter--stoffer 7-decyl-MEDPIN fra en pH-værdi på ca. 6 til ca. 8,5, 5 når farveændringer fra orange til blå. Ved højere pH-værdier, fra 8,5 til 10, fås der nuancer af mørkeblåt, som er vanskelige at skelne visuelt, og en lavere pH-værdi på fra 5 til 6 giver nuancer af bleggul, der også er vanskelige at skelne visuelt. Begge de ekstreme pH-værdier kan anvendes ved in-10 strumentanalyse, omend den bedste instrumentelle præcision forekommer ved pH-området fra ca. 6 til ca. 8,5. Bestemmelsen af en egnet pH-værdi er et rutinemæssigt laboratorieforsøg på basis af den foreliggende beskrivelse.

15 Den hydrofobe polymer

Hydrofobe polymere, der kan anvendes, er i det væsentlige ikke-polære, dvs. de mangler ioniserbare funktionelle grupper, og er blandbare med det hydrofobe medium. Disse polymere omfatter polyvinylchiorid, polyvinylidenfluorid, 20 polystyren, polycarbonat, poly-(4-chlorstyren), polyvinyl-acetat, vinylidenchlorid-vinylchlorid-copolymer, vinyliden-chlorid-acrylonitril-copolymer, vinylchlorid-vinylacetat--copolymer, polymethylmethacrylat, vinylchlorid-vinylacetat--vinylalkohol-terpolymer, polyethylen, polypropylen og poly-25 urethan. Naturligvis er mange andre polymere materialer egnede til anvendelse som den hydrofobe polymer, og identifikationen af sådanne materialer ligger inden for fagmandens formåen på basis af nærværende beskrivelse. Indførelsen af en hydrofob polymer i det hydrofobe materiale forøger nøj-30 agtigheden af bestemmelsesresultaterne således, at variationskoefficienten ikke er større fra 2 til 4%. Når der inkluderes en hydrofob polymer i det hydrofobe materiale, kan det visuelle respons desuden korreleres semikvantitativt med ionkoncentrationen.

35

O

DK 159168 B

29

Interferensfjernelsessystem

Legemsvæsker indeholder normalt mange kationer, + + ++ f.eks. natriumion(Na ), kaliumion (K ), calciumion (Ca ) og magnesiumion (Mg ). Omend ionophoren almindeligvis 5 vil blive udvalgt for dens selektivitet til den ønskede ionanalyt, kan tilstedeværelsen af andre kationer i nogle tilfælde interferere med samvirkningen mellem ionophoren og den ønskede ionanalyt. Eksempelvis vil natrium--ionophor I binde natriumion frem for calciumion i et for-10 hold på ca. 4:1. I prøver, hvor forholdet mellem natriumion og calciumion er mindre end 4:1, kan det være nødvendigt at hindre interaktionen af caliumionen med ionophoren til sikring af det rette forhold mellem natriumionkoncentration og det detekterbare respons. Et interfe-15 rensfjernelsessystem kan tilvejebringes til løsning af dette problem.

Et interferensfjernelsessystem kan inkorporeres direkte i bærematrixen eller med pufferstoffet. I en fo-retrukken udførelsesform er fjernelsessystemet udformet 20 til at reagere med en interfererende kation således, at denne holdes i den vandige fase, eller at man på anden måde hindrer kationinteraktion med ionophoren i den hydrofobe fase. Eksempelvis er ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA) og ethylenglycol-bis-(aminoethyl)-tetraeddikesyre 25 vandopløselige forbindelser, som danner komplekser med divalente kationer, f.eks. calciumionen. Såfremt EDTA inkorporeres med et testmateriale ved bestemmelse af natriumioner, vil EDTA ved kontakt med en vandig prøve indeholdende natrium- og calciumioner fortrinsvis binde Ca++. De 30 bundne calciumioner vil ikke væsentligt interferere med dannelsen af ionophor-natriumion-komplekset. Desuden kan ionophorer anvendes til fjernelse af interfererende kationer, såfremt de er specifikke for den interfererende ion og er vandopløselige eller modificeres kemisk til for-35 øgelse af deres vandopløselighed uden formindskelse af de- 0

DK 159168 B

30 res evne til at reagere med det interfererende stof. Eksempelvis kan natrium-ionophor III modificeres ved addition af solubiliserende grupper, f.eks. -SO^H-grupper, til benzenringene til forøgelse af vandopløseligheden uden at formind-5 ske evnen til at reagere med natriumioner. Andre forbindelser såsom uramildieddikesyre og trans-l,2-diaminocyclohexan--Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraeddikesyre, kan også anvendes med fordel.

Fugtemiddel 10 Til nogle anvendelser vil funktionen af testmateria let eller testorganet forbedres ved tilsætning af et fugte-middel. Når eksempelvis en prøve pipetteres på testmaterialet, kan den danne en væskedråbe på materialets overflade. Ethvert stof, der vil formindske overfladespændingen af den 15 vandige prøve således, at prøven tillades at flyde ind i mellemrummene i testmatrixen, kan fungere som fugtemiddel. Naturligvis må stoffet vælges således, at det ikke interfererer med dannelsen af ionophor-ion-komplekset eller med coaktio-nen af ionophor-ion-komplekset og reporter-stoffet til frem-20 bringelse af et detekterbart respons.

I nogle tilfælde er det ikke nødvendigt at tilsætte et fugtemiddel. Når der f.eks. anvendes natrium-ionophor III, er et yderligere fugtemiddel ikke nødvendigt. Såfremt der skal tilsættes et fugtemiddel, inkorporeres dette for-25 trinsvis enten sammen med.pufferstoffet eller særskilt. Egnede fugtemidler omfatter agarose og detergenter såsom po-lyethylengiycol-p-isooctylphenylether, 2-0-acetoxy-3-(per-fluoralkyl)-N-carboxymethyl-N,N-dimethylpropylamin, poly-ethylenglyeol-1-(2-perfluoralkyl)-ethylether, n-decyl-N,N-30 -dimethyl-3-ammonio-l-propansulfonat, N-perfluoralkyl-N--carboxyethyl-N,N-dimethylamin og polyoxyethylenestere af fedtalkoholer, navnlig Brij ® 35SP (fra ICI United States,

Inc., Wilmington, Delaware). Andre detergenter kan anvendes, forudsat at de ikke interfererer med frembringelsen af et 35 detekterbart respons på den anvendte ionanalyt.

O

31

DK 159168 B

Koncentrationsområder for testmaterlalebestanddele

Koncentrationerne af testmaterialebestanddelene er ikke kritiske for opfindelsen, forudsat at koncentrationerne af ionophor, hydrofobt medium, reporter-stof og puffer-5 stof er tilstrækkelige til frembringelse af det ønskede de-tekterbare respons. I nogle tilfælde kan dannelsen af det ønskede detekterbare respons eller opnåelsen af den ønskede nøjagtighed kræve tilsætning af en hydrofob polymer. Til opnåelse af kvalitative resultater er imidlertid hverken kon-10 centrationen af ionophoren eller koncentrationen af reporter-stoffet bundet til koncentrationsområdet af den ionana-lyt, der skal bestemmes.

Bestemmelsen af optimale koncentrationer ligger inden for fagmandens formåen på basis af den foreliggende be-15 skrivelse. Der kan imidlertid gives følgende retningslinier. Det foretrækkes, at ionophoren er til stede i molært overskud i forhold til reporter-stoffet (dvs. større end et molært forhold på 1:1 mellem ionophor og reporter-stof). Ar-bejdskoncentrationer af ionophoren kan strække sig fra 20 2 g pr. liter til mætning. Den hydrofobe polymer, såfremt denne overhovedet tilsættes, anvendes almindeligvis i koncentrationer, der varierer fra O til 50 g pr. liter. Interferensfjernelsessystemet og fugtemiddel anvendes, såfremt det overhovedet tilsættes, almindeligvis kun i en koncentra-25 tion på fra 0 til 30 g pr. liter. De foretrukne og i praksis anvendte områder for instrumentelle og visuelle ion-re-sponsive testorganer fremgår af det følgende: 1 35 DK 159168 B ' 32

O

Instrumentalt Anvendt område Foretrukkent

Hydrofob blanding (koncentration givet i g/1 organisk opløsningsmiddel 5 Ionophor 2-200 g/1 50-100 g/1

Reporter-stof 1-50 g/1 5-30 g/1

Hydrofobt medium 0,01-0,3 g/1 0,02-0,05 g/1

Hydrofob polymer 0-50 g/1 10-30 g/1

Fugtemiddel 0-30 g/1 0-20 g/1 10 Pufferblanding (koncentrationer givet som gram til koncentration pr. liter vand eller med vand blandet opløs-ningemiddel

Puffer 0,1-1 M 0,1-0,5 M

15 Interferensfjernelsessystem 0-30 g/1 10-20 g/1

Fugtemiddel 0-30 g/1 10-20 g/1

Visuelt 20 Hydrofob blanding (koncentration givet i vægt pr. endeligt volumen hydrofob opløsning)

Ionophor 2-50 g/1 5-15 g/1

Reporter-stof 0,5-5 g/1 1,5-4 g/1 25

Hydrofobt medium 20-200 g/1 80-150 g/1

Hydrofob polymer 10-50 g/1 10-20 g/1

Pufferblanding (kon-_ centration i endeligt volumen puffer-3Q opløsning)

Puffer 0,1-1,0 M 0,3-0,7 M

Interferensfjernelsessystem 0-30 g/1 0-20 g/1

Fugtemiddel 0-30 g/1 0-20 g/1 35

O

33

DK 159168 B

Testmateriale

De testmaterialer, der fremstilles som beskrevet i det foregående, kan monteres ved den ene ende af en aflang understøtning, idet den anden ende af understøtningen tje-5 ner som et håndgreb, idet der herved dannes et testorgan.

Et sådant testorgan kan holdes ved håndgrebsenden, medens den anden ende, der bærer testmaterialet, bringes i kontakt med testprøven.

Materialer, der kan anvendes til understøtningen, 10 omfatter film af et overmåde stort antal plastmaterialer eller polymere. Eksempler herpå omfatter sådanne polymere materialer som celluloseacetat, polyethylenterephthalat, polycarbonater og polystyren. Understøtningen kan være ui-genneraskinnelig, eller den kan transmittere lys eller anden 15 energi. Når det detekterbare respons er fluorescens, eller når et overtræk anbringes over den øvre overflade af testorganet for at tillade, at prøven kan afviskes, kan testorganet aflæses gennem understøtningen. I dette tilfælde omfatter anvendelige understøtninger transparente materialer, der 20 er i stand til at transmittere elektromagnetisk stråling ved en bølgelængde i området fra ca. 200 nm til ca. 900 nm. Understøtningen behøver naturligvis ikke at transmittere over hele området fra ca. 200 til ca. 900 nm, omend det ved fluorometrisk detektering af analytiske resultater er øn-25 skeligt, at understøtningen er transparent over et bånd, der er bredere end eller i det mindste lige så bredt som i absorptions- og emissionspektre af de fluorescerende materialer, der anvendes til detekteringen. Det kan også være ønskeligt at have en understøtning, der transmitterer et 30 eller flere snævre bølgelængdebånd og er uigennemskinneligt for tilstødende bølgelængdebånd. Dette kan f.eks. opnås ved imprægnering eller overtrækning af understøtningen med ét eller flere farvende midler med passende absorptionsegenskaber.

35 Til fremstilling af et testorgan ifølge opfindel-

O

DK 159168 B

34 sen fastgøres et lille rektangel af testmaterialet, dvs. en dobbelttørret porøs bærematrix, der er dobbeltinkorporeret med homogent, hydrofobt materiale, indeholdende en ionophor, et hydrofobt medium og et reporter-stof, samt med et puffer-5 stof og eventuelt andre bestanddele, til en aflang understøtning med en øvre, i det væsentlige plan overflade, f.eks. et aflangt stykke polystyrenfilm. Stykket af testmateriale fastgøres til den øvre plane flade ved den ene ende, idet man efterlader den anden ende af polystyrenet til at tjene 10 som et bekvemt håndgreb.

Testmaterialerne kan fastgøres ved hjælp af vilkårlige midler, der er forenelige med den tilsigtede anvendelse. Ved én metode anvendes der et dobbeltsidet adhæsivt tape mellem testmaterialet-rektanglet og understøtningen. Et 15 sådant tape, der kendes som Double Stick, fås fra 3 M Company, St. Paul, Minnesota.

Opfindelsens anvendelse

Testmaterialerne og testorganet ifølge den forelig-20 gende opfindelse kan anvendes ved udførelse af et betydeligt antal kemiske analyser, ikke blot inden for klinisk kemi, men inden for kemisk research og i kemiske proceskontrollaboratorier. Testmaterialerne og -organerne er egnede til anvendelse ved klinisk undersøgelse af legemsvæsker, 25 f.eks. blod, blodserum, cerebrospinalvæske og urin, eftersom der ved sådant arbejde hyppigt udføres et stort antal gentagne tests, og testresultaterne kræves ofte meget kort tid efter, at en prøve er udtaget. Inden for eksempelvis blodanalyseområdet kan opfindelsen anvendes ved udførelse 30 af kvantitativ analyse for mange af de ioniske blodbestand-dele, der har klinisk interesse.

Testmaterialerne og testorganet anvendes ved at bringe dem i kontakt med testprøven i et tilstrækkeligt tidsrum. I tilfælde af urin-testning er det tilstrækkeligt 35 blot at dyppe testmaterialet eller testorganet i prøven.

O

35

DK 159168 B

Skønt det almindeligvis er unødvendigt at fjerne overskud af prøve, er det dog i nogle tilfælde, f.eks. i tilfælde af prøver af helblod, ønskeligt at fjerne ethvert overskud ved afviskning eller aftrykning.

5 Såfremt den ion, for hvilken der analyseres, er til stede i testprøven, vil komplekset af ionophor og ion reagere med reporter-stoffet, og der vil fremkomme et detek-terbart respons. Når reporter-stoffet er et dissocierbart stof, der frembringer en farvet modion til analytten, vil 10 der dannes en iagttagelig farve i testmaterialet, som instrumentelt kan styres fra hver side af testorganet, når der anvendes en transparent bærer. Når reporter-stoffet er en fluorophor, f.eks. fluorescein eller et derivat deraf, kan der anvendes et fluorescens-spektrofotometer til må-15 ling af det detekterbare respons, der dannes i testmaterialet, i dette tilfælde fremkomsten af eller en ændring i fluorescensen. Andre metoder, der kan anvendes til iagttagelse af et detekterbart respons, omfatter reflektans--spektrofotometri, absorptions-spektrofotometri og målin-20 ger af lystransmission.

Der kan anvendes forskellige kalibreringsmetoder som kontrol på analysen. Eksempelvis kan en prøve af ana-lyt-standardopløsuing påføres et særskilt testmateriale som en sammenligning eller for at tillade anvendelsen af 25 differentielle målinger i analysen. Testmaterialer eller testorganer, der fremstilles med et hydrofobt materiale, inklusive en hydrofob polymer, kan anvendes til semikvantita-tive, visuelle bestemmelser, når der anvendes et passende farvekort.

30

Metodik

Generel fremstilling Testmaterialefremstilling

Testmaterialer, der giver respons på en bestemt 35 ion, der betegnes som analytten, fremstilles ved hjælp af

O

36

DK 159168 B

den følgende metode: a) Dannelse af en homogen første blanding af det hydrofobe materiale indeholdende i det mindste en ionophor, der er specifik for en bestemt ion, et hydrofobt medium, 5 et reporter-stof og et organisk opløsningsmiddel.

b) Dannelse af en homogen anden blanding af et pufferstof, der er i stand til at tilvejebringe en pH-værdi i området fra ca. 5 til ca. 10, og vand eller et med vand blandbart opløsningsmiddel eller en blanding deraf.

10 c) Inkorporering af en af den første eller den an den blanding med en porøs bærematrix.

d) Tørring af den inkorporerede matrix.

e) Inkorporering af den anden af den første eller den anden blanding med den porøse bærematrix og 15 f) tørring af den dobbelt-inkorporerede bærematrix.

Med mindre andet er angivet, er den første blanding en homogen, hydrofob opløsning, der er fremstillet ved opløsning af de nødvendige bestanddele i et organisk opløsningsmiddel. Egnede organiske opløsningsmidler omfatter ketoner 20 og ethere, f.eks. tetrahydrofuran, acetone og cyclohexanon. Valget af et egnet opløsningsmiddel vil være rutine for en fagmand på basis af den foreliggende beskrivelse. Omend en sammensætning, med hvilken der kan arbejdes, kan fås med kun ionophoren, det hydrofobe medium og reporter-stoffet, omfat-25 ter blandingen almindeligvis yderligere en hydrofob polymer.

Den anden blanding er almindeligvis en vandig opløsning indeholdende en egnet puffer, fremstillet ved opløsning af pufferen i destilleret vand og titrering til den ønskede pH-værdi. I de følgende eksempler er pufferopløsningen 30 defineret med hensyn til dens subkoncentration. Whatman ®-type 31 ET-filtrérpapir anvendes som den porøse bærematrix.

Hver opløsning inkorporeres i den porøse bærematrix særskilt. Den homogene, hydrofobe opløsning inkorporeres med papiret, først ved nedsænkning af papiret i opløsningen. Papiret tør-35 res dernæst i en luftovn. Den anden inkorporering udføres

O

37

DK 159168 B

ved neddypning af det tørrede papir i den vandige pufferopløsning. Det dobbelt-inkorporerede papir tørres igen i en luftovn.

5 Fremstilling af testmateriale

Testmaterialer fremstilles, medmindre andet er angivet, ved at fastgøre et stykke dobbeltnedsænket og tørret papir, udskåret af det resulterende testmateriale, til den ene ende af en 0,5 cm x 10 em polystyrenfilmstrimmel med et 10 dobbeltsidet adhæsiyt tape (Double'.Stick fra 3M Co., St. Paul, Minn.). Det således fremstillede testmateriale kan anvendes sammen med Ames-SERALYZER ®-fotometer eller til visuel aflæsning under anvendelse af et egnet farvekort.

15 Fremstilling, variationer

Enhver variation fra den ovenfor beskrevne, generelle fremgangsmåde vil være specifikt angivet i eksemplerne.

I nogle tilfælde fremstilles pufferopløsningen med et med vand blandbart opløsningsmiddel, f.eks. en lavere al-20 kohol eller acetone, eller blandinger af vand og et med vand blandbart opløsningsmiddel. Eksempelvis kan pufferstoffet opløses i destilleret vand, titreres til den ønskede pH-værdi, og en blanding af vand og en lavere alkohol, f.eks. methanol eller ethanol, tilsættes til frembringelse af det endelige 25 rumfang. I disse tilfælde defineres pufferopløsningen med hensyn til dens sigtkoncentration i vand-alkohol-opløsnin-gen. Når der anvendes et med vand blandbart opløsningsmiddel alene, opløses pufferstoffet i opløsningsmidlet, titreres til en passende pH-værdi med phosphorsyre og bringes på slut-30 rumfanget med opløsningsmiddel.

Normalt isoleres ethvert fugtemiddel og/eller interferensfjernelsessystem, der anvendes, i pufferopløsningen og inkorporeres i testmaterialet ved den anden imprægnering.

35

O

DK 159168 B

38

Resultater

Et testmateriale eller testorgan afprøves for dets respons på en bestemt ion-analyt ved tilvejebringelse af kontakt mellem materialet og en vandig prøve og iagttagel-5 se af ethvert detekterbart respons. Kontakt tilvejebringes enten ved neddypning af materialet i en prøve eller ved pipettering af en prøve på materialet. Prøverne er enten kunstige vandige prøver, urinprøver eller serumprøver. Når der anvendes prøver af legemsvæsker, benyttes der flammef otome-10 tri til bestemmelse af koncentrationen af ion-analytten i prøven. Reflektansmålinger foretaget en forudbestemt tid efter kontakten relateres til koncentrationen af ion-analytten.

Når der fremstilles materialer til kvantitativ in-15 strumentel aflæsning, måles reflektansen på et Ames SERALYZER ® -reflektansfotometer (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN.) ved en bølgelængde mellem 640 og 700 nm. Disse reflektansmålinger bedømmes ved hjælp af en forenklet form af den velkendte Kubelka-Munk-ligning, jfr. Gustav 20 Kortum, "Reflectance Spectroscopy", side 106-111, Springer Verlag, New York (1969): (1-R) 2 K/S = -

2-R

25 1 hvilken R er fraktionen af reflektans fra testmaterialet, K er en konstant, og S er lysspredningskoefficienten for det bestemte reflekterende medium. K/S er relateret til 30 koncentrationen af det absorberende stof, sædvanligvis det deprotoniserede reporter-stof. K/S (eller en potens af K/S, afhængigt af ligevægtsforholdene mellem koncentrationen af det absorberende materiale og ion-analytten) afsættes mod stigende koncentration af ion-analyt [ion], i millimol pr.

35 liter (mM) i testprøven. Lineær regressionsanalyse efter de

O

39

DK 159168 B

mindste kvadraters metode anvendes til opnåelse af den bedste rette linie, der passer til de opnåede data. Når K/S anvendes, er den rette linie repræsenteret ved ligningen 5 K/S = hældning*[ion] + afskæring hvor [ion] er koncentrationen af ion-analytten i den vandige prøve, K/S er defineret som ovenfor, "hældning" refererer til hældningen af linien efter de mindste kvadraters meto-10 de, og "afskæring" refererer til afskæringen af linien ifølge de mindste kvadraters metode. Der beregnes en regressionskoefficient, r, og denne viser spredningen af data fra den rette linie,. Data, der passer til en perfekt ret linie, vil have en regressionskoefficient på 1. Når en eller anden 15 potens af K/S er relateret til koncentrationen af ion-analytten på grund af ligevægtsforhold mellem ionen og det absorberende materiale, kan denne potens af K/S anvendes til at definere ligningen, dvs.

2 20 (K/S.). = hældning* [ion] + afskæring. 1 hvert tilfælde repræsenterer ligningen respons for testmaterialet på stigende ionkoncentration, og kurven betegnes ofte som dosis-respons-kurven.

25 En stor hældning indikerer, at materialet er stærkt sensitivt, eftersom en lille ændring i koncentrationen af ion-analytten i prøven vil frembringe en større ændring i respons, dvs. farve. På den anden side bør afskæringen (det datapunkt, hvor ion-analyt-koncentrationen er 0), være så 30 lille som muligt, eftersom dette punkt indikerer baggrunden (farve), der ikke er relateret til ion-analyt-koncentrationen.

Materialer, der er fremstillet under anvendelse af en hydrofob polymer, responderer semikvantitativt på ion-35 koncentration. Ionkoncentrationen kan bestemmes visuelt, 0

DK 159168 B

40 når der anvendes et passende farvekort. Disse materialer bedømmes under anvendelse af reflektansmålinger optaget på et Macbeth®-ko lo rime ter, serie 1500 (Kollmorgen Corp., Newburgh, N.Y.) ved bølgelængder fra 400 til 700 nm.

5 Disse reflektansdate anvendes til beregning af Δε mellem to prøver. Δ E er et mål for den totale farveforskel mellem to prøver i tredimensionel rumlig farve. Δε beregnes ved hjælp af den følgende ligning, jfr. D.B. Judd og G. Wyszecki, "Color in Business, Science and Industry", John 10 Wiley and Sons, New York (1975): E = [(Al8)2 + (Δ ax)2 + (Δ^)2]1/2 hvor Δ Lx er et mål for forskellen i lyshed mellem de to prø-15 ver og varierer fra 0 for absolut sort til 100 for en perfekt hvid farve, Δ ax er et mål for forskellen i rødhed-grøn-hed mellem to prøver, og Δ&* er et mål for forskellen i gul-hed-blåhed. Værdierne for L , a og b beregnes ud fra reflek-tansen ved bølgelængder fra 400 til 700 nm. Δ E mellem en ne-20 gativ prøve (en prøve, der ikke indeholder ion-analytten) og en positiv prøve (en prøve, der indeholder ion-analytten), vil forøges med stigende ionkoncentration. Til visuel afprøvning bør forskellen mellem koncentrationsniveauer defineret på et farvekort være så stor som mulig for at tillade det 25 menneskelige øje at skelne mellem de frembragte farver. To farver opleves normalt som forskellige af det menneskelige øje, såfremt ΔΕ-værdien mellem dem er mindst tre farvedif-ferenceenheder, dvs. ΔΕ mellem koncentrationsniveauerne bør være 3 eller større. Det menneskelige øjes evne til at skel-30 ne farveforskelle vil variere i nogen grad, afhængigt af farveskalaen, der er tale om, dvs. at ændringer fra gylden til lys gulbrun og variationer i grå nuancer kan have den samæ ΔΕ-værdi, og alligevel kan de førstnævnte farver skelnes lettere fra hinanden end de sidstnævnte. Naturligvis er en 35 sådan forskel ikke nødvendig, såfremt der skal anvendes in-

O

41

DK 159168 B

strumentel aflæsning.

De forkortelser, der anvendes i eksemplerne, er som følger: [ ], anvendes til at betegne ionkoncentration i mil- limol pr. liter (mM) i lineære regressionsligninger. Alle 5 %-koncentrationer er angivet i vægt pr. dl, medmindre andet er anført.

Temperatur: °C celciusgrader Længde: cm centimeter 10 Vægt: g gram mg milligram

Rumfang: dl deciliter 15 ml milliliter pi mikroliter 1 liter

Koncentration: mM millimolær (millimol pr. liter) 20 M molær (mol pr. liter) % w/v procent vægt pr. deciliter % v/v procent rumfang pr. deciliter

Ioner:'

Na+ natriumion 25 K+ kaliumion

Li+ lithiumion

Ca++ calciumion

Forkortelser for anvendte kemiske bestanddel er angi-30 vet i det følgende. Ionophor-betegnelserne er valgt af praktiske årsager. Navnet er normalt baseret på den principielle ion, som ionophoren skal anvendes til at bestemme. Imidlertid responderer ionophorerne almindeligvis i varierende omfang på andre ioner (strukturer for foretrukne ionophorer er 35 angivet i dét foregående).

O

42 DK 159168 B

Ionophor:

Natrium-ionophor I l,l,l-tris-[l'-(2'-oxa-4'- -oxo-5'-aza-5'-methyl)-do-decanyl]-propan

Natrium-ionophor II N ,N1-dibenzyl-N,N'-diphenyl- 5 -1,2-phenylendioxydiacetamid

Natrium-ionophor III 6,7,9,10,18,19-hexahydro-17- -n-butyl-dibenzo[b,k][1,4,7,-10,13]pentaoxacyclohexadecin--18-yl-oxyeddike syre

Kalium-ionophor I 2,3-naphtho-l,4,7,10,13-pen- taoxacyclopentadeca-2-en

Lithium-ionophor I N,N'-diheptyl-N,N'-5,5-tetra- methyl-3,7-dioxanonandiamin

Lithium-ionophor II N,N'-diheptyl-5,5-dimethyl- -N,N1-di-(3-oxapentyl)-3,7--dioxanonan-diamid

Calcium-ionophor Diethyl-Ν,Ν'-[(4R,5R)-4,5- 15 -dimethyl-l,8-dioxo-3,6-di- oxaoctamethylen]bis-(12-me-thylaminododecanoat)

Hydrofobe medier: NPOE 2-Nitrophenyl-octylether 2Q NPBE 2-Nitrophenyl-butylether CDA Cis-N,N,N',N1-tetraisobutyl- -1,2-cyclohexan-dicarboxamid

Reporter-stof: 2-decyl-MEDPIN 7-(n-decyl)-2-methyl-4-(31,51-di- chlorophen-41-on)-indonaphthol 25 Pufferstof:

Bis-Tris Bis-[2-hydroxyethyl]-imino- -tris-[hydroxymethyl]-methan

Bis-Tris-propan 1,3-bis-[tris-(hydroxymethyl)- methyl)methylamino]-propan

Tris Tris-(hydroxymethyl)-amino- 30 methan ADA N-[2-acetamido]-2-iminodied- dikesyre HEPPS N-2-hydroxyethylpiperaz in-N',- 3-propansulfonsyre

Bicin N,N-bis-[2-hydroxyethyl]-glycin 35

O

DK 159168 B

43 TMA-borat Tetramethylammoniumborat TMA-phosphat Tetramethylammoniumphosphat TAPSO 3-[N-tris-(hydroxymethyl)- -methylamino]-2-hydroxypro-pan-sulfonsyre (P.L. Bioche-5 micals, Inc., Milwaukee, WI)

Hydrofob polymer (alle fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, medmindre andet er anført) PVC Polyvinylchlorid med lav mo- (lav MW) med lav molekylvægt (meget høj MW) med meget høj molekylvægt

VdC/VC Vinylidenchlorid/vinylchlo- rid-copolymer (Scientific ' Polymer Products, Ontario, N.Y.)

VdC/AN Vinylidenchlorid-acrylonitril- -copolymer (Scientific Poly- 15 mer Products, Inc ., Ontario, N.Y.) PC - I Polycarbonat (molekylvægt 20.000-25.000) PC - II Polycarbonat (molekylvægt 33.800) 20 PC - III Polycarbonat (molekylvægt 38.100)

Diverse: THF Tetrahydrofuran EDTA E thylendi amintetraeddike syre EGTA Ethylenglycol-bis-(aminoethyl)- 25 -tetraeddikesyre (G. Fredrick Smith Chemical Co., Columbus Ohio)

Triton ®X-100 Polyethylenglycol-p-isooctyl- phenylether (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 30 Zonyl ^ FSK 2,0-Acetoxy-3-(perfluoralkyl)- -N-carboxymethyl-N,N-dimethyl-propylamin (Dupont Chemical Co., Wilmington, Del.) f r)

Zonyl · FSN Polyethylenglycol-1-(2-perfluor alkyl ) -ethy lether (Dupont Chemical Co., Wilmington Del.) 35

DK 159168 B

44

Zonyl ® FSB N-Perfluoralkyl-N-carboxy- ethyl-N,N-dimethylamin (Dupont Chemical Co., Wilmington Del.)

Zwittergent ® 3-10 n-Decyl-N,N-dimethyl-3-am- monio-l-propan-sulfonat, 5 (Calbiochem-Behring, San Die- go, CA)

Brij ^ 358P Polyoxyethylenethere af fedt alkoholer (ICI United States, , Inc., Wilmington, Del.) 10 Eksempler

Den foreliggende opfindelse illustreres nærmere i de følgende udførelseseksempler.

Eksempel 1

15 Natriumion: Natrium-ligand I

Testmaterialer og testorganer, der giver respons på koncentration af natriumion i vandige prøver, fremstilles som beskrevet under den generelle metode.

Den hydrofobe opløsning er sammensat på følgende måde: 20 Natrium-ligand I 6 mg NPOE 0,3 ml PVC (lav MW, 10% i cyclohexanon) 0,6 ml 7-Decyl-MEDPIN 5,4 mg 25 Cyclohexanon 1,35 ml

Efter den første imprægnering tørres papiret ved 50°C

i 40 minutter. Pufferopløsningen indeholder 0,3 M bis-tris, pH = 7,5. Den anden tørring udføres ved 50°C i 30 minutter.

Et kvadrat på 0,6 cm x 0,6 cm af det dobbelt-imprægnerede og tørrede papir anvendes som testmaterialet. Dette materiale 30 afprøves til bestemmelse af, om visuelt skelnelige farveni-veauer kan udvikles, når materialet neddyppes i en vandig prø-ved indeholdende fra 0 til 200 mM natriumion. Resultaterne er positive, idet det udviklede farveniveau svarer semikvantita-tivt til den tilstedeværende natriumionkoncentration.

GO

t

O

45

DK 159168 B

Eksempel 2

Natriumion; En foretrukken udførelsesform

En foretrukken sammensætning af testmaterialer og testorganer, der giver respons på koncentrationen af na-5 triumion i vandige prøver fremstilles som beskrevet under den generelle metode.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: Natrium-ligand I 300 mg NPOE 4,5 ml 10 PVC (høj MW, 5% i THF) 15 ml 7-Decyl-MEDPIN 81 mg THF 12,75 ml

Pufferopløsningen indeholder 0,45 M bis-tris, pH = 7,5, og 0,05% polyvinylmethylether (Gantrez ^ M-154 fra 15 GAF Corp., New York, N.Y.). Begge tørringstrin udføres ved 65°C i 7 minutter. Et stykke af det dobbelttørrede og -imprægnerede papir med dimensionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm anvendes som testmateriale.

Udførelsen af testen gennemføres med urinprøver in-20 deholdende 0, 30, 70, 120 eller 200 mM natriumion. Materialer neddyppet i forskellige prøver kan skelnes visuelt. Der optages reflektansspektre 30 sekunder efter neddypningen af materialerne. Δ E-beregning giver følgende resultater: [Na+], mM Δε mellem niveauer 25 30---------------------5,97 70---------------------6,65 120---------------------4,16 200

Eftersom forskellen i Δ E fra ét koncentrationsni-30 veau til et andet er godt over tre enheder, kan disse koncentrationsniveauer skelnes visuelt.

35

DK 159168 B

46 o

Eksempel 3

Natriumion; Alternativ ionophor

En alternativ ionophor til bestemmelse af natriumionkoncentration i vandige prøver afprøves under anvendel-5 se af det her omhandlede materiale.

Testmaterialer og testorganer fremstilles som beskrevet under den generelle metode, idet der anvendes en alternativ ionophor, nemlig natrium-ionophor II. Den hydro-fobe opløsning indeholder følgende: 10 Natrium-ionophor II 50 mg NPOE 0,75 ml PVC (lav MW, 10% i cyclohexanon) 1 ml 7-Decyl-MEDPIN 14 mg cyclohexanon 3,3 ml

Efter den første imprægnering tørres papiret ved 90°C i 20 minutter. Pufferopløsningen er 0,3 M bis-tris, pH = 7,5. Den anden tørring udføres ved 75°C i 20 minutter.

Et stykke dobbelt-imprægneret og -tørret papir med dimen-2Q sionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm anvendes til dannelse af testmaterialet .

Når testmaterialerne neddyppes i urinprøver indeholdende 14, 34, 68 og 119 mM natriumion, udvikles der visuelt skelnelige farver. Der optages reflektansspektre 2 minutter 25 efter, at materialerne er neddyppet i urinprøverne. ΔΕ-be-regninger giver følgende resultater; [Na+], mM E mellem niveauer 14----------------------8,68 34---------------------11,03 30 6 8----------------------^37 119

Resultaterne viser, at det menneskelige øje kan skelne mellem farven udviklet efter kontakt med de tre lavere koncentrationer, men at øjet ikke vil være i stand til at 35 skelte farveforskellen mellem koncentrationerne 68 mM og 119 mM.

O

47

DK 159168 B

Eksempel 4

Natriumion: Ændring af rækkefølgen' for inkorporering

Testmaterialer og testorganer, der giver respons på koncentrationen af natriumion i vandige prøver, fremstil-5 les. Den generelle metode ændres ved imprægnering af Whatman-papiret først med pufferopløsningen fremstillet i methanol og dernæst med den hydrofobe opløsning. Pufferopløsningen indeholder 0,3 M bis-tris (i methanol), pH = 7,5. Efter imprægnering med pufferen tørres papiret ved 90°C i 20 minutter.

10 Den hydrofobe opløsning indeholder følgende:

Natrium-ligand I 40 mg PVC (lav MW, 10% i cyclohexanon) 4,0 ml ΝΡ0Ε 3,08 ml 7-Decyl-MEDPIN 56 mg

Cyclohexanon 12,92 ml

Den anden tørring udføres ved 75°C i 20 minutter. Et stykke af det dobbelt-imprægnerede og -tørrede papir med dimensionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm anvendes til dannelse af 2Q testmaterialet.

Når materialerne fremstillet ved reversering af rækkefølgen for imprægneringen dyppes i urinprøver, er farverne visuelt skelnelige og svarer semikvantitativt til natrium- + ionkoncentrationen [Na ], som målt ved flammefotometri. Der 25 optages reflektansspektre 30 sekunder efter, at materialerne er dyppet i urinprøver.

Ae-beregninger giver følgende resultater: [Na+], mM Δε mellem niveauer 21----------------------2,59 30 51---------------------12'52 101

Farveniveauer opnået for de lavere koncentrationsniveauer er svagt mindre end tre farveenheder. Ved lave koncentrationer af natriumion ændres dette materiale imidlertid 35 fra gylden til lys gulbrun, som lettere kan skelnes visuelt

O

48

DK 159168 B

end den samme grad (ΔΕ mellem niveauer) af farveændring ved højere natriumionkoncentrationer. Eksempelvis ved 100 mM natriumion og højere udviser denne sammensætning varierende nuancer af gråt, som det er vanskeligere at skelne visuelt.

5

Eksempel 5

Kaliumion: En foretrukken udføreIsesform

Testmaterialer og testorganer, der giver respons på koncentrationen af kaliumion i en vandig prøve, fremstilles 10 i overensstemmelse med den generelle metode.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende:

Kalium-ionophor I 50 mg NPOE 0,6 ml

VdC/AN 300 mg 15 PC-II 110 mg 7-Decyl-MEDPIN 19 mg THF 25 ml

Pufferopløsningen, pH = 6,26, indeholder 500 mM ADA, 667 mM Tris og 0,3% af et overfladeaktivt middel, Triton® 20 x-100, i destilleret vand. Hver tørringstrin udføres ved 60°C i 10 minutter. Et stykke af det dobbelt-imprægnerede og -tørrede papir med dimensionerne 0,2 cm x 0,4 cm anvendes til fremstilling af testmaterialet.

Der anvendes vandige kaliumchloridopløsninger som 25 prøver. For hver koncentration af kaliumion måles materialereaktiviteterne tre gange ved hjælp af reflektansen, og K/s-middelværdien beregnes.

[K+], mM Middelværdi 2 0,4750 30 3 0 , 6114 4 . 0,7119 5 0,8555 6 0,9592

Analyse af de pågældende data efter de mindste kva-35 draters metode (middelværdi af K/S mod mM-kaliumionkoncen- r

O

49

DK 159168 B

tration) giver følgende lineære relation: K/S = 0,121[K+] + 0,238; r = 0,9986 5 Testmaterialet giver et positivt respons på nærvæ relsen af kaliumion med en god korrelation mellem K/S og kaliumionkoncentration.

Eksempel 6 10 Kaliumion: Ionophor-variation

Der fremstilles en række testmaterialer og testorganer i overensstemmelse med den generelle metode, idet der anvendes forskellige kalium-selektive ionophorer.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: 15 Ionophor (se nedenfor) NPOE 2,4 ml

VdC/AC 254 mg PC-II 254 mg 7-Decyl-MEDPIN 76 mg 20 THF 100 ml

Pufferopløsningen, pH = 6,6, indeholder 300 mM ADA, 471 mM tris og 0,2% af et overfladeaktivt middel, Triton ® X-100, i destilleret vand. Begge tørringstrin udføres ved 60°C i 10 minutter. Et stykke af det dobbelt-imprægnerede 25 og -tørrede papir med dimensionerne 0,2 cm x 0,4 cm anvendes til dannelse af testmaterialer, der er egnede til brug sammen med Ames SERALYZER ^ -fotometret.

De ionophorer, der anvendes i den hydrofobe opløsning, er angivet i det følgende. Alle ionophorerne fås fra 30 Parish Chemical Co., Orem, Utah.

35 0

DK 159168 B

50

Ionophor A Cyclohexyl-15-krone-5 47,6 jil B Benzo-15-krone-5 50,6 mg C 4-Acetylbenzo-15-krone-5 58,6 mg 5 D 4-(1-Hydroxyethyl)-benxo-15-krone-5 58,9 mg E 4-(1-Hydroxymyristyl)-benzo-15-krone-5 90,7 mg F 4-tert.Butylbenzo-15-krone-5 61,2 mg G Kalium-ionophor I 60,0 mg ner fremstilles vandige kaliumchloridprøver indehol-10 dende 0, 2, 4, 6, 8 og 10 mM kaliumion. Desuden fremstilles der vandige natriumchloridprøver indeholdende 0, 40, 80, 120, 160 og 200 mM natriumion. Hver sammensætning testes for respons på kaliumionprøver og natriumionprøver. Hver prøve pipetteres på et testmateriale, og der udføres reflektans-15 målinger. Resultater af regressionsanalyse af de opnåede data efter de mindste kvadraters metode (beregnede K/S-vær-dier mod ionkoncentrationen i mM) for respons for hver sammensætning på natriumion og på kaliumion er angivet i den følgende tabel: 20 Selektivitet + +

Ionophor Dosis-respons K /Ha A K/S = 0,1540 + 0,02371 [K+] , 62 A K/S - 0,1440 + 0,00383 [Na Ί B K/S - 0,1293 + 0,006576 [K+] . 41 25 B K/S = 0,1255 + 0,000162 [Na^] C K/S = 0,1376 + 0.00633 [K+]. 73 C K/S = 0,1437 + 0,00091 [Na+] D K/S = 0,1562 + 0,00904 [K+], 60 D K/S = 0,1477 + 0,00015 [Ua*] E K/S = 0,2901 + 0,1527 [K+]. 160 30 E K/S = 0,1793 + 0,00096 [Na^] F K/S = 0,4253 + 0,1606 [K+] . 179 F K/S = 0,1805 + 0,000896 [Na^] G K/S = 0,2734 + 0,1171 [K+]. 276 G K/S = 0,1409 + 0,00042 [Na'1'] 35

O

51

DK 159168 B

Resultaterne viser dosis-respons for hver sammensætning for hver natriumion og på kaliumion. I hvert tilfælde er respons på kaliumion i det mindste en størrelsesorden større end respons på natriumion. Selektiviteten for hver 5 sammensætning for kaliumion i forhold til natriumion beregnes som forholdet mellem hældningen af den afledte ligning for kaliumion i forhold til hældningen af den afledte ligning for natriumion.

10 Eksempel 7

Kaliumion: serumprøver

Testmaterialer og testorganer, der giver respons på koncentrationen af kaliumion, fremstilles ved den generelle metode.

15 Den hydrofobe opløsning indeholder følgende:

Kalium-ionophor I 1,875 g NPOE 15 ml PC-II 3,0 g

VdC/AN 6,0 g 20 7-Decyl-MEDPIN 0,75 g THF 600 ml

Pufferopløsningen, pH = 6,6, fremstilles ved opløsning af 42,8 g ADA, 42,8 g tris og 1,5 g af et fugtemiddel, Zonyl^FSB, i 750 ml destilleret vand. Begge tørringstrin 25 udføres ved 60°C i 10 minutter. Et stykke af det dobbelt-im-prægnerede papir med dimensionerne 0,2 cm x 0,4 cm anvendes til fremstilling af et testmateriale.

På denne måde fremstillede testmaterialer afprøves for respons for kaliumion i serumprøver. Reflektansen af 30 testmaterialerne måles på et Ames SERALYZER ®-reflektans-fotometer mellem 60 og 75 sekunder efter kontakt med serumprøverne. Aflæsningerne foretages ved 640 nanometer.

K/S, beregnet som en funktion af reflektansmålinger, afsættes mod koncentrationen af kaliumion (mM) i hver prøve 35 (som bestemt ved flammefotometri). Analyse efter de mindste

O

52

DK 15916 8 B

kvadraters metode af disse data giver følgende relation: K/S = 0,1198 [K+] + 0,608 5 hvilket viser, at sammensætningen giver et godt respons på serum-kaliumkoncentration.

Eksempel 8

Kaliumion: Polymervariation 10 To rækker testmaterialer og testorganer fremstilles ved den generelle metode under anvendelse af forskellige hydrofobe polymere.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: Kalium-ionophor I 188 mg 15 NPOE 0,60 ml

Hydrofob polymer 0,90 g 7-Decyl-MEDPIN 75 mg THF 60 ml

Pufferopløsningen, pH = 6,6, fremstilles indeholdende 20 3 00 mM ADA, 470 mM tris og 0,2% af et fugtemiddel, Triton® X-100, i destilleret vand. Begge tørringstrin udføres ved 60°C i 10 minutter. Et stykke af det dobbelt-imprægnerede og -tørrede papir med dimensionerne 0,2 cm x 0,4 cm anvendes til fremstilling af et materiale.

25 Testmaterialer, sæt A, fremstilles under anvendelse af polycarbonat (PC-II) som den hydrofobe polymer. Et andet sæt, B, fremstilles under anvendelse af vinylidenchlorid--acrylonitril-copolymer (VdC/AN) som den hydrofobe polymer. Materialets respons på kaliumionkoncentration bestemmes ved 30 tilvejebringelse af kontakt mellem materialet og vandige opløsninger indeholdende 2, 3, 4, 5 eller 6 mM kaliumchlorid og måling af reflektansen. Begge sammensætninger giver respons på koncentrationen af kaliumion, men reaktiviteten, som angivet ved hældningen, og baggrunds-interferensen, som angivet 35 ved afskæringen af dosis-respons-kurven, ændres. Lineær regres-

O

53

DK 159168 B

sionsanalyse efter de mindste kvadraters metode for hver sammensætning giver følgende dosis-respons-ligninger: A K/S = 0,2214 + 0,0510[K+];r = 0,9642 B K/S = 0,4826 + 0,1662[K+];r = 0,9886 5 Begge sammensætninger giver et positivt respons på kaliumionkoncentration med god korrelation for K/S og kalium-ionkoncentration. Sammensætning B udviser en større ændring i K/S med stigende kaliumionkoncentration end sammensætning A.

10 Eksempel 9

Kaliumion; Variation af det hydrofobe medium

To rækker testmaterialer og testorganer fremstilles ved den generelle metode med forskellige hydrofobe medier.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende; 15 Kalium-ionophor I 150 mg

Hydrofobt medium 0,60 ml PC-III 126 mg 7-Decyl-MEDPIN 19 mg THF 25 ml 20 Pufferopløsningen indeholder 300 mM ADA, 470 mM tris og 0,2% af et fugtemiddel, Triton ®X-100, i destilleret vand. Der fremstilles testmaterialer og -organer, af rækken A, under anvendelse af 2-nitrophenyl-octylether (ΝΡ0Ε) som det hydrofobe medium. Testmaterialer og -organer fra rækken B fremstilles 25 under anvendelse af 2-nitrophenyl-butylether (NPBE) som det hydrofobe medium.

Dosis-respons for hver række testmaterialer på kalium-ionkoncentrationen måles under anvendelse af vandige prøver indeholdende 2, 3, 4, 5 eller 6 mM kaliumchlorid. Analyse efter 30 de mindste kvadraters metode af beregnede K/S-værdier versus mM-kaliumkoncentration giver de følgende dosis-respons-relatio-ner; A K/S = 0,2302 + 0,0747[K+];r = 0,9995 B K/S = 0,3263 + 0,1150[K+]·,τ = 0,9962 35 Begge sammensætninger udviser et godt lineært respons på kaliumionkoncentration.

O

54

DK 159168 B

Eksempel 10

Kaliumion; udeladelse af polymer

Der fremstilles testmaterialer og -organer under anvendelse af den generelle metode, men uden tilsætning af hy-5 drofob polymer til den hydrofobe opløsning.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: Kalium-ionophor I 150 mg NPOE 0,6 ml 7-Decyl-MEDPIN 19 mg 10 THF 25 ml

Den vandige pufferopløsning, pH = 6,6, indeholder 0,30MADA og 0,47 M tris, sammen med 0,2% af et overfladeaktivt middel, Triton ®X-100. Det dobbelt-inprægnerede og -tørrede papir udskæres og anvendes til fremstilling af testmate-15 rialer, der er egnet til anvendelse med Ames SERALYZER ®-re-flektansfotometeret. Materialerne fremstilles, og respons på vandige opløsninger indeholdende 2, 3, 4, 5 og 6 mM kaliumchlo-rid måles ved 640 nanometer som beskrevet under den generelle metode. Analyse efter de mindste kvadraters metode af K/S-vær-20 dier (beregnet ud fra reflektansdata) versus mM-kaliumionkon-centration giver følgende dosis-respons-relation: K/S = 0,1888 + 0,0435[K+];r = 0,998 Sammensætningen viser et positivt respons på kalium-ionkoncentration, selv uden tilsætning af et hydrofobt medi -25 um.

Eksempel 11

Lithiumion; lithium-ionophor II

Testmaterialer og -organer, der giver respons på kon-30 centrationen af lithiumion, fremstilles som beskrevet i den generelle procedure.

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: 35 ψ

O

55

DK 159168 B

Lithium-ionophor II 10 mg CDA 0,75 ml PVC (lav MW, 10% i cyclohexanon) 1,0 ml 5 7-Decyl-MEDPIN 14 mg

Cyclohexanon 3,3 ml

Pufferopløsningen er 0,3 M bis-tris, pH = 7,5. Begge tørringstrin udføres ved 65°C i 7 minutter. Der anvendes et dobbelt-imprægneret og -tørret papir til dannelse af 10 testmaterialet.

Når materialerne neddyppes i vandige prøver indeholdende fra 0 til 50 mM lithiumion, udvikles der visuelt skelnelige farveniveauer, der semikvantitativt svarer til koncentrationen af lithiumioner.

15 De værdier for ΔΕ, der beregnes ud fra reflektans- målinger, som optages 5 minutter efter, at et materiale er dyppet i prøverne for hver lithiumkoncentration, der afprøves, er følgende: [Li+], mM Δ E mellem niveauer 20 1-----------------------5,91 5-----------------------4,61 10-----------------------2,31 15-----------------------6,24 25-----------------------3,82 25 50

Koncentrationsniveauer 1, 5, 15, 25 og 50 mM kan let skelnes visuelt under anvendelse af sammensætningen. Medens 10 mM lithiumion kan skelnes fra 15 mM, er visuel skelnen mellem 5 mM og 10 mM mere vanskelig. Naturligvis kan alle 30 koncentrationsniveauerne let skelnes instrumentelt.

Eksempel 12

Lithiumion: en foretrukken udførelsesform

Der fremstilles testmaterialer og -organer under an-35 vendelse af lithium-ionophor II. Den hydrofobe opløsning frem-

O

56

DK 159168 B

stilles ved blanding af 0,04 ml af en opløsning indeholdende I, 008 g CDA, 18 mg 7-decyl“MEDPIN og 90 pi lithiumionophor II, samt 14,6 ml af en opløsning indeholdende 0,1 mg VdC/VC og 25 ml THF. Papiret tørres og neddyppes derpå i en puffer- 5 opløsning indeholdende 0,20 M bicin, indstillet på en pH-vær-di på 8,5, og 0,5% Triton ®X-100. Det dobbelt-imprægnerede papir ovntørres ved 60°C.

Testmaterialerne bedømmes ved reflektansaflæsninger for respons på lithiumionkoncentration, idet der anvendes 10 vandige prøver indeholdende fra O til 10 mM 1-ithiumchlorid.

En analyse efter de mindste kvadraters metode af de opnåede 2 data [(K/S) beregnet ud fra reflektansmålingerne ved stigende mM lithiumionkoncentration] giver følgende relation: (K/S)2 = 0,3146 + 0,03691[Li+];r = 0,988 15 Den afledte ligning viser, at materialet giver re spons på stigende lithiumkoncentration med god korrelation 2 af beregnet (K/S) og lithiumionkoncentration.

Eksempel 13 20 Lithiumion: alternative puffere

Der fremstilles testmaterialer og -organer som beskrevet under den generelle metode. Den hydrofobe opløsning fremstilles som beskrevet i eksempel 11. Pufferopløsningen indeholder 0,3 M HEPPS, pH = 7,5.

25 Bedømmelse på et Macbeth ® -kolorimeter 5 minutter efter, at materialerne er dyppet i vandige prøver indeholdende lithiumion, giver følgende resultater: [Li ], mM Δ E mellem niveauer 10-------------------:----5,07 30 25----------------------6,33 50

Et andet sæt testmaterialer fremstilles under anvendelse af en pufferopløsning indeholdende 0,2 M tris, pH = 7,5. Tilsvarende bedømmelsesmetoder på vandige prøver indeholden-35 de lithiumion giver følgende resultater: 4*

O

57

DK 159168 B

[Li ], mM Δ E mellem niveauer 10----------------------6 25----------------------5,61 50 5 Begge sammensætninger udviser omtrentlig samme far veændring fra én prøvekoncentration til den næste, men som angivet i det foregående påvirker valget af pufferen far-veudviklingen.

10 Eksempel 14

Lithiumion: fjernelse af calciumion-interferens

Testmaterialer og -organer, der giver respons på tilstedeværelsen af lithiumion, fremstilles under tilsætning af bestanddele, der skal eliminere calciumion-interferens. Se-15 rie-imprægnering og -tørring af Whatman-filterpapir anvendes til fremstilling af testmaterialerne.

Den hydrofobe opløsning fremstilles ved blanding af 0,4 ml af en opløsning indeholdende 90 ul lithium-ionophor I, 1,004 g CDA og 9 mg 7-decyl MEDPIN, med 14,6 ml af en opløs-20 ning indeholdende 19 mg VdC/AN og 25 ml THF. Papiret neddyp-pes i den hydrofobe opløsning og tørres. Det tørrede papir neddyppes dernæst i en opløsning indeholdende 1% agarose og 0,2% Triton - X-100 og tørres. Det dobbelt-tørrede papir nedsænkes derpå i en tredje opløsning, pH = 8,50, indeholdende 25 pufferstoffet og et interferensfjernelsessystem, der er sammensat af 0,46 M tris, 0,05 M MgSO^^^O (magnesiumsulfat--heptahydrat) , 0,1% Triton ®X-100 og 0,05 M EGTA. Efter den tredje imprægnering tørres papiret påny. Et stykke af det tre gange imprægnerede og tørrede papir anvendes til frem-30 stilling af testmaterialer, der er egnet til anvendelse sammen med et Ames SERALYZER ^-reflektansfotometer. Prøver indeholdende 0, 2, 4, 6, 8 eller 10 mM calciumchlorid pipetteres på materialerne. Reflektansmålinger på reagerede mate- 2 rialer anvendes til beregning af (K/S) . De beregnede værdi-35 er anvendes derpå i en lineær regressionsanalyse efter de

O

58

DK 159168 B

mindste kvadraters metode til bestemmelse af, om materialerne, der indeholder calcium-interferensfjernelsessyste-met, giver respons på nærværelsen af calciumion. Den opnåede dosis-respons-ligning er følgende: 5 (K/S)2 = 0,1488 - 9,77 x 10_5[Ca++];r = -0,068 hvilket viser, at tilstedeværelsen af calciumion ikke har nogen virkning på materialer sammensat med calciumion-in-terferensfj ernelsessystemet.

10 Eksempel 15

Lithiumion: ionophor som interferensfjernelsessystemet

Testmaterialer og -organer, der giver respons på nærværelsen af lithiumion, fremstilles som beskrevet i eksempel 12. Til formindskelse af interferensen af natrium-15 ion med samvirkningen mellem en lithium-ionophor og lithiumion, inkorporeres der en vandopløselig, natrium-specifik ionophor såsom —d >— H03S--- I I I SOnH 1 papiret sammen med pufferopløsningen. Den vandopløselige ionophor fremstilles ved kemisk addition af solubiliseren-de grupper, f.eks. -SO^H, til en ion-specifik ionophor på 30 en sådan måde, at den kemiske modifikation ikke interfererer med dannelsen af det ønskede ionophor-ion-kompleks. Samvirkningen mellem natriumion og den interferensfjernende ionophor i den vandige base vil tilbageholde natriumionen i den vandige fase og hindre den interfererende ion i at træ-35 de ind i den hydrofobe fase, hvor den kunne reagere med li- 59

DK 159168 B

O

thium-ionophoren.

Andre kation-interferenser fjernes ved anvendelse af egnede selektive ionophorer/ der kan gøres vandopløselige ved kemisk modifikation.

5

Eksempel 16 Calciumion

En tidlig sarmensætning af testmaterialer og -organer fremstilles som beskrevet i eksempel 3.

10 Den hydrofobe opløsning indeholder følgende:

Calcium-ionophor 20 mg NPOE 0,75 ml PVC (lav MW, 10% i cyclohexanon) 1,0 ml 1-Decyl-MEDPIN 14 mg

Cyclohexanon 3,3 ml

Pufferopløsningen indeholder 0,3 M bis-tris-propan, pH = 7,5, i destilleret vand. Et stykke af det dobbelt-im-prægnerede og -tørrede papir anvendes til dannelse af et materiale som beskrevet under den generelle metode.

20

Resultaterne af instrumentel bedømmelse på Macbeth -kolorimeteret, 30 sekunder efter neddypning af materialerne i fremstillede vandige opløsning indeholdende calciumion, er følgende: [Ca ], mM Ae mellem niveauer 25 5----------------------5,23 15----------------------3,50 20

Resultaterne viser, at materialet kan anvendes til 3Q fremstilling af materialer til visuel korrelation med den semikvantitative koncentration af calciumion i vandige opløsningsområder.

35 0

DK 159168 B

60

Eksempel 17

Calciumion: en foretrukken udførelsesform

Der fremstilles testmaterialer og -organer ved serie-imprægnering og -tørring som beskrevet under den gene-5 relle metode, med den undtagelse, at EGTA, en kraftig calciumbinder, sættes til pufferopløsningen. Koncentrationen af EGTA indstilles således, at testmaterialet ikke vil give respons på nærværelsen af calciumion, før ionkoncentrationen når 1 mM. Dette forventes at tillade, at testmateria-10 let kan fungere med højere præcision over det ønskede koncentrationsområde .

Den hydrofobe opløsning indeholder følgende: Calcium-ionophor 100 mg

VdC/VC 282 mg 15 PC-III 100 mg NPOE 0,625 ml 7-Decyl-MEDPIN 12,5 mg THF 25 ml

Pufferopløsningen indeholder 500 mM TAPSO, 75 mg 20 Triton ®X-100 og 1 ml af en opløsning indeholdende 190 mg EGTA, 123 mg MgSO^^H^O og 1297 mg TAPSO i et slutrumfang på 10 ml i destilleret vand.

Et stykke af det dobbelt-imprægnerede, tørrede papir anvendes til fremstilling af et testmateriale. Materia-25 lerne afprøves på vandige calciumchloridopløsninger indeholdende fra 0 til 4 mM calcium i 0,25 mM-inkrementer, og der optages reflektansmålinger på et Ames SERALYZER ®-reflek-tansfotometer. På grund af den ligevægtsrelation, der viser, 3 at calciumionkoncentrationen er proportional med (K/S) , be- 3 30 regnes værdien (K/S) for hvert koncentrationsniveau. Disse data anvendes ved en lineær regressionsanalyse efter de mindste kvadraters metode. Det således bestemte dosis-respons er følgende: (K/S)3 = -1,711 + 1,938[Ca++];r = 0,997 35

DK 159168B

O

61

Den negative afskæring skyldes den beregnede extrapolation af en dosis-respons-kurve, der ikke viser noget respons, indtil koncentrationen af calciumion når 1 mM. Resultaterne viser, at de således dannede materialer viser et 5 signifikant respons på calciumionkoncentration, hvorved der tilvejebringes den høje nøjagtighed, der kræves til serum--calcium-bestemmelser.

10 15 20 25 30 35

Claims (11)

1. Testmateriale til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, 5 at testmaterialet indeholder en porøs bærematrix, der i det væsentlige ensartet er inkorporeret med a) et homogent, hydrofobt materiale indeholdende en ionophor, der er i stand til at danne et kompleks med P ionen, et hydrofobt medium og et reporter-stof, der er i 10 stand til at reagere med komplekset af ionophor og ion til tilvejebringelse af et detekterbart respons, og b) et pufferstof, der er i stand til at tilvejebringe en pH-værdi i området fra ca. 5 til ca. 10.

2. Testmateriale ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den porøse bærematrix er papir.

3. Testmateriale ifølge krav 1 eller 2, kende -tegnet ved, at ionophoren er en uladet podand. 20

4. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det homogene, hydrofobe materiale yderligere indeholder en hydrofob polymer.

5 -OCN, -N3, -COZ, -COOZ, -CONHZ, -CF3, -CC13, -N02, -S02CF3, -S02CH3, -S02, -C6H5, -S02C6H4CH3, -SOCgH5 eller -SOCF3, hvor Z betegner alkyl eller aryl.

5. Testmateriale ifølge ethvert af krav 1-4, ken detegnet ved, at den porøse bærematrix yderligere er inkorporeret med et fugtemiddel og/eller interferensfjernelsessystem.

6. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at reporter-stoffet er et sådant, der er i stand til at frembringe en tilsynekomst af eller en ændring i farve eller fluorescens i nærværelse af komplekset af ionophoren og ionen. 35 DK 159168 B O

7. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at reporter-stoffet er en forbindelse med strukturformlen Λ i 1 0 15. hvilken X betegner et halogen eller et -CN, -SCN, -OCN, -n3, -coz, -cooz, -conhz, -cp3, -CC13, -no2, -so2cf3, -S02CH3, -S02, -CgHg, -S02CgH4CH3, -SOCgHg eller -SOCF3, hvor Z betegner alkyl eller aryl, hvert af symbolerne R, der er ens eller forskellige, er en substituent i stil- 20 ling 2-, 3-, 5- og/eller 6, og udvalgt blandt lavere alkyl havende 1-4 kulstofatomer, intermediært alkyl havende 5-15 kulstofatomer, aryl og en kondenseret ring ved 2,3-eller 5,6-stillingerne, og n har en værdi fra 0 til 4, eller med strukturen

25 H TQlof " Sl A o 35 O DK 159168 B i hvilken R' betyder hydrogen eller lavere alkyl havende 1-4 kulstofatomer, fortrinsvis methyl, Rx betyder hydrogen eller intermediært alkyl havende 5-15 kulstofatomer, fortrinsvis n-decyl, og X betyder halogen eller -CN, -SCN,

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et testmate- 10 riale til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at fremgangsmåden omfatter følgende trin: a) dannelse af en homogen første blanding af det hydrofobe materiale indeholdende en ionophor, der er i 15 stand til at danne et kompleks med ionen, et hydrofobt medium, et reporter-stof, der er i stand til at reagere med komplekset af ionophoren og ionen til tilvejebringelse af et detekterbart respons, og et organisk opløsningsmiddel, b) dannelse af en homogen anden blanding af et puf- 20 ferstof, der er i stand til at tilvejebringe pH-værdi i området fra ca. 5 til ca. 10, og vand eller et med vand blandbart opløsningsmiddel eller en blanding deraf, c) inkorporering af den ene af de nævnte blandinger med en porøs bærematrix, 25 d) tørring af den inkorporerede matrix, e) inkorporering af den anden af de nævnte blandinger med den porøse bærematrix til dannelse af en dobbelt--inkorporeret matrix og f) tørring af den dobbelt-inkorporerede bærematrix. 30

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den første blanding yderligere indeholder en hydrofob polymer. 35 DK 159168 B O

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, k endete g n e t ved, at den anden blanding yderligere indeholder et fugtemiddel og/eller et interferensfjernelsessystem.

11. Fremgangsmåde til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at man bringer testprøven i kontakt med testmaterialet ifølge ethvert af kravene 1-7 og iagttager et detekterbart respons. 10 15 20 25 30 35