DK159206B - K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents
K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- DK159206B DK159206B DK547486A DK547486A DK159206B DK 159206 B DK159206 B DK 159206B DK 547486 A DK547486 A DK 547486A DK 547486 A DK547486 A DK 547486A DK 159206 B DK159206 B DK 159206B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ala
- asn
- gln
- leu
- peptides
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 65
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 47
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 14
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- WUFYAPWIHCUMLL-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Ala Chemical group [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WUFYAPWIHCUMLL-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 2
- RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N Asp-Gln-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- MEJHYNPOIFOIIU-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical compound CN1C(=O)CNC1=S MEJHYNPOIFOIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical group NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 108010032939 des-Arginine Complement C5a Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 244000221226 Armillaria mellea Species 0.000 description 1
- 235000011569 Armillaria mellea Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000735431 Homo sapiens Terminal nucleotidyltransferase 4A Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100034939 Terminal nucleotidyltransferase 4A Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- -1 amino acid anilinothiazolinones Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000007885 bronchoconstriction Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000006215 rectal suppository Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012031 short term test Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DK 159206 B
K-CELLESTIMULERENDE PEPTIDER OG SALTE DERAF SAMT FARMACEUTISKE PRÆPARATER INDEHOLDENDE DISSE
Opfindelsen angår hidtil ukendte peptider med formlen I nedenfor og fysiologisk forenelige salte deraf, hvilke peptider har interessante og overraskende farmakologiske egenskaber, idet de besidder en evne til at forstærke 5 cellemedieret cytotoksicitet. Opfindelsen angår således også farmaceutiske præparater, der indeholder i det mindste ét af disse peptider.
I den følgende beskrivelse og kravene er den anvendte nomenklatur i overensstemmelse med J.Biol.Chem.
10 247 (1972), 977 ff.
Cancertyper og virusinfektioner er alvorlige lidelser, og der er indtil nu ikke fremkommet noget lægemiddel, der kan anvendes over for alle cancertyper eller virusinfektioner uden bivirkninger.
15 Naturlig dræbning (herefter NK) og antistofaf hængig cellulær cytotoksicitet (herefter ADCC) er kendte eksempler på immunologiske forsvarsmekanismer over for cancer og virusinfektioner. Adskillige undersøgelser har antydet en forbindelse mellem disse typer cellulære cyto-20 toksiske reaktioner og forsvarsmekanismer over for cancer samt virusinfektioner. Derfor anses stimulering af NK-og/eller ADCC-aktivitet samt andre cellulære cytotoksici-tetsmekanismer (herefter kollektivt betegnet cellulær dræbning (K-celleaktivitet)) in vivo for at være af stor 25 betydning ved behandling af cancertyper og virusinfektioner.
Det har vist sig, at én gruppe proteiner, dvs. interferonerne, stimulerer disse reaktionstyper. Det er også kendt, at visse andre peptider og proteiner stimulerer 30 K-celleaktiviteter. Lymfokinen interleukin-2 er blevet angivet som værende særlig vigtig ved stimulering af K-celleaktivitet, og forstærkningen af K-celleaktivitet med lymfokiner efter stimulering i 3 - 5 dage benævnes ofte lymfokinaktiveret dræbning (herefter LAK), og stimulerede
DK 159206 B
2 celler benævnes lymfokinaktiverede dræberceller (herefter LAK-celler).
Det er kendt, at protein A fra Staphylococcus aureus stimulerer K-celleaktiviteter.
5 Det er endvidere kendt, at S. aureus protein A
(herefter SpA) har et antal andre immunologiske egenskaber herunder aktivering af komplementsystemet, polyklonal stimulering af B- og T-lymfocyter, polyklonal aktivering af antistofsyntese og interferoninduktion.
10 Disse egenskaber ved SpA har frembragt stor inter esse for anvendelsen af SpA som immunologisk reagens, og det er yderst ønskeligt at komme frem til en måde, hvorpå SpA's nyttige egenskaber kan udnyttes uden at fremkalde de mere skadelige egenskaber ved dette protein.
15 SpA kan ikke anvendes direkte in vivo, eftersom det kan fremkalde overfølsomhedsreaktioner (sandsynligvis på grund af dets binding til immunoglobuliners Fc-del med efterfølgende aktivering af komplement etc.). Forskellige præparater med det fuldstændige SpA molekyle har imidlertid 20 været anvendt til ekstrakorporeal plasmaadsorbtion i stor skala (J. Balint Jr. et al: Cancer Research 44 (1984), 734 - 743), hvilket er blevet fortolket som en vekselvirkning med immungiobuliner i immunkomplekser, eller til intravenøs infusion i dyr (H.D. Harper et al.: Cancer 55 25 (1985), 1863 - 1867) med gunstige resultater.
Protein A fra S. aureus er et protein, hvor den NH2-terminale del indeholder fem homologe enheder hver omfattende fra 56 til 61 aminosyrer, og den COOH-terminale del indeholder adskillige gentagelser af en octapeptid (cf.
30 Uhlén M. et al.: J.Biol.Chem. 259, 3 (1984), 1695 - 1702).
De fem homologe områder i den N-terminale del benævnes som regel E-, D-, A-, B- og C-områderne, og den C-terminale del- benævnes X-området.
35 SpA's struktur er blevet indgående undersøgt og er ud over i den tidligere henvisning beskrevet i en række publikationer, såsom WO 8400773, WO 8400774, WO 8403130
DK 159206 B
3 (alle Pharmacia AB) og EP A2 107,509 (Repligen Corp.), hvortil der henvises.
Resultater, der er opnået i undersøgelser udført af J. Sjodahl og G. Moller (Scand.J.Immunol. 10 (1979), 593 5 - 596) og Olinescu et al. (Immunol.Letters 6 (1983), 231 - 237), er blevet fortolket som angivende, at den aktive del af SpA molekylet skulle ligge i det såkaldte X-område, den C-terminalt lokaliserede del af molekylet. En tilsvarende angivelse af aktive sites i SpA findes på side 3 i oven-10 nævnte europæiske ansøgning nr. EP A2 107.509.
Det har nu overraskende vist sig, at peptider med formlen I nedenfor har K-cellestimulerende virkning. Et antal forbindelser med formlen I er blevet identificeret ud 15 fra proteolytisk spaltning af SpA og isolering af fragmenter, som udviser ingen eller kun ringe binding til immuno-globuliner (d.v.s. de er i det væsentlige uden immunoglobulin tværbindingsaktivitet). Disse fragmenter har vist sig at have K-cellestimulerende virkning in vitro over for både 20 NK-følsomme og -ufølsomme targetceller.
Som angivet ovenfor kan de omhandlede peptider afledes fra SpA som fragmenter bestående af en kontinuerlig del af aminosyresekvensen fra det såkaldte E-område (jfr.
Uhlén M. et al.: J.Biol.Chem, 259, 3 (1984), 1695 - 25 1702), hvilke fragmenter indeholder fra 20 aminosyregrupper og op til 25 aminosyrerester fra hele sekvensen for E-omr-ådet.
Peptiderne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel I 30
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-
Tyr-Gln-Val-Leu-Asn-Met-Pro-Asn-R (I) hvori R er Leu, Leu-Asn, Leu-Asn-Ala, Leu-Asn-Ala-Asp, 35 Leu-Asn-Ala-Asp-Gln eller Leu-Asn-Ala-Asp-Gln-Arg, og fysiologisk forenelige salte deraf.
4
DK 159206 B
Som eksempler på specifikke og foretrukne peptider med formlen I kan de følgende nævnes:
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val-5 Leu-Asn-Met-Pro-Asn-Leu-Asn-Ala-Asp-Gln-Arg, px-l' (svarende til de første 25 aminosyregrupper i E-området), og
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val-Leu-Asn-Met-Pro-Asn-Leuf pX-2', 10 (svarende til de første 20 aminosyregrupper i E-området),
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder i det mindste ét peptid eller salt deraf ifølge et vilkårligt af kravene l til 3 i 15 kombination med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel eller excipiens.
Ifølge et foretrukkent aspekt angår opfindelsen peptider og kompositioner, der er nyttige til forstærkning 20 af K- celleaktiviteten i dyreceller, omfattende et peptid med en aminosyresekvens svarende til et fragment af E-området i SpA, hvor peptiderne er yderligere karakteriseret ved, at de er i det væsentlige fri for immunoglobulinfo indingsaktivitet, og fysiologisk forenelige salte deraf.
25
Nedenfor beskrives opfindelsen nærmere under henvisning til tegningen, hvori fig. 1 viser aminosyresekvenserne for område E i protein A fra Staphylococcus aureus stamme 8325-4 (jfr.
3 0 Uhlén et al. ovenfor), fig. 2 viser det elueringsmønster, der opnås ved isoleringen af et peptid ifølge opfindelsen, fig. 3 viser resultaterne af en komparativ test mellem SpA og non-IgG-bindingsfragmenter, og 35 fig. 4 viser resultaterne af en test for komple mentaktivering med SpA og et peptid ifølge opfindelsen.
DK 159206 B
5
Opfindelsen er baseret på den overraskende observation, at SpA's evne til at forstærke cellemedieret cytotoksicitet øjensynlig ligger i E-området eller fragmenter deraf.
5 Endvidere har det også overraskende vist sig, at E- området eller fragmenter deraf har ingen eller ringe affinitet til immunoglobuliner, hvorved aktivering af komplement i det væsentlige elimineres.
Disse fragmenter omfatter alle aminosyregrupperne 10 His-Ala-Glu-Ala.
I fig. 1 er aminosyresekvensen for område E angivet med markeringer, der anfører de foretrukne peptider ifølge opfindelsen.
Den omhandlede opfindelse angiver et antal pepti- 15 der, hvoraf nogle kan udledes fra SpA's aminosyresekvens.
*
Et af disse blev frembragt ved plasminnedbrydning af SpA, og aminosyresekvensen blev bestemt som følger:
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val-Leu-20 5 10 15
Asn-Met-Pro-Asn-Leu-Asn-Ala-Asp-Gln-Arg (pX-l') 20 25
Et andet syntetiseredes som: 25
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val-Leu-5 10 15
Asn-Met-Pro-Asn-Leu (pX-21) 20 30
Begge disse peptider ifølge opfindelsen blev afprøvet og fandtes at forstærke cellemedieret cytotoksicitet ved in vitro undersøgelser for forstærkning af K-celleaktiviteten.
35 Aminosyresekvenserne for pX-l' og pX-2' svarer til sekvenserne for henholdsvis de første 25 og 20 aminosyre-grupper i SpA, svarende til den N-terminale del af område E, der omfatter de første 56 aminosyregrupper i SpA.
DK 159206 B
6
De omhandlede peptider kan syntetiseres efter en vilkårlig, kendt fremgangsmåde. En oversigt over sådanne teknikker kan ses i J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman, San Francisco, 1969 5 og J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, (1973), side 46,Academic Press, New York, for fastf asesyntese og i E. Schroder og K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, (1965), Academic Press, New York, for klassisk opløsningssyntese.
10 I almindelighed omfatter disse metoder en sekventiel tilføjelse af én eller flere aminosyrer eller passende beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkæde.
I almindelighed beskyttes enten amino- eller carboxyl-gruppen i den første aminosyre med en passende beskyttel-15 sesgruppe. Den beskyttede eller derivatiserede aminosyre kan derefter enten fæstnes til et inert fast underlag eller anvendes i opløsning ved at tilføje den næste aminosyre i sekvensen med den komplementære (amino- eller carboxyl-) gruppe beskyttet passende under betingelser, der er egnede 20 til at danne amidbindingen. Derefter fjernes den beskyttende gruppe fra denne nyligt tilføjede aminosyregruppe, og den næste aminosyre (passende beskyttet) tilføjes derefter, og så fremdeles. Efter at alle de ønskede aminosyrer er blevet forbundet i den korrekte sekvens, fjernes alle 25 tilbageblevne beskyttelsesgrupper (og ethvert fast underlag) sekventielt eller samtidigt til opnåelse af det endelige peptid. Ved enkel modificering af denne almene procedure er det muligt at tilføje mere end én aminosyre på én gang til en voksende kæde, f.eks. ved (under betingel-30 ser, der ikke racemiserer kirale centre) at koble et beskyttet tripeptid til et passende beskyttet dipeptid til efter fjernelse af beskyttende grupper at danne et penta-peptid.
De omhandlede polypeptider kan endvidere frem-35 stilles ved rekombinant DNA-teknologi, f.eks. ved modificering og anvendelse af en del af den DNA-sekvens, der koder for S. aureus protein A.
DK 159206 B
7
De omhandlede peptider Jean også fremstilles ved proteolytisk eller kemisk spaltning af SpA og efterfølgende fraktionering og isolering af SpA-fragmenterne.
Til nedbrydningen kan der anvendes forskellige 5 proteolytiske enzymer såsom trypsin, plasmin, Armillaria mellea protease eller clostripain, chymotrypsin, carboxy-peptidaser eller S. aureus V8 protease. Til kemisk spaltning kan der anvendes CNBr, syrer eller baser.
Peptidernes isolering kan udføres efter en 10 vilkårlig, passende, kendt fremgangsmåde, såsom ved højtryksvæskekromatografi (HPLC).
Peptider med formlen I eller peptider med en aminosyresekvens svarende til E-området i SpA eller fragmenter deraf overføres i farmaceutiske præparater og 15 indgives fortrinsvis til mennesker efter kendte metoder. Peptider med formlen I samt salte eller estere deraf kan indgives peroralt, topisk, rektalt, vaginalt, intravenøst, intramuskulært, intratekalt eller subkutant med dosis i området fra ca. 1 til 1000 ^g/kg legemsvægt, skønt mindre 20 eller større dosis også kan indgives. Den fornødne dosis vil afhænge af, hvor alvorlig patientens tilstand er, det anvendte peptid, indgiftsmåden og behandlingens varighed.
Præparaterne kan formuleres som "slow-release" præparater eller depotpræparater.
25 Til parenteral indgift opløses peptider med formlen I i sterile isotoniske saltopløsninger.
Som eksempler på salte af de ovennævnte peptider kan nævnes natrium-, kalium-, magnesium-, kalcium- og zinksalte og syreadditionssalte med organiske eller uorganiske 30 syrer såsom myresyre, methansulfonsyre, saltsyre og svovlsyre. Foretrukne salte af peptider med formlen I er fysiologisk og farmaceutisk acceptable salte.
Ud over et af de nævnte peptider eller et salt deraf kan de farmaceutiske præparater omfatte et farmaceu-35 tisk acceptabelt bæremiddel, fortyndingsmiddel, fortrinsvis isotoniske saltopløsninger og/eller excipiens.
Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende ek-
DK 159206 B
8 sempler.
Eksempel 1
Fremstilling af peptider ved proteolvtisk spaltning af SpA 5 a) plasminnedbrydning.
15 mg renset SpA fra Pharmacia, Uppsala, Sverige, opløstes i 600 μΐ 0,1 M ammoniumformat (pH 7,5), og 600 μΐ plasmin (svarende til 14 CU (caseinenheder)) opløst i samme 10 puffer tilsattes. Blandingen inkuberedes ved 37°C i 205 minutter. Omsætningen standsedes ved tilsætning af aproti-nin koblet til Sepharose 4B efterfulgt af yderligere 15 minutters inkubering ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen centrifugeredes derefter og den ovenstående væske 15 sugedes bort. 1,0 ml 0,1 M ammoniumformat sattes til pelleten (indeholdende immobiliseret aprotinin samt resterende reaktionsblanding), prøven blandedes og centrifugeredes, og den ovenstående væske sugedes bort. Den sidstnævnte procedure gentoges to gange.
20 Endelig samledes alle de ovenstående væsker og lyophiliseredes gentagne gange.
b) Rensning.
Peptiderne fra ovenfor rensedes ved HPLC på en 25 modfasesøjle (Nucleosil 5C1g) med det følgende udstyr: 2 LKB 2150 HPLC pumper, LKB 2151 variabel bølgelængdemonitor, LKB 2152 HPLC kontrol, LKB 2220 registreringsintegrator og LKB Superrac.
Rensningerne udførtes som følger: 30 Puffer A: 0,02 M ammoniumformat (pH 6,5); puffer B: 40% 0,05 M ammioniumformat (pH 6,5) og 60% ethanol; strømningshastighed: 0,5 ml/min; fraktionsrumfang: 0,25 ml.
Materialet i fraktionerne 150 - 152 valgtes til 35 karakterisering.
HPLC rensningens resultater er vist i fig. 2, hvor de udvalgte fraktioner er angivet.
DK 159206 B
9
Produktet indeholdt 2 peptider, der sekventeredes efter den følgende forskrift:
Edman-nedbrydninger af peptiderne udførtes med en Applied Biosystems model 470A gasfasesekvensor som beskre-5 vet (R.M. Hewick, M.W. Hunkapiller, L.E. Hood og W.J. Dreyer: J.Biol.Chem. 256 (1981), 7990 - 7997; M.W. Hunkapiller, R.M. Hewick, W.J. Dreyer og L.E. Hood: Methods Enzy-mol. 91 (1983), 399 - 413) med adskillige modifikationer.
Et fjerde opløsningsmiddel (SI = n-heptan) inkluderedes til 10 vask af filteret i 30 sekunder efter kobling med phenyli-sothiocyanat (PITC). For at opnå de methylerede derivater af Asp og Glu udførtes omdannelsen af aminosyreanilinothia-zolinoner til phenylthiohydantoiner med 1 N methanolisk HC1 i stedet for 25% trifluoreddikesyre (TFA). Sekvensorpro-15 grammet justeredes efter dette reagens, eftersom kortere tørretidsrum var nødvendige. Phenylthiohydantoinamino- syrerne (PTH-a.a.) opløstes i ca. 0.25 ml methanol og tørredes i en Savant vakuumcentrifuge i 10 minutter ved 45°c. Tørrede PTH-a.a. genopløstes i 0,025 ml methanol indehol-20 dende methylthiohydantoin (MTH)tyrosin som intern standard. PTH-a.a. identificeredes og kvantificeredes ved modfase HPLC på en 25 cm x 0.46 cm IBM cyanosøjle udrustet med en 5 cm x 0,46 cm Permaphase ETH cyano guard søjle (DuPont) (M.W. Hunkapiller og L.E. Hood: Methods Enzymol. 91 25 (1983), 486 - 493) i en Hewlett Packard væskekromatograf model 1084B udstyret med en variabel UV detektor model 79875. A opløsningsmidlet var 16 mM natriumacetat, pH 5,60, og B opløsningsmidlet var acetonitril/methanol, 9:1 (rumfang/rumfang). Søjlen bragtes i ligevægt med 15% B og 30 elueredes med en lineær gradient på 15% - 51,4% B i 0 - 15,30 minutter. PTH-a.a. detekteredes ved 263 nm ved 1,5 mAUFS (Absorption Unit Full Scale).
Aminosyresekvensdataene er anført i tabel 1 nedenfor:
DK 159206 B
10
Tabel 1
Sekvensanalvse af peptid-pool
Prøve: Fraktion 150 - 152 (se Fig. 2) 5 Gennemsnitligt gentagent udbytte: 95.7%
Cyklus nr. PTH-a.a. Mængde PTH-a.a. Mængde (pmol) (pmol) 1 Asp 391 Ala 853 10 2* Gin (1500) Gin (750) 3 Gin 1405 His 266 4 Ser 59 Asp 168 5 Ala 870 Glu 424 6 Phe 715 Ala 505 15 7 Tyr 1062 Gin 749 8* Glu (850) Gin (425) 9 Ile 746 Asn 665 10 Leu 624 Ala 360 11 Asn 531 Phe 298 20 12 Met 575 Tyr 454 13 Pro 519 Gin 560 14 Asn 820 Val 383 15* Leu (483) Leu (241) 16* Asn (737) Asn (368) 25 17 Glu 198 Met 323 18 Ala 288 Pro 176 19 Gin 540 Asn 419 20 Arg 140 Leu 392 21 Y, 30 22 Ala 280 23 Y2 24 Gin 79 25 Arg 177 * Samme aminosyregruppe forekommer i begge peptider, den 35 fundne mængde deles derfor proportionalt mellem peptiderne
Af tabel 1 fremgår det, at det rensede, samlede
DK 159206 B
11 materiale indeholder en blanding af to peptider. De ikke identificerede aminosyregrupper Y1 og Y2 kan tilordnes som henholdsvis Asn og Asp ved at sammenligne sekvensen med sekvensen af protein A fra S. aureus (Uhlen et al., se 5 ovenfor).
Produktet består således af 33% peptid, pX-1’, med formlen
Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val- -Leu-Asn-Met-Pro-Asn-Leu-Asn-Ala-Asp-Gln-Arg, 10 svarende til de første 25 aminosyregrupper i den N-terminale del af SpA, hvilket også er de første 25 aminosyregrupper af den N-terminale del af region E, og 67% af et peptid svarende til aminosyregrupperne 11 til 30 i region D.
15 Produktet viste sig at have K-celleaktivitet, idet det forstærkede aktiviteten i de nedenfor beskrevne assay-procedurer.
Eksempel 2 20
Fremstilling af peptidblandinoer ved proteolytisk spaltning af SpA
a) Nedbrydning med plasmin 25 150 jug renset SpA blev nedbrudt med 0,3 CU (casein enheder) plasmin (KABI) ved 37°C i 60 minutter.
Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af aprotinin bundet til Sepharose 4B og inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten blev fjernet 30 efter centrifugering og anvendt i de følgende eksperimenter.
b) Analyse af K cellestimuleringsaktivitet
Med henblik på evaluering af betydningen af non-Fc 35 bindingspeptider ved in vitro stimulering af K celleaktivitet blev det proteolytiske nedbrydningsmateriale fra før (svarende 12 til 8 μg SpA) inkuberet med human IgG bundet til Sepharose 4B eller med kontrol-Sepharose 4B i 30 minutter ved stuetemperatur. Renset SpA blev inkuberet under identiske forhold som kontrol. Reaktionsblandingerne blev centri-5 fugeret, og supernatanten blev anvendt direkte i K celleprøven som forklaret i det følgende. Normale cirkulerende blodleukocyter (PBL) blev inkuberet med 1) SpA absorberet med IgG-Sepharose 4B, 2) SpA absorberet med kontrol-Sepharose 4B, 3) plasminnedbrudt SpA absorberet med IgG Sepharose 10 4B, 4) plasminnedbrudt SpA absorberet med kontrol-Sepharose 4B. PBL inkuberet blot med medium tjente som kontrol. Resultaterne udtrykt som Kill% er vist i fig. 3. Det fremgår, at det ved proteolytisk spaltning af renset SpA er muligt at opnå peptider med ingen eller lav IgG binding, 15 men med K cellestimuleringsaktivitet.
Eksempel 3
Syntetisk fremstilling af peptider 20 pX.r2' a) Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe—
Tyr-Gln-Val-Leu-Asn-Met-Pro-Asn-Leu, pX-2, svarende til de 25 første 20 aminosyregrupper af den N-terminale del af område E, fremstilledes syntetisk som angivet ovenfor.
pX-2' havde K-cellevirkning, idet det forstærkede aktiviteten i de nedenstående assay-procedurer.
30 Assav-procedurer K-celleaktivitet er her defineret som forøgelsen i cellemedieret cytotoksicitet for normale periferale blod-lymfocyter (PBL) over for tumorafledte targetceller. PBL 35 isoleredes efter Boyum-metoden (Scand.J.Clin.Lab.Invest. 22 (1968), 77) ved centrifugering af hepariniseret blod fra sunde donorer på Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala,
DK 159206 B
13
Sverige). I et stort antal eksperimenter fjernedes vedhæftede celler ved at inkubere PBL i sterile glasflasker ved 37°C i 1 til 2 timer. Som targetceller anvendtes både den NK følsomme K562- (C.B. og B.B. Lozzio, J.Nat.Cancer 5 Inst. 50 (1973), 535 - 538) og de relativt NK-resistente Daudi- (E. Klein et al., Cancer Res. 28 (1968), 1300 - 1-310) og Raji- (R.J.V. Pulvertaft, J.Clin.Pathol. 18 (1965), 261 - 273) cellelinier for de ved proteolytisk nedbrydning af SpA opnåede peptider, mens kun Raji- og Daudi— 10 cellelinier anvendtes til de syntetiske peptider.
Cellelinierne holdtes i kultur i RPMI 1640 (Gihco, Paisley, Scotland, Katalog nr. 041-1875), hvortil der var sat føtalt kalveserum (10% vægt/vægt) (FCS) samt penicillin (100 lU/ml) og streptomycin (100 /xg/ml), ved 37°C og 15 carbondioxid i luft.
Targetcellerne mærkedes med 51Cr (New England Nuclear, Dreieich, Vesttyskland).
K-celle-assav 20 PBL inkuberedes med rensede peptider eller med SpA i 24 timer ved 37°C med 6% C02 i luft. Det anvendte medium var RPMI 1640, hvortil der var sat 10% FCS, penicillin (100 IU/ml) og streptomycin (100 μg/ml). Efter inkubering 25 justeredes celletætheden, og cellerne fordeltes i rund-bundede mikrotiterplader (NUNC, Roskilde, Danmark). 51Cr-mærkede K652 targetceller tilsattes til et ønsket forhold mellem effektor-(E) og target-(T)celler (E/T 10:1).
Efter yderligere 4 timers inkubering ved 37°C med 6% C02 i 30 luft anbragtes pladerne på en Titertek mikrotiterplade-ryster (Flow Laboratories Ltd., Ayrshire, Scotland). Mikrotiterpladerne centrifugeredes, og kendte rumfang af ovenstående væske sugedes bort og taltes (51Cr-prøve). Som maksimumsværdi (51Cr-max) anvendtes den ovenstående væske 35 fra K562 inkuberet med saponin. Den spontane frigørelse af 51Cr (51Cr-spont) måltes ved at inkubere 51Cr-K562 uden effek-torceller. Den specifikke drabsprocent (drabs-%) bereg-
DK 159206 B
14 nedes efter den følgende ligning (alle værdier henviser til 51Cr i direkte sammenlignelige ovenstående væsker):
Drabs-%: 100 (51Cr-sample - 51Cr-spont)/(51Cr-max - 51Cr-spont)
Den anvendte metode var i praksis den samme som 5 ovenfor for Daudi- og Raji-targets. Den eneste væsentlige forskel var, at der ikke gennemførtes nogen præinkubation inden tilsætning af de 51Cr-mærkede targetceller, og den fuldstændige inkubation af effektor- og targetceller udførtes på 24 timer. Drabsprocenten beregnedes som be-10 skrevet ovenfor.
De ovennævnte assays for peptidernes aktivitet anvendtes til den endelige karakterisering samt ved adskillige screeningsundersøgelser. Screeningsundersøgelseme udførtes direkte på fraktioner fra de forskellige trin ved 15 HPLC-rensningen, og i de fleste tilfælde lyophiliseredes fraktionerne først. To forskellige targetceller (K562 og Daudi) anvendtes ved screeningsundersøgelserne. Kun de fraktioner, der var positive i begge prøvesystemer, anvendtes i den yderligere rensning og karakterisering.
20
Korttidsprøve. NK-lianende aktivitet 4 x 105 monocytdepleterede enkeltkernede celler inkuberedes med 4 x 104 51Cr-mærkede Raji-celler. Totalt rumfang: 800 μΐ. Hertil sattes henholdsvis 1, 5, 6, 25 25 eller 100 μg peptid pr. ml. Kontrollerne var: ikke-stimu-lerede effektorceller + 51Cr-mærkede Raji- og effektorceller stimuleret med SpA (20 jLtg/ml) (in duplo). Efter 2 timers inkubation udtoges 3 X 200 μΐ til inkubering i rundbundede mikrotiterbakker. Inkubering ved 37“C, 7% C02, 18 timer.
30
Langtidsorøve. LAK-lianende aktivitet 6 x 106 monocytdepleterede monokernede celler inkuberedes i 6 ml RPMI 1640 + 5% FCS, penicillin (100 IU/ml) og streptomycin (100 Mg/ml) i vertikalt ophængte 35 Falcon-kolber (Falcon Plastics, Oxnard, CA., USA, Katalog nr. 3013). Som ved korttidsprøven tilsattes henholdsvis 1, 5, 6, 25 eller 100 jug peptid pr. ml. Kontroller var:
DK 159206 B
15 ikke-stimulerede effektorceller og effektorceller + SpA (20 jiig/ml) . Inkubering ved 37°c, 7% co2, 72 timer. Cellerne taltes, tætheden justeredes, og cellerne inkuberedes sammen med 51Cr-mærkede Raji- og Daudi-targetceller. E/T forhold 5 var: 10:1 og 20:1. Ved Daudi-prøven varede inkuberingen 16 timer, og ved Raji-prøven 18 timer (rundbundede mikrotiter-plader som ovenfor).
Resultaterne af de ovennævnte assays er vist i den følgende tabel 2 for SpA-peptiderne og i tabel 3 for de 10 syntetiske peptider.
Tabel 2
Naturlig dræber-lignende (NK)-aktivitet induceret ved 15 inkubering af periferale blodlymphocyter (PBL) med peptider isoleret ved proteolytisk nedbrydning af SpA eller intakt SpA.
drabs-%* 20 Raii Daudi
Kontrol 15 _46
Pool- (pX-11**) ca. 100 pmol/ml 27 75 20 pmol/ml 27 72 4 pmol/ml 24 68 25 Protein A 10 jitg/ml (250 pmol/ml) 46 77 5 jug/ml (125 pmol/ml) 46 71 0.5 ua/ml (12.5 pmol/ml) 31 66 * E/T forhold = effektor- targetcelle-forhold = 10:1 ** pX-1' koncentrationer er omtrentlige.
30
Tabel 3 5 16
DK 159206 B
Virkningen af det syntetiske peptid, pX-2', på de NK- og LAK- lignende virkninger af PBL.
Stimuleringsindex
Korttidsassav Lanatidsassav (NK-lianende aktivitet! (LAK-1ianende aktivitets Targets Raii Raii Daudi 10 Ε/Τ» forhold 10:1 10:1 20:1 10:1 20:1 100 jug/ml 0,79 n.d.** n.d. n.d. n.d.
25 " 1,15 1,41 1,48 1,15 1,07 6 " 1,23 1,02 1,12 1,05 1,03 15 1.5 » 0.97 0.94 0.97 1.00 0.99 SPA 20 uq/ml 1.08 1.51 1.17 1.19 1.07 * E/T forhold = effektor- targetcelle-forhold ** ikke udført 20 Af tabel 2 fremgår det, at en anslået mængde materiale på 100 pmol/ml (beregnet på basis af pX-1') viste den samme NK-cellestimulerende virkning som 125 til 250 pmol/ml intakt SpA med Daudi-celler som targets, mens dens aktivitet over for Raji-celler var noget mindre.
25 Af tabel 3 fremgår det, at pX-2' har en aktivitet ved alle undersøgelserne, der er lig med aktiviteten af intakt SpA.
Komplementaktiverina 30 For at undersøge indflydelsen af forbindelserne ifølge opfindelsen på komplementsystemet blev der udført en test, hvor frembringelsen af komplementspaltningsproduktet C5a blev anvendt som målestok for aktiveringen af komplement.
35 Testen blev udført ved inkubering af normal human serum med SpA (Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, Sweden) eller pX-21 i 60 minutter. Alikvoter blev udtaget efter 0, 30 og 60 minutter og C5a des-Arg blev bestemt med et kom-
DK 159206 B
17 mercielt RIA-kit (Upjohn Company, ).
Resultaterne er vist i fig. 4, og det ses tydeligt, at pX-2' helt mangler aktiverende effekt, medens SpA har en betydelig C5a skabende kapacitet, som afhængigt af 5 dosis øgede dannelsen af C5a-des-Arg (den stabile C5a meta-bolit).
Marsvinemodel
Der blev udført en yderligere test, hvor evnen hos 10 peptiderne ifølge opfindelsen og SpA til at fremkalde en anaphylactoidlignende reaktion ved intravenøs indgift i anæstetiserede og kunstigt respirerede marsvin blev undersøgt.
Marsvin af Dunkin-Hartley stammen (ca. 500 g) blev 15 anæstetiserede med natriumpentobarbital og blev forsynet med et kateter i jugularvenen til indførelse af medikament. Blodtrykket blev målt fra en karotid arterie. Dyrene blev respireret kunstigt med en Harvard respirator til små dyr med en cyklus på 38 åndedræt pr. minut og et volumen på 1 20 ml pr. 100 g dyr.
Protein A og pX-2' blev indgivet intravenøst, og man fandt, at protein A afhængigt af dosis (10 - 100 μg/ml i.v.) fremkaldte en anaphylactoidagtig reaktion angivet ved en initial bronchokonstriktion og hypertension (senere 25 hypotension) efter intravenøs indgift, medens pX-2' ikke fremkaldte en sådan reaktion.
Eksempel 4 30 Et præparat til parenteral indgift indeholdende 1 mg peptid med formlen I pr. ml kan fremstilles som følger: 1 g peptid med formlen I samt 99 g lactose opløses i 1 liter destilleret vand, og pH justeres til ca. 7,0. Opløsningen sterilfiltreres. Den sterile opløsning fyldes 35 på 10 ml glas på en sådan måde, at hvert glas indeholder 1,0 ml opløsning. Opløsningerne lyophiliseres, og glassene lukkes under aseptiske betingelser.
DK 159206 B
is
Præparatet i hvert enkelt glas skal opløses i 1,0 ml steril, isotonisk saltopløsning inden indgift.
Eksempel 5 5
Rectale stikpiller fremstilles ved at blande 1 mg peptid med formlen I med 4 g kakaosmør.
Claims (4)
1. K-cellestimulerende peptider, kendetegnet ved, at 5 de har den almene formel I Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gln-Val-Leu-Asn-Met-Pro-Asn-R (I) 10 hvori R er Leu, Leu-Asn, Leu-Asn-Ala, Leu-Asn-Ala-Asp, Leu-Asn-Ala-Asp-Gln eller Leu-Asn-Ala-Asp-Gln-Arg, og fysiologisk forenelige salte deraf.
2. Peptider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 deres aminosyresekvenser er identiske med en kontinuerlig del af E området i protein A fra Staphylococcus aureus og indeholder aminosyresekvensen His-Asp-Glu-Ala.
3. Peptider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de 20 har aminosyresekvenser svarende til et fragment af E området i SpA, og at de endvidere i det væsentlige mangler immunoglobulinbindingsaktivitet, og fysiologisk acceptable salte deraf. 25
4. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder i det mindste ét peptid eller salt deraf ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3 i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer eller excipiens.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK547486A DK159206C (da) | 1985-11-15 | 1986-11-14 | K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK528285 | 1985-11-15 | ||
| DK528285A DK528285D0 (da) | 1985-11-15 | 1985-11-15 | Peptider samt praeparater indeholdende disse |
| DK547486 | 1986-11-14 | ||
| DK547486A DK159206C (da) | 1985-11-15 | 1986-11-14 | K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK547486D0 DK547486D0 (da) | 1986-11-14 |
| DK547486A DK547486A (da) | 1987-06-17 |
| DK159206B true DK159206B (da) | 1990-09-17 |
| DK159206C DK159206C (da) | 1991-02-11 |
Family
ID=26067804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK547486A DK159206C (da) | 1985-11-15 | 1986-11-14 | K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK159206C (da) |
-
1986
- 1986-11-14 DK DK547486A patent/DK159206C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK547486A (da) | 1987-06-17 |
| DK547486D0 (da) | 1986-11-14 |
| DK159206C (da) | 1991-02-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6126939A (en) | Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof | |
| EP0413908B1 (en) | Soluble extracellular fragment of the human IFN-beta 2/IL-6 receptor, its preparation and pharmaceutical compositions containing it | |
| DE69029579T2 (de) | Inhibitoren der plättchen-aggregation | |
| US5461034A (en) | Osteogenic growth polypeptides identified from regenerating bone marrow | |
| EP1560590B1 (en) | Synthetic complementary peptides and ophthalmologic uses thereof | |
| US5939529A (en) | Methods and kits for stimulating production of megakaryocytes and thrombocytes | |
| IE61569B1 (en) | Novel polypeptides with a blood coagulation-inhibiting action, proceses for their preparation and isolation, their use and agents containing them | |
| AU724940B2 (en) | Protein which induces interferon-gamma production by immunocompetent cell | |
| KR101088740B1 (ko) | 샤페로닌 10을 이용한 면역억제 방법 | |
| NO893452L (no) | Rekombinant naturlig dreper-celleaktivator. | |
| US4816441A (en) | Peptides and compositions | |
| EP0687270B1 (en) | Osteogenic growth oligopeptides and pharmaceutical compositions containing them | |
| JPWO1998029446A1 (ja) | サソリ由来神経ペプチド | |
| US7115562B2 (en) | Peptides and their use to ameliorate cell death | |
| EP0384731B1 (en) | Osteogenic growth polypeptides identified from regenerating bone marrow | |
| WO1995003067A1 (en) | Pharmaceutical with immunomodulating activity | |
| WO2024235986A1 (en) | Peptides for use in the treatment of sarcoma | |
| JPH0570364A (ja) | 骨への破骨細胞付着を阻害する組成物及び方法 | |
| NZ248724A (en) | Modified platelet factor-4, its preparation and pharmaceutical formulations thereof | |
| DK159206B (da) | K-cellestimulerende peptider og salte deraf samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse | |
| HU210694B (en) | Method for production of new cell growth regulatory factor | |
| EP1224217A2 (en) | Use of colostrinin, constituent peptides thereof, and analogs thereof for inducing cytokines | |
| US5917013A (en) | Peptides and their use to ameliorate cell death | |
| WO1993023428A1 (en) | Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis | |
| RU2076151C1 (ru) | Способ получения фактора некроза опухоли, человеческий фактор некроза опухоли |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |