DK159274B - Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger - Google Patents

Description

x DK 159274 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte human insulinanaloger, der har den samme eller en større negativ ladning ved neutralt pH end human insulin, og med hurtigt indsættende virkning ved subkutane injektioner og inji-5 cerbare insulinopløsninger med hurtigt indsættende virkning, der indeholder sådanne insulinanaloger.

Til behandling af diabetes mellitus er der foreslået og anvendt mange forskellige insulinpræparater. Nogle af disse præparater er hurtigtvirkende, og andre præparater 10 har mere eller mindre retarderet virkning.

Hurtigtvirkende insulinpræparater kan anvendes i akutte situationer, såsom insulinchock, under operation, under graviditet og ved alvorlige infektioner. Desuden kan hyppige daglige injektioner af hurtigtvirkende insulinpræparater 15 forbedre kontrollen hos diabetikere, som har vist sig at være vanskelige at kontrollere med længerevirkende insulin.

I de senere år har der været en stigende interesse for at tilnærme insulinbehandlingen til insulinudskillelsen fra betaceller i den sunde organisme, d.v.s. tilførsel af 20 insulin i forbindelse med måltider og opretholdelse af et basalt insulinniveau. Kliniske undersøgelser har vist, at diabetikere kan opnå tilnærmelsesvis normale insulin- og glu-cosekoncentrationer ved hjælp af en daglig injektion af insulin med retarderet virkning til at dække det basale behov 25 suppleret med injektioner med mindre mængder (bolus) af hurtigtvirkende insulin før hovedmåltiderne.

Hurtigtvirkende insuliner anvendes også i blanding med middel- og længerevirkende insuliner til behandling af diabetikere, der kræver en stærkere initial virkning foruden 30 den forsinkede virkning af middel- og længerevirkende insuliner.

Endelig anvendes hurtigtvirkende insulin i kontinuerte insulinindgiftsystemer.

Ved subkutan injektion af hurtigtvirkende insulin-35 opløsninger er der blevet observeret en initial forsinkelse i absorptionen (Binder, Diabetes Care ]_, nr. 2 (1984), 188- 199). En forsinkelse i absorptionen, som resulterer i en langsommere indsætning af virkningen, er imidlertid meget

2 DK 159274 B

uheldig, når der tilstræbes en stringent metabolisk kontrol. Blanding af hurtigtvirkende insulinopløsninger med længere-virkende insulinpræparater kan desuden resultere i formindsket absorptionshastighed af det hurtigtvirkende insulin.

5 Der er derfor et behov for hurtigtvirkende insulin opløsninger med en hurtigere indsættende virkning ved subkutan injektion og en forbedret blandbarhed med protraherede insulinpræparater.

En yderligere ulempe ved kendte hurtigtvirkende 10 insulinopløsninger er insulins tendens til at fibrillere og fælde ud fra insulinopløsninger, der anvendes til kontinuerlig insulinindgift, hvorved både mekaniske dele og infusionskateteret tilstoppes.

Der er endelig et behov for alternative insulinpræ-15 parater til behandling af patienter, der er blevet resistente overfor normal insulin.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte hurtigtvirkende insulinopløsninger med hurtigre indsættende virkning ved subkutan injektion 20 eller andre administrationsmåder, og som desuden kan have en eller flere af følgende forbedrede egenskaber: 1) forbedret blandbarhed med protraherede insu- 1inpræparater, 2) formindsket tendens til fibrillering ved an- 25 vendelse i bl.a. implanterbare indgiftssystemer, og 3) anvendelighed til behandling af resistente patienter (lav affinitet til på forhånd eksisterende antistoffer).

Formålene med den foreliggende opfindelse opnås med 30 injicerbare vandige opløsninger af de i det efterfølgende beskrevne hidtil ukendte human insulin analoger.

Der er i årenes løb blevet beskrevet et stort antal af insulinanaloger. Mårke et al. (Hoppe-Seyler's Z.Physiol. Chem., 360. (1979), 1619-1632) beskriver syntese af analoger 35 til human insulin, der adskiller sig fra human insulin ved, at en enkelt aminosyre i positionerne 2, 5, 6, 7, 8 og 11 i A-kæden og 5, 7, 13 og 16 i B-kæden er blevet udskiftet med

3 DK 159274 B

det formål at opnå ny indsigt i den interessante sammenhæng mellem struktur og aktivitet af insulin. Yderligere undersøgelser har til formål at modificere hovedreceptorbindingsare-alet i insulin (B(20)-B(26)) med det formål at undersøge ind-5 virkningen af sådanne mutationer på receptorbindingsaktiviteten. Sådanne kendte insulinanaloger vil imidlertid ikke have de ovenfor beskrevne forbedrede egenskaber.

Det er kendt, at sulfaterede insuliner har en væsentlig mindre tendens til fibrillering (Albisser et al., 10 Desired Characteristics of insulin to be used in infusion pumps. In: Gueriguian J.L. et al., eds. US Pharmacopeial Convention, Rockwille, Maryland, pp. 84-95) og udviser en lav antigenicitet. Sulfaterede insuliner er imidlertid en heterogen blanding af mindst ni forskellige insulinderivater, der 15 indeholder i middel 4,5 sulfatestergrupper pr. molekyle. Sulfaterede insuliner har desuden en formindsket insulinaktivitet, der andrager ca. 20% af aktiviteten af naturligt insulin. En yderligere ulempe ved sulfaterede insuliner i sammenligning med naturligt insulin er, at de indeholder aminosyre-20 rester, der er kemisk modificeret, d.v.s. aminosyrer, der ikke forekommer naturligt.

Det er derfor et yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe insulinanaloger, der er homogene, kun indeholder naturligt forekommende aminosyrer, 25 og fortrinsvis har en højere biologisk aktivitet end sulfaterede insuliner.

Med "insulinanaloger" som anvendt her menes en forbindelse med en molekylær struktur, der svarer til strukturen af human insulin omfattende disulfidbroerne mellem A(7)Cys og 30 B(7)Cys og mellem A(20)Cys og B(19)Cys og en intern disulfidbro mellem A(6)Cys og A(ll)Cys, og som har insulinaktivitet.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende erkendelse, at visse insulinanaloger, i hvilke mindst en af aminosyreresterne i human insulin er blevet sub-35 stitueret med en naturligt forekommende aminosyrerest, har den ønskede hurtigere virkning.

De hidtil ukendte, hurtigtvirkende human insulinanaloger ifølge opfindelsen fremkommer ved at erstatte en

4 DK 159274 B

eller flere af aminosyreresterne i human insulin med naturligt forekommende aminosyrerester, der giver anledning til mindre selvassociering til dimere, tetramere, hexamere eller polymere, og har samme ladning eller en større negativ lad-5 ning ved neutralt pH end ladningen af human insulin.

Til tilvejebringelse af en formindsket tendens til selvassociering til dimere, tetramere, hexamere eller polymere er visse rester i human insulin fortrinsvis erstattet med andre aminosyrerester, der er mere hydrophile end de na-10 turlige aminosyrerester på den pågældende position i moleky let. Ved visse positioner i insulinmolekylet vil substitutioner med en aminosyrerest med mere bulk også bevirke en formindsket tendens af insulinmolekylet til at associere til dimere, tetramere, hexamere eller polymere.

15 Insulinanalogerne ifølge opfindelsen er ejendomme lige ved, at de har den almene formel (I) A-kæde (e'OCM*XvaaGiuXG,nXc'«XCivLxAxAxIc»*Is*'Xx Xt,,agiXi,tXa,"at,,Ic,,X o 1 2 3 4 S β 7| * · 10 11 I! 11 14 15 16 17 18 19 201 21

S

V

(* γx X*,nXGinXx X*Xr^X^XJLXv.xJvXx Χ°ΙυΧx XL,iXx Xx Xx X,*Xx 1 2 3 4 $ 8 7 3 * 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2<j 21 22 23 24 25 28 27 28 29 30 2 0 B-kæde

s DK 159274 B

hvori X'erne er aminosyreresterne i human insulin eller ens eller forskellige aminosyrerestsubstitutioner valgt blandt naturligt forekommende aminosyrer, med den betingelse, at mindst et X og højst 4 af X'erne er forskellige fra amino-5 syreresten i human insulin på den tilsvarende position i insulinmolekylet, at mindst et X i B-kæden er forskellig fra aminosyreresten i human insulin på den tilsvarende position i human insulin molekylet og at når X i position B(5) er Ala, X i position B(9) er Leu, X i position B(10) er Asn eller Leu, 10 X i position B(12) er Asn, eller X i position B(26) er Ala, så er mindst en af de øvrige X'er forskellige fra aminosyreresten i human insulin på den tilsvarende position i insulinmolekylet, og med den yderligere betingelse, at op til 4 ami-nosyrerester kan være blevet fjernet fra den N-terminale ende 15 på B-kæden, og op til 5 aminosyrerester kan være fjernet ved den C-terminale ende af B-kæden.

Fortrinsvis er i det mindste hovedparten af amino-syrerestsubstitutionerne mere hydrofile end aminosyreresten på det tilsvarende sted i human insulinmolekylet, og mere 20 fortrinsvis er alle aminosyrerestsubstitutionerne mere hydrofile end de tilsvarende human insulinaminosyrerester.

Med hensyn til hydrofilicitet kan der henvises til C. Frommel, J.Theor.Biol. 111 (1984), 247-260, tabel 1.

Aminosyrerestsubstitutionerne vælges fortrinsvis 25 fra gruppen bestående af Asp, Glu, Ser, Thr, His og Ile og er mere foretrukket negativt ladede aminosyrer, d.v.s. Asp og/eller Glu.

De hidtil ukendte human insulinanaloger kan fortrinsvis indeholde Asp og/eller Glu i stedet for en eller 30 flere hydroxyaminosyrer i human insulin, eller i stedet for en eller flere Gin og Asn i human insulin.

De hidtil ukendte human insulinanaloger kan yderligere fortrinsvis indeholde Ser og/eller Thr eller Asp og/eller Glu i stedet for en eller flere af aminosyreresterne 35 i human insulin med en aliphatisk og/eller aromatisk sidekæde.

De hidtil ukendte human insulinanaloger kan også fortrinsvis indeholde His i stedet for en eller flere af ami-

6 DK 159274B

nosyreresterne i human insulin med en aliphatisk og/eller aromatisk sidekæde eller i stedet for en eller flere af hy-droxyaminosyrerne i human insulin.

Foretrukne substitutionssteder er ved positionerne 5 B9, BIO, B12, B26, B27 og B28, fortrinsvis B9, B12, B27 og B28, i hvilke positioner én substitution kan være tilstrækkelig til opnåelse af en reduceret tendens til selvassociering og en hurtigere virkning ved indgift.

Aminosyrerestsubstitutionen i position B9 kan væl-10 ges fra gruppen bestående af Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val,

His, Thr, Gin, Asn, Met, Tyr, Trp og Phe, og mere foretrukket fra gruppen bestående af Asp, Glu, Gin, Asn og His.

Aminosyrerestsubstitutionen i position B12 kan vælges fra gruppen bestående af Ile og Tyr. Aminosyrerestsubsti-15 tutionen i position BIO kan vælges fra gruppen bestående af Asp, Arg, Glu, Asn og Gin og i position B26, B27 og B28 er aminosyrerestsubstitutionerne fortrinsvis Asp eller Glu.

I de resterende positioner af insulinmolekylet menes mindst to substitutioner (fortrinsvis i kombination med 20 de ovenfor nævnte positioner) at være nødvendige for at opnå de forbedrede egenskaber. I disse positioner kan substitutioner foretages som følger:

7 DK 159274 B

Position Foretrukne aminosvrerestsubstitutioner_ A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp, Pro A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala, Pro A10 Leu, Pro, Val, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gin, Asn 5 A13 Pro, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gly, Gin,

Asn, Asp A21 Asp, Glu

Bl Glu, Asp, Thr, Ser B2 Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gin, Ser, 10 Asn B5 Glu, Asp, Thr, Ser, Gin, Asn B14 Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, Gly B16 Asp, Glu, Gin, Asn, Ser, Thr, His, Arg B17 Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Asp, His 15 BIS Ser, Thr, Asn, Gin, His B20 Gin, Ser, Asn, Asp, Glu, Arg

Yderligere foretrukne forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse er insulinanaloger, i hvilke substitutioner er ved de følgende positioner: B27, B12, B9, (B27+B9), 20 (B27+A21) , (B27+B12), (B12+A21), (B27+B17), (B27+A13), (B27+B16) , (B27+A10), (B27+B28), (B27+B26), (B27+B10), (B27 + B1) , (B27 + B2), (B27+B5), (B27+B14), (B27+B18), (B27+B20), (B12+B17), (B12+A10), (B12+A13), (B12+B16) , (B12 + B1) , (B12 + B2) , (B12+B5) , (B12+B10), (B12+B26), 25 (B12+B28), (B9+B17), (B9+A13), (B9+B16), (B9+A8), (B9+A9), (B9+A10), (B9+B1), (B9+B2), (B9+B5), (B9+B10), (B9+B12), (B9+B14), (B9+B28), (B9+B18), (B9+B20), (B9+B26), (B27+B9+A21) , (B9+B27+A8) , (B27+B12+A21), (B27+B12+B9) , (B9+B12+B27+B17) , (B9+B12+B27+A13) , (B9+B12+B27+B16) og 30 (B12+B16+B17+B27+A10+A13).

Foretrukne udførelsesformer for formel I er som følger: 8

DK 159274 B

A-kæde s 1 2 3 4 5 β 7| 8 B 10 11 12 13 14 15 18 17 18 19 20 | 21 ;; / @@@{q^©@@0©@0 j 2 3 4 6 8 7 8 B 10 11 12 13 14 16 18 17 18 1fl 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 B-kæde A-kæde r “s"i 1 2 3 4 6 8 7| 8 B 10 11 12 13 14 15 18 17 18 19 20| 21 li s / 1 2 3 4 6 8 7 8 B 10 11 12 13 14 16 16 17 18 18 20 21 22 23 24 25 28 27 28 29 30 B-kæde A-kæde

i s 1—8 I -COOH

^ly)^ii^(vaj)^i^^i^^y»)(cy*)^^^^^I^(cy»)^^^u)^r)(Qin)(Leu)(Qiu)^»^^i)(Cy»)^»n) 1 2 3 4 6 8 7j 8 B 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2θ| 21 I 8 NH2- ί ί 1 2 3 4 6 8 7 8 B 10 11 12 13 14 15 18 17 18 1fl 20 21 22 23 24 25 28 27 28 29 30 B-kæde

9 DK 159274B

i hvilke X'erne defineres som ovenfor.

Under henvisning til formel I er andre foretrukne insulinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse sådanne, i hvilke X i position B27 er Glu, X i position B12 er Ile eller 5 Tyr, X i position A21 er Asp og i position B27 er Glu, X i position B9 er Asp, X i position A21 og i position B9 er Asp og i position B27 er Glu, X i position A8 er His, i position B9 er Asp og i position B27 er Glu, X i position BIO er Asp, X i position B28 er Asp, eller X i position B9 er Asp og i 10 position B27 er Glu.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der injicerbare opløsninger med hurtigt indsættende insulinaktivitet. De injicerbare insulinopløsninger ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder 15 human insulinanaloger ifølge opfindelsen eller et farmaceutisk akceptabelt salt deraf i vandig opløsning, fortrinsvis ved neutral pH. Det vandige medium kan gøres isotonisk ved tilsætning af f.eks. natriumchlorid og glycerol. Også puffere, såsom acetat eller citrat og konserveringsmidler, såsom 20 m-cresol, fenol eller methyl 4-hydroxybenzoat kan tilsættes. Endvidere kan insulinopløsningerne indeholde zinkioner.

Human insulinanalogerne ifølge opfindelsen kan erstatte human eller svineinsulin i de hidtil kendte hurtigtvirkende insulinopløsninger.

25 Efter fremkomsten af rekombinant DNA-teknologien har mulighederne for protein-engineering vist sig at være enorme. Ved såkaldt "site specific mutageneseteknik" er det muligt at ændre et gen, der koder for et naturligt forekommende protein ved at substituere en eller flere af codonerne 30 i det naturlige gen med codoner for andre naturligt forekommende aminosyrer. Alternativt kan det modificerede gen fremstilles ved kemisk syntese af hele DNA-sekvensen på velkendt måde. Formålet med en sådan manipulation med et gen for et naturligt protein vil typisk være at ændre egenskaberne af 35 det naturlige protein på ønsket måde.

De hidtil ukendte insulinanaloger kan fremstilles ved at ændre proinsulingenet ved erstatning af codoner på det passende sted i det naturlige human proinsulingen med codo-

10 DK 159274 B

ner, der koder for de ønskede aminosyrerestsubstitutioner, eller ved at syntetisere hele DNA-sekvensen, der koder for den ønskede insulinanalog. Det nye modificerede eller syntetiske gen, der koder for den ønskede insulinanalog, indsættes 5 derpå i en egnet ekspressionsvektor, der derpå overføres til en passende værtsorganisme, f.eks. E. coli. Bacillus eller gær, der er i stand til at udtrykke det ønskede produkt. Det udtrykte produkt isoleres derpå fra cellerne eller fra kulturvæsken, afhængigt af, om det udtrykte produkt udskilles 10 fra cellerne eller ej.

De hidtil ukendte insulinanaloger kan også fremstilles ved kemisk syntese ifølge fremgangsmåder, der er analoge med den af Mårki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619-1632) beskrevne metode. De kan også 15 dannes ud fra individuelt in vitro fremstillede A- og B-kæder indeholdende de pågældende aminosyrerestsubstitutioner, hvorefter de modificerede A- og B-kæder forbindes ved etablering af disulfidbroer ifølge kendte metoder (f.eks. chance et al.,

In: Rick DH, Gross E (eds.) Peptides: Synthesis - Structure-20 Function. Proceedings of the Seventh American Peptid Symposium, Illinois, pp. 721-728).

De hidtil ukendte insulinanaloger fremstilles fortrinsvis ved omsætning af en biosyntetisk precursor med den almene formel II: 11

DK 159274 B

A-kæde , 2 i 4 g « tT 8 9 10 11 H 13 14 1* 18 17 1β 1» *°| 21 q®©©ø©^^ VTTTYTVTYVTV 13 14 1» 13 17 1. 1» *> 21 12 ” 24 25 ** 27 “ " Π B-kæde hvor Qn er en peptidkæde med n naturligt forekommende amino-syrerester, R er Lys eller Arg, n er et helt tal fra 0 til 33, m er 0 eller 1, og X'erne defineres som ovenfor, med den betingelse, at peptidkæden -Qn“R" ikke indeholder to nabo-5 stillede basiske aminosyrerester, med en L-threoninester i nærvær af trypsin eller et trypsinderivat efterfulgt af konvertering af den fremkomne threoninester af humaninsulinana-logen til humaninsulinanalogen ifølge kendte metoder. Denne såkaldte "transpeptideringsreaktion" er beskrevet i US pa-10 tentskrift nr. 4.343.898.

Ved transpeptideringsreaktionen fraskæres broen -(Qn-R-)xn“ mellem aminosyre 29 i B-kæden og aminosyre 1 i A-kæden og en threoninestergruppe kobles på den C-terminale ende af B29Lys.

15 Precursorerne med formel II kan fremstilles ifølge en fremgangsmåde, der er analog med den i EP patentansøgning nr. 0163529A beskrevne fremgangsmåde. Ved denne fremgangsmåde indsættes en DNA-sekvens, der koder for den pågældende precursor, i en egnet udtrykkelsesvektor, som, når den overføres 20 til gær, er i stand til at udtrykke og secernere den ønskede forbindelse med korrekt anbragte disulfidbroer. Det udtrykte produkt isoleres derpå fra dyrkningsmediet.

12 DK 159274 B

!

De foreliggende insulinanaloger kan også fremstilles ved omsætning af en biosyntetisk precursor med den generelle formel III: A-kæde

fGlyY l,*X,olXB,0iG,nXc»0(c*»X x Y * Y x YcytYs«fY x YT»,YGtnYl«iJGtuYAt,YTrrTcy«Y X J

1 2 2 4 S 6 7j 8 i IC II » 11 14 15 ti «7 18 18 20j 21 ^ 1 2 a 4 5 8 7 8 8 10 11 12 13 14 IS 18 17 18 18 20 21 22 23 24 2$ 26 27 28 29 30 m B-kæde hvor V og T er henholdsvis Lys eller Arg og X'erne defineres 5 som ovenfor, i vandig opløsning med trypsin og carboxypepti-dase B og udvinding af human insulinanalogen fra reaktionsopløsningen.

Precursorerne med den ovenfor anførte formel III I

kan fremstilles ifølge en fremgangsmåde, der er analog med 10 den i EP patentansøgning nr. 86302133.3 beskrevne fremgangs- j måde. Ifølge denne fremgangsmåde indsættes en DNA-sekvens, der koder for precursoren, i et egnet gærudtrykkelsesmedium, som, når det overføres til gær, er i stand til at udtrykke og secernere det udtrykte produkt med korrekt anbragte disulfid-15 broer i dyrkningsmediet.

Den foreliggende opfindelse tænkes at omfatte visse deriveringer eller yderligere substitutioner i insulinanalo-gerne forudsat disse deriveringer eller yderligere substitutioner ikke har nogen væsentlig indflydelse på det ovenfor 20 beskrevne formål med opfindelsen. Det er således muligt at derivere en eller flere af de funktionelle grupper i aminosy-reresterne. Eksempler på en sådan derivering er en i og for sig kendt omdannelse af syregrupperne i insulinmolekylet til

13 DK 159274 B

ester- eller amidgrupper, omdannelse af alkoholgrupper til alkoxygrupper eller omvendt, og selektiv deamidering. Eksempelvis kan A21Asn deamideres til A21Asp ved hydrolyse i surt medium, eller B3Asn kan deamideres til B3Asp i neutralt medi-5 um.

Endvidere er det muligt at modificere de foreliggende insulinanaloger enten ved tilsætning eller fjernelse af aminosyrerester ved de N- eller C-terminale ender. Insulin-analogerne ifølge opfindelsen kan mangle indtil fire aminosy-10 rerester ved den N-terminale ende på B-kæden og op til fem aminosyrerester ved den C-terminale ende på B-kæden uden væsentlig indflydelse på de almene egenskaber hos insulinanalo-gen. Eksempler på sådanne modificerede insulinanaloger er insulinanaloger, der mangler BIPhe eller B30Thr aminosyre-15 resten.

Der kan også indføres naturligt forekommende aminosyrerester ved en eller flere ender af polypeptidkæderne under forudsætning af, at dette ikke har nogen væsentlig indflydelse på det ovenfor beskrevne formål.

20 Sådanne deletioner eller additioner ved enderne af polypeptidkæden i de foreliggende insulinanaloger kan udføres in vitro på insulinanalogerne med aminosyresubstitutioner ifølge den foreliggende opfindelse; eller genet for de hidtil ukendte insulinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse 25 kan modificeres enten ved tilsætning eller fjernelse af kodonerne, der svarer til de ekstra aminosyrerester henholdsvis de manglende aminosyrerester ved enderne af polypeptidkæden.

De for aminosyrerne anvendte forkortelser er som anført i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrerne er i L 30 konfigurationen.

Som anvendt i det følgende betyder B(l-29) en forkortet B-kæde af human insulin fra BlPh til B29Lys og A(1-21) betyder A-kæden i human insulin.

De substitutioner, der foretages i human insulin-35 molekylet ifølge den foreliggende opfindelse, er angivet med et præfix henførende til human insulin. Som et eksempel herpå betyder B27Glu human insulin en human insulinanalog, hvor Glu er blevet substitueret for Thr i position 27 i B-kæden.

14 DK 159274 B

B27G1U, B9Asp human insulin betyder en human insulinanalog, hvor Glu er blevet substitueret for Thr i position 27 i B-kæden, og Asp er blevet substitueret for Ser i position 9 i B-kæden. B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin 5 betyder en precursor for insulinanalogen (se formel II), hvor !

Glu er blevet substitueret for Thr i position 27 i den for- i kortede B-kæde (se ovenfor), og hvor B(1-29)-kæden og A-kæden (A(l-21)) er forbundet med peptidsekvensen Ala-Ala-Lys. Med mindre andet anføres er det underforstået, at B(1-29)-kæden i 10 og A(l-21)-kæden er forbundet ved disulfidbroer mellem A(7)Cys og B(7)Cys henholdsvis mellem A(20)Cys og B(19)Cys som i human insulin, og at A-kæden indeholder den interne disulfidbro mellem A(6)Cys og A(ll)Cys.

Som det allerede er nævnt, er hensigten med den 15 foreliggende opfindelse at tilvejebringe hurtigtvirkende, injicerbare insulinopløsninger. Under bestræbelserne herpå blev det først og fremmest taget i betragtning, at der findes betydelige forskelle mellem insulin i et depot eller bolus og insulin i kredsløbet, herunder især en helt uundgåelig for-20 skel i insulinkoncentration. Specifikt er insulin i det cirkulerende blod særdeles fortyndet, nemlig 10-11 til 10”8 M, og er i monomer form med muligvis noget insulin i dimer form.

Det meget mere koncentrerede insulin lagret i betacellegranuler i pancreas og i den almindelige, administrerbare opløs-25 ning er stort set, om ikke hovedsageligt, i den ikke-aktive hexamere form for eskempel som den velkendte 2 zink hexamer.

Det er kendt, at human insulin i opløsning eksisterer i mange molekylære former, nemlig den monomere, den dimere, den tetramere og den hexamere (Blundell et al., Advances 30 in Protein Chemistry, Academic Press, New York og London, vol. 26, (1972), 279 - 330), hvor de oligomere former er favoriseret ved høje insulinkoncentrationer, og de monomere er den aktive insul inform. Den tetramere og hexamere er ikke aktive former, og selv den dimere kan være inaktiv. Den for 35 den foreliggende opfindelse tilgrundliggende idé går ud på, at det erkendte og accepterede forsinkede absorptionsfænomen (Binder, Diabetes Care 7, nr. 2 (1984) , 188 - 199) for en stor dels vedkommende skyldes den tid, der kræves til at in-

15 DK 159274 B

sulinet disassocieres fra den hexamere, tetramere og dimere form til den (aktive) monomere form.

Human insulinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse opnår deres hurtige virkning gennem en molekylær 5 struktur, der ikke umiddelbart er i stand til at danne dimere, tetramere, hexamere eller polymere, d.v.s. med en formindsket tendens til selvassociering til dimere, tetramere, hexamere eller polymere med eller uden tilstedeværelse af zinkioner.

10 Det har i lang tid været kendt fra de betydelige artsforskelle i aminosyresekvensen, som findes i insulin, at ikke alle de aminosyrerester, der findes i insulinmolekylet er væsentlige for insulinaktiviteten, og at nogle af de aminosyrer, der er uvæsentlige for insulinaktiviteten, er vig-15 tige for de fysiske egenskaber af insulinmolekylet. Det er kendt, at marsvineinsulin er ude af stand til at dimerisere. Sulfateret insulin og tetranitrotyrosininsulin dimeriserer ikke. Således kan mange af aminosyreresterne i human insulinmolekylet ændres uden en væsentlig formindskelse af insulin-20 aktiviteten. Aminosyresubstitutionerne i human insulinmolekylet ifølge den foreliggende opfindelse er rettet mod, at dannelse af dimere, tetramere, hexamere eller polymere undgås uden at ødelægge insulinaktiviteten.

Aminosyreresterne i positionerne i A-kæden og B-25 kæden i formel I, hvor substitutionerne kan foretages, er ikke væsentlige for insulinaktiviteten, men de er vigtige for evnen af human insulin til at aggregere i dimere, tetramere, hexamere eller polymere eller for opløselighed af human insulin. De foreliggende aminosyrerestsubstitutioner interfere-30 rer med de atom-til-atom kontakter mellem tilstødende insulinmolekyler, som letter aggregationen til dimere, tetramere, hexamere eller polymere.

Som det kunne forventes er ændringer i visse positioner i huamn insulinmolekylet mere effektive end andre.

35 Stort set vil en enkelt substitution foretaget i B-kæden være tilstrækkelig til at mindske tendensen til selv-associering, hvorimod mindst to ændringer af andre rester kan være nødvendige. Substitutionerne i A-kæden tjener hovedsageligt til at 16

DK 159274 B

forbedre opløseligheden af det dissocierede molekyle. Foretrukne positioner, i hvilke der foretages aminosyrerestsub-stitutioner er B9, B12, BIO, B26, B27 og B28 alene, i kombination med hinanden eller sammen med substitutioner andre 5 steder i insulinmolekylet som angivet i formel I.

Substitutionen af en eller flere negativt ladede aminosyrerester for en uladet eller positivt ladet aminosyre-rest gør ladningen af human insulinanalogen mere negativ ved neutralt pH og sænker det isolektriske punkt i forhold til 10 human insulin. Karakteristisk har human insulinanalogerne ifølge opfindelsen den samme eller en mere negativ ladning (ved neutralt pH) og et lavere isoelektrisk punkt end human insulin.

Som oftest vil fra 1 til 3 substitutioner opfylde 15 de umiddelbare mål for opfindelsen, nemlig at tilvejebringe et mere hurtigtvirkende insulin, og sådanne repræsenterer foretrukne udførelsesformer for opfindelsen. Ved at anvende 2-3 substitutioner kan der desuden opnås en forbedret blandbarhed med protraherede insulinpræparater. Imidlertid anses 20 det for at være en fordel, at de umiddelbare mål for opfindelsen kan nås, også med et større antal substitutioner end tre, eftersom ønskelige sekundære mål herved kan opnås.

Især kan et yderligere antal substitutioner, f.eks.

4 eller 5 substitutioner af aminosyrerester, resultere i en 25 human insulinanalog, som også har mindre tendens til fibril-lering eller interfacepolymerisering, hvilket især er ønskeligt, når insulinopløsningen er beregnet til kontinuert tilførsel. Human insulinanalogerne ifølge opfindelsen vil dog ikke indeholde mere end 4 substitutioner i insulinmolekylet.

30 Der foretrækkes 2-4 substitutioner.

Gener, der koder for precursorerne for de foreliggende insulinanaloger kan fremstilles ved modificering af gener, der koder for de ovennævnte insulinprecursorer med formlen (II) eller (III), i hvilke alle X'er er aminosyreres-35 terne i human insulin, ved site specific mutagenese for at indføre eller substituere med codoner, der koder for den ønskede mutation. DNA-sekvenser, der koder for precursoren for insulinanalogen kan også fremstilles ved enzymatisk syntese

„ DK 159274 B

fra oligonucleotider svarende til hele insulinanalog-precursorgenet eller dele deraf.

DNA-sekvenser, der indeholder et gen med den ønskede mutation af insulingenet kombineres derpå med fragmenter, 5 der koder for TPI-promoteren (TPIp) (T. Alber and G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J.Mol.Applied Genet. 1 (1982) 419-434), MFal leader-sekvensen (J. Kurjan and I.

Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFal): A 10 Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-943) og transskriptions-terminatorsekvensen fra TPI fra S. cerevisiae (TPIrji). Disse fragmenter tilvejebringer sekvenser, der sikrer en høj transskriptionsgrad af genet for precursoren og tilvejebringer 15 også en præsekvens, der kan bevirke lokaliseringen af precursoren i sekretionsvejen og dens senere udskillelse i vækstmediet. Ekspressionsenhederne forsynes desuden med gær 2μ replikationsinitieringssitet og en selekterbar markør, LEU 2.

Ved in vivo modning af α-faktoren i gær, fjernes de 20 sidste (C-terminale) seks aminosyrer af MFal leaderpeptidet (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) fra α-faktor precursoren ved sekvensvis virkning af en endopeptidase, der genkender Lys-Arg-sekvensen, og en arainodipeptidase, der fjerner Glu-Ala-amino-syreresterne (Julius, D. et al. Cell 32 (1983), 839-852). For 25 at eliminere behovet for gæraminodipeptidasen blev den sekvens, der koder for den C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala i MFal-leaderen, fjernet fra MFal-leaderen ved in vitro mutagenese.

I den efterfølgende tekst betyder "MFal leaderen" hele leadersekvensen, mens MFal-leader (minus Glu-Ala-Glu-Ala) 30 betyder en leadersekvens, hvori den C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala sekvens er blevet fjernet.

Eksempel 1

Fremstilling af B27Glu human insulin B27Glu human insulin blev fremstillet ved transpep-35 tidering af B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin 18

DK 159274 B

med Thr-OBu*· og acidolyse af den opnåede theroninester med trifloureddikesyre. Fremstilling bestod af følgende trin: I. Konstruktion af et aen. der koder for B27Glu, (1-29)-Ala-Ala-Lvs-A(1-21) insulin 5 Et gærkodonoptimeret strukturelt gen for B(l-29)-

Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin blev konstrueret som følger:

De følgende 10 oligonucleotider blev syntetiseret på en automatisk DNA-synthesizer under anvendelse af phos-10 phoramiditkemi på en glasporesupport (S.L. Beaucage og M.H. Caruthers (1981) Tetrahydron Letters 22., 1859-1869) :

I: AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC

35- mer

II: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA

15 36-mer

III: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT

43-mer

IV: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC

42-mer

20 V: TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC

32- mer

VI: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTAGGAGT

34-mer

VII: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT

25 37-mer

VIII: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC

37-mer

IX: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT

36- mer

30 X: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG

33- mer 5 duplekser A-E blev dannet fra de ovennævnte 10 oligonucleotider som vist på fig. 1.

20 pmol af hver af duplekserne A-E blev dannet fra 35 de tilsvarende par af 5'-phosphorylerede oligonucleotider I-X

19 DK 159274 B

ved opvarmning i 5 minutter ved 90“C efterfulgt af afkøling til stuetemperatur i løbet af 75 minutter. 33-meren (X) i dupleks E blev ikke 5'-phosphoryleret for at undgå dimerise-ring omkring de selvkomplementære Xbal-ender under ligerin-5 gen. De fem duplekser blev blandet og behandlet med T4 ligase. Det syntetiske gen blev isoleret som et 182/183 bp bånd efter elektroforese af ligeringsblandingen på en 2% agarose gel.

Det opnåede syntetiske gen er vist i fig. 1.

10 Det syntetiske gen blev ligeret til et 4 kb Kpnl-

EcoRl-fragment og et 8 kb Xabl-Kpnl-fragment fra pMT644 og en 0,3 kb EcoRl-Hgal-fragment fra pKFN9 til opnåelse af følgende struktur TPIp-MFal-leader-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT.

Plasmid pMT644 indeholder DNA-sekvensen TPIp-MFal-15 leader-B(l-29)-A(l-21)-TPIT, og dets konstruktion er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1293/85. Konstruktionen af plasmid pKFN9 er beskrevet i det følgende.

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli stammer (r“, m+) (MT172). 30 ampicil-20 linresistente kolonier blev overført til plader indeholdende minimalmedium M9 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 68) resulterende i 8 Leu+ kolonier. Maxam-Gilbert sekventering af et 32P-Xbal-EcoRl fragment viste, at tre plasmider indeholdt et gen med den 25 ønskede sekvens. Et plasmid pKFN27 blev udvalgt til yderligere anvendelse.

Konstruktionen af pKFN27 er illustreret i fig. 2.

Konstruktion af plasmid pKFN9

Formålet med konstruktionen af plasmid pKFN9 var at 30 opnå et plasmid, der indeholder et Hgal-site umiddelbart efter MFal-leadersekvensen. Plasmid pMT544 (hvis konstruktion er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 278/85) blev skåret med Xbal, og ca. 250 baser blev fjernet fra 3'-enden ved ExoIII nucleasebehandling. En syntetisk 32-mer primer 35 GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC indeholdende en Hgal-sekvens blev annealeret til det delvis enkeltstrengede DNA. Et dob-

20 DK 159274 B

beltstrenget cirkulært DNA blev fremstillet ved udfyldning med Klenow polymerase og ligering med T4 ligase. Efter transformering af E. coli (r“, m+) (MT172) blev der identificeret kolonier, der indeholdt muteret plasmid, ved kolonihybridise-5 ring med en 51-32P-mærket 32-mer primer. Tilstedeværelsen af et nyt Hgal site blev bekræftet ved restriktionsenzymskæring (EcoRl+Hgal, Hind3+Hgal). Efter retransformation blev der udvalgt en mutant pKFN9 til yderligere anvendelse. Konstruktionen af pKFN9 er illustreret i fig. 3.

10 Plasmid pKNF27 blev lineariseret i det unikke Xbal site lige efter det syntetiske insulinprecursorgen. For ikke at ødelægge Xabl sitet ved det nedenfor beskrevne udfyldningstrin, blev en 19-mer Hind3-Xbal dobbeltstrenget linker

Xbal Hind3

15 CTAGAAGAGCCCAAGACTA

TTCTCGGGTTCTGATTCGA

ligeret til begge ender af det lineariserede plasmid. Linke-ren blev 5'-phosphoryleret ved den enkeltstrengede Xbal-ende, men blev efterladt uphosphoryleret ved Hind3 enden, hvorved 20 polymeriseringen af linkeren under ligeringstrinnet og ringslutningen af DNA blev undgået, jfr. fig. 4.

5'mononucleotiderne blev fjernet fra 3'-enderne af det opnåede lineære, dobbeltstrengede DNA ved ExoIII-nucleasebehandling. ExoIII-nucleasebehandlingen blev udført 25 ved 23"C under betingelser, hvor ca. 250 nucleotider blev fjernet fra begge 3'-enderne af DNA-strengen (L. Guo og R. Wu (1983), Methods in Enzymology 100, 60-96).

En 5'-phosphoryleret 25-mer mutageneseprimer d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) blev annealeret til mutations-30 stedet. Efter udfyldning med Klenowpolymerase i nærværelse af T4 ligase blev dobbeltstrenget DNA fordøjet med Xbal. Hetero-dupleks cirkulært DNA med mutationen i den ene streng blev derpå dannet med T4 ligase.

Ligeringsblandingen blev transformeret i E. coli 35 (r“, m+) (MT172), idet der blev selekteret for ampicillin- resistens.

21

DK 159274 B

Mutanter blev identificeret ved kolonihybridisering med den 51-32P-mærkede 25-mer mutageneseprimer. Efter re-transformering blev plasmid pKFN37 fra en af de fremkomne kolonier påvist at indeholde den ønskede mutation ved DNA-5 sekventering af et 0,5 kb Xbal-EcoRl-fregment (A. Maxam og W. Gilbert (1980) Methods in Enzymology 65, 499-560).

II. Transformering

S. cerevisiae stamme MT663 (E2-7B X E11-3C

a/a,Dtpi/otpi, pet 4-3/pep 4-3) blev dyrket på YPGaL (1% 10 Bacto gærekstrakt, 2% Bactopepton, 2% galactose, 1% lactat) til ODgoonm på 0,6.

100 ml kulturvæske blev høstet ved centrifugering, vasket med 10 ml vand, recentrifugeret og resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0 og 6,7 mg/ml di-15 thiotreitol. Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 15 minutter og centrifugeret, og cellerne blev resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat pH = 5,8 og 2 mg Novozym, 234. Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 30 minutter, cellerne blev samlet ved centrifugering, vasket 20 i 10 ml 1,2 M sorbitol og i 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminometan) pH = 7,5) og resuspenderet i 2 ml CAS. Til transformering blev 0,1 ml CAS-resuspenderede celler blandet med ca. 1 μG plasmid pKFN37 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. 1 ml 25 20% polyethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris pH = 7,5 blev tilsat, og blandingen blev henstillet i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev centrifugeret, og pillerne blev resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPGaL, 6,7 mM CaCl2, 14 μg/ml leucin) og inkuberet 30 ved 30°C i 2 timer. Suspensionen blev derpå centrifugeret, og pillerne blev resuspenderet i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. Der blev tilsat 6 ml topagar (SC mediet ifølge Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) med leucin udeladt og indeholdende 1,2 M sorbitol plus 35 2,5% agar) ved 52“C, og suspensionen blev hældt ud på plader indeholdende det samme agarstørknede, sorbitolholdige medium.

22

DK 159274 B

Transformantkolonier blev taget op efter 3 dage ved 30°C, reisoleret og anvendt til at starte flydende kulturer. En sådan transformant KFN40 (=MT663/pKFN37) blev valgt til yderligere karakterisering.

5 III. Udtrykke Ise af B27Glu. Bf 1-29) -Ala-Ala-Lvs-AΓ1-2H insulinorecursor Gærstamme KFN40 blev dyrket på YPD medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, (begge fra Difco Laboratories), og 2% glucose). En 10 ml kultur af stammen blev rystet ved 30°C til 10 et ODgoo 26. Efter centrifugering blev supernatanten analyseret ved reverse phase HPLC, og man fandt 13,5 mg/1 precursor.

Analogen i supernatanten blev koncentreret på en kationbyttersøjle ved lavt pH efterfulgt af desorption med en 15 passende pufferopløsning. Krystallisering blev udført med en alkoholisk citratpuffer.

IV. Transpeptiderinq 0,2 mol (47,1 g) Thr-OBu*-, HOAC blev opløst i DMF resulterende i 100 ml opløsning, 50 ml 76,5% v/v DMF i vand 20 blev tilsat og 10 g rå B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin blev opløst i blandingen, som blev thermostate-ret ved 12“C. Derpå blev tilsat 1 g trypsin i 25 ml 0,05 M calciumacetat, og efter 24 timer ved 12“C blev blandingen sat til 2 liter acetone og de udfældede peptider blev isoleret 25 ved centrifugering og tørret in vacuo. B27Glu, B30Thr-0But human insulin blev renset på en HPLC søjle med silica-C18 som søjlemateriale.

V. Konvertering til B27 human insulin B27Glu, B3OThr-OBu*· human insulin blev opløst i 100 30 ml trifloureddikesyre. Efter 2 timer ved stuetemperatur blev opløsningen lyophiliseret. Det lyophiliserede pulver blev opløst i 400 ml 47,5 mM natriumcitrat ved pH 7. Peptiderne blev udfældet ved pH 5,5 efter tilsætning af 2,4 ml 1 M ZnCl2/ isoleret ved centrifugering og tørret i vacuum. Pro-

23 DK 159274 B

duktet blev renset ved anionbytterkromatografi og udsaltet ved gelfiltrering. Udbytte: 1,7 g B27Glu human insulin.

Eksempel 2

Fremstilling af B9Asp human insulin 5 B9Asp human insulin blev fremstillet ved transpep- tidering af B9Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin med Thr-OBut og acidolyse af den opnåede threoninester med trifluoreddikesyre.

I. Fremstilling af et gen, der koder for B9Asp, B(l-29)-Ala-10 Ala-Lvs-A(l-21) huamn insulin

Dette gen blev fremstillet på samme måde som beskrevet for genet, der koder for B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin ved site specific mutagenese af pKFN27 styret af en 23-mer mutageneseprimer 15 d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG). Plasmid pKFN38 påvistes at indeholde den ønskede mutation.

II. Transformering

Plasmid pKFN38 blev transformeret i S. cerevisiae stamme MT663 ved den samme fremgangsmåde som i eksempel 1, 20 II, og en transformant KFN41 blev isoleret.

III. Udtrykkelse af B9Asp, Bf1-29)-Ala-Ala-Lvs-A(1-21) human insulin Gærstamme KFN41 blev dyrket på YPD medium som beskrevet i eksempel 1, III. 2,5 mg/1 insulinanalogprecursor 25 blev fundet i supernatanten.

IV. Transpeptidering 7,4 g rå B9Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin blev transpeptideret som beskrevet i eksempel 1, IV resulterende i B9Asp, B3OThr-OBut human insulin.

24 DK 159274 B

V. Konvertering B9Asp, B3 OThr-OBu"*- human insulin blev konverteret til B9Asp human insulin som beskrevet i eksempel 1, V. Udbytte: 0,83 g B9Asp human insulin.

5 Eksempel 3

Fremstilling af B9Asp, B27Glu human insulin B9Asp, B27Glu human insulin blev fremstillet ved transpeptidering af B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l- 21) human insulin med Thr-OBu*- og acidolyse af den opnåede 10 threoninester med trifloureddikesyre.

I. Konstruktion af et gen, der koder for B9Asp. B27Glu. Bfl-29)-Ala-Ala-Lvs-Af1-21) human insulin

Et 367 bp EcoRl-Hind3 fragment fra pKFN38 (se eksempel 2) og et 140 bp Hind3-Xbal-fragment fra pKFN37 (se 15 eksempel 1) blev ligeret til det store Xbal-EcoRl fragment fra plasmid pUC13 (dette plasmid er konstrueret som beskrevet for pUC8 og pUC9 af Vieira et al. (1982), Gene 19, 259-268). Ligeringsblandingen blev transformeret i E. coli (MT 172), idet der blev selekteret for ampicillinresistens. Plasmider 20 blev fremstillet fra et antal transformanter og analyseret ved fordøjelse med Pstl og med Hind3. 0,5 kb Xbal-EcoRl-frag-mentet fra et plasmid, der viste det korrekte restriktionsenzymmønster, blev ligeret til et 7,8 kb Xbal-Kpnl-fragment og et 4,3 kb Kpnl-EcoRl-fragment, begge fra pMT644 (beskrevet 25 i dansk patentansøgning nr. 1293/84). Ligeringsblandingen blev transformeret i E. coli (MT172), idet der blev selekteret for ampicillinresistens. Plasmid pKFN43 fra en af de fremkomne kolonier viste sig at indeholde genet for den ønskede insulinderivatprecursor ved DNA sekventering af et 0,5 30 kb Xbal-EcoRl-fragment. Konstruktionen af pKFN43 er illustreret i fig. 5.

25

DK 159274 B

II. Transformering

Plasmid pKFN40 blev transformeret i S. crevisiae stamme MT663 ifølge samme fremgangsmåde som i eksempel 1, II og en transformant KFN44 blev isoleret.

5 III. Udtrvkkelse af B9Asp. B27Glu. B(l-29)-Ala-Ala-Lvs(A(l-21) human insulin Gærstamme KFN44 blev dyrket på YPD medium som beskrevet i eksempel 1, III. Der blev fundet 7,3 mg/1 insulin-analogprecursor i supernatanten.

10 IV. Transpeptidering 12,7 g rå B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin blev transpeptideret som beskrevet i eksempel 1, IV og gav B9Asp, B27Glu, B30Thr-OBut human insulin.

V. Konvertering 15 B9Asp, B27Glu, B30Thr-OBu*- human insulin blev kon verteret til B9Asp, B27Glu, B30Thr human insulin og renset som beskrevet i eksempel 1, V. Udbytte: 1,0 g B9Asp, B27Glu human insulin.

Eksempel 4 20 Fremstilling af A8His. B9Asp, B27Glu human insulin A8His, B9Asp, B27Glu human insulin blev fremstillet ved transpeptidering af A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin med Thr-OBu^ og acidolyse af den fremkomne threoninester med trifloureddikesyre som be-25 skrevet i eksempel l.

I. Fremstilling af et gen, der koder for A8His, B9Asp, B27Glu. B(1-2 9)-Ala—Ala-Lvs-A(1-21) human insulin

Dette gen blev fremstillet ved oligonucleotidstyret mutagenese under anvendelse af en brudt duplex procedure (Y.

30 Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye og M. Inouye (1984), Biotechnology 2, 636 - 639). Det pUC13 deriverede plasmid, 26

DK 159274 B

der koder for MFal leadersekvensen og B9Asp, B27Glu human insulin precursor (fig. 5) blev skåret med Hpal og Xbal. Det store fragment blev blandet med det Ndel lineariserede plasmid. Efter varmedenaturering og afkøling indeholder blandin-5 gen brudte duplexer med et enkeltstrenget "vindue" i området svarende til insulinprecursorgenet (Hpal-Xbal). Den 37-mere mutagene umage primer d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT) blev hybridiseret til den brudte duplex efterfulgt af udfyldning med Klenow 10 polymerase og ligering. Blandingen blev anvendt til transformering af E. coli (MT172) under selektering for ampicillin-resistens. Mutanter blev identificeret ved kolonihybridise-ring med en 18-mer 513^P-mærket probe d(AATGCTGTCACTCCATCT). Efter retransformering viste det sig, at et plasmid fra en af 15 de fremkomne kolonier indeholdt den ønskede mutation ved DNA sekventering af et 0,5 kb Xbal-EcoRl fragment. Dette plasmid blev anvendt til konstruktion af gærplasmidet pKFN102 som beskrevet i eksempel 3 for konstruktionen af pKFN43.

II. Transformering 20 Plasmid pKFN102 blev transformeret i S. cerevisiae stamme MT663 ved samme fremgangsmåde som i eksempel 1, II og en transformant KFN109 blev isoleret.

III. Udtrvkkelse af A8His. B9Asp. B27Glu. Bfl-29)-Ala-Ala-Lvs-Af1-21^ human insulin 25 Gærstamme KFN109 blev dyrket på YPD medium som be skrevet i eksempel 1, III. Der fandtes 21,5 mg/1 insulinanalog precursor i supernatanten.

IV-V. Transpeotiderina og konvertering 22,0 g rå A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-30 Lys-A(1-21) human insulin blev transpeptideret, konverteret og renset som beskrevet i eksempel l, IV-V. Udbytte: 4,0 g A8HisB9AspB27Glu human insulin.

27 DK 159274 B

Eksempel 5

Fremstilling af B12Ile human insulin B12Ile human insulin blev fremstillet ved transpep-tidering af 812116, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin 5 med Thr-OBu*· og acidolyse af den fremkomne threoninester med trifloureddikesyre som beskrevet i eksempel 1.

I. Konstruktion af et gen, der koder for B12Ile. B(l-29^-Ala-Ala-Lvs-A(l-21) human insulin

Et 0,5 kb EcoRl-Xbal fragment af pMT598 (konstruk-10 tionen af et plasmid pMT598 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 0163529A), der koder for MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) blev indsat i M13 mplO RF fag skåret med Xbal-EcoRl, og det tilsvarende enkeltstrengede DNA blev renset fra den M13 mp 10 rekombinante fag. Det en-15 keltstrengede templat DNA blev hybridiseret til en 27-mer mutageneseprimer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) og en M13 universel sekventeringsprimer d(TCCCAGTCACGACGT). Primerne blev forlænget med dNTP og Klenow polymerase og ligeret med T4 DNA ligase. Mutageneseprimeren KFN92 blev valgt med 20 henblik på ødelæggelse af et BstNl site (unikt i Xbal-EcoRl fragmentet). For at selektere mod umuteret EcoRl-Xbal fragment blev blandingen derfor skåret med BstNl og derpå med EcoRl og Xbal og ligret til EcoRl- og Xbal-skåret pUC13 vektor. Fra en af de fremkomne transformanter blev valgt et 25 plasmid pMT760, som manglede BstNl sitet i den sekvens, der koder for insulin. Den ønskede muterede sekvens blev verificeret ved Maxam-Gilbert DNA sekventering. Plasmid pMT760 indeholder en 0,5 kb EcoRl-Xbal sekvens svarende til det samme fragment fra pMT598 (se ovenfor) bortset fra en mutation ved 30 B12 (Val -*· Ile). Denne muterede sekvens blev derpå flyttet til et gærudtrykkelsesplasmid ved ligering af 0,5 kb EcoRl-Xabl fragmentet fra pMT760 til et 7,8 kb Xbal-Kpnl og et 4,3 Kpnl-EcoRl fragment fra pMT644 resulterende i pMTA.

28

DK 159274 B

II-V. Transformering, udtrvkkelse. transpeptidering. konvertering

Plasmid pMTA blev transformeret i gærstamme MT663 som beskrevet i eksempel 1, II og den transformerede stamme 5 MTA blev dyrket som beskrevet i eksempel l, III. Der blev fundet 10,4 mg/1 insulinanalogprecursor i supernatanten. 10 g af den rå analogprecursor blev transpeptideret, konverteret og renset som beskrevet i eksempel 1, IV-V. Udbytte: 1,3 g B12Ile human insulin.

10 Eksempel 6

Fremstilling af B12Tvr human insulin B12Tyr, human insulin kan fremstilles ved transpep-tidering af B12Tyr, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) human insulin med Thr-OBu*· og acidolyse af den fremkomne threoninester med 15 trifloureddikesyre som beskrevet i eksempel 1.

I. Konstruktion af et gen, der koder for B12Tvr. Bfl-29)-Ala-Ala-Lvs-Af1-211 human insulin

Genet blev fremstillet ved en fremgangsmåde analog med fremgangsmåden til fremstilling af genet, der koder for 20 B12Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin med undtagelse af, at primeren KFN93 d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC) blev anvendt i stedet for KFN92.

II-IV. Transformering, udtrvkkelse. transpeptidering. konvertering 25 Trin II-III blev udført som beskrevet i eksempel 1.

Der blev fundet 1,7 mg/1 insulinanalogprecursor i supernatanten. Den rå analogprecursor kan transpeptideres, konverteres og renses som beskrevet i eksempel 1, VI-V resulterende i B12Tyr human insulin.

30 Eksempel 7

Fremstilling af BlOAsp human insulin

BlOAsp human insulin blev fremstillet ved transpep-tidering af BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin

DK 159274B

med Thr OBu1- og acidolyse af den fremkomne threoninester med trifloureddikesyre som beskrevet i eksempel 1.

I. Konstruktion af et gen, der koder for BIOAsp. B(l-29)-Ala-Ala-Lvs-A(l-21) human insulin 5 Genet blev konstrueret ifølge en fremgangsmåde, der er analog med fremgangsmåden til fremstilling af det gen, der koder for B12Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin med undtagelse af, at primeren KFN94 (d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) blev anvendt i stedet for 10 KFN92.

II-IV. Transformering, udtrykkelse. transpeptidering. konvertering

Trin II-III blev udført som beskrevet i eksempel 1.

Der blev fundet 36 mg/1 insulinanalogprecursor i supernatan-15 ten. Den rå analogprecursor blev transpeptideret, konverteret og renset som beskrevet i eksempel 1, IV-V. Udbytte 7,6 g BIOAsp human insulin.

Eksempel 8

Fremstilling af B28Asp human insulin 20 B28Asp human insulin blev fremstillet ved transpep- tidering af B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) human insulin med Thr-OMe og hydrolyse af den fremkomne threoninester ved pH på ca. 8 til 12.

Konstruktion af et gen, der koder for B28Asp, B(l-29)-Ala-25 Ala-Lvs-Af1-21) human insulin

Et 0,5 kb EcoRl-Xbal fragment af pMT 462 (konstruktionen af plasmid pMT 462 er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1257/86), der koder for Mfal leaderen (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A, dvs. det humane proinsulingen, anbragt 30 efter den modificreede MFal leader, blev indsat i M13 mplO RF fag skåret med Xbal-EcoRl, og det tilsvarende enkeltstrengede DNA blev renset fra M13 mplO rekombinantfagen. Det enkeltstrengede templat DNA blev hybridiseret til en mutagen 41-mer primer NOR205 d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC) og 30

DK 159274 B

en M13 universel sekventeringsprimer d(TCCCAGTCACGACGT). Primerne blev forlænget med dNTP og Klenow polymserase og ligeret med T4 DNA ligase.

Efter phenolekstraktion, ethanoludfældning og re-5 suspension blev DNA skåret med restriktionsenzymerne Apal, Xbal og EcoRl. Efter yderligere en phenolekstraktion, ethanoludfældning og resuspension blev DNA ligeret til EcoRl-Xbal skåret pUC13. Ligationsblandingen blev transformeret i en E. coli (r”m+) stamme, og plasmider blev fremstillet fra 10 et antal transformanter. Plasmidpræparater blev skåret med EcoRl og Xbal, og de præparater, der viste bånd ved både 0,5 og 0,6 kb, blev retransformeret i E. coli. Fra retransforme-ringen blev valgt en transformant kun indeholdende pUC13 med et 0,5 indsat fragment.

15 Fra en af transformanterne blev der valgt et plas mid pMT881 med den ønskede mutation ved Β2δ (Pro - Asp). Den muterede sekvens blev verificeret ved Maxam-Gilbert DNA-se-kventering. Den muterede sekvens blev derpå flyttet til et gærudtrykkelsesplasmid ved ligering af et 0,5 kb EcoRl-Xbal 20 fragment fra ρΜΤδδΙ til en 7,δ kb Xbal-Kpnl og et 4,3 Kpnl-EcoRl fragment fra pMT644 resulterende i pMTAl.

II. Transformering

Plasmid pMTAl blev transformeret til S. cerevisiae stamme MT663 ved den samme procedure som i eksempel 1, II og 25 en transformant MTA1 blev isoleret.

III. Udtrykkelse af B23Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lvs-Af1-21) human insulin Gærstamme MTA1 blev dyrket på YPD medium som beskrevet i eksempel 1, III. Der blev fundet 7,2 mg/1 insulin-30 analogprecursor i supernatanten.

IV. Transoeotiderincr

Den rå B26Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) blev transpeptideret som beskrevet i eksempel I, IV ved at substi

31 DK 159274 B

tuere Thr-OB^ med Thr-OMe resulterende i B28 Asp, B30Thr-OMe human insulin.

V. Konvertering B28Asp, B30Thr-OMe human insulin blev dispergeret i 5 vand til 1% (w/v) og blev opløst ved tilsætning af IN natriumhydroxid til en pH-værdi på 10,0. pH-værdien blev holdt konstant ved 10,0 i 24 timer ved 25”C. Det dannede B28Asp human insulin blev udfældet ved tilsætning af natriumchlorid til ca. 8% (w/v), natriumacetattrihydrat til ca. 1,4% (w/v) 10 og zinkacetatdihydrat til ca. 0,01% (w/v) efterfulgt af tilsætning af IN saltsyre til pH 5,5. Bundfaldet blev isoleret ved centrifugering og renset ved anionbytterkromatografi og udsaltet ved gelfiltrering. Udbytte: 0,2 g B28Asp human insulin.

15 Eksempel 9

Fremstilling af A21Asp, B9Asp. B27Glu human insulin A2lAsp, B9Asp, B27Glu human insulin blev fremstillet fra B9Asp, B27Glu human insulin ved selektiv deamidering (hydrolyse af en 5% opløsning i 14 dage ved 37”C, pH 2,5).

20 Det deamiderede produkt blev isoleret ved anionbytterkromatografi.

Eksempel 10

Fremstilling af B27Glu. A21Asp human insulin B27Glu, A2lAsp human insulin blev fremstillet ved 25 transpeptidering af B27G1U, A21Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) med ThrOBu-*- og acidolyse af den fremkomne threoninester med trifloureddikesyre som beskrevet i eksempel 1.

B27GluA21AspB(1-21)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) blev fremstillet fra B27G1U,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (se eksempel 30 1) ved deamidering som beskrevet i eksempel 9.

Karakterisering af human insulinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse

Bestemmelse af molekylvægte (Gutfreund H. Biochemical Journal 42 (544), 1948).

„ DK 159274 B

32

Metode: Knauer Membran Osmometer

Type: 1.00

Membran. Schleicher and Schull Type: R52 5 Solvens: 0,05 M NaCl pH 7,5

Temp.: 21°C

Resultater: Alle typer insulin blev målt ved en koncentra tion på 4 mg/ml.

Tabel 1 10 Insulintvpe_Molekylvægt k Dalton

Human 2 Zn insulin 36 ± 2

Human Zn fri insulin 29 ± 1

Zn fri B27Glu human insulin 22 ± 1 15 - - B12Ile human insulin 17 ± 1 - - B27Glu, A21Asp human insulin 8 ± 1 - - B9Asp, B27Glu human insulin 6 ± 1 - - B9Asp human insulin 6 ± 1 - - B9Asp, B27Glu, A21Asp human insulin 6 ± 1 20 - - B9Asp, B27Glu, A8His human insulin 9 ± 3 - - BlOAsp human insulin 12+1 - - B28Asp human insulin 9 ± 2

Det fremgår af ovenstående tabel 1, at human insu-linanalogerne har en væsentlig reduceret molekylvægt sammen-25 lignet med human insulin, hvilket betyder, at selvassocieringen til dimere, tetramere og hexamere er mindre udtalt eller endog mangler i adskillige tilfælde.

Tabel 2

33 DK 159274B

Halveringstid og biologisk styrke

Human insulinanalog T 1/2* Biologisk styrke** (% af % af human insulin 5 human (95% conf.interval) _insulin_ B27Glu human insulin 78 101 (83-123) B9Asp, B27Glu human insulin 54 110 (90-139) B12Ile human insulin 78 91 (80-103) 10 B27Glu, A2lAsp human insulin 56 64 (58-71) B9Asp human insulin 52 80 (72-90) A21Asp, B9Asp, B27Glu human insulin 56 75 (66-85) A8His, B9Asp, B27Glu human insulin 68 116 (101-135)

BlOAsp human insulin 64 104 (92-18) 15 B28Asp human insulin 53 104 (95-114) * Tid til 50% forsvinden fra injektionsstedet (subkutant) hos grise. Fremgangsmåde ifølge Binder 1969 (Acta Pharmacol.Toxicol. (suppl. 2), 27:1-87).

** Museblodsglucoseassay ifølge europæisk farmacopi.

20 Det fremgår af ovenstående tabel 2, at tiden til 50% forsvinden af insulinanalogerne fra injektionsstedet er væsentligt reduceret i sammenligning med human insulin.

Den biologiske styrke af insulinanalogerne er sammenlignelig med human insulin eller kun let reduceret.

Claims (8)

34 DK 159274 B

1. Hurtigtvirkende human insulinanaloger, der har den samme eller en større negativ ladning ved neutralt pH end human insulin, kendetegnet ved, at de har formlen I A-kæde , 2 3 4 8 * 7 ·· 10 11 11 13 14 IS 1* 17 1* 1« lOJ 11 S / S (*Χ*)Θ©0©4θΘΘΘΘΘ , 2 3 4 8 · 7 ( S 10 11 11 13 14 18 1* 17 1* 1* 10 11 11 13 14 15 1* 17 1* 1* 30 B-kæde 5 hvori X'erne er aminosyreresterne i human insulin eller ens eller forskellige aminosyrerestsubstitutioner valgt blandt naturligt forekommende aminosyrer, med den betingelse, at mindst et X og højst 4 af X'erne er forskellige fra amino-syreresten i human insulin på den tilsvarende position i in- 10 sulinmolekylet, at mindst et X i B-kæden er forskellig fra aminosyreresten i human insulin på den tilsvarende position i human insulin molekylet og at når X i position B(5) er Ala, X i position B(9) er Leu, X i position B(10) er Asn eller Leu, X i position B(12) er Asn, eller X i position B(26) er Ala, 15 så er mindst en af de øvrige X'er forskellige fra aminosyreresten i human insulin på den tilsvarende position i insulinmolekylet, og med den yderligere betingelse, at op til 4 ami-nosyrerester kan være blevet fjernet fra den N-terminale ende DK 159274 B 35 på B-kæden, og op til 5 aminosyrerester kan være fjernet ved den C-terminale ende af B-kæden.

2. Human insulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyrerestsubstitutionerne er mere hydrofile 5 end aminosyreresten i human insulin ved den respektive position i insulinmolekylet.

3. Human insulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyresubstitutionerne er valgt fra gruppen bestående af Asp, Glu, Ser, Thr, His og Ile, fortrinsvis Asp 10 og/eller Glu.

4. Human insulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mindst et X i position B(9), B(10), B(12), B(26), B(27) eller B(28) er forskelligt fra aminosyreresten på det tilsvarende sted i human insulinmolekylet, fortrinsvis et X i 15 position B(9), B(12), B(27) eller B(28).

5. Human insulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X i position B27 er Glu, X i position B12 er Ile eller Tyr, X i position A21 er Asp og i position B27 er Glu, X i position B9 er Asp, X i position A21 og i position B9 er

20 Asp og i position B27 er Glu, X i position A8 er His, i position B9 er Asp og i position B27 er Glu, X i position BIO er Asp, X i position B9 er Asp og i position B27 er Glu, eller X i position B28 er Asp.

6. Human insulinanaloger ifølge krav 1, kendeteg- 25 net ved, at de mangler op til fire aminosyrerester ved den N- terminale ende af B-kæden og/eller op til fem aminosyrerester ved den C-terminale ende af B-kæden.

7. Human insulinanaloger ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de mangler B(l)-aminosyreresten og/eller B(30)- 30 aminosyreresten.

36 DK 159274 B

8. Injicerbare opløsninger med hurtigt indsættende insulinvirkning, kendetegnet ved, at de indeholder en insulinanalog ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf i vandig opløsning.