DK160459B

DK160459B - Fremgangsmaade til fremstilling af denatureringsbestandige vandige proteinoploesninger

Info

Publication number: DK160459B
Application number: DK185180A
Authority: DK
Inventors: Horst Thurow
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1979-04-30
Filing date: 1980-04-29
Publication date: 1991-03-18
Also published as: FI801361A7; DK185180A; DE3064888D1; ES8106407A1; AU535040B2; ES494356A0; DK160459C; EP0018609B1; GR67209B; EP0018609A1; FI70671C; EG15017A; US4885164A; IL59933A0; CA1146069A; IL59933A; FI70671B; AU5787780A

Description

DK 160459 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en vandig proteinopløsning, der er bestandig mod denaturering af proteinerne ved grænseflader.

Det er kendt, at opløste proteiner adsorberes til 5 hydrofobe grænseflader (dertil hører også grænsefladen mellem vandig opløsning og luft) (C.W.N. Cumper og A.E. Alexander, Trans. Faraday Soc. 46, 235 (1950)). Proteiner er amphifile stoffer, dvs. de har både hydrofile og hydrofobe områder. De hydrofobe områder danner kontakten 10 med den hydrofobe grænseflade.

Som følge af adsorptionen af proteiner til grænseflader iagttages forskellige sekundærreaktioner, der alment sammenfattes under begrebet "denaturering". Der sker en formændring af de adsorberede proteinmolekyler (ændring 15 af den tertiære og/eller sekundære struktur). Desuden kan der ske en aggregation af adsorberede proteinmolekyler til opløselige eller uopløselige polymere former. For mange proteiner kendes der således en overflade-aggregation, der f.eks. gør sig bemærket som en uklarhedsdannelse i

2 O

opløsningen eller som en biologisk inaktivering af proteinerne ved omrøring eller rystning af de vandige opløsninger (A.F. Henson, I.R. Mitchell, P.R. Mussellwhite, J. Colloid Interface Sci. 32, 162 (1970)). Denne overfladeadsorption og -aggregation er særlig uheldig i apparater til transport 25 af proteinopløsninger, f.eks. i automatiske doseringsapparater til lægemidler. I nogle tilfælde sker der også kemiske reaktioner mellem de adsorberede proteiner og opløste stoffer (F. MacRitchie, J. Macromoi.Sci., Chem., 4, 1169 (1970)).

Dette gælder især for okse-, svine-, og humaninsulin 30 eller disses des-Bl-phenylalaninderivater. Disse er med et zinkindhold på indtil 0,8%, beregnet på insulinets vægt, klart opløst i vandige medier under en pH-værdi på 4,3 og over en pH-værdi på 6,5. De nævnte insuliner danner i vandige opløsninger aggregater, således at opløsningen udgør en 35

O

DK 160459 B

2 ligevægtstilstand mellem monomere, dimere, tetramere, hexa-mere og oligomere insulinmolekyler. Det er kendt, at insulin adsorberes stærkt til hydrofobe overflader, hvortil også regnes grænsefladen mellem opløsningen og luft (Weisenfeld 5 et. al., Diabets 17, 766 (1968) og Browne et al., Eur. J.

Biochem. 33 233 (1973)). Forsøg har vist, at det adsorberede insulin kan denaturere ved overfladen. Denne proces påvirkes af temperaturen og bevægelse af opløsningen. Det denaturerede produkt desorberes igen som polymert aggregat og udfælder 10 ved en tilstrækkelig høj koncentration i opløsningen som et bundfald eller danner en tixotrop gel. Det denaturerede insulin er biologisk uvirksomt og fører til tilstopninger i transportslanger f.eks. i en kontinuerlig eller reguleret arbejdende insulin-infusionspumpe, der anvendes i kunstige 15 betaceller.

Desuden kan det denaturerede insulin give anledning til immunologiske uforeneligheder. Der kendes undersøgelser, der gør den fysiske tilstandsform af insulin ansvarlig for dannelsen af antistoffer mod insulin (Kumar et. al. Horn.

20 Metab. Res. 6, 175 (1974)). Det er desuden kendt, at selv humaninsulin anvendt hos mennesker kan føre til immunologiske reaktioner (Ά. Teuscher et. al., Diabetologia 13, 435 (1977)).

Ifølge kendt teknik fremstillede vandige insulinopløsninger til terapeutiske formål kan foruden det virksomme 25 stof, okse- eller svineinsulin eller et des-Bl-phenylalanin-derivat af disse insuliner, indeholde opløst zink i en mængde på indtil 0,8%, beregnet på insulinets vægt, et middel til indstilling af isotoni, såsom natriumchlorid, glycerol eller glucose, et konserveringsmiddel, såsom phenol, kresol 30 eller p-hydroxybenzoesyrernethylester og et salt til pufring af pH-værdien, såsom natriumphosphat, acetat eller citrat. Desuden kan der også være tilsat depothjælpestoffer, såsom "protamin" eller "Surfen", til opnåelse en forlænget insulinvirkning, eller opløsningerne kan være blandet med 35 krystallinske eller amorfe depotformer for insulin. Det har vist sig, at opløst insulin i alle disse præparater dena-

O

DK 160459 B

3 turerer ved grænseflader.

Forsøg har vist, at denatureringshastigheden stiger med temperaturen, bevægelsen af opløsningen og opløsningens pH-værdi. Humaninsulin denaturerer ligeledes i vandig opløsning. Tilsætninger, der forskyder aggregations-

O

ligevægten for insulin i vandig opløsning i retning af det monomere molekyle, såsom guanidin, urinstof, pyridin eller monomere detergenter, fremskynder denatureringen. Stoffer, der forskyder ligevægtene i den modsatte retning, såsom 1Q zink og andre divalente metalioner, forsinker denatureringen. Men selv en kombination af alle gunstige betingelser kan ikke forhindre denatureringen af insulin. Denne denaturering iagttages også, selvom den er langsommere, ved rolig oplagring af opløsningerne.

En speciel form for hydrofobe grænseflader dannes ved frysning af vandige opløsninger, f.eks. ved frysetørring af proteiner. Ved disse grænseflader sker der ligeledes de beskrevne denatureringer af proteiner (U.B. Hansson,

Acta Chem. Scand., 22, 483 (1968)).

20 Denatureringsprocessen kan give et protein immu nogene egenskaber (dvs. evnen til at inducere immunologiske afværgereaktioner i en organisme) eller forstærke allerede tilstedeværende immunogene egenskaber. Desuden kan biologiske egenskaber, såsom enzymatiske, serologiske eller hormonelle 25 aktiviteter, ændres eller ødelægges.

Det er endvidere kendt, at adsorptionen af proteiner ved grænsefladen, der dannes mellem en vandig opløsning og en flydende hydrofob fase, kan forhindres ved, at der til dette system sættes monomere overfladeaktive stoffer .

3Q såsom alkylalkoholer (R. Cecil og C.F. Louis, Biochem, J. 117, 147 (1970)).Disse stoffer adsorberes på deres side reversibelt til de hydrofobe grænseflader og fortrænger på denne måde proteinerne. Det er en ulempe ved denne fremgangsmåde, at anvendelseskoncentrationen af 35 de ‘overfladeaktive stoffer skal ligge nær deres mætningsgrænse i vandig opløsning, idet der kun på denne måde sikres en 4

O

DK 1-60459 B

optimal ladning af grænsefladen. I mange tilfælde er grænsefladens størrelse ikke konstant, men variabel (f.eks. grænsefladen mellem opløsning og luft ved omrøring eller rystning . af proteinopløsninger), således at den 5 vandige opløsning skiftevis skal aflevere og optage molekyler af disse overfladeaktive stoffer,dvs. skal indeholde et pufferforråd. Ved en nødvendig anvendelseskoncentration nær mætnings grænsen er dette imidlertid kun muligt i begrænset omfang.

10 En yderligere ulempe ved denne fremgangsmåde er endvidere, at de nævnte monomere overfladeaktive stoffer ikke kun adsorberes til de hydrofobe grænseflader, men også til de hydrofobe områder i de opløste proteiner.

Der bevirker de en denaturering af de opløste proteiner, 15 der i mange tilfælde er irreversibel og netop er det, som man vil forhindre.

Styrken af bindingen af monomere overfladeaktive stoffer til både de hydrofobe grænseflader og de hydrofobe områder i de opløste proteiner er afhængig af stoffernes 20 hydrofobicitet, dvs. f.eks. af længden af alkylkæderne.

Jo længere alkylkæderne er, desto større er bindingsstyrken. Modsætningen mellem en mest mulig fuldstændig ladning af grænsefladerne med de overfladeaktive stoffer ( der kan opnås ved en høj hydrofobicitet af stofferne eller en 25 høj anvendelseskoncentration) og en mest mulig ringe binding til de hydrofobe områder i de opløste proteiner har forekommet uovervindelig.

Endvidere kendes der fra DE fremlæggelsesskrift 2 620 483 insulinopløsninger, hos hvilke en tilsætning af 30 0,1-20 vægt-% af polyoxyethylenethere af højere alkoholer har til formål at give en beskyttelse mod geldannelse og udfældning under oplagringen.

Ved anvendelsen af disse polyoxyethylenethere, i hvis molekylkæde ethylenenheder alternerer med oxygenatomer, 35 kan der imidlertid ikke observeres nogen beskyttelsesvirkning mod denaturering af vandige proteinopløsninger. De nævnte

O

DK 160459 B

5 ethylenenheder har åbenbart ikke de for en sådan beskyttel-sesvirkning nødvendige hydrofobe egenskaber, da de på grund af deres rumlige anordning i kæden ikke kan vekselvirke med de hydrofobe grænseflader eller med de hydrofobe områder af 5 opløste proteiner.

Det har nu vist sig, at polymere stoffer med alternerende anordnede hydrofobe og hydrofile områder ændrer grænsefladerne på en sådan måde, at adsorptionen af proteiner til disse grænseflader og derved også de nævnte sekundære 10 reaktioner, f.eks. grænsefladeaggregationen, forhindres på virksom måde.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af en vandig proteinopløsning, som er bestandig mod denaturering af proteinerne ved grænseflader, hvilken 15 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der til den vandige proteinopløsning sættes en homopolymerisat, copolymerisat eller blokpolymerisat med formlen I

A - xn - R3 (I) 20

hvori betyder en kæde af n led med formlerne II eller III

R1 R1 R1

25 - CH - CH - 0 - - CH - O

(II) (III) i vilkårlig rækkefølge, og n betyder 2-80, fortrinsvis 8 - 45, Y betyder oxygen eller imino, betyder hydrogen, methyl eller ethyl, idet grupperne R^ kan være ens eller 30 forskellige, idet der dog i mindst halvdelen af kædeleddene 2 3 X forekommer methyl eller ethyl, og R og R uafhængigt af hinanden betyder hydrogen eller en organisk gruppe.

Særlig foretrukne er forbindelser med formlen I, hvori R3 betyder hydrogen, alkyl med 1-20 carbonatomer, 35 carboxyalkyl med 2-20 carbonatomer eller alkylphenyl med 1-10 carbonatomer, og R2 betyder hydrogen eller alkyl med

O

6

DK 160459B

1-20 carbonatomer, men også, når Y betyder -O-, carboxy-alkyl med 2-20 carbonatomer eller alkylphenyl med 1-10 alkyl-carbonatomer.

Som særlig foretrukne skal fremhæves forbindelser 5 med formlen I, hvori R3 betyder hydrogen eller alkyl med 1-20 carbonatomer, og R2 betyder hydrogen, idet R2 og R3 = hydrogen har den største betydning.

Eksempler på grupperne R2 og R3 er methyl, ethyl, propyl, butyl eller grupper, der afledes af laurylalkohol 10 eller myristylalkohol, carboxyalkylgrupper, der afledes af eddikesyre, propionsyre, smørsyre, palmitinsyre, eller stearinsyre, nonylphenyl eller oleyl.

R2 eller R3 kan også være afledt af en polyvalent alkohol, såsom glycerol eller pentaerythritol, eller en poly-15 valent carboxylsyre, såsom citronsyre, eller en polyvalent amin såsom ethylendiamin. Polyfunktionelle led R2 eller R3 kan være forbundet med tre eller flere polyalkoxykæder af den ovenfor angivne art, hvorved der ved tri- eller høj-erefunktionelle led dannes forgrenede produkter.

20 Fremstillingen af de ifølge opfindelsen anvendte, overfladeaktive stoffer gennemføres på i og for sig kendt måde ved kontrolleret tilsætning af alkylenoxider til alkylendiglykoler (eller til polyvalente alkoholer eller aminer, f.eks. pentaerytritol eller ethylendiamin, til 25 fremstilling af forgrenede produkter). De endestillede hydroxylfunktioner. kan eventuelt derpå forestres eller forethres. En almindelig forskrift til fremstilling af et egnet blokpolymerisat er beskrevet i eksempel la.

De her omhandlede overfladeaktive stoffer ud-30 mærker sig ved, at de allerede er virksomme i koncentrationer på 2-200 ppm i vandige medier. Man kan forestille sig, at disse stoffer ved grænsefladen er formet således > at deres hydrofobe grupper rager ind i den hydrofobe fase, og de alternerende anordnede hydrofile grupper 35 rager ind i den vandige fase. Da hydrofobiqiteten af de enkelte hydrofobe grupper er relativt svag, må også

O

DK 160459B

7 bindingen af disse enkelte hydrofobe grupper til fremmede hydrofobe strukturer, f.eks. til de hydrofobe områder i opløste proteiner, være så svag, at der kan ses bort fra 5 den ved de omhandlede anvendelseskoncentrationer. Først summen af alle bindinger af de enkelte hydrofobe grupper til en større hydrofob flade (grænseflade, mod hvilken de hydrofobe områder af de opløste proteiner er meget lille) bevirker, at disse stoffer også ved ringe anvendelseskoncen-10 tration dækker grænsefladerne optimalt.

Molekylformen, som de omhandlede overfladeaktive stoffer udviser i vandig opløsning, må adskille sig fra den form, de antager ved overfladen. I vandig opløsning er den polymere kæde formet således, at de enkelte hydrofobe 15 områder afmættes mod hinanden, og de hydrofile områder rager ud efter i de vandige omgivelser. Dette bevirker en tilstrækkelig høj opløselighed i vandige medier, således at der er en tilstrækkelig stor forrådspuffer til stede der også ved stadig ændring af størrelsen af grænsefladerne 20 muliggør en optimal ladning af grænsefladerne med de nævnte stoffer.

Hindringen af adsorptionen og denatureringen med de omhandlede tilsætninger er så meget mere overraskende, som en tilsætning af monomere opløselige overfladeaktive 25 stoffer (detergenter) som ovenfor beskrevet netop fremmer denatureringen af proteinopløsninger, især af insulin.

Metoden til stabilisering af vandige proteinopløsninger som beskrevet ifølge den foreliggende opfindelse er generelt anvendelig på peptider og polypeptider, der kan 30 adsorberes til en hydrofob grænseflade fra en opløsning.

Blandt anvendelige peptider og polypeptider kan der nævnes enzymer, f.eks. uricase, lysozym, streptokinase, myoglobin, neuraminidase, peptidhormoner, f.eks. secretin, glucagon, 35

O

DK 160459 B

8 calcitonin, gastrin, ACTH, bradykinin, chlolecystokinon, væksthormon, erytropoietin, skjoldbruskkirtelstimulerende hormoner, thymosin, hypothalamiske frigørelsesfaktorer, relazin samt proteiner med andre funktioner, f.eks. albumin, 5 immunoglobuliner af forskellige klasser og arter, fibroblast-interferon, leukocyt-interferon og immuninduceret interferon af human oprindelse.

Tilsætningen af de nævnte polymere overfladeaktive stoffer til proteinopløsninger er ikke begrænset til op-10 løsninger til terapeutiske formål. Man kan også sætte disse stoffer til proteinopløsninger under fremstillingen og rensningen af proteiner til undgåelse af adsorption og denaturering ved grænseflader, især ved gelchromatografering og ultrafiltrering af proteinopløsninger.

15 Denatureringen af insulin er en reversibel proces.

Véd behandlingen af det denaturerede insulin,- med let opløselige detergenter (f.eks. natriumdodecylsulfat), med vandige alkaliske medier over en pH-værdi på 10,5 eller med koncentreret trifluoreddikesyre kan de denaturerede 20 produkter renatureres. Det er altså muligt at renaturere de ringe andele af denatureret insulin i insuliner, der fremkommer ved en sædvanlig fremstillingsproces, under de nævnte betingelser, før opløsningerne af disse produkter bringes i kontakt med de her omhandlede overfladeaktive 25 stoffer.

Insulinopløsninger til terapeutiske formål kan fremstilles ifølge følgende almene fremstillingsforskrift:

Indtil 1.500.000 IE okseinsulin, svineinsulin eller humaninsulin eller et des-Bl-phenylalaninderivat 30 af disse insuliner, der kan indeholde indtil 0,8 vægtprocent zink, opløses i 400 ml vand under tilsætning af 1 N saltsyre. Denne opløsning blandes med 500 ml af en opløsning, der indeholder et konserveringsmiddel, f.eks. phenol, kresol eller p-hydroxybenzoesyremethylester, et middel 35 til indstilling af isotoni, f.eks. natriumchlorid, glycerol, glucose eller et lignende kulhydrat, og et salt til pufring

O

DK 160459 B

9 af pH-værdien, f.eks. natriumphosphat, acetat, citrat, veronalnatrium eller tris- (hydroxymethyl) - aminomethan Desuden kan denne opløsning også indeholde et depothjælpestof såsom "Surfen" (1,3-bis-(4-amino-2-methyl-6-quinolyl)-urin-5 stof), til opnåelse af en forlænget insulinvirkning. Med 1 N saltsyre eller 1 N natriumhydroxidopløsning indstilles en pH-værdi på 3,0-4,0 eller 6,8-7,5. Derpå tilsættes der 50 ml af en vandig opløsning, der indeholder 2 -200 mg af et af de omhandlede overfladeaktive stoffer. Opløsningen 10 fyldes op med vand til 1,000 1. En sådan insulinopløsning til terapeutiske formål kan blandes med en suspension, der indeholder amorft eller krystallinsk insulin med forlænget virkning.

15 Eksempel 1 (a) I en 10 liters glaskolbe med omrører, varmebad, tilbagesvaler og en anordning til dosering af alkylenoxider under nitrogen anbringes 152,1 g propylenglykol og 125 g 40%'s kaliumhydroxidopløsning. Der afvandes ved vakuumdestillation. Derpå tilsættes der langsomt ved 120°C under omrøring successivt 4141 g propylenoxid og 476 g ethylenoxid. Efter afsluttet omsætning neutraliseres kaliumhydroxidet ved tilsætning af mælkesyre. De letflygtige andele fraskilles og produktet afvandes ved vakuumdestillation. Den gennemsnitlige molekylvægt af produktet er 2000 ved et indhold af polyoxyethylen på 10 vægt% i molekylet.

(b) 2 prøver med hver 10 ml af en 0,1%'s opløsning af okseserum-albumin eller human-albumin i en 0,01 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7 og to prøver 30 af samme art med en tilsætning af stabilisator på 10 ppm (beregnet på vægten af opløsningen) af et blokpolymerisat bestående af en lineær kæde af poly-propylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 1750, der på begge sider er tilpolymeriseret 5% 35 0 polyethylenglycol, omrystes ved 37 C. De to første prøver udviser efter 7 og 30 dage en stærk uklarhedsdannelse.

der er fremkaldt af denatureret protein. De to prøver, 10

DK 160459B

o der indeholder stabilisator, er stadig klare efter flere måneder.

Eksempel 2 10 prøver med hver 10 ml af en 0,01%'s opløsning 5 af enzymet β-galactosidase fra E. coli i 0,01 M phosphat- 6 puffer med en pH-vær di på 7 og med 3 x 10 ^iU/ml tilsættes trinvis 10-100 mg siliconolie AK 350. Suspensionerne omrystes i 48 timer ved 5°C. Derved dannes en emulsion, der ved ultracentrifugering (40.000 g, 30 minutter, 10 4°C) kan adskilles i to faser. I den vandige fase bestemmes enzymaktiviteten. Det viser sig, at silikone-olieemulsionen har adsorberet indtil 70% af enzymet.

En gentagelse af forsøget i nærværelse af 100 ppm (beregnet på opløsningens vægt) af følgende forbindelse 15 , C?3

CH3-(CH2)12-CH2-0-(-CH2-CH2-Ol)4-(-CH -CH-0-)4-H

viser, at der i nærværelse af denne overfladeaktive forbindelse ikke adsorberes enzymaktivitet til silikonolien. Eksempel 3 20 10 ml af en vandig suspension af polystyrenkugler ("Dow-Latex"^ med en gennemsnitlig diameter på 0,481 γ. deles i to lige store dele. Medens den første del forbliver ubehandlet, omrystes den anden del med 50 mg af et blokpolymerisat bestående af en lineær kæde 25 af polypropylenglyool med en gennemsnitlig molekylvægt på 2250, der på begge sider er tilpolymeriseret 5% polyethylenglyool, ved stuetemperatur i 2 dage. Derpå fjernes overskuddet ved dialyse mod en vandig opløsning, der indeholder 20 ppm af dette polymere overfladeaktive 3^ stof.

Af de i den efterfølgende tabel angivne proteiner fremstilles hver gang 2 x 3 ml af en opløsning med den nævnte koncentration i phosphatpuffer_med en pH-værdi på 7. Hver af disse opløsninger omrystes ved 5°C med 500 yul af den ubehandlede og den som ovenfor beskrevet

DK 160459 B

11 o forbehandlede polystyrensuspension. Derpå klarfiltreres hver prøve gennem et 0,2 μ filter. Tabellen viser proteinkoncentrationerne i filtraterne.

5 Proteinkoncentration i opløsningerne

Protein _A_B_C__

Human-γ-globulin 1,2 mg/ml 1,2 mg/ml 0,2 mg/ml Æg-albumin 0,5 mg/ml 0,50 mg/iiil 0,22 mg/ml

Lysozym 1,0 mg/ml 0,95 mg/ml 0,25 mg/ml

Secretin 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 0,3 mg/ml

Glucagon 1,0 mg/ml 0,9 mg/ml 0,3 mg/ml

Insulin 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 0,2 mg/ml A - 3 ml af den anvendte proteinopløsning + 450 μΐ puffer b = efter kontakt med forbehandlede polystyrenflader C = efter kontakt med ubehandlede polystyrenflader

Dette forsøg gentages ved 37°C. Derved undersøges filtraterne desuden ved gelkromatografering i en søjle. Det viser sig, at proteinopløsningerne, der har været i kontakt med de 20 ubehandlede polystyrenkugler, indeholder højmolekylære aggregater. I proteinopløsningerne, der har været i kontakt med de forbehandlede polystyrenkugler, findes der ikke sådanne aggregater.

Eksempel 4 25 -- 5 prøver med hver 10 ml af en 0,l%?s opløsning af glucagon i 0,05 M tris/saltsyrepuffer med en pH-værdi på 8,0 og 5 prøver af samme art med tilsætning af 50 ppm (beregnet på vægten af opløsningen) af følgende forbindelse: 30 CH3 ch3-(ch2)14-ch2-o-(-ch2-ch2-o-)4-(-ch2-ch-o-)4-h omrystes ved stuetemperatur. De første 5 prøver udviser efter 4 dages forløb en uklarhedsdannelse, der er iorårsaget 55 af udfældet denatureret protein. Prøverne hvortil der er sat overfladeaktivt stof, forbliver klare i flere uger.

0 12

DK 160459B

Eksempel 5

Ampuller med 1-5 ml af en 0,1%'s opløsning af peptidhormonerne secretin, calcitonin, glucagon, gastrin, adrenocorticotropt hormon (ACTH), bradykinin, cholecy-5 stokinin (CCK), gastrininhiberende polypeptid (GIP) vasoaktivt intestinalt polypeptid (VIP) og luteiniserings--frigørende-hormon (LHR) i 0,05 M tris/saltsyrepuffer med en pH-værdi på 7,5 og prøver af samme art med en tilsætning af 10 ppm (beregnet på opløsningens vægt) 10 af et blokpolymerisat bestående af en lineær kæde af polypropylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 2000, der på begge sider er tilpolymeriseret 5% poly-ethylenglycol, omrystes ved 37°C. Prøverne uden stabilisator udviser efter nogle dage en stærk uklarhedsdannelse, der 15 er fremkaldt af denatureret protein. De stabiliserede prøver er stadig klare efter flere måneder.

Eksempel 6 0,1%'s opløsninger af æg-albumin, human-immun-globulin-G eller, hval-myoglobin i 0,01 M phosphatpuffer 20 med en pH-værdi på 7 og opløsninger af samme art med en tilsætning af 0,1% (beregnet på vægten af opløsningen) af følgende forbindelse: R—

_TN - CH0 - CH„ - iC

25 2 2 ch3 R = -(CH2-CH-0)n-(CH2-CH2--0)m-H 30 hvorved n og m vælges således, at der fås en gennemsnitlig samlet molekylvægt af forbindelsen på 12.500 og en ethylenoxidandel deri på 40%, befries for aggregater ved ultracentrifugering (f.eks. 100.000 g/90 minutter) . Ampuller

«J J Q

med 10 ml af disse opløsninger omrystes ved 37 C. Prøverne uden stabilisator udviser efter nogle få timer en stærk uklarhedsdannelse, der er forårsaget af udfældet denatureret protein. De prøver, hvortil der er sat de overfladeaktive

O

13

DK 160459 B

stoffer, forbliver klare i flere måneder og udviser ingen nye aggregater ved en analytisk ultracentrifugering.

Eksempel 7

Krystalliseret okseinsulin (40.000 I.E.) med 5 0,5 vægtprocent zink opløses i 200 ml vand under tilsæt ning af 3 ml 1 N saltsyre. Til denne opløsning sættes 700 ml af en opløsning af 1 g p-hydroxybenzoesyremethyl-ester, 16 g glycerol og 1,4 g natriumacetat, 3 H20. Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 6,9 - 7,4 med 1 N natriumhydroxidopløsning. Efter tilsætning af 5 ml af en vandig 0,1% 's opløsning af lineær polypropylen-glycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 2.000 fyldes der op med vand til 1,000 liter, og opløsningen'sterilfiltreres.

15 Eksempel 8

Krystalliseret Des-Bl-phenylalanininsulin fra okse (100.000 I.E.) med 0,6 vægtprocent zink opløses i 200 ml vand under tilsætning af 3 ml 1 il saltsyre.

Til denne opløsning sættes 700 ml af en. opløsning af 2 20 g phenol, 17 g glycerol og 6,057 g tris-(hydroxymethyl)- -amino-methan, der er indstillet til en pH-værdi på 7,6 med 35 ml IN saltsyre .Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,2 - 7,6. Efter tilsætning af 10 ml af en vandig 1%'s opløsning af forbindelsen.

25 CH3 ch3-(ch2)12-ch2-o-(-ch2-ch2-o-)4-(-ch2-ch-o-)4-h fyldes der op med vand til 1,000 1, og opløsningen sterilfiltreres.

30

Eksempel 9

Amorft okseinsulin (1.000.000 I.E.) med 0,8 vægtprocent zink opløses i 400 ml vand under tilsætning af 5 ml 1 N saltsyre. Til denne opløsning sættes 500 ml af en opløsning af 2,5 g phenol, 16 g glycerol og 1,78 g 35 dinatriumhydrogenphosphat, 2 H20. Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,2 - 7,5. Efter tilsætning af 5 ml af en vandig 0,1%'s_opløsning af lineær polypropylenglycol. · DK 160459 8 14 0 med en gennemsnitlig molekylvægt på 1750 fyldes der op med vand til 1,000 1, og opløsningen sterilfiltreres.

Eksempel 10

Okseinsulin (40.000 I.E.),der er renset ved 5 chromatografering i nærværelse af et blokpolymerisat bestående af en lineær kæde af polypropylenglygol med en gennemsnitlig molekylvægt på 1750, der på begge sider er tilpolymeriseret 5% polyethylenglycol, og som indeholder 0,6 vægtprocent zink, opløses i 200 ml vand under tilsætning 10 af 3 ml 1 N saltsyre. Til denne opløsning sættes 700 ml af en opløsning af 2,5 g m-kresol, 50 g glucose, 1,4 g natriumacetat, 3^0 og 10 mg af det ovennævnte blokpolymerisat. Opløsningen indstilles med 1 N natriumhydroxidopløsning til en pH-værdi på 6,9 - 7,4, fyldes 15 op med vand til 1000 1 og sterilfiltreres.

Eksempel 11

Krystalliseret svineinsulin (40,000 I.E.) med 0,6 vægtprocent zink opløses i 200 ml vand under tilsætning af 3 ml 1 N saltsyre. Til denne opløsning sættes 20 700 ml af en opløsning af 1 g p-hydroxybenzoesyremethyl- ester, 17 g glycerol, 1,4 g natriumacetat, 3 E^O og 10 mg lineær polypropylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 1.750. Opløsningen indstilles til én pH-værdi på 6,9-7,4. Der fyldes op med vand til 1,000 1 25 og opløsningen sterilfiltreres.

Eksempel 12

Krystalliseret okseinsulin (450.000 I.E.), der er renset ved^chromatografering i nærværelse af et blokpolymerisat bestående af en lineær kæde af polypropylen-30 glycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 1.750, der på begge sider er tilpolymeriseret 5% polyethylenglycol, og som indeholder 0,5. vægtprocenttzink, opløses i 400 ml 0,03 N saltsyre, og til denne opløsning sættes en opløsning af 150 mg zinkchlorid og 5 mg af det tilchromatograferingen 35 anvendte blokpolymerisat i 100 ml 0,03 N saltsyre. Op løsningen sterilfiltreres og blandes med 500 ml af en ligeledes sterilfiltreret opløsning af 70 g natriumchlorid, 14 g natriumacetat, 3 I^O, 5 mg af det til chromatograferingen

DK 160459B

O

15 anvendte blokpolymerisat og 10 ml IN natriumhydroxid -opløsning i vand. Blandingen indstilles til en pH-værdi på 5,4 og omrøres i 48 timer ved stuetemperatur, hvorved insulinet krystalliserer i rhomboedre'. Til krystalsuspen-5 sionen sættes 10,25 1 af en steril opløsning af 20 g natriumchlorid, 1,75 g natriumacetat, 3 ^0, 11,25 g p-hydroxybenzoesyremethylester og 102,5 mg af det til chromatograferingen anvendte blokpolymerisat. Ved tildrypning af 1 N natriumhydroxidopløsning indstilles •*-0 pH-værdien til 6,9 - 7,3.

Eksempel 13

Krystalliseret okseinsulin .(40.000 I.E.), der er renset ved sædvanlig chromatografering i nærværelse af forbindelsen 15 ?H3

(CIi3 . (CH2) 10-ch2-o- (-CH2-CH2-P“) 4“ (-CH2-CH-0-) 4-H

og indeholder 0,5 vægtprocent zink, opløses i 200 ml vand under tilsætning af 3 ml 1 N saltsyre. Til denne opløsning sættes 700 ml af en opløsning af 1 g p-hydroxybenzoesyremethylester, 50 g glucose, 0,175 g "Surfen" og 100 mg af det samme stof som det, der er anvendt: til chromatograferingen. Opløsningen indstilles eventuelt med 1 N saltsyre eller 1 N natriumhydroxidopløsning til en pH-værdi på 3,3-3,5, fyldes op med vand til 1,000 1 og sterilfiltreres.

30 35 16

DK 160459B

0

Eksempel' 14

Fem prøver på hver 1,5 ml af en opløsning af 5000 enheder humant fibroblast-interferon i phosphatpuffer, pH-værdi 7, og fem analoge prøver, der som stabilisator indeholder 5 10 ppm (beregnet på opløsningens vægt) af en blokpolymer be stående af en lineær kæde af 1,2-propylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 1750 dalton, til hvilken der på hver side er bundet 5% polyethylenglycol ved polymerisation, omrystes ved 37°C. I de fem første prøver konstateres et tab af biolo-10 gisk aktivitet på mere end 97% efter to dage. Den biologiske aktivitet af interferonet i de fem prøver indeholdende stabilisator forbliver imidlertid uændret, selv efter flere uger.

En gentagelse af forsøget ved stuetemperatur viser et lignende tab af biologisk aktivitet i de ustabiliserede prø-15 ver efter 5 dage. I prøverne indeholdende stabilisator forbliver aktiviteten af interferonet uændret efter flere uger.

Eksempel 15 10 ml af en vandig suspension af polystyrenperler ("Dow Latex") med en gennemsnitlig diameter på 0,481 p deles 20 i to portioner, hvoraf den ene forbliver ubehandlet, medens den anden omrystes i to dage ved stuetemperatur med 50 mg af en blokpolymer bestående af en lineær 1,2-propylenglycol-kæde med. en gennemsnitlig molekylvægt på 1750 dalton, til hvilken der på hver side er bundet 10% polyethylenglycol ved polymeri-25 sation. Overskuddet fjernes derpå ved dialyse mod en vandig opløsning indeholdende 150 ppm af det samme polymere overfladeaktive stof.

Der fremstilles to prøver på hver 3 ml af en opløsning af 10.000 enheder humant fibroblast-interferon i en phos-30 phatpuffer, pH-værdi 7, og hver opløsning omrystes ved 5°C i 20 timer med 500 pliter af den ubehandlede polystyrensuspension eller polystyrensuspensionen, der er behandlet som beskrevet ovenfor. Hver prøve klarfiltreres derefter gennem et 0,2 u-filter. Den biologiske aktivitet af interferonet i filtratet bestemmes. I opløsningerne, som var i kontakt med 35

DK 160459 B

17

O

de ubehandlede polystyrenperler, konstateres mindre end 1% af den beregnede aktivitet. I opløsningerne, som var i kontakt med polystyrenperler behandlet som beskrevet ovenfor, bevares mere end 95% af den aktivitet, der bestemmes ved for-5 søgets begyndelse.

Eksempel 16

To ampuller, der hver er fyldt med 10 ml af en opløsning af humant insulin (500 enheder pr. ml) i 0,05M tris/-HCl-puffer, pH-værdi 7, og to analoge prøver, der som stabi-10 lisator indeholder 10 ppm (beregnet på opløsningens vægt) af en blokpolymer bestående af en lineær 1,2-polypropylenkæde med en gennemsnitlig molekylvægt på 1750 dalton, til hvilken der på hver side er bundet 5% polyethylenglycol ved polymerisation, omrystes ved 37°C. De to førstnævnte prøver bliver 15 stærkt uklare efter 5 dage på grund af denatureret insulin, og den biologiske aktivitet af hormonet falder til mindre end 10% af den aktivitet, der bestemmes ved forsøgets begyndelse.

De to prøver, der indeholder stabilisator, forbliver klare, selv efter mere end 1 år, og det konstateres, at den biologi-20 ske aktivitet er uændret.

25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en vandig proteinopløsning, som er bestandig mod denaturering af proteinerne ved grænseflader, kendetegnet ved, at der 5 til den vandige proteinopløsning sættes et overfladeaktivt homopolymerisat, copolymerisat eller blokpolymerisat med formlen I R2Y - Xn - R3 (I) 10 hvor Xn betyder en kæde af n led med formlerne II eller III R1 R1 R1 I I I

15 -CH - CH - O - -CH - O - (II) (III) 20 i vilkårlig rækkefølge, og n betyder 2-80, fortrinsvis 8-45, Y betyder -O- eller -NH-, R1 betyder hydrogen, methyl eller ethyl, idet grupperne R1 kan være ens eller forskellige, idet der dog i mindst halv-25 delen af kædeledene X forekommer methyl eller ethyl, og R2 og R3·uafhængigt af hinanden betyder hydrogen eller en organisk gruppe.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R2 og R3 hver især betyder alkyl med 1-20 30 carbonatomer, carboxyalkyl med 2-20 carbonatomer eller alky lphenyl med 1-10 alkyl-carbonatomer, ider R2 dog, såfremt Y betyder -NH-, kun kan betyde alkyl med 1-20 carbonatomer.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at R2 og/eller R3 er tri- eller polyvalente og 35 er forbundet med tre eller flere polyalkoxykæder -Xn til forgrenede produkter.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at proteinet er insulin, og at opløsningen eventuelt indeholder de ved insulinopløsninger gængse tilsæt- DK 160459B ninger til indstilling af isotoni, konservering og/eller depotvirkning.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at en opløsning af okseinsulin, svineinsulin 5 eller humaninsulin eller et des-Bl-phenylalaninderivat af disse insuliner, der indeholder indtil 0,8% zink, beregnet på insulinets vægt, blandes med en opløsning, der indeholder en forbindelse med formlen I, og der tilsættes eventuelt et middel til indstilling af isotoni, såsom glycerol, natrium-10 chlorid, glucose, eller et lignende kulhydrat, til konservering en tilsætning af phenol, cresol eller p-hydroxyben-zoesyremethylester, og til pufring af pH-værdien natrium-phosphat, acetat, citrat, 5,5-diethylbarbitalnatrium eller tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et insulinpræ parat med depotvirkning, kendetegnet ved, at der til en insulinopløsning, der er fremstillet ifølge krav 5, sættes en depotkomponent for insulin med forlænget virkning.