DK160536B - Erektions- og frugtbarhedsfremmende middel og fremgangsmaade til dets fremstilling - Google Patents

Description

DK 160536 B

Den foreliggende opfindelse angår et erektions- og fertilitetsfremmende middel samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf ud fra de cowperske kirtler og/eller de bartholinske kirtler fra pattedyr indbefattet mennesker.

5

Lipidekstrakter fra mands og hanpattedyrs cowperske kirtler og kvinders og hunpattedyrs tilsvarende organer, de store vesti-bulære kirtler betegnet de bartholinske kirtler, i det følgende for nemheds skyld betegnet kirtlerne, har vist sig at have 10 egenskaber, som fører til at man af gode grunde kan forvente, at de vil fremme erektion, ejakulation, spermatozoernes mobilitet og deres evne til at trænge gennem protein og de kvindelige reproduktionsorganer. Midlet kan derfor udgøre en aktiv bestanddel i farmaceutiske præparater med denne indikation.

15 Mænds og hanpattedyrs kirtler betegnes de cowperske kirtler (også bulbo-urethrale kirtler) og består af parvis symmetrisk sammensatte alveolakirtler med fast konsistens, grågul eller svagt brun farve og af en størrelse som en almindelig haveært 20 eller havebønne. Deres udførelsesgang er op til 4 cm i længden og fører ind til urethra umiddelbart ved siden af det sted, hvor urethra fører ind til corpus cavernosum penis.

Kvinders og hunpattedyrs homologe kirtler kaldes de bartholin-25 ske kirtler og består af to gråligt gule, runde eller ovale kirtler af størrelsen som en almindelig haveært eller havebønne, og ligger på den dorsale side af vaginaåbningen. Udførelsesgangen har en længde fra 1,5 til 2 cm og udmunder i introi-tus vagina. De svarer direkte til handyrenes cowperske kirt-30 ler. Kirtlernes funktion er ikke fuldt afklaret. Med hensyn til handyrenes cowperkse kirtler er det kendt, at den samlede ekstrakt af sekretet fra disse kirtler koagulerer sædvæsken.

På denne måde dannes en slimet klump, hvilket forhindrer, at sædvæsken løber tilbage ved ejakulation. R. G. Hart, The me-35 chanism of Cowper's secretion in coagulating cat semen. J. Re-prod. Fert. (1968), 17, 223-226. J. J. Gueze og J. W. Slot,

Synthesis and secretion og glycoproteins in rat bu 1 bo-urethra 1 2

DK 160536 B

(Cowper's) glands, Biology of redproduction 15, 118-125 (1976).

Den biologiske virkning af 1 i pidfrakt i onerne udvundet fra 5 kirtlerne har ikke tidligere været undersøgt. Den foreliggende opdagelse af 1 i pidfrakt i onernes kraftige virkning på forskellige dele i det urogenitiale område er således af stor betydning for bestemmelsen af kirtlernes funktion. Lipidfrakt ioner udvundet fra disse kirtler, taget fra mænd, kvinder, tyre, or-10 ner, væddere, får og køer har været undersøgt, og når de underkastes farmakologiske prøver har de vist sig at have omtrent de samme egenskaber, som dem, der er angivet i det følgende .

15 Der er således nu overraskende i 1 ipidfraktionen fra kirtler vundet fra de ovennævnte arter fundet en faktor, der ses at påvirke både erektion og ejakulation såvel som spermatozoernes mobilitet og deres evne til at trænge gennem protein hos mennesker og dyr. Denne faktor kunne se ud til at være en kraftig 20 peptid-1ipid-mægler af prostaglandin!ignende/leucotrienlignen-de type.

Opfindelsen angår et erektions- og fertilitetsfremmende middel, der er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ud fra de 25 cowperske- og/eller de bartholinske kirtler fra pattedyr, indbefattet mennesker, ved at kirtlerne findeles og ekstraheres, efter at de først eventuelt er befriet fra proteiner, med li-pidopløsende middel ved sur pH-værdi, hvorefter vand fjernes, opløsningsmidlet afdampes og remanensen fraktioneres kromato-30 grafisk på kendt måde, og at de fraktioner, som sammentrækker sandrottetyktarm, opsamles og eventuelt yderligere renses ved kromatografiske metoder, hvor de opsamlede fraktioner udgør det erektions- og fertilitetsfremmende middel, eventuelt sammen med sædvanlige fortyndingsmidler.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det erektions- og fertilitetsfremmende middel ud fra de 35 3

DK 160536 B

cowperske- og/eller bartholi nske kirtler fra pattedyr indbefattet mennesker, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at kirtlerne findeles og ekstraheres, efter at de først eventuelt er befriet fra proteiner, med 1 ipidopløsende middel ved 5 sur pH-værdi, hvorefter vandet fjernes, opløsningsmidlet af-dampes og remanensen fraktioneres kromatografisk på kendt måde, hvorpå de fraktioner, som konstateres at sammentrække sandrottetyktarm opsamles og eventuelt yderligere renses ved kromatografiske metoder.

10

Prostaglandiner og tilsvarende stoffer sammentrækker gerbil colon, dvs. tyktarm fra sandrotte, og derfor anvendes sammentrækning af sandrottetyktarm som et kriterium for sådanne stoffers biologiske aktivitet. Den dermed forbundne prøve gen-15 nemføres på følgende måde: Den øvre del af en tyktarm, der er fjernet fra en sandrotte, ophænges i et konventionelt tarmbad, den nedre fastgørelse fastgøres mens den øvre fastgørelse forbindes til en føler, der registrerer sammentrækning og afslapning af tarmen under de forskellige stoffers indflydelse.

20

Da midlerne sammentrækker sandrottetyktarm er der gode grunde til at antage, at de indeholder prostaglandin!ignende stoffer. Imidlertid er ingen kendte prostaglandiner eftervist som værende til stede i de 1 ipidfraktioner taget fra kirtlerne, 25 der sammentrækker sandrottetyktarm og som er midlet ifølge opfindelsen (jf. eksemplet og figurerne 2, 3, 4 og 5, hvoraf det vil ses, at det ikke har været muligt at eftervise prostaglan-dinerne PGI2, PGE^, PGE2, PGF2a# PGA2 ved anvendelse af kendt teknik i sådanne 1ipidfraktioner, der sammentrækker sandrotte-30 tyktarm, fra kirtlerne). Sammentrækningerne af sandrottetyktarm kan således anvendes som et kriterium for, at den omhandlede faktor i midlet, der har frugtbarhedsfremmende egenskaber, er til stede i 1 ipidekstrakten fra kirtlerne.

35 Faktoren har positiv ni nhydr i nreakt i on, hvilket viser, at den indeholder aminogrupper. Prøver under anvendelse af røntgenstrålespredningsanalyse (KEVEX) viser tilstedeværelsen af 4

DK 160536 B

svovl (S) i faktoren. Disse to omstændigheder - positiv ninhy-drinreaktion og tilstedeværelse af svovl - viser, at der foreligger ligheder mellem faktoren og 1eucotri ener. Imidlertid sammentrækker leucotriener ikke sandrottetyktarm. På den anden 5 side sammentrækker de kraftigt uterusmuskulaturen, hvilket midlet også gør.

Gaskromatografisk og massespektrometrisk analyse viser en kompleks blanding, hvor imidlertid visse fragmenter viser nærvæ-10 relse af neurotransmitterlignende stoffer med sådan en molekylvægt, at der ved massespektrometrisk analyse ses værdier på mellem 200 og 1000 m/e (dvs. masse/ladning).

NMR (kernemagnetisk resonans) af en fraktion med høj biologisk 15 aktivitet har vist alle prostaglandiniignende stoffers egenskaber, såsom: lang molekylekæde, tilstedeværelse af fedtsyrer og en endestillet CH3~gruppe.

Midlet ifølge opfindelsen er fremstillet ved metoder, der er 20 konventionelle for ekstraktion af prostaglandiner. Kirtlerne kan således først befris fra proteiner, dvs. ved ethanoleks-traktion og derefter ekstraheres remanensen ved en sur pH-vær-di med diethylether, hvilket opløser lipider. Kirtlerne kan også ekstraheres direkte i et surt miljø, en eller flere gan-25 ge, med et opløsningsmiddel, og navnlig med et lipidopløs- ningsmiddel, såsom ethylacetat, isopropanol, methanol, acetone, chloroform og blandinger deraf, såsom chloroform/methanol i rumfangsforholdet 2:1; ethylacetat i blanding med isopropa-nol, methanol, acetone i varierende rumfangsprocenter med 30 vand, eller de ovennævnte 1 ipidopløsningsmidler, fortrinsvis methanol eller ethylacetat/methanol i rumfangsforholdet 3:1 og med pH indstillet med en puffer til pH 3,5-5, fortrinsvis til 4,5 med 0,1 M ka1 iumhydrogenphthalat.

35 Vandet fjernes derpå på en konventionel måde, f.eks. ved frysetørring. Ekstrakten kan også henstilles natten over i køleskab ved en temperatur under 0°C, og de dannede iskrystaller

DK 160536 B

s filtreres fra ved lave temperaturer under OeC. Arbejdet udføres hens igtsmæsisgt i et nitrogenmiljø for at skærme mod atmosfærisk oxygens oxiderende virkninger. Prøven bliver derpå om ønsket fordampet på et vandbad (40eC), fortrinsvis i en ni-5 trogengasatmosfære. Denne prøve kan anvendes som det erektionsfremmende middel ifølge opfindelsen. Prøven opløses om ønsket i få milliliter af det ovennævnte 1 ipidopløsningsmiddel, fortrinsvis i ethylacetat, og opbevares i et nitrogenmiljø ved -20°C.

10

Prøven kan derefter behandles i overensstemmelse med kendte metoder, der er konventionelle ved separation af prostaglan-diner og de fraktioner, der sammentrækker sandrottetyktarm, kan udvindes. Separationen kan f.eks. gennemføres ved kro-matografi på silicagel, fortrinsvis ved såkaldt tørkolonne-kromatografi under eluering med blandinger af ethylacetat, isooctan, ethanol, vand, eddikesyre, chloroform, isopropa-nol og myresyre, fortrinsvis med ethylacetat/isooctan/etha-nol/eddikesyre/vand (i rumfangsforholdet 35:10:3:0,1:0,1) 20 eller med chloroform/isopropanol/ethanol/myresyre (i rumfangsforholdet 45:5:0,5:0,3). De respektive fraktioner kan derefter elueres ud med blandinger af chloroform og methanol, fortrinsvis i et rumfangsforhold på 1:1.

25 Fraktionerne kan også separeres på silicagelplader (TLC) eller ved søjlekromatografi med det samme eller et modificeret opløsningsmiddelsystem. De fraktioner, der sammentrækker sandrottetyktarm udvindes og lagres ved -20°C til yderligere analyse. Disse fraktioner kan anvendes som midlet 30 ifølge opfindelsen, fortrinsvis efter inddampning til tørhed.

De kan også renses yderligere ved kromatografi, fortrinsvis efter først at være inddampet til tørhed. Fraktionerne kan derefter renses ved kromatografi, fortrinsvis på silicagel, f.eks. ved højtryksvæskekromatografi under eluering med 35 blandinger af phosphorsyre, acetonitril, methanol, fortrinsvis med phosphorsyre/acetonitril/methanol i forholdet 40:12:48.

Opfindelsen skal nu beskrives mere detaljeret under henvis ning til tegningen, på hvilken 6

DK 160536 B

fig. 1 illustrerer en foretrukket fremgangsmåde til frem-5 stilling af midlet ifølge eksempel If fig. 2 viser UV-adsorptionen som funktion af e lue rings rum-? fanget ved højtryksvæskekromatografering af prostaglandin-standarder, 10

Fig. 3-5 illustrerer UV-adsorptionen som funktion af elue-ringsrumfanget ved højtryksvæskekromatografering af henholdsvis fraktionerne a^, a,- og ag vundet ved kromatograferingen på "Silica Noelin DCC" i eksempel 1.

15

Eksempler på en foretrukket fremgangsmåde til fremstillingen ifølge opfindelsen er givet i det følgende (jf. også oversigten på fig. 1).

20

Eksempel 1

Isolation 25 Faktoren isoleres fra kirtlerne på følgende måde: De cowperske kirtler fjernes fra nyligt afdøde forplantningsdygtige hanner. Kirtlerne fryses derefter øjeblikkeligt ned til en temperatur på -20°C. De bartholinske kirtler isoleres fra nyligt afdøde forplantningsdygtige hunner, og kirtlerne blev øjeblikkeligt 30 frosset ned til -20eC.

Ekstraktion

Lipidekstrakten blev ekstraheret fra kirtlerne i overensstem-35 melse med følgende proces: 23,5 g cowperske kirtler og 16,1 g bartholinske kirtler findeltes og homogeniseredes hver for sig med en "U1traturrax" i henholdsvis 60 ml og 20 ml ethylacetat/ 7

DK 160536 B

methanol i rumfangsforholdet 3:1. pH indstilledes med 0,1 M kaliumhydrogenphthalat til 4,5.

Lipidekstrakterne fik lov til at stå natten over i køleskab og 5 vandkrystallerne filtreredes derefter fra ved en temperatur på under 0eC. Derefter koncentreredes prøverne ved inddampning i et vandbad (40°C) i et nitrogenmiljø. Herefter vandtes der 0,43 g fra de cowperske kirtler og 0,15 g fra de bartholinske kirtler. Prøverne lagredes derpå ved en temperatur på -20°C i 10 en nitrogenatmosfære.

Separation og rensning

Den biologiske faktor separeredes ved hjælp af en modificeret 15 metode til tørsøj1ekromatografi som på vellykket måde adskiller de biologiske aktive lipider fra de øvrige stoffer i ekstrakten. Der blev anvendt en søjle omfattende 10 teflonringe med en højde på 2 cm og en indre diameter på 2,5 cm, tæt pakket i et rør. Hver ring svarede til en fraktion, som udstrakte 20 sig mellem to efter hinanden følgende decimale (Rf-)-værdier. Søjlen fyldtes under vibrering med aktiveret silikagel. (Silica Woelm DCC, en særlig silikagel til tør søjlekromatografi (DCC) fremstillet af Woelm AG, Tyskland). Hver af de førnævnte prøver på henholdsvis 0,43 g og 0,15 g indførtes for sig 25 selv i en sådan søjle og elueredes i en opløsningsmiddel bl ånding af chloroform/isopropanol/ethanol/myresyre i rumfangsforholdet 45:5:0,5:0,3.

Tilførslen af opløsningsmiddel holdtes konstant ved hjælp af 30 udløbet fra en skilletragt anbragt 1-2 cm over prøven. Opløsningsmiddelfrontens position op til søjlens bund blev angivet med et første akustisk advarselssignal fremkaldt ved hjælp af en en elektrisk føler. Afslutningspunktet blev angivet med et andet signal. En skruehætte på den øverste ende af røret blev 35 derpå fjernet, således at den indvendigt værende delte teflonkolonne kunne skubbes aksialt opad ved hjælp af et stempel. Teflonringene blev let adskilt fra hinanden, en af gangen,

DK 160536 B

s med hurtige skærende bevægelser. Til sidst blev hver ring monteret i 10 specielt arrangerede teflonsøjler til samtidig elu-ering. De resulterende fraktioner elueredes med nogle milliliter chloroform/methanol i rumfangsforholdet 1:1 og den bio-5 logiske aktivitet afprøvedes på sandrottetyktarm. Fraktionerne 4, 5 og 6 (ringene 4, 5 og 6 talt fra toppen betegnes i det følgende alfa-4, alfa-5 og alfa-6) viste sig at sammentrække sandrottetyktarm og havde de egenskaber, der er vist i forsøg 1-7. Dette gjaldt for begge de førnævnte fraktioner fra hen-10 holdesvis de cowperske og de bartholinske kirtler. Fraktionerne inddampedes til tørhed inden for et nitrogengasmi1jø på et vandbad (40°C) og rensedes ifølge det følgende, selv om dette rensningstrin er valgfrit.

1 R

Højtryksvæskekromatografi - (HPLC)-analyse

Fraktionerne alfa-4, alfa-5 og alfa-6 isoleret fra de respektive kirtler analyseredes ved højtryksvæskekromatografi, der her betegnes som HPLC. Separation gennemførtes o n på en højtryks 5 pm omvendt-fase-kolonne. Der anvendtes et system omfattende en "Consta Metric - 111-HPLC-pumpe" (Lab. Data Control) og en "Consta Metric Spectromonitor III" (LDC) variabel bølgelængdedetektor. Detektoren kobledes til en "Rec-2-recorder" (Pharmacia) og en integrator 25 (HP 3888 A). Kolonnesystemet omfattede en 49 x 4,6 mm LD forkolonne pakket med 40 pm partikelformet omvendt-fase-materiale CPelliguar LC-18") og en 250 x 4,6 LD, "Supelco-sil LC-18" analysekolonne pakket med 5 pm kugleformede partikler.

30

Prostaglandiner elueret fra HPLC-systemet påvistes ved adsorption i ultraviolet lys. Uderivatiserede prostaglandiner påvistes ved 199,5 nm. De fra henholdsvis de cowperske kirtler og de bartholinske kirtler ved tørsøjlekroma-tografi vundne og til tørhed inddampede fraktioner alfa-4, alfa-5 og alfa-6 opløstes hver i 2 ml absolut ethanol.

9

DK 160536 B

Fra hver af disse 2 ml prøver blev der udtaget 20 μΐ. Af de cowperske og bartholinske kirtler blev 5 sådanne 20 μΐ prøver behandlet i kolonnen for hver af fraktionerne alfa-4, alfa-5 og alfa-6. Et trekomponent-elueringsmiddel omfattende phos-phorsyre (o,l M), acetonitril og methanol i forholdet 40:12: 48 anvendes til at adskille fraktionerne på kolonnen. Prøver blev derpå udtaget systematisk fra kolonnen og analyseret med hensyn til sammentrækning af sandrottetyktarm. Fraktionerne med retentionstider (RT) 3-6 og 12-15 fra fraktion alfa-4, 10 fraktionerne med retentionstid 3-^6 og 12-15 fra alfa-5 og dem med retentionstid 8-10 fra alfa-6 sås ifølge observationer af sammentrække sandrottetyktarm. Dette gælder for alfa-4, alfa-5 og alfa-6 fra såvel de cowperske som de bartholinske kirtler.

15

Da der blev foretaget sammenligning med et antal prostaglan-

dinstandarder, såsom PGE , PGI„ og PGE. og også PGF„ og PGA

Δ Δ X 2, O t 2 kunne ingen af disse prostaglandiner iagttages i blandingen (jf. fig. 2, der illustrerer UV-adsorption ved 199,5 nm 2 0 som funktion af elueringsrumfang og retentionstid ved HPLC af disse standarder/med figurerne 3, 4 og 5, der viser den samme kurve for fraktionerne a4, a5, og ag fra DCC.).

Den biologiske aktivitet viste sig imidlertid at være kompleks, når fraktioneringen gennemførtes med HPLC. Den 25 primære biologiske aktivitet fandtes i HPLC-fraktioner alfa-4:12-15, alfa-5:12-15 og alfa-6:8-10.

Gaskromatografisk-massespektometrisk-analyse

Denne analyse viste en kompleks blanding, hvor imidlertid visse fragmenter blev iagttaget, som viser nærværelse af neurotransmitterlignende stoffer med en molekylvægt på mellem 200-1000 m/e (alfa-6:8-10).

35 NMR-analyse NMR (kernemagnetisk resonans) anvendes til at undersøge fraktion alfa-5:12-15, der er en fraktion med høj biolo- ! gisk aktivitet. Den viste alle prostaglandinlignende stof-·

DK 160536 B

ίο fers egenskaber, såsom en lang kæde, nærværelsen af fedtsyrer og terminal CH^-gruppe.

Eksempel 2 5 50 g cowperske kirtler taget fra afdøde mænd homogeniseredes med 50 ml methanol i "Ultraturrax". pH indstilledes til 4,5 med 0,1·Μ kaliumhydrogenphosphat. Ekstrakten henstod natten over i køleskab, hvorefter iskrystaller filtreredes 10 fra ved en temperatur på under 0°C. Derefter koncentreredes prøven ved inddampning til tørhed i en nitrogenatmosfære på et vandbad.

Nedenfor er angivet et antal forsøg, der belyser den biolo-15 9iske virkning af faktoren i midlet ifølge opfindelsen.

Forsøg 1

Faktorens virkning på muskel-collagen-trabikuler i men-neskers og dyrs (tyr) corpora cavernosa samt virkning på penisarteriers glatte muskler.

Erektionen af penis hos mænd og hanpattedyr skyldes en overfyldning af erektilvævene i penis, dvs. corpora cavernosa (svulmelegemer). Disse indeholder et svampelignende væv, der omfatter collagenvævbundter og glatmuskulatur-filamenter, som danner et omfattende net, det såkaldte trabecula corpora cavernosa. De dannede hulrum kan hurtigt udvides og trækkes sammen, dvs. fyldes og tømmes for blod.

Ved en erektion afspændes den glatte muskulatur i corpora 30 cavernosa. Desuden forsyner arterierne corpora cavernosa med blod, dvs. penisarterieme udvides. Erektion af penis afsluttes, dvs. penis afslappes på en tilsvarende måde ved en tilsvarende sammentrækning af muskelfilamenterne i corpora cavernosa og penisarterierne.

35

Præparering:

Et- antal handyr blev aflivet og hele penis blev fra hver fjernet og transporteret til laboratoriet i en puffer- 11

DK 160536 B

opløsning (Krebs's opløsning) ved en temperatur på +4°C.

Dele af corpora cavernosa fra væddere blev fjernet på en lignende måde. Lange strimler målende ca. 1,5 cm i længden og 4 cm i bredden blev skåret ud fra den centrale del ^ af muskulaturen i trabecula-netværket. På lignende måde blev en strimmel med længden 1,5 cm og en bredde på ca. 3 mm udskåret fra penisarteriens muskulatur. Dissektionen blev tilendebragt inden for 1-2 timer efter aflivningen af dyret. Strimlerne holdtes i Krebs-opløsningen i højest 1 kalender-^ dag og fremviste intet aktivitetstab i løbet af denne peri ode.

Bioanalyse: Virkningen af faktoren på isolerede muskelfilamenter undersøgtes ved hjælp af en "Grass Force Deplacement 1 c

Transducer" koblet til en "Grass-polygraph". PGE_ og PGF0

£. A (X

anvendtes som standarder under disse forsøg. Ved at undgå for kraftig tension i fastgørelsesorganerne i det biologiske prøvningssystem var det muligt at opretholde spontan motilitet i vævet. Faktoren vundet fra cowperske kirtler 2 0 dryppedes på de isolerede muskelfibre, hvorved der således vandtes en klar afslapning af musklerne ved trabecula-net-værket fra penis. Den samme reaktion - omend svagere - vandtes med fraktionen udvundet fra de bartholinske kirtler. PGE2 i en koncentration på 50 ng/ml gav en lignende virkning, selv

2 K

om den var yderst svag, mens PGF2a i tilsvarende koncentration i stedet gav en forøget muskeltonus.

Faktoren fra de cowperske kirtler dryppedes på den i den biologiske analysesystem nedhængte penisarterie på en måde, 30 ligesom for de ovennævnte muskelfibre. Der blev iagttaget en klar afslapning af muskulaturen, når faktoren dryppedes på penisarterien. På den anden side gav PGF2a / koncentration 50 ng/ml,og PGE2 i den samme koncentration en kraftig sammentrækning af penisarterien. Dette synes klart at vise, 35 at mens de anvendte to typer prostaglandiner primært mod virker erektion, fremmer lipidfraktionerne vundet fra kirtlerne erektionen i kraftigt omfang.

12

DK 160536 B

Forsøg 2

Faktoren vundet fra kirtlerne sammentrækker urethra^muskulaturen hos mænd og hanpattedyr. Urethra omfatter en slim-5 hindekanal, hvoraf størstedelen er omsluttet af et lag musk ler med en indre i længderetningen udstrakt muskulatur og ydre tværgående lag. Det er bedst udviklet i den bageste del af urethra. I den forreste del af urethra findes der skråt forløbende muskelbundter. Når der arbejdes med 10 prostata fra det hanlige genitialsystem, fjernes der fra

urethra inden for prostatasektionen en del af urethra, som præpareres og opbevares i en Krebs-puffer. Ved den bioanalytiske prøve blev de præparerede muskelstrimler monteret i det ovenfor beskrevne bioanalysesystem med ekstrem 15 følsomhed. En blanding af O2 (95%) og CC^ (5%) ved 37°C

sattes til organbadet. Faktoren vundet fra de cowperske kirtler dryppedes på muskelstrimlerne, hvorpå der blev iagttaget en udtalt sammentrækning af urethramuskulaturen.

Den samme virkning, skønt mindre udtalt, blev opnået med 20 faktoren vundet fra de bartholinske kirtler. Begge fakto rerne var ekstraheret fra menneskekirtler. Resultaterne er siden blevet bekræftet med tyreurethra\ pGF2a Uav en liU“ nende sammentrækning af urethramuskulatur, mens PGE2 afslappede muskulaturen. Sammentrækning af urethra muskula-25 turen, når den udsættes for faktoren må fremme ejakulations- processen. Det er rigtigt, at denne metode til at måle denne funktion er indirekte, men for tiden findes der ingen metoder, hvor funktionen kan måles direkte på mennesker, 3Q Forsøg 3

Faktoren fremmer spermatozoernes motilitet (bevægelighed). Det er kendt, at prostaglandiner af type E ikke har nogen virkning på spermatozoernes bevægelighed. Prostaglandin 3 g F2a har muligvis en retarderende virkning på spermatozoers motilitet. Der er foretaget prøver til undersøgelse af faktoren, hvor spermatozoernes motilitet blev undersøgt under et mikroskop. Ved disse forsøg blev henholdsvis de bartholinske og de cowperske kirtler opløst i saltvand og sat til en opløsning indeholdende aktive spermatozoer.

DK 160536 B

O

13

Det kunne vises, at faktoren vundet fra de bartholinske kirtler skabte en særligt aktiv forstærkning af spermatozoernes bevægelighed. Faktoren vundet fra de cowperske kirtler gav en lignende , men mindre udtalt virkning ved 5 den samme koncentration. Saltvandet havde ingen virkning.

Spermatozoerne fra mennesker, får og tyre tømmes ved ejakulation ind i vagina og er styret til at nå ægcellen ved hjælp af deres egen bevægelighed. Der er således gode grunde til at antage, at faktoren letter den aktive van-10 dring af spermatozoerne gennem vagina og livmoderhulen.

Forsøg 4

Faktoren fremmer spermatozoernes gennemtrængning gennem 15 frisk æggehvide. Et hønseæg blev knust og æggehviden blev anbragt på et objektglas til et mikroskop. Derpå indførtes et kapillarrør i æggehviden og æggehviden blev udtrukket.

En spermatozoprøve blev anbragt på hver af to urglas, det ene med faktoren tilført dertil og det andet uden faktor.

20 Ved de respektive prøveprocedurer anvendtes faktoren vun det fra både de bartholinske kirtler og de cowperske kirtler fra mennesker. Reagensglassene, der indeholdt æggehvide, blev anbragt i spermatozoprøverne og fikseret med syntetisk modelervoks (modeleringsler). Kapillarrørene blev anbragt 25 lodret, og urglassene, med capillarrørene placeret derpå, blev derpå anbragt i et varmeskab. Spermatozoernes evne til at vandre gennem æggehviden undersøgtes derpå under et mikroskop med et tidsmellemrum på 60, 120 og 180 minutter. Det kunne tydeligt ses, at faktoren vundet fra de bartholinske 30 kirtler signifikant øgede spermatozoernes evne til at pas sere gennem æggehvidej faktoren vundet fra de cowperske kirtler havde en lignende, men svagere virkning.

Spermatozoernes evne til at trænge gennem proteinet i æg-35 cellerne er af største betydning med hensyn til befrugtning.

O

14 DK 160536 B

Forsøg 5

Faktoren koagulerer sædvæske (den væske, hvori spermatozoer er suspenderet). Fibrinolytiske enzymer i sædvæsken giver 5 fuldstændig eller partiel flydendegørelse af koagulerede sper^ matozoer. Det er kendt, at den samlede ekstrakt af sekretet fra de cowperske kirtler vundet fra tyre og fra væddere koagulerer sædvæske. Udtrykt funktionelt danner flydende sædvæske en koaguleringsklump, som udgør et vigtigt træk ved ejaku^· 10 lationsprocessen. Det forhindrer også tilbageløb af sædvæske under ejakulationsfasen og fremmer således dyrenes frugtbarhed og er især fremmende hos væddere.

Faktorens evne til at koagulere spermatozoer belyses ved hjælp 15 af følgende: 0,5 ml flydendegjorte spermatozo er ( i en let flydedygtig tilstand) indførtes i et reagensglas ved 37°C. 0,5 ml af faktoren (vundet fra de cowperske kirtler) opløstes i saltvand og sattes til de flydende sper-r matozoer. Spermatozoerne viste sig at koagulere hurtigt til 20 dannelse af en fast koagulat. Dette koagulat sås at vende tilbage til den flydende form efter ca. 10 minutter. Tilsætning af faktoren vundet fra de bartholinske kirtler gav en lignende, men svagere koagulation.

25 Forsøg 6

Faktoren sammentrækker den glatte muskulatur i det uterotuba-le forbindelsespunkt hos kvinder (UTJ). Når faktoren anbringes på glat muskulatur fra UTJ opnås en sammensat reaktion.

30 Dette skyldes, at det kvindelige uterotubale forbindelses punkt indeholder tre forskellige muskellag, som giver en specifik reaktion på lipide mæglere inden for prostaglandin-familien. Muskelvæv isoleredes fra UTJ taget fra sunde forplantningsdygtige kvinder, der var underkastet sterilisar 35 tion eller hysterektomi. Cirkulære og langsgående muskelfi lamenter indførtes i en bioanalyseenhed med en Krebs bicar- 15

DK 160536 B

bonatpuffer. På normal måde tilsattes en blanding af oxygen og carbondioxid og prøverne gennemførtes ved en temperatur på 37°C. Faktoren viste sig at skabe sammentrækning af længdemuskulaturen og svækkelse af den cirkulære musku-5 latur.

Forsøg 7

Faktoren sammentrækker vaginalmuskulaturen. Glat muskulatur 10 isoleret fra køers vaginalvægge arrangeredes i den bioana lytiske enhed. Faktoren vundet fra de cowperske kirtler ekstraheret fra tyre fremkaldte en udtalt sammentrækning af muskelstrimler. Det er velkendt, at penisarterierne er udvidet ved erektion, at der tilføres mere blod til corpora 15 cavernosa, som derved fyldes og en erektion finder sted.

Ved ejakulatiansprocessen trækkes muskulaturen omkring urethra sammen i flere autonome sammentrækninger og udsender sæden fra penis med højt tryk. De spermatozoer, der er til stede 20 i åen ejakulerede sæd afsættes i vagina, og bevæger sig enten ved hjælp af aktiv mobilitet eller passiv vandring til livmoderhulen, hvorfra spermatozoerne vandrer yderligere for at nå ægcellen, med efterfølgende indtrængning deri.

Forsøg 8 - erektionsprøve 25

Aber (marekatte) fra 3 til 4 år gamle og vejende 4,5-5,0 kg blev bragt til at sove med "Ketalar"® (et hurtigt virkende anæstetisk middel, der indeholder ketaminhydrochlorid i en mængde på 50 mg/ml, og som leveres af Park-Davis, USA) i en 30 dosis på 1,8 ml + eventuelt yderligere 0,5 ml. De respektive abers penis blev holdt tilbage ved hjælp af et aflangt sugeapparat.

Følgende stoffer indsprøjtedes gennem tunica albuginea i corp carvarnosum (glat muskulatur) ved hjælp af sprøjte med 26 G 35 spids, den indsprøjtede opløsning havde en temperatur på 30°C.

1, 0,5 ml fysiologisk natriumchlorid (NaCl), hvilket ikke gav nogen reaktion; j i i

DK 160536 B

O

16 2. 0,5 ml (15 mg) papaverin, som fremhjalp en erektion på få minutter; erektionen opretholdtes i 1·=-2 timer; 3. 0,5 ml (2 mg) phenoxybenzamin, som gav samme reaktion som papaverin, måske med længere varighed; 5 4. Et frysetørret stof vundet ifølge eksempel 2 opløstes i 0,5 ml fysiologisk NaCl efter blæsning i nitrogen. 3 aber blev afprøvet. Der blev iattaget erektion og denne varede i 2-4 timer for 2 dyr og op til 24 timer for 1 dyr.

10 Det har været muligt at vise, at faktoren vundet fra kirt^ lerne fra mennesker og pattedyr (de cowperske og de bartholinske kirtler) klart fremmer såvel erektion og ejakulation og befrugtning af ægcellen ved: - udvidelse af muskulaturen i corpora cavernosa i penis; 15 - udvidelse af penisarteriens muskulatur; sammentrækning af urethramuskulaturen; sammentrækning af vaginalmuskulaturen; - sammentrækning af de langsgående bundter i det uterotuba-r le forbindelsessted (forbindelsen mellem livmoder og ægleder\ 20 - forstærkning af spermatozoernes aktive bevægelighed; forøgelse af spermatozoernes evne til at trænge gennem æggehvide (protein); og - koagulering af sædvæske.

25 Taget sammen med den kendte kendsgerning., at ekstrakten fra kirtlerne tjener til at smøre den urogenitale slimhinde er der herved opnået en indikation for, at faktoren har en virkelig betydning til fremme af erektion, ejakulation og sper·? matozoernes mobilitet og deres evne til at trænge gennem 30 protein. Faktoren kan således anvendes som et frugtbarheds·*· fremmende stof.

Den måde, hvorpå faktoren udøver sin virkning på en situa-r tion in vivo kan illustreres ved at gå ud fra ansøgernes pi-35 onerarbejde med elektronmikroskopundersøgelser af kirtlerne, især de cowperske kirtler (L. Hellgrén, E*Mylius og J.Vincent;

DK 160536 B

O

17

The ultra-structure of the human bulbo-urethral giand.

J. Submicrose Cytol 14 (4), 683-689, 1982). Faktoren kan opfattes som havende enten en direkte eller en indirekte virkning eller en kombination af begge dele. Den direkte 5 virkning kan opfattes som virkende på spermatozoerne i over ensstemmelse med forsøgene 1-7. Faktorens indirekte ("hormonale") virkning på muskulaturen i penisarterien, vagina, urethra og æggeleder eller de fallopiske rør kan opnås ved blodcirkulation. At det sandsynligvis forholder sig på denne 10 måde underbygges af ansøgernes elektronmikrosopiske opdagelse af små sekretionskorn, som er til stede i kirtlernes blodkar i de cowperske og bartholinske kirtler, idet indholdet af de små korn sandsynligvis udtømmes direkte i blodkredsløbet.

15 Faktoren kan anvendes som et frugtbarhedsfremmende og erek tionsfremmende middel. Disse midler kan bestå af de lipid-fraktioner fra de cowperske og bartholinske kirtler, som vil sammentrække sandrottetyktarm, f.eks. den første urene samlede lipidekstrakt og navnlig de aktive fraktioner elueret 20 ved tørsøjlekromatografi og højtryksvæskekromatografi i eksempel 1. Midlerne kan også være til stede i præparater sammen med konventionelle fortyndingsmidler. Præparaterne kan være i form af en injicerbare væsker, sprøjtepræparater, tabletter, suspensioner, opløsninger, sirupper, suppositorier 25 og kapsler. Prøveopløsningerne inddampes fortrinsvis til tørhed og opløses i fysiologisk kogsalt og indsprøjtes.

30 35 j i

Claims (5)

1. Erektions- og frugtbarhedsfremmende middel, kende-5 tegnet ved, at det er fremstillet ud fra de cowperske- og/eller de bartholinske kirtler fra pattedyr, indbefattet mennesker, ved at kirtlerne findeles og ekstraheres, efter at de først eventuelt er befriet fra proteiner, med 1ipidopløsen-de middel ved sur pH-værdi, hvorefter vand fjernes, opløs-10 ningsmidlet afdampes og remanensen fraktioneres kromatografisk på kendt måde, og at de fraktioner, som sammentrækker sandrot-tetyktarm, opsamles og eventuelt yderligere renses ved kromatografiske metoder, hvor de opsamlede fraktioner udgør det erektions- og fertilitetsfremmende middel, eventuelt sammen 15 med sædvanlige fortyndingsmidler.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et erektions- og frugt-barhedsfremmende middel ifølge krav 1 ud fra de cowperske- og/ eller de bartholinske kirtler fra pattedyr indbefattet menne- 20 sker, kendetegnet ved, at kirtlerne findeles og ekstraheres, efter at de først eventuelt er befriet fra proteiner, med 1ipidopløsende middel ved sur pH-værdi, hvorefter vandet fjernes, opløsningsmidlet afdampes og remanensen fraktioneres kromatografisk på kendt måde, hvorpå de fraktioner, 25 som konstateres at sammentrække sandrottetyktarm opsamles og eventuelt yderligere renses ved kromatografiske metoder.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at ekstraktionen med 1ipidopløsende middel gennemføres med ethyl- 30 acetat, isopropanol, methanol, acetone, acetone/vand-blandin-ger, chloroform eller blandinger deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den kromatografiske fraktionering gennemføres på silikagel un- 35 der anvendelse af ethylacetat, isooctan, ethanol, eddikesyre og vand i rumfangsforholdet 35:10:3:0,1:0,1, eller chloroform, isopropanol, ethanol og myresyre i rumfangsforholdet 45:5:0,5: 0,3, som elueringsmiddel. 19. DK 160536 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den yderligere rensning gennemføres ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) med en blanding af phosphorsyre, acetonitril og methanol i rumfangsforholdet 40:12:48 som elueringsmiddel. 5 10 15 20 25 30 35