DK160945B

DK160945B - Humant interferon-gamma-polypeptid og fremgangsmaade til fremstilling deraf, rekombinant plasmid omfattende et dna-fragment, som koder for peptidet, og mikroorganisme transformeret med plasmidet

Info

Publication number: DK160945B
Application number: DK155184A
Authority: DK
Inventors: Seiga Itoh; Tatsunari Nishi; Tadatsugu Taniguchi; Haruo Sugano
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk; Japan Found Cancer
Priority date: 1983-03-14
Filing date: 1984-03-13
Publication date: 1991-05-06
Also published as: AU2561984A; JPS59167596A; JPH05320200A; NO169020C; DK155184D0; ES8506194A1; JPH0740925B2; DK155184A; ES530597A0; NO840952L; NO169020B; EP0121157B1; EP0121157A1; DK160945C

Description

DK 160945 B

i

Opfindelsen angår et. hidtil ukendt humant interferon-V-polypeptid og en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt et rekombinant plasmid omfattende et DNA-fragment, som koder for peptidet, og en mikroorganisme, som er 5 transformeret med plasmidet.

Interferoner (i det følgende betegnet med IFN) kan efter den nuværende viden klassificeres i tre store grupper, IFN-a, IFN-β og IFN-}(. IFN-a produceres hovedsageligt fra leukocyter, IFN-β fra fibroblaster og IFN-^ fra 10 T-lymphocyter. Disse interferoner er blevet noteret som biologisk aktive stoffer med anti-vi rus-aktivitet, aktiverende aktiviteter på naturlige dræberceller og makrofager, anti-tumor-aktivitet og lignende. Imidlertid kan konventionelle metoder til opnåelse af interferoner 15 ved isolering fra leukocyter og dyrkede celler ikke give dem i tilstrækkelig grad og tilstrækkelig renhed.

Rekombinant-DNA-teknologi er nu blevet udviklet i en sådan grad, at masseproduktion af stoffer, som kun secerneres i lille mængde i celler hos højere dyr, og 20 som er vanskelige at isolere, såsom IFN, er blevet mu lig ved anvendelse af mikroorganismer. F.eks. blev mRNA'er for henholdsvis IFN-β og IFN-a isoleret fra celler, og cDNA komplementært til mRNA'en blev syntetiseret enzymatisk, indsat i et egnet plasmid som en dobbelt-25 strenget DNA og klonet i Escherichia col i TTaniguchi, et al.: Proc. Jap. Acad., 55(B), 464 - 469 (1979); Na-gata, et al.: Nature 284, 316 - 320 (1980)].

Hvad angår IF N - y har der været, en rapport om, at det har en stærkere ce 1 le.inhiberende aktivitet end andre 30 interferoner, baseret på forsøg under anvendelse af dyreceller [B.Y. Rubin and 5.L. Gupta: Proc. Nati. Acad.

Sci., USA, 77, 5928 - 5932 (1980)].

DK 160945 B

2

Gray et al., Nature, bind 295 (1982), side 503-509;

Derynck et al., Nucleic Acids Research, bind 10, nr.

12 (1982), side 3605-3615; og EP offentliggørelsesskrift nr. 77670, offentliggjort d. 27. april 1983, beskriver 5 kloningen af en IFN-lf-DNA i Escherichia coli og bestem melse af dens basesekvens, og Gray et al. anfører, at IFN-i tilskrives et bredt område af biologiske aktiviteter, herunder forstærkning af de antivirale aktiviteter af IFN-α og -β, men først og fremmest som immunoregula-10 torisk middel. I EP offentliggørelsesskriftet beskrives også det udtrykte interferon-^-polypeptid, som omfatter 146 aminosyrerester, hvor aminosyreresten nr. 9 er Lys.

Ifølge den foreliggende opfindelse inkorporeres en hidtil ukendt IFN-)(-DNA, som koder for et hidtil ukendt IFN->f-15 polypeptid, der er forskelligt fra det ovennævnte kendte IFN-1(-polypeptid ved, at aminosyre nr. 9 er Gin i stedet for Lys, i et rekombinant plasmid og udtrykkes i en mikroorganisme, især i Escherichia coli.

Det har vist sig, at aktiviteten af humant interferon-20 C forøges i serum ved 37 °C på grund af indvirkning af enzymer i serum, såsom protease, og at aktivitets-forøgelsen er meget større for IFN-lf-polypeptidet ifølge opfindelsen end for det kendte IFN-V-polypeptid. Dette er en meget stor fordel ved klinisk anvendelse.

25 Opfindelsens formål er således at tilvejebringe et rekom binant plasmid, hvori der er inkoporeret en hidtil ukendt IFN-^ -DNA, en mikroorganisme indeholdende plasmidet, en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt humant IFN-^-polypeptid under anvendelse af mikroor-30 ganismen og det humane IFN-^-polypeptid som sådant.

Det hidtil ukendte polypeptid ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har den aminosyresekvens,

DK 160945 B

3 som er belyst i fig. 3.

Det rekombinante plasmid ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har inkorporeret et DNA-fragment, som koder for et humant interferon-^-polypeptid med 5 den basesekvens, som er belyst i fig. 3, efter en tryp- tophanpromotor.

Mikroorganismen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den indeholder et rekombinant plasmid ifølge opfindelsen.

10 Endelig er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendomme lig ved, at en mikroorganisme transformeret med et rekombinant plasmid, hvori der er inkorporeret et DNA-frag-ment, som koder for humant interferon-f-polypeptid, dyrkes i et næringsmedium, og at det dannede humane 15 interferon-f-polypeptid udvindes fra dyrkningsmediet.

DK 160945B

4

Kort beskrivelse af tegningerne: fig. 1 er et arbejdsdiagram, som belyser konstruktionen af plasmid pGC-7.

Fig. 2 er et arbejdsdiagram, som belyser konstruktionen 5 af plasmid pGKA-2.

Fig. 3 belyser basesekvensen omkring den humane IFN-γ-DNA i plasmid pGKA-2.

Fig. 4 (A) belyser strukturen af plasmid pKYP-1, og (B) belyser strukturen af plasmid pKYP-5.

10 Fig. 5 er et arbejdsdiagram, som belyser konstruktionen af pKYP-5.

Fig. 6 er et arbejdsdiagram, som belyser konstruktionen af pKYP-10.

Fig. 7 (A) er et arbejdsdiagram, som belyser konstruktio-15 nen af pKYP-11, og (B) belyser strukturen af pKYP-12.

Konstruktionen af det rekombinante plasmid udføres på følgende måde.

Som den hidtil ukendte humane IFN-^-DNA anvendtes pIFN-Y-G4, som var klonet af opfinderne. Escherichia coli inde-20 holdende pIFN-y-G4 er blevet deponeret hos the American Type Culture Collection, U.S.A., under accessionsnummeret ATCC 39123.

Basesekvensen af IFN-y-DNA'en i pIFN~Y-G4 blev bestemt ved den metode, som er beskrevet af Maxam and Gilbert 25 [Proc. Natl. Acad. Sci. 74_, 560 (1977)] og er belyst i fig. 3.

5

DK 160945 B

Sammenligning af den humane IFN-ycDNA i pIFNγ'— G4 og den kendte IFN-ycDNA [P.W. Gray, et al.: Nature 29_5, 503 (1982)] afslører følgende: den første base i tripletten, der koder for den 9. aminosyre fra N-termina-5 len i det modne humane IFN-Y-polypeptid, lysin, er i den kendte cDNA adenin [Gray et al.: Nature 295, 503 (1982)]. Da på den anden side den tilsvarende base i pIFNY~G4-cDNA er cytosin, er den 9. aminosyre fra N-terminalen i det humane IFN-Y-polypeptid, som er indkodet 10 i pIFNy-GA-cDNA, glutamin og ikke lysin. Derfor er det klart, at pIFNY~G4 koder for et hidtil ukendt humant IFN-y-polypeptid.

Endvidere har pIFN^-Gi· et Rsal-restriktionssted, da den 25. base er C. Dvs. sekvensen af den 22. til 25.

15 base fra 5'-terminalen af IFNY-DNA'en i pIFNY~G4 er GTAC, og Rsal klipper DNA'en i den position, som er vist ved pilen (GT^AC).

Da ingen af de kendte IFN-y-gener har et Rsal-sted i et DNA-område, der koder for IFN-Y-polypeptid, er det 20 klart, at pIFNY~G4 indeholder en DNA, der koder for et hidtil ukendt humant IFN-Y-polypeptid.

Derfor er rekombinante plasmider konstrueret under anvendelse af pIFNy-G4 alle hidtil ukendte rekombinante plasmider.

25 Som plasmid til at inkorporere IFN-^-DNA kan anvendes ethvert plasmid, blot den deri inkorporerede DNA udtrykkes i Escherichia coli. Fortrinsvis anvendes et plasmid, hvori en fremmed DNA kan indsættes efter en egnet promotor, såsom trp-motoren eller lac-promotoren, og læng-30 den mellem Shine-Dalgarno-sekvensen (i det følgende betegnet som SD-sekvens) og translations-start-stedet er indstillet til f.eks. 6-18 basepar. Foretrukne 6

DK 160945 B

eksempler er pKYP-10, pKYP-11 og pKYP-12, som blev konstrueret af opfinderne [japansk patentansøgning nr.

213193/81 (japansk offentliggørelsesskrift nr. 110600/83)]. Disse udtrykkelsesvektorer fremstillet ved den frem-5 gangsmåde, som er belyst i referenceeksempel 1, indeholder tryptophan-promotorer (i det følgende betegnet som Ptrp).

Det rekombinante plasmid pGC-7 fremstilles ud fra pKYP-11 og pIFNy-G4 som belyst i fig. 1. Dvs. pIFN^-G4 nedbrydes med PvuII og Hindlll, og nedbrydningsproduktet renses 10 ved gelelektroforese på agarose med lav geleringstempe ratur. [L. Wieslander, Analytical Biochemistry 9j3, 305 (1979)]. Det resulterende fragment af IFNy-G4 indsættes i pKYP-11 ved HindiII-BamHI-stedet til opnåelse af pGC-7.

Derefter klippes pGC-7, som belyst i fig. 2 med BstNI 15 og Sall, og IFN-y-DNA renses ved gelelektroforese på agarose med lav geleringstemperatur. IFN-y-DNA'en klones sammen med en syntetisk DNA i Hindlll-Sall-stedet på udtrykkelsesvektoren pKYP-10, der indeholder Ptrp, til opnåelse af det rekombinante plasmid pGKA-2.

20 IFN-y-polypeptidet iføl-ge opfindelsen fremstilles på følgende måde.

Escherichia coli K-12 HB101 [S.N. Cohen, et al.: Proc.

Natl. Acad. Sci., 69_, 2110 (1972)] transformeres med pGKA-2, og en Escherichia coli-stamme indeholdende pGKA-2 25 selekteres fra kolonier, som er resistente over for ampicillin (i det følgende betegnet som Ap ). Escherichia coli-stammen indeholdende pGKA-2 dyrkes i et medium til produktion af IFN-y-polypeptid i mediet.

Som medium kan anvendes enten et syntetisk eller et 30 naturligt medium, blot det er egnet for væksten af Es cherichia coli og produktionen af IFN-y-polypeptid.

7

DK 160945 B

Som carbonkilde kan anvendes glucose, fructose, lactose, glycerol, mannitol, sorbitol, osv.

Som nitrogenkilde kan anvendes NH^Cl, (NH^^SO^, cas-aminosyre, garekstrakt, polypepton, kødekstrakt, bacto-5 trypton, majsstøbevand osv.

Desuden kan der anvendes næringsstoffer, såsom NI^HPO^, Κ2ΗΡ0^, ΚΗ2Ρ0^, NaCl, MgSO^, vitamin og MgCl2·

Dyrkningen udføres ved pH 5,5 - 8,5 og ved 18 - 40 °C med beluftning og omrøring.

10 Efter dyrkning i 5 - 90 timer er det humane IFN-y'-poly-peptid akkumuleret i de dyrkede celler. De opsamlede celler behandles med lysozym, brydes ved gentagen frysning og smeltning og underkastes centrifugering. Den således opnåede supernatante væske underkastes ekstrak-15 tion ifølge en konventionel metode til ekstraktion af polypeptider for at udvinde IFN-y-polypeptidet.

Bestemmelsen af det humane IFN-y udføres ifølge den metode, der er beskrevet af J.A. Armstrong et al.: Appl. Microbiol. 21, 723 - 725 (1971).

20 Nogle specifikke udførelsesformer af opfindelsen bely ses ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Indsætning af human IFN-y-DNA i udtrykkelsesvektoren pKYP-11: 25 6 yug plasmid pIFN-y-G4 [3,6 kilobaser (i det følgende betegnet som kb)] blev opløst i 50 ^,ul af en opløsning indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 8

DK 160945 B

10 mM dithiothreitol og 50 mM NaCl. Derpå tilsattes 12 enheder hver af restriktionsenzymerne PvuII (produkt fra Takara Shuzo Co.; dette gælder alle følgende restriktionsenzymer, med mindre andet er anført) og Hindlll, 5 og nedbrydningsreaktionen udførtes ved 37 °C i 4 timer.

Reaktionsopløsningen blev opvarmet til 65 °C i 7 minutter for at inaktivere enzymerne og blev derpå underkastet rensning ved gelelektroforese på agarose med lav geleringstemperatur til opnåelse af 1,2 yug af et DNA-10 fragment indeholdende human IFN-y-DNA på 1,3 kb.

Separat blev 4 ^ug pKYP-11 opløst i 40 ml af en opløsning indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^» 10 mM dithiothreitol og 50 mM NaCl. Der tilsattes 8 enheder BamHI, og nedbrydningsreaktionen udførtes ved 15 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet til 65 °C i 5 minutter for at inaktivere enzymet. Derefter tilsattes 30 ^uM hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 8 enheder Escherichia coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment, produkt fra New England Biolabs, 1 ^ul). Ud-20 fyldningsreaktionen udførtes ved 15 °C i 1 time, og reaktionsopløsningen blev opvarmet til 68 °C i 15 minutter for at inaktivere DNA-polymerase I. Der tilsattes 10 enheder Hindlll, og nedbrydningsreaktionen udførtes ved 37 °C i 3 timer, efterfulgt af opvarmning til 65 25 "C i 5 minutter for at inaktivere Hindlll-enzymet. Ned brydningsopløsningen af plasmidet pKYP-11 blev underkastet rensning ved gelelektroforese på agarose med lav geleringstemperatur til opnåelse af omkring 2,5 ^ug af et DNA-fragment på omkring 4,7 kb indeholdende 30 Ptrp.

Derpå blev 0,5 ^ug af DNA-fragmentet på 1,3 kb indeholdende human IFN-Y-DNA og 1,0 ^ug af DNA-fragmentet på omkring 4,7 kb indeholdende Ptrp, som var opnået fra plasmidet pKYP-11, opløst i 20 ^ul af en opløsning in-

DK 160945B

9 deholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol og 500 ^uM ATP, og der tilsattes 4 enheder T4-DNA-ligase (produkt fra New England Biolabs). Ligeringsreaktionen udførtes ved 4 DC i 18 timer, og 5 Escherichia coli HB101 blev transformeret med den opnåe de rekombinant-plasmid-blanding ved konventionel teknik til opnåelse af en Ap -koloni. Et plasmid, pGC-7 vist i fig. 1, blev udskilt fra dyrkningsvæsken. Strukturen af pGC-7 blev bekræftet ved nedbrydning med Hindlll, 10 BamHI, Hpal, Sall, EcaRI og Clal og agarosegelelektro- forese. En Escherichia coli-stamme indeholdende pGC-7 er blevet deponeret hos the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (i det følgende betegnet som FERM) som Escherichia coli 15 IGC-7 (FERM P-6814), (FERM BP-497).

EKSEMPEL 2

Konstruktion af det rekombinante plasmid pGKA-2: 6 ^ug af pGC-7-DNA'en opnået i eksempel 1 blev opløst i 50 yul af en opløsning indeholdende 20 mM "Tris"-HCl 20 (pH 7,5), 10 mM MgCl^, 10 mM dithiothreitol og 10 mM NaCl, og der tilsattes 12 enheder BstNI (produkt fra New England Biolabs). Reaktionen udførtes ved 60 °C i 3 timer. Derpå tilsattes 150 mM NaCl og 8 enheder Sall, og nedbrydningsreaktionen udførtes ved 37 °C i 25 3 timer. Reaktionsopløsningen blev igen opvarmet til 65 °C i 5 minutter for at inaktivere Sall-enzymet og blev underkastet rensning ved gelelektroforese på agarose med lav geleringstemperatur til opnåelse af omkring 0,8 yug af et DNA-fragment på omkring 1125 basepar (i 30 det følgende betegnet som bp) indeholdende en stor portion af den humane IFN-y-DNA.

Separat blev 3 ^ug pKYP-10 opløst i 40 yul af en opløs- 10

DK 160945 B

ning indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol og 100 mM NaCl. Der tilsattes 6 enheder hver af Hindlll og Sall, og nedbrydningsreaktionen udførtes ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen 5 blev opvarmet til 65 DC i 5 minutter for at inaktivere

HindiII og Sall og blev underkastet rensning ved gelelek-troforese på agarose med lav geleringstemperatur til opnåelse af omkring 1,8 ^-ug af et DNA-fragment på omkring 4,1 kb indeholdende Ptrp.

1Q Den N-terminale aminosyre i det modne humane IFN-X-po-lypeptid er cystein (Cys). For at udtrykke modent IFN-][-DNA er det nødvendigt at tilvejebringe en startcodon (ATG) lige før den 5'-terminale codon TGT (Cys) og yderligere at indstille længden mellem SD-sekvensen og ATG 15 til en passende længde på 6 - 18 bp. Derfor syntetiseredes den følgende DNA-linker.

Hind·1 XI jjetCy sTvrCy s BstNI

51 A G C T t|a T G[t G T T & C T G C C 3 « (18-mer) 3^]a TACACAATGACGG tJs1 (15-mer)

To enkeltstrengs 18-mere og 15-mere DNA'er blev syntetiseret ved en konventionel triester-metode [R. Crea et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., _75, 5765 (1978)]. Der-20 på blev 2 ^ug hver af den 18-mere og den 15-mere DNA

opløst i 20 ^ul af en opløsning indeholdende 50 mM "Tris"-HC1 (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. Der tilsattes 30 enheder T4-po-lynucleotidkinase (produkt fra Boehringer Mannheim), 25 og phosphoryleringsreaktionen udførtes ved 37 °C i 60 minutter.

Derpå blandedes 2 ^ug hver af de phosphorylerede 18-mere og 15-mere DNA'er, og blandingen blev opvarmet til 70 11

DK 160945 B

°C i 5 minutter og fik lov at stå ved stuetemperatur til sammensmeltning og opnåelse af DNA-linkeren med den ovenfor angivne struktur.

0,4 yug af det ovenfor fremstillede BstNI-Sall-frag-5 ment på 1125 bp afledt fra pGC-7 og 1,0 ^ug af DNA-frag-

mentet på 4,1 kb opnået ved nedbrydning af udtrykkelses-vektoren pKYP-10 med Hindlll og Sall blev opløst i 25 yul af en opløsning indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH

7,5), 6 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol og 500 ^-uM ATP.

10 Der sattes omkring 0,1 ^ug af den ovennævnte DNA-linker til blandingen, efterfulgt af t i Isætning af 6 enheder T4-DNA-ligase. Ligeringsreaktionen udførtes ved 4 °C i 17 timer. Escherichia col i HB101 blev transformeret under anvendelse af den opnåede rekombinant-plasmid- 15 blanding ved konventionel teknik til opnåelse af en

R

Ap -koloni. Et plasmid, pGKA-2 vist i fig. 2, blev isoleret fra koloniens dyrningsvæske. Strukturen af pGKA-2 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, Clal, Hindlll,

BstNI og Sall og agarosegelelektroforese. Det blev be-20 kræftet ved den metode, som er beskrevet af A.M. Maxam et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560 (1977), at basesekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til startcodonen (ATG) i plasmidet pGKA-2 er "AAGGGTATCGATAAGCTTATG".

Den humane IFN-t-DNA i pGKA-2 er forskellig fra kendte 25 DNA’er ved, at DNA’en har et Rsal-sted, og at den 9, aminosyre i det humane IFN-X-polypeptid, som er indkodet i DNA'en, er glutamin (Gin).

Endvidere er den ovenfor anvendte syntetiserede DNA forskellig fra den, der blev anvendt af P.W. Gray et 30 al., og som har den følgende struktur: metcystyrcys a at t c (at g|t gttattgtc

GTACACAATAACAGT

12

DK 160945 B

i de understregede dele. Således har pGKA-2 et restriktionssted for BstNI, CCAGG, i DNA-området, der koder for humant IFN~y, og dette træk adskiller også pGKA-2 fra kendte plasmider. Endvidere er længden og strukturen 5 mellem SD-sekvensen og ATG vigtig på grund af indflydel sen på udtrykkeisen af proteiner i Escherichia coli. Basesekvensen mellem SD-sekvensen og ATG i pGKA-2 er øjensynligt forskellig fra den, der findes i det kendte rekombinante plasmid pIFN-^ trp48 (P.W. Gray et al.) 10 Escherichia coli indeholdende pGKA-2 er blevet deponeret hos FERM som Escherichia coli IGKA-2 (FERM P-6798), (FERM BP-496).

EKSEMPEL 3

Produktion af interferon ved hjælp af Escherichia coli 15 IGC-7 og IGKA-2:

Escherichia coli HB101 stammer indeholdende de rekombinante plasmider pGC-7 og pGKA-2 opnået i eksempel 1 og 2 (henholdsvis IGC-7 og IGKA-2) blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i et LG-medium bestående af 10 g/1 20 trypton, 5 g/1 gærekstrakt, 5 g/1 NaCl og 2 g/1 glucose og indstillet til pH 7,0 med NaOH. Derpå blev 0,2 ml af dyrkningsmediet indpodet i 10 ml af et MCG-medium (pH 7,2) bestående af 0,6 % Na^HPO^, 0,3 % KH^PO^, 0,5 % NaCl, 0,1 % NH^Cl, 0,5 % glucose, 0,5 % casaminosyre, 25 1 mM MgSO^ og 4 ^ul/ml vitamin B^. Dyrkningen udførtes ved 30 °C i 4 - 8 timer. Derpå tilsattes 10 ^ug/ml indol-acrylsyre (i det følgende betegnet som IAA), som er en induktor for tryptophangenet, og dyrkningen fortsattes i yderligere 2-12 timer. Cellerne blev indhøstet 30 ved centrifugering ved 8000 omdr./min. i 10 minutter og vasket med pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl og 30 mM "Tris"-HCl (pH 7,5). De vaskede celler blev 13

DK 160945 B

suspenderet i 1 ml af den ovennævnte pufferopløsning, og der tilsattes 200 ^ug lysozym og 5 ^ul 0,25 M EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). Blandingen fik lov at stå ved 0 °C i 30 minutter. Frysning og smeltning blev 5 gentaget 3 gange for at bryde cellerne. De brudte cel ler blev centrifugeret ved 15000 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en supernatant væske. Mængden af interferon i supernatanten blev bestemt ifølge den metode, som er beskrevet af J.A. Armstrong et al.: Appl.

10 Microbiol. 2_1, 723 - 725 (1971), hvorved der som virus anvendtes Sindvis-virus og som dyrecelle anvendtes FL-celle afledt fra humane amnionceller. Resultatet er vist i tabel 1.

TABEL 1 15 Stamme Indeholdt plasmid IFN- (enh./l) IGC-7 pGC-7 0 IGKA-2 pGKA-2 1 x 106 - 2 x 108

Referenceeksempel 1

Konstruktion af en plasmidvektor med trp-promotor: 20 (a) Rensning af tryptophan-transducerende fag-DNA:

En ^ptrp-fag, /\cI857trpED10 [i det følgende betegnet som /\trp ED, G.F. Miazzari, et al.: J. Bacteriol. 133, 1457 (1978)] blev lysogeneret i Escherichia coli JA 194 stamme [F~, r^-, m[<"’, Atrp E5, leu6, J. Carbon 25 et al.: Recombinant Molecules, side 355 (1977), Raven

Press], Den resulterende lysogene stamme JA 194 C^trp ED) blev dyrket ved 42 °C i 30 minutter for at induce- 14

DK 160945B

re ^trp ED fager og fremstille 7\-fag-lysat. Ά-fagerne blev renset fra 7i-fag-lysat ved cæsiumchlorid-ligevægts-densitetsgradient-centrifugering, som er beskrevet af Yamakawa et al.: "Chemicals of Nucleic Acids I" Tokyo 5 Kagaku Dojin, side 54 - 61, (1974). λ-fagerne blev yderligere renset ved phenolbehandling og chloroformbehandling ifølge den metode, som er beskrevet af Yamakawa et al.: "Chemicals of Nucleic Acids I" Tokyo Kagaku Dojin, side 62 - 65, (1974).

10 (b) Kloning af trp-promotoren ind i et plasmid:

Kloning af trp-operonet fra Atrp ED fag DNA blev udført på følgende måde. 8 ^ug i^trp ED DNA blev nedbrudt ved 37 “C i 2 timer med 16 enheder EcoRI og 16 enheder Hindlll i 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 75 mM NaCl, 10 mM MgCl2 15 og 5 mM dithiothreitol. Separat blev 1 ^ug plasmid pBR325 DNA nedbrudt med 2 enheder EcoRI og 2 enheder Hindlll ved den samme metode som nævnt ovenfor (slutvolumen:

30 ^ul). Reaktionerne blev stoppet ved opvarmning til 65 °C i 5 minutter. Derpå blev 15 ^ul af hver af nedbryd-20 ningsblandingerne blandet, og der tilsattes 500 ^uM

(slutkoncentration) ATP og 5 enheder T4-DNA-ligase (produkt fra New England Biolabs). Blandingen fik lov at reagere ved 4 °C i 18 timer. Escherichia coli C600 SF-stamme [Cameron et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 72^, 3416 25 (1975)] blev transformeret med plasmidblandingen ved den konventionelle metode [S.N. Cohen et al.: Proc.

Natl. Acad. Sci. 69_, 2110 (1972)], og der blev opnået transformanter, som var resistente over for ampicillin

R R

(Ap ), resistente over for tetracyclin (Tc ) og sensi- 5 30 tive over for chloramphenicol (Cm ). Plasmid-DNA'er blev isoleret fra transformanterne af Escherichia coli og spaltet med EcoRI, Hindlll og Hpal. En af plasmid-DNA'erne havde den struktur, som er vist i fig. 4 (A), og blev navngivet pKYP-1.

15

DK 160945 B

Et Taql-spaltningssted findes 4 basepar efter SD-sekven-sen (AAGG), som er til stede efter tryptophan-promotoren.

Ved udnyttelse af denne kendsgerning blev plasmidet pKYP-1 nedbrudt med Taql og EcoRI, og nedbrydningsmate-5 rialet blev underkastet rensning ved agarosegelelektro- forese til opnåelse af et 2,6 kb DNA-fragment indeholdende tryptophan-promotoren og SD-sekvensen. 2,6 kb DNA-fragmentet blev klonet ind i en kendt vektor, pBR322, ved den metode, som er belyst i fig. 5. 8 yug pBR322 10 blev nedbrudt ved 45 °C i 60 minutter med 2 enheder

Taql i 100 yul af en reaktionsblandingen indeholdende 10 mM "Tris"-HCl (pH 8,4), 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 6 mM 2-mercaptoethano1. Efter delvis nedbrydning med Taql blev nedbrydningsmaterialet underkastet gelelektro-15 forese på agarose med lav geleringstemperatur [Lars

Wieslander: Analytical Biochemistry 9j3, 305 (1979)] til opnåelse af et 4,36 kb renset DNA-fragment. Omkring 1,5 yug af DNA-fragmentet blev fuldstændigt nedbrudt ved 37 °C i 3 timer med 3 enheder EcoRI. Ved den samme 20 gelelektroforese på agarose med lav geleringstemperatur som nævnt ovenfor blev der udvundet ca. 1,0 yug af et 4,33 kb DNA-fragment. Derpå blev 12 yug pKYP-l-DNA nedbrudt med 3 enheder Taql, nedbrydningsmaterialet blev underkastet gelelektroforese på agarose med lav gelerings-25 temperatur til opnåelse af ca. 2 yUg af et 8,5 kb renset DNA-fragment, og DNA'en blev fuldstændig nedbrudt med EcoRI ved den samme procedure som ovenfor til opnåelse af ca. 0,5 yug af et renset 2,6 kb DNA-fragment. Derpå sattes 0,4 yug af 4,33 kb DNA-fragmentet fra pBR322 30 og 0,25 yug af 2,6 kb DNA-fragmentet fra pKYP-1 til 20 yul af en reaktionsopløsning indeholdende 20 mM "Tris"-HC1 (pH 7,6), 10 mM MgCl^ og 10 mM dithiothreitol. Derefter sattes 0,5 mM ATP og 4 enheder T4-DNA-ligase til blandingen, og reaktinen udførtes ved 4 °C i 18 timer.

35 Escherichia coli C600 SF8-stamme blev transformeret med den således opnåede rekombinante plasmid-DNA. Pias- 16

DK 160945 B

R R

miderne i transformanten med Ap og Tc blev isoleret. Plasmid-DNA1 en blev nedbrudt med 6 restriktionsendo-nucleaser, EcoRI, Hindlll, Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH), Hpal, Hindi og BamHI for at analysere 5 plasmidets struktur. Plasmidet blev erkendt at have den i fig. 4 (B) viste struktur og blev navngivet pKYP-5.

(c) Fremstilling af en overførbar promotor ud fra trp-promotoren:

Den ovennævnte plasmidvektor pKYP-5 er anvendelig som 10 DNA-indførende vektor, da den har et Clal-sted og et

Hindlll-sted på DNA'en 1-20 basepar efter SD-sekvensen. Imidlertid findes et andet Clal-sted i pKYP-5-DNA foruden Clal-stedet umiddelbart efter SD-sekvensen, og det fragment med trp-promotoren, som opnås ved klipning af pKYP-5-15 DNA med EcoRI og Hindlll, er lidt for stort, dvs. 2,65 kb. For at lette anvendelsen blev pKYP-5 forbedret ved den fremgangsmåde, som er belyst i fig. 6, til opnåelse af et plasmid med et DNA-fragment indeholdende en kortere tryptophanpromotor. pKYP-5-DNA blev nedbrudt med 20 Hpall og Hindlll, og nedbrydningsmaterialet blev renset til opnåelse af et DNA-fragment på omkring 340 bp. Fragmentet blev indsat i det med Clal og Hindlll nedbrudte pBR322 som belyst i fig. 6 til opnåelse af pKYP-10. Strukturen af pKYP-10 blev bestemt ved nedbrydning med 25 EcoRI, Clal, Hindlll og Hpal og agarosegelelektroforese.

(d) Forbindelse af to eller flere trp-promotorer:

For at konstruere en plasmidvektor med en stærkere promotoraktivitet blev to trp-promotorer indsat i vektoren.

Det i trin (c) ovenfor nævnte DNA-fragment på omkring 30 340 bp indeholdende trp-promotoren blev indsat i pKYP-10 nedbrudt med Clal oa Hindlll til opnåelse af pKYP-11 som belyst i fig. 7 (A). Den samme procedure blev genta- 17

DK 160945 B

get til konstruktion af pKYP-12 som belyst i fig. 7 (B), hvori tre trp-promotorer blev forbundet i den samme orientering. Strukturen af pKYP-12 blev bekræftet ved nedbrydning af EcoRI, Clal, Hindlll og Hpal.

Forsøg 1

Aktivitet af interferon-K i serum:

Aktiviterne af interferon-^-polypeptidet ifølge denne opfindelse (i det følgende betegnet som Gin -IFN-if) og det interferon-^-polypeptid, som er beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 77 670 (i det følgende betegnet som Lys9-IFN-V)} i serum blev undersøgt på følgende måde.

10 μΐ af en opløsning indeholdende 100 jjg/ml IFN-Y (Gin9-IFN-Y eller Lys -IFN-lf) og 490 /Jl humant serum blev blandet, og blandingen blev holdt ved 37 °C i 24 timer. Blandingen blev fortyndet 50 gange med MEM-medium indeholdende 5 % okseserumalbumin, og IFN-ί -aktiviteten (antivirus-aktivitet) blev bestemt ved Armstrongs metode [Armstrong J.A. et al., Appl. Microbiol, 21_, 723-725 (1971)]. Som kontrol blev opløsningen indeholdende IFN-¥ holdt ved 4 “C i 24 timer og underkastet undersøgelsen. Resultaterne er vist i den følgende tabel.

Gln9-IFN-V> Lys9-IFN-Y

Antivirus- Aktivitets- Antivirus- Aktivitetsaktivitet forhold aktivitet forhold (enh./ml) (enh./ml) gennemsnit gennemsnit >

Kontrol 200 193 158,0 169,3 1,00 201,8 212,1 1,00 149.9 241,2

Prøvning 284,0^1 205,7 248,3 254,4 1,50 234,0 222,8 1,05 239.9 228,8 ' 1 18

DK 160945 B

Forsøg 2

Aktivering af IFN-^ ved behandling med trypsin: 45 jjl af hver af to opløsninger indeholdende hhv. 50 ^ig/ml Gln^-INF-K^ og 50 jug/ml Lys^-IFN-Y' blev hver for sig sat til 5 μΐ af en trypsinopløsning til fremstilling af blandinger indeholdende trypsin og IFN-)f i vægtforholdene 1:50, 1:100, 1:200 og 1:400. Blandingen blev inkuberet ved 5 °C i 60 min. 2 μΐ af blandingen blev sat til 980 jjI MEM-medium indeholdende trypsininhibitor for at stoppe reaktionen. Antivirus-aktiviteten af reaktionsblandingen blev bestemt ved den samme metode som i Forsøg 1. Resultaterne er vist i den følgende tabel.

Gln9-IFN-Y Lys^-IFN-V'

Antivirus- Aktivitets- Antivirus- Aktivitets-... aktivitet forhold aktivitet forhold trypsin: (enh./ml) I FN-gennemsnit gennemsnit

Kontrol 651,07^ 747,66 539,13 605,8 1,00 599,04 613,4 1,00

627,10^ 493,50J

1:50 263,37*1 604,31^ 318,56 292,8 0,48 528,99 603,4 0,98

296,53J 676,89J

1:100 1059,30*1 633,7 6^ 843,73 887,7 1,46 684,30 688,7 1,12 760,2lJ 748,04j 1:200 1404,19*1 1271,8 1388,89 1326,0 2,18 1214,5 1240,6 2,02

1184,88,1 1235, GJ

1:400 1708,7θ1 1004,08 1448,74 1553,1 2,56 1566,84 1309,2 2,13 1501,81 1356,62

' J

Claims

1. Humant interferon-^-polypeptid, kendetegnet ved, at det har den i fig. 3 belyste aminosyre-sekvens.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et humant interfe- 5 ron-{-polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en mikroorganisme transformeret med et rekom-binant plasmid, hvori der er inkorporeret et DNA-fragment, som koder for humant interferon-l^-polypeptid, dyrkes i et næringsmedium, og at det dannede humane interfe-10 ron-T^-polypeptid udvindes fra dyrkningsmediet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet er inkorporeret efter en tryp-tophanpromotor.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendete g- 13 net ved, at mikroorganismen tilhører arten Escherichia coli.

5. Rekombinant plasmid til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 2-4, kendetegnet ved, at det har inkorporeret et DNA-fragment, som koder for humant 20 interferon-/-polypeptid ifølge krav 1, efter en tryp- tophan-promotor.

6. Rekombinant plasmid ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det er plasmidet pGC-7 eller pGKA-2.

7. Mikroorganisme til brug ved fremgangsmåden ifølge 25 krav 2-4, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant plasmid ifølge krav 5 eller 6.

8. Mikroorganisme ifølge krav 7, kendetegnet DK 160945 B ved, at den tilhører arten Escherichia coli.

9. Escherichia coli IGC-7 (FERM P-6814), (FERM BP-497).

10. Escherichia coli IGKA-2 (FERM P-6798), (FERM BP-496).