DK161013B - Fremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat samt hapten, i det vaesentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat samt hapten, i det vaesentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved fremgangsmaaden Download PDFInfo
- Publication number
- DK161013B DK161013B DK093584A DK93584A DK161013B DK 161013 B DK161013 B DK 161013B DK 093584 A DK093584 A DK 093584A DK 93584 A DK93584 A DK 93584A DK 161013 B DK161013 B DK 161013B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- polysaccharide
- prp
- protein
- ribose
- conjugate
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 79
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 75
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims abstract description 21
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims abstract description 21
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 6
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 9
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 abstract description 10
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 abstract description 8
- -1 cyanogen halide Chemical class 0.000 abstract description 7
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 6-hydrazinyl-6-oxohexanoic acid Chemical compound NNC(=O)CCCCC(O)=O ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100459438 Caenorhabditis elegans nac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 208000036756 Diphtheria carrier Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 206010061190 Haemophilus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000010899 haemophilus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
DK 161013 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat, der er i stand til at frembringe T-celle-afhængig antistofreaktion mod polysaccharid fra Hae-5 mophilus influenzae b, med en molekylvægt mellem 140.000 og 4.500.000 Dalton og med et ribose/protein-forhold mellem 0,25 og 1,0, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man a) opvarmer et kapsulært polysaccharid af Haemophilus 10 influenzae b bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og phosphat, indtil mere end 60% af poly-saccharidet har en molekylvægt mellem 200.000 Dalton og 2.000. 000 Dalton, b) aktiverer det fremkomne størrelsesregulerede poly-15 saccharid med cyanogenbromid, c) fjerner i det væsentlige alt uomsat cyanogenbromid, og d) omsætter det aktiverede produkt med et adipinsyre-hydrazid derivatiseret diphtheriatoxoid.
20 Opfindelsen angår også et hapten, i det væsentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved den nævnte fremgangsmåde, og dette hapten er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ud fra kapsulært Haemophilus influenzae b-polysaccharid, bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære 25 mængder ribose, ribitol og phosphat, ved opvarmning, indtil mindre end 20% af polysaccharidet har en molekylvægt under 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylvægt over 2.000. 000 Dalton med dekstranstandard som reference ved gelpermeeringschromatograf i.
30 Polysaccharidet er fortrinsvis til stede som natrium salt.
Det aktiverede polysaccharid blandes grundigt med et exotoxoid, diphtheria-toxoid, til udvirkning af konjugation. Exotoxoidet derivatiseres ved som afstandsstykke at anvende 35 en bro på 4-8 C-atomer, nemlig med adipinsyre-hydrazidderi-
DK 161013 B
2 vatet af diphtheria-toxoid (D-AH). Exotoxoidet er knyttet til adskillige AH-enheder.
Ved hjælp af denne metode fås der en konjugatvaccine, der fremkalder en T-celle-afhængig reaktion mod polysacchari-5 det fra Haemophilus influenzae b.
Et sådant konjugat er særlig værdifuldt til anvendelse ved forebyggelse af Haemophilus-infektioner hos børn og spædbørn.
Schneerson et al. omtaler i New Developments with 10 Human and Veterinary Vaccines, Progr. Clin. Res., 77-94 (1980) fremkaldelsen af forøget immunogenitet af Haemophilus influenzae (Hib) kapsulært polysaccharid ved subcutan injektion af en saltopløsning af Hib-polysaccharid covalent bundet til proteinkonjugater. Der fremstilles adipinsyre-hydrazid-15 derivater af albumin, hæmocyanin og diphtheria-toxin.
Schneerson et al. omtaler i artiklen Protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines, side 265-272 (1982) anvendelsen af flere proteiner, herunder diphtheria-toxin, til fremstilling af konjugater med forskellige bakterielle kapsulære polysaccha-20 rider til anvendelse som "T-celle-afhængige" antigener til subcutan saltopløsningsinjektion i laboratoriedyr. Ca. 85% af proteinet omdannes til konjugatet, og ca. 30% af poly-saccharidet bindes i det tomme volumen efter passage af konjugatet gennem en 4B Sepharose®-søjle. Cyanogenbromid-25 aktivering af Hib-polysaccharidet og adipinsyre-dihydrazid-derivatisering af proteinet anvendes.
Schneerson et al. angiver i Bacterial Capsular Polysaccharide Conjugates i L. Weinstein og B.N. Fields (ed.), Seminars in Infections Disease, Vol. 4, Bacterial Vaccines, 30 New York, 311-321 (1982), en metode til covalent binding af Hib-kapsulært polysaccharid til proteiner til forøgelse af polysaccharidets immunogenitet. AH-derivater af BSA, HSA, diphteria-toxin og hæmocyanin anvendes som bærerproteiner.
I Journal of Exp. Med. 152. 361-376 (1980) beskrives 35 en metode til covalent binding af Haemophilus influenzae type b - kapsulært polysaccharid til flere proteiner, idet
DK 161013 B
3 der anvendes adipinsyre-dihydrazid som afstandsstykke mellem det kapsulære polysaccharid og bærerproteinet.
Ifølge de ovennævnte artikler anvendes der i intet tilfælde toxoider, og der er ikke tale om anvendelsen af et 5 trin til regulering af haptenets molekylvægt, undgåelse af anvendelsen af calcium, fjernelse af overskud af cyanogen-halogenid til undgåelse af excessiv tværbinding og et udbytte på 70-100% baseret på udgangspolysaccharid. Den fra artiklerne kendte teknik afviger således væsentligt fra den fore-10 liggende opfindelse, såvel med hensyn til udøvelsen deraf som med hensyn til resultatet.
Schneerson et al. har ifølge Prog. Allergy 32, 144-178 (1982) undersøgt fremstillingen og virkningen af vaccine sammensat af polysaccharid covalent bundet til et "T-celle-15 afhængigt" bærerprotein. Adipinsyre-hydrazidderivaterne af diphteria-toxiner eller tetanus-toxoid blev covalent omsat med cyanogenbromid-behandlet Hib-polysaccharid, og produktet blev dialyseret, ledt gennem en 4B Sepharose®-søjle, steril-filtreret og opbevaret som en steril saltopløsning.
20 Chu et al. beskriver i Infection and Immunity, 245- 256 (1983) fremstillingen af konjugater ved kobling af AH-derivater af Hib-polysaccharider med tetanus-toxoid eller hæmocyanin. Polysaccharidet aktiveres med CNBr, omsættes med AH og dialyseres, efterfulgt af gelfiltrering og fryse-25 tørring. AH-polysaccharidderivatet og proteinet kobles derefter. Udbyttet af Hib-tetanus-toxoid-konjugater er 62%, når reaktanterne udgør 30 mg/ml.
Forfatterne til de to sidstnævnte artikler omtaler intet trin til regulering af haptenets molekylvægt og ej 30 heller undgåelsen af anvendelsen af calcium eller fjernelse af overskud af cyanogenhalogenid til undgåelse af excessiv tværbinding. Den teknik, der er beskrevet i disse artikler, afviger således betydeligt fra den foreliggende opfindelse, såvel med hensyn til udøvelsen deraf som med hensyn til det 35 opnåede resultat.
DK 161013 B
4
Der kan således på basis af den foreliggende opfindelse opnås en konjugatvaccine, der er anvendelig til immunisering mod sygdommen diphtheria. Virkningsstyrken hos mennesker af sådanne konjugater er større end den, der er 5 opnåelig med de kendte diphteriapræparater. Fremgangsmåden giver ved omhyggelig kontrol og fjernelse af overskydende aktivator et polysaccharidkonjugat opbygget af adskillige exotoxoidmolekyler knyttet til enkelte polysaccharidmolekyler forbundet gennem et afstandsstykke og i det væsentlige uden 10 tværbundne eller polymere derivater. Formlen kan generelt gengives som PRP “xm hvor PRP er polysacchar idet, og X er den toxoide molekyldel, og n er et helt tal under 20, idet et typisk gennemsnit er 7-8. (Diphtheria-toxoid-konjugatet omtales her som PRP-D, uden brug af tallet n).
15 På tegningen vises immunogeniteten af Haemophilus influenzae b-kapsulært polysaccharid, dvs. anti-PRP-reak-tionen. Dette søjlediagram viser de data, der er opnået ifølge tabel I til slut i beskrivelsen (fra eksempel 5).
Udviklingen af stabil humoral immunitet kræver gen-20 kendelse af fremmedstoffer mod mindst to separate sæt lymfocyter. Disse sæt er B-lymfocyterne, der er forstadier for antistof-dannende celler, og T-lymfocyterne, der modulerer B-cellernes funktion. Medens nogle antigener, herunder flere polysaccharider, er i stand til direkte at stimulere B-celler 25 til produktion af antistoffer (T-uafhængige antigener), skal de fleste antigener (T-afhængige) præsenteres for B-cellen af en T-lymfocyt. Med hensyn til de her omhandlede vacciner genkendes den exotoxoide del af vaccinen af T-cel-lesystemet. Eftersom proteinet bærer både sine egne antigene 30 determinanter og det covalent bundne hapten, bør begge sæt determinanter præsenteres af T-celler for B-cellerne. Resultatet af indgivelsen af dette bærer-hapten-konjugatpræparat er, at PRP præsenteres som et T-afhængigt immunogen. En T-afhængig præsentation af PRP medfører protektiv immunitet 35 hos børn og spædbørn, den del af befolkningen, der er udsat
DK 161013 B
5 for den største risiko. Konjugatvaccinen har derfor særlig værdi til småbørn.
Indgivelse af et sådant konjugat til kvinder medfører en høj andel af IgG-antistoffer mod vaccineantigenerne, som 5 gennemtrænger placentabarrieren under svangerskab, og yder således spædbarnet beskyttelse fra fødslen.
T-uafhængige antigener får B-celler til terminalt at differentiere i antistof-afsondrende celler (plasmaceller), medens T-afhængige reaktioner er betydeligt mere komplekse.
10 Efter modtagelsen af en T-afhængig stimulus indgår B-cel-lebestanden ikke blot i antistof produktionen, men også i proliferation og i modning. Herved fremkommer en stigning i antallet af B-celler, der fremstiller antistoffer mod PRP, og en forøgelse af antallet af B-celler, der er i stand til 15 at reagere på en udsættelse nr. 2 for PRP. Gentagen immunisering resulterer i yderligere stigninger af antallet af PRP-specifikke B-celler og derfor højere antistoftitere, en booster-reaktion. Kort sagt, medens T-uafhængige reaktioner er begrænset af antallet af reaktionsdygtige B-celler, resul-20 terer T-afhængige reaktioner i en stigning af det samlede antal antigen-reaktive celler.
Den her omhandlede PRP-exotoxoid-vaccine har vist sig at fungere som et T-afhængigt immunogen hos laboratoriedyr. Alle dyr i en gruppe af kaniner immuniseret serievis 25 med en standarddosis PRP-D udviser booster-reaktioner. Desuden viser primære immuniseringer med bærerproteiner, der anvendes i konjugatet, f.eks. diphtheria-toxoid til prp-d, sig at forøge begyndelsesreaktionen på PRP-komponenten i PRP-exotoxoid-konjugatet. En lignende forøgelse af PRP-reak-30 tion iagttages ikke hos dyr, der er præpareret med et exo-toxoid, der er forskelligt fra det, der anvendes i konjugatet.
Den omhandlede vaccine er et PRP-exotoxoid-hapten--bærer-konjugat. I sådanne vacciner bidrager det antigene, 35 men svagt immunogene haptenmolekyle (PRP) til en ny antigen-
DK 161013 B
6 specificitet over for stærkt immunogene bærermolekyler, såsom diphtheria-(D)-toxoid.
Det rensede diphtheria-toxoid (D), der anvendes som bærer ved fremstillingen, er et i handelen værende exotoxoid, 5 der er modificeret (derivatiseret) ved tilknytning af et 4- 8-C-atom-af standsmolekyle, nemlig adipinsyre-dihydrazid (ADH), ved hjælp af vandopløseligt carbodiimid-kondensations-metoden. Det modificerede exotoxoid, adipinsyre-hydrazidderi-vatet X-AH, befries derpå for uomsat ADH. Dette er et oplø-10 seligt produkt, der i det væsentlige er uden tværbinding, hvilket bekræftes ved udeblivelse af en væsentlig stigning i molekylstørrelse, bestemt ved gelchromatografi og poly-acrylamidgel-elektroforese.
Haemophilus influenzae b's kapsulære polysaccharid 15 fremstilles ud fra kilder, der fås i handelen, således som de anvendes til autoriserede polysaccharidvacciner og fås hos Connaught Laboratories. Medens polysaccharidet imidlertid konventionelt er renset som et calciumsalt, skal anvendelsen af calciumioner undgås, fordi de griber ind i anvendelsen 20 af carbonatpuffer ved konjugationsproceduren. Polysacchari-dets molekylstørrelse justeres derpå ved opvarmning, til den ønskede dimension for haptenet er nået. Typisk er opvarmning af det flydende polysaccharid i 15 minutter ved 100°C tilstrækkeligt til at sikre, at mindre end 20% af 25 molekylerne har en molekylstørrelse, der er mindre end 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylstørrelse på over 2.000.000 Dalton. Denne tilpasningsoperation er vigtig for at opnå et rigtigt PRP-D-konjugat.
Det størrelsesjusterede polysaccharid, der således 30 fås, aktiveres med en aktivator for at skabe en elektrofil gruppe på polysaccharidet, såsom et cyanogenhalogenid eller natriumborhydrid. En typisk aktivator, der anvendes, er cyanogenbromid. Uomsat aktivator fjernes fuldstændigt, fordi en væsentlig rest bevirker tværbinding af proteinet i den 35 følgende reaktionsblanding. Det fremkomne tværbundne produkt indfanger polysaccharid, idet der fås et lavere udbytte af
DK 161013 B
7 vaccine og et konjugat med større molekyIstørrelse, der afviger med hensyn til kemiske egenskaber og opløselighed fra det ifølge opfindelsen fremstillede konjugat, og en vaccine, der ikke har den ønskede andel af den her omhandlede 5 vaccine.
Det aktiverede PRP og X-AH kombineres derpå og får lov at reagere i kulden. Nogle af hydrazidgrupperne på det derivatiserede exotoxoid reagerer med de aktiverede steder på PRP til dannelse af covalente bindinger. Produktet er 10 PRP-covalent bundet til derivatiseret exotoxoid via en 4-8 C-atom-bro. Dette reaktionsprodukt renses ved gelpermeerings-chromatografi for at fjerne eventuelt uomsat protein og forureninger med ringe molekylstørrelse. Den typiske mole-kylstørrelse for hovedfraktionen er ca. 675.000 Dalton i 15 relation til en dekstranstandard. Et typisk interval for relativ molekylstørrelse er 140.000 Dalton til 4.500.000 Dalton.
Et konserveringsmiddel, såsom "Thimerosal", tilsættes; når det drejer sig om "Thimerosal", i en slutkoncentration 20 på 1:10.000. Hovedkoncentratet filtreres gennem et 0,2/xm membranfilter og opbevares koldt.
PRP-exotoxoid-konjugationsproduktet er varmemodstands-dygtigt og vandopløseligt. Manglen på tværbinding konstateres ved udeblivelsen af en væsentlig stigning i molekylstørrel-25 sen i forhold til udgangspolysaccharidets, bestemt ved gel-permeeringschromatografi og ved polyacrylamid-gelelektrofo-rese. Varmestabiliteten sikrer lang lagerholdbarhed og et stabilt produkt selv under ugunstige klimaforhold.
Reaktionen kan gengives skematisk i to trin: 30 (1) PRP + CNBr -» PRP* (2) PRP* + nX -» PRP(-X)n
Hvis fjernelsen af cyanogenhalogenidet ikke udføres effektivt, opstår der foruden konjugationen af det aktiverede PRP og exotoxoid til dannelse af PRP(-X)n sådanne uønskede 35 reaktioner som f.eks. dannelse af X-X eller flere forbundne derivater, f.eks.
DK 161013 B
8
PRP* + CNBr -i nX + XX-PRP-X
X-X-PRP
5 En typisk dosis PRP-exotoxoidkonjugatvaccine til mennesker til subcutan eller intradermal injektion består af 0,5 ml, der indeholder 10 mikrogram ribose eller et tilnærmelsesvis ækvivalent til 40 mikrogram af konjugatproduk-tet. Der fremstilles ampulopløsninger ved fortynding af 10 hovedkoncentratet med -phosphatpufret saltvandsopløsning, idet der anvendes "Thimerosal" som konserveringsmiddel.
Produktet fremkalder antistofdannelse hos mennesker over for både PRP- og exotoxoid-komponenten.
Opfindelsen vil i det følgende bliver forklaret ved 15 hjælp af eksempler.
Eksempel 1
Fremstilling af PRP
A. Organisme. Kapsulært polyribosylribitolphosphat (PRP) af Haemophilus influenza b fremstilles ud fra Eagan-20 stammen. Kulturen overføres gentagne gange, og der fremstilles lyophiliseret podemateriale. Fra dette lyophiliserede podemateriale foretages en yderligere overføring for at fremstille vådarbejdende podemateriale (opbevares v. -60°C).
Der fremstilles gæringsanlægportioner af bakterieceller ud 25 fra det vådarbejdende podemateriale.
Dyrkningsrenhed bestemmes efter følgende kriterier: 1. Gram-negative farvekarakteristika.
2. Vækst på agar indeholdende NAD (diphosphopyridin-nucleotid) og hæmin (okse type I krystallinsk 30 salt af ferrihæm).
3. Manglende evne til at gro på agar uden NAD eller hæmin.
4. Agglutination ved specifikke antisera (type b Haemophilus influenza b, Hyland Laboratories).
35 B. Dyrkning og medier. Til subdyrkning af bakterien, dvs. forud for inokulering af en gæringsbeholder, anvendes BHI-Agar (pr. liter: 37 g BHI Difco, 15 g Bacto Agar Difco,
DK 161013 B
9 0,6 ml 1%'s NAD Sigma-kvalitet III og 6 ml 0,2%'s hæmin (Sigma-okse, type 1). Celler (20 timer) vasket fra en agaroverflade anvendes til at inokulere Haemophilus influenza b (Hib) flydende medie (1 liter alikvote mængder); disse 5 kulturer inkuberes under rystning, indtil bakterien når den logaritmiske fase i sin vækstcyklus. På dette tidspunkt anvendes 2 liter kultur til at inokulere hver 40 liter flydende Hib-medier i en gæringsbeholder, og der tilsættes 300 ml 8%'s "UCON" (Union Carbide smøremiddel). Efter 16-18 10 timer er kulturen i gæringsbeholderen parat til høst.
Sammensætningen af Hib-flydende medier pr. 1000 ml er: Gærekstraktdialysat, Difco 5,0 g
Casaminosyrer, Difco 22,5 g 15 Natriumphosphat, dibasisk 12,4 g
Dekstrose 5,59 g Hæmin 20,0 g
Ammoniumhydroxid (30%) 0,1534 ml NAD 1% 0,6 ml 20 Når en gæringsbeholder høstes, bestemmes kulturren heden ved passende Gram-farvning og dyrkningsteknik (se A. 1-4 ovenfor). Der tilsættes "Cetavlon" (hexadecyltrimethyl-ammoniumbromid) til kulturen indtil en slutkoncentration på 0,1%. Efter 30 minutter, når bakterierne er blevet inak-25 tiveret, opsamles den faste pasta ved centrifugering. Den våde pasta opbevares ved -70°C indtil videre forarbejdning.
C. Renset polvsaccharid. Ekstraktion og efterfølgende rensning af PRP udføres ved hjælp af følgende procedure: 1. Dissocierinc ud fra detergent.
30 For hvert g af pastaens vådvægt tilsættes 10 ml 0,4 molær NaCl. Suspensionen blandes i en blandemaskine, som fås i handelen, i 30 sekunder. Blandingen centrifugeres i 15 minutter ved 17.000 G i kulde (4°C). Den ovenpå flydende væske opsamles, og der tilsættes ethanol indtil en koncentra-35 tion på 25%. Dette materiale centrifugeres derpå i 2 timer ved 17.000 G (4°C), og den ovenpå flydende væske gemmes.
10
DK 161013 B
Der tilsættes ethanol i et volumen, der er fire gange så stort som den ovenpå flydende væskes, og materialet holdes natten over ved 4°C.
2. Fjernelse af nucleinsvrer.
5 Materialet centrifugeres i 5 minutter ved 2800 G
(4°C). Sedimentet opsamles og gensuspenderes i tris-MgS04-puffer med en fjerdedel af det volumen, der oprindeligt anvendtes til at ekstrahere pastaen. Sammensætningen af Tris-pufferen er som følger pr. liter destilleret vand: 10 Tris-hydroxymethylåminomethan (Sigma) 6 g
MgS04.7 Η20 246 mg "Thimerosal" (Elanco) 50 mg pH justeres til 7,0 ± 0,2 med koncentreret saltsyre. Deoxyribonuclease I 1,5 mg (Sigma D-0876) og ribonu-15 clease-A 0,75 mg (Sigma type 1-AS, R-5503) pr. 100 g oprindelig våd pasta tilsættes. Materialet anbringes i en dialysepose og inkuberes i 18 timer ved 37°C mod 18 liter tris--MgS04-puffer.
3. Fjernelse af proteiner 20 Materialet oparbejdes yderligere for at fjerne pro- teinbestanddele ved, at der tilsættes et lige så stort volumen phenol/acetatopløsning (135 ml 10%'s (vægt/vol.) natriumacetat kombineret med 454 g phenol) . Derpå rystes materialet i 30 minutter (4°C), centrifugeres i 15 minutter ved 17.000 25 G, og den vandige fase opsamles. Der foretages to yderligere phenolekstraktioner efterfulgt af dialyse af den sidste vandige fase mod destilleret vand.
På dette statium mdgør materialet den flydende kap-sulære polysaccharidmasse og opbevares ved -20°C, indtil 30 yderligere oparbejdning finder sted (afsnit D nedenfor).
4. Bedømmelse af polvsaccharidets kvalitet.
Kvaliteten af PRP-massen bedømmes på basis af en analyse af en flydende prøve, der udtages. Der tilsættes 4 volumendele ethanol, derpå CaCl2 til en slutkoncentration 35 på 0,02 molær, og der udfældes PRP. PRP sedimenteres ved centrifugering og tørres under vakuum over et tørremiddel.
DK 161013 B
11
En termogravimetr isk analyse (TGA) anvendes til bestemmelse af fugtighedsindholdet. Yderligere analyser beregnes på tørvægtbasis.
Kriterierne for godkendelse omfatter: 5 (a) Analyse for ribose (Orcinolmetode): over 30%.
(b) Analyse for protein (Lowry's metode): under 1%.
(c) Analyse for nucleinsyrer (U.V. absorbens): under 1%.
(d) Fældning med specifikke immunsera (modimmunelek- 10 troforesemetode).
Desuden bestemmes molekylstørrelsen ved passende gelpermeeringschromatografi. Polysaccharidet overvåges for endotoxin ved hjælp af Limulus-lysatprøve og ved feberfremkaldende prøve på kaniner.
15 En typisk portion har følgende karakteristika: (a) Proteinindhold 0,5%.
(b) Indhold af nucleinsyre 0,35%.
(c) Residualokseantigener: ingen forurening af det rensede PRP med okse RNA-ase og DNA-ase, der 20 anvendes til fremstilling af polysaccharidet som målt ved radioimmunanalyse.
(d) Endotoxinindhold måles ved hjælp af Limulus amoe-bocyt/lysat-analyse (LAL): 200 ng/mg PRP.
(e) Kd på CL-4B-"Sepharosen®: 0,40. En værdi på 0,30 25 svarer til en tilnærmelsesvis molekylvægt på 1.125.000 i forhold til dekstranstandarder.
D. Fremstilling af polysaccharid(PRP)reagens. Polysaccharidet renses således som en væske, men der anvendes ikke calcium ved rensningsproceduren. (Gængs polysaccharid-30 rensning giver et calciumsalt, men calcium kan kombinere med carbonatpufferen, der anvendes nedenfor, under konjugation, så at der dannes et bundfald).
Polysaccharidets størrelse justeres ved opvarmning ved 100°C i et tidsrum, der er proportionalt med graden af 35 den nødvendige størrelsesændring. Polysaccharidets størrelse justeres, så at mindre end 20% eluerer fra en CL-4B "Sepha- 12
DK 161013 B
rose"®-kolonne i mel lemrums voluminet, og mindre end 20% eluerer med et Kd på over 0,5. Hovedfraktionen har en mole-kylstørrelse på 200.000 til 2.000.000 Dalton.
Eksempel 2
5 Aktivering af PRP
A. Polysaccharidet afkøles på isbad til 4°C i en reaktionsbeholder udstyret med magnetisk omrører. PRP's begyndelses volumen ved en koncentration på 25 mg/ml (20-30 mg/ml-interval) i destilleret vand noteres. Derpå tilsættes 10 natriumchlorid til en koncentration på 0,85%.
B. pH i den fremkomne opløsning af polysaccharidets natriumsalt hæves til 10,5-11,0 ved tilsætning af IN natriumhydroxid . (Dette interval vælges, fordi ved lavere pH sker der mindre reaktion med cyanogenbromid, og ved højere pH
15 nedbrydes polysaccharidet).
C. Tørt cyanogenbromid opløses i 0,005 N natriumbicar-bonatpuffer med pH 10,5-11,0 og sættes straks (inden for 10 minutter efter fremstillingen) til reaktionsbeholderen i et forhold på 0,4 mg/mg PRP.
20 D. Blandingens pH justeres til og holdes ved 10,5- 11,0 i 6 minutter ved tilsætning af natriumhydroxid.
E. pH sænkes derpå til 6,0 med IN HC1. (Surt pH stabiliserer de aktiverede steder, der er dannet på polysaccharidet med cyanogenbromid. Yderligere sænkning af pH resulterer 25 i hydrolyse af PRP).
G. Der tilsættes et lige så stort volumen saltvandsopløsning, pH 6,0, i forvejen afkølet til 4°C.
H. Cyanogenbromid/polysaccharidblandingen overføres til et inddampningsapparat og inddampes til det oprindelige 30 volumen i trin A.
I. Trin G og H gentages ialt 10 gange. Således fjernes ca. 99,9% af det uforbrugte cyanogenbromid, medens polysac-charidkoncentrationen holdes på 25 mg/ml. Hvis cyanogenbro-midet ikke fjernes, reagerer det med diphtheria-exotoxoidet, 35 der anvendes nedenfor.
13
DK 161013 B
Eksempel 3
Fremstilling af D-AH-bærer A. I handelen værende diphtheria-exotoxoid (D) i destilleret vand inddampes til 20-40 mg/ml, typisk 35 mg/ml, 5 over en membran, der tilbageholder molekyler på over 10.000 Dalton, i en omrørt fordamper med positivt tryk.
B. En tør blanding af 8 mg adipinsyre-dihydrazid (ADH) pr. mg protein og 0,75 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid (EDAC) pr. mg protein anbringes i en 10 reaktionsbeholder udstyret med en effektiv omrører og en pH-sonde, der tillader overvågning og regulering af pH.
C. Derpå tilsættes diphtheria-exotoxoidet til reaktionsbeholderen, så at forholdet mellem reaktanterne bliver diphtheria exotoxoid = 35 mg protein/ml 15 ADH =8,0 mg/mg protein EDAC = 0,75 mg/mg protein (Anvendelsen af acetatpuffer på tilsætningen af først ADH og derpå EDAC resulterer i et vedvarende fnugget bundfald. Reaktanterne har tilstrækkelig pufringskapacitet i 20 sig selv).
D. pH justeres straks til 4,7 og holdes på 4,7±0,2 i mindst 2 timer.
1. Forløbet af den kemiske reaktion kan følges på pH-kontrollens registrator. Om nødvendigt får 25 reaktionen lov at forløbe i mere end 2 timer, indtil pH har været stabilt i mindst 15 minutter (dvs. 15 minutter, uden at det er nødvendigt at tilsætte HC1 til regulering af pH).
2. Den forbrugte mængde HC1 noteres som kontrol 30 af processen.
3. Temperaturændringer i reaktionsbeholderen overvåges ligeledes.
E. Reaktionsproduktet dialyseres ved 4°C mod to ændringer af saltvandsopløsning, et minimum på 100 volumen- 35 dele og 8 timer pr. ændring.
DK 161013 B
14 F. Produktet dialyseres derpå mod to ændringer af phosphatpufret saltvandsopløsning, minimumvolumen, tid og temperatur som i trin E.
G. Produktet (D-AH) inddampes tilbage til 25 mg/ml 5 protein med et apparat med positivt tryk og en 10.000 molekylvægt-membran .
H. Koncentratet filtreres sterilt (0,2 μ) og opbevares ved 4°C.
Analyse af en prøve af en typisk portion af en sådan 10 D-AH-bærer viser et forhold på 38,3 mikrogram ADH/mg D. Chromatografi af den samme prøve viser en Kd-værdi på CL-4B ,,Sepharose,,® på 0,75, hvilket svarer til en tilnærmelsesvis molekylvægt på 139.000 i forhold til proteinstandarder.
Eksempel 4 15 Dannelse af det covalente polysaccharid/diphtheria-toxoid--koniuaat (ΡΚΡ-ΡΪ A. Diphtheria-toxoid-adipinsyre-hydrazidbæreren (D-AH) i eksempel 3 behandles ved en koncentration på 25 mg/ml med natriumbicarbonat til en koncentration på 0,5 molær, og 20 pH justeres til 8,5. (Udtalt lavere saltkoncentrationer resulterer i dannelsen af en gel i den endelige reaktionsblanding med aktiveret polysaccharid).
B. I reaktionsbeholderen, der kan tillukkes, tilsættes en lige så stor mængde af den vaskede PRP-opløsning, der 25 blev fremstillet i eksempel 2, og pH skal ligge stabilt på 8,4-8,6. (Hvis CNBr ikke er fjernet, vil pH hurtigt glide nedad, og der vil dannes et rigeligt bundfald. Denne reaktion indtræffer, selv når der ikke er polysaccharid til stede.
Der må ikke forekomme en klar ændring af reaktanternes fysis- 3 0 ke udseende efter kombinationen).
C. Reaktionsblandingen omtumles i 15-18 timer ved 4°C.
D. Konjugatet renses ved gelpermeeringschromatografi på "Sephacry1"®-3 0 0 i ligevægt i phosphatpufret saltvandsopløsning for at fjerne uomsat protein og materiale med en 35 molekylstørrelse under 140.000 Dalton. (Hvis udgangspoly-
DK 161013B
15 saccharidet har for ringe størrelse, vil det ikke være muligt at adskille konjugatet fra frit protein på denne måde).
E. Prøver af det rensede konjugat udtages til kemisk analyse, der beskrives i det følgende afsnit af det forelig- 5 gende eksempel.
F. Der tilsættes "Thimerosal" til det rensede konjugat indtil en koncentration på 1:10.000, og produktet opbevares ved 4°C, indtil det analyseres.
G. Produktet filtreres 0,2 μ sterilt. (Hvis polysac-10 charidet ikke er størrelsesjusteret som beskrevet i eksempel 1(D), dvs. hvis det er for stort, kan det fremstillede konjugat ikke filtreres).
Analyse
Der udføres prøver på koncentratmassen i eksempel 4, 15 og disse giver følgende resultater: a) Riboseindhold: 156,5 mikrogram/ml.
(Til beregning af PRP-værdien i eksempel 5 anvendes en omregningsfaktor på 2 til udregning af en nominel poly-saccharidkoncentration baseret på den empirisk bestemte 20 ribosekoncentration).
b) Proteinindhold: 330 mikrogram/ml.
c) Ribose/protein-forhold: 0,47 (grænser 0,25-1,0).
d) Chromatografisk analyse på "Sepharose"® CL-2B giver en chromatografisk profil, der viser homogen fordeling 25 af konjugatmolekyler som en enkelt spids.
e) Kd (polysaccharid): 0,36 med "Sepharose"® C1-4B, 0,77 med C1-2B.
Bestemt ved hjælp af individuel fraktionsriboseanalyse med hensyn til PRP. En værdi på 0,36 på C1-4B svarer til en 30 tilnærmelsesvis molekylstørrelse på 674.000 i forhold til dekstranstandarder.
f) Kd (protein): 0,34 med C1-4B, 0,71 med C1-2B.
Bestemt ved individuel Lowry fraktionsanalyse med hensyn til protein. Ændringen i diphteria-exotoxoidets Kd-35 værdi fra 0,75 til 0,34 på C1-4B viser, at proteins konjuga-
DK 161013 B
16 tion med polysaccharid danner et molekyle, der er chromato-grafisk forskelligt fra begge råmaterialer.
g) Frit protein: mindre end 5%.
Frit protein repræsenterer derivatiseret diphtheria-5 bærerprotein, der ikke er blevet bundet til PRP. Det bestemmes ved at sammenligne den mængde protein, der eluerer i en diphtheria-exotoxoid-prøves stilling i forhold til det totale eluerede protein.
h) Endotoxinindhold: 1 ^g/ml.
10 Endotoxin mængdebestemmes ved Limulus Amøbocyt/lysat- analyse (LAL). Endotoxinindholdet beløber sig til 64 ng pr, 10 nq ribose dosis PRP-D til mennesker.
i) Pyrogenicitet: Koncentratmassen opfylder USA-stan-darder for ikke-pyrogenicitet, når der anvendes en vægtæk- 15 vivalent (til mennesker) dosis på 0,15 ^g ribose pr. ml pr. kg legemsvægt af kanin.
j) Polyacrylamid-gel-elektroforese (PAGE): PAGE-analyse foretages for at få yderligere bevis på renhed og covalent binding mellem polysaccharid og protein.
20 Medens fri bærer bindes lige over halvvejen i gelsøjlen, omtrent ved katalases stilling (molekylvægt 60.000), er PRP-D-konjugatet ikke i stand til at komme ind i gelen (før thyroglobulins stilling, molekylvægt 330.000). PRP-D udviser et enkelt bånd ved begyndelsen.
25 k) Cyanogenbromid:
Medens der anvendes cyanogenbromid (CNBr) i de første trin før fremstillingen af et PRP-D-konjugat, udelukkes det derefter fra produktet. Flere trin i fremgangsmåden bidrager til reduktion af CNBr-indholdet. Imidlertid fjerner den 30 endelige rensning af vaccinen ved hjælp af gelpermeerings-chromatografi enhver forurening under molekylvægt 100.000. Denne rensning udelukker forurening med residualspormængder af frit CNBr eller dettes nedbrydningsprodukter.
1) Varmestabilitet: En undersøgelse af PRP-D-kon- 35 jugatets varmemodstandsevne foretages. Materialemassen inddampes 40 fold, og der udtages 3 prøver på hver 3 ml. Den
DK 161013B
17 første holdes i et 4°C varmt bad i 16 timer, og den tredje opvarmes i et 100°C varmt vandbad i 30 minutter. Prøverne udføres med hensyn til protein- og riboseindhold, gelper-meeringschromatografi med "Sepharose"® C1-4B og SDS-polysac-5 charid-gelelektroforese (PAGE).
Resultaterne viser ingen afgørende ændring i ribose-eller proteinindhold mellem prøverne sammenlignet med resultaterne af prøverne a) og b) ovenfor. De chromatografiske analyser viser en mindre nedgang i konjugatmaterialets mole-10 kylstørrelse, efterhånden som betingelserne gøres strengere. Imidlertid bibeholder materialet efter fraktioneret analyse af disse prøver ved at måle absorbens ved 254 nm kun én spids, der falder sammen med polysaccharidspidsen, og der kommer ingen spidser for frit protein; resultaterne kan såle-15 des sammenlignes med dem for prøverne d) og g) ovenfor. Dette viser, at bindingen mellem proteinet og polysaccharidet ikke brydes, men nedgangen i molekylstørrelse skyldes brydningen af bindingerne i det lineære polysaccharid. Dette påvises yderligere ved sammenligning af PAGE-analyse af 20 disse prøver med resultaterne, der er beskrevet under j) ovenfor. Frit protein kunne ikke påvises i nogen af prøverne, selv ikke i nærvær af et detergent (natriumdodecylsulfat). Dette bekræfter stærkt den derivatiserede protein/polysac-charidbindings covalens og dens stabilitet under behandlingen 25 ved høj temperatur.
Eksempel 5 PRP-D-immunogenicitetsafprøvning
Dette forsøg er udformet for at vise T-celle-afhængig-heden, som den kommer til udtryk: i bærerafhængighed, bærer-30 specificitet, booster-virkning og ændringen af Ig-klasse. Dette forsøg udføres i to dele: 1) en indledende forberedelsesrække på to injektioner, 2) en påvirkningsrække på to injektioner.
Materialer: 35 1. PRP-D koncentratmasse, eksempel 4.
2. Tetanus-toxoid (T).
DK 161013 B
18 3. Diphtheria toxoid (D).
4. H. influenza b kapsulært polysaccharid (PRP).
5. PRP/D en blanding af 20 øg PRP (10 øg ribose) og 20 øg D.
5 6. PRP/D-AH, en blanding af 20 øg PRP (10 øg ribose) og 20 øg D-AH.
Fremgangsmåde:
Alle immuniseringer indgives subcutant uden hjælpestof i voluminer på 1 ml. Alle doser, der indeholder PRP, justeres 10 til 10 øg ribose pr. 1 ml dosis. Ukonjugerede exotoxoiddoser justeres til 20 øg protein pr. 1 ml dosis. En rotationsplan anvendes med immuniseringer med 14 dages mellemrum. Hver immunisering efterfølges af en blodaftapning 10 dage senere.
Alle præparater fortyndes i phosphatpufret saltvandsopløs-15 ning, der indeholder 0,01% "Thimerosal". Alikvote mængder fremstilles som ampuller med 4 doser og opbevares ved -20°C.
I hver gruppe immuniseres tre kaniner.
Serologi;
Sera analyseres ved hjælp af fast-fase radioimmunana-20 lyse (SPRIA) med hensyn til anti-PRP, anti-D-AH, anti-D og anti-T som anført. Antistofniveauerne mængdeangives i mikrogram IgG og IgM pr. ml.
Protokol: _SPRIA_ 25 Gruppe Primær_Sekundær_PRP D-AH D_T_ 1 PRP PRP + 2 T PRP-D + + + ' + 3 D PRP-D + + + + 4 PRP/D PRP/D + + 30 5 PRP/D-AH PRP/D-AH + + 6 PRP-D PRP-D + + +
Plan;
Kaniner tappes for blod i forvejen og immuniseres efter gruppe hver 14. dag. Hver immunisering efterfølges af 35 en eftertapning af blod 10 dage senere. De første to injektioner foretages med det primære immunogen, medens den tredje og fjerde injektion foretages med det sekundære immunogen.
DK 161013 B
19
Anti-PRP-reaktion vises på tegningen. IgG-antistofs gennemsnitsniveau over for Haemophilus influenza b kapsulært polysaccharid i de 6 forsøgsgrupper kaniner (tre dyr i hver gruppe) er vist grafisk. Grupperne er i denne figur mærket 5 ifølge ovenstående protokol. De i forvejen af tappede niveauer er under 1 jug/ml for alle kaniner og er af hensyn til tydeligheden ikke vist på tegningen. Angivelsen "PO" (forkortelse af "Post·· i tabel I) refererer til det respons, der fås efter den med et tal angivne injektion ("POl" = respons 10 efter injektion nr. 1 etc.).
Åbne kolonner viser IgG-niveauet efter to efter hinanden følgende injektioner med det primære immunogen. De udfyldte kolonner viser IgG-niveauerne efter den tredje og den fjerde injektion, som foretages med de sekundære eller 15 påvirkningsimmunogenerne.
IgG-reaktioner ses kun efter immunisering med PRP-D--konjugatvaccinen, jfr. gruppe 2, 3 og 6 på tegningen. Præparering af kaninerne i gruppe 3 med diphtheria-toxoid frem-skynder reaktionen på PRP-D, medens præparering med tetanus 20 toxoid (gruppe 2) ikke har nogen virkning.
De grupper, der er angivet i den følgende tabel I, er de samme som de, der er angivet i den ovennævnte protokol.
DK 161013 B
20
Tabel I
ANTI-PRP-RESPONS
Fastfase-radioimmunoafprøvning for IaM oa IaG
PRP Difteri-toxoid Tetanus-toxoid
5 IaG* IaM IaG IaM IaG IaM
Gruppe 1
Præ 0.0# 0 IG IG
Post 1 0.33 0 10 ±0.58
Post 2 0.8 0 ±1.39
Post 300 Post 40 0 15 Gruppe 2
Præ 0 0 0 0 0.5 0 ±0.87
Post 1 0 0 0 0 25.1 113.1 ±15.10 ±129.54 20 Post 20 0 0 0 112.00 44.60 ±0 ±36.90
Post 3 4.82 26.3 0 0 112.00 8.50 ±2.59 ±45.55 0 0 ±0 ±14.72
Post 4 36.1 74.57 0 0 151.60 2.00 25 ±17.43 ±28.81 ±52.64 ±3.46
Gruppe 3
Præ 0.2 0 0 27.07 0.8 65.00 ±0.35 ±46.88 ±1.39 ±112.58
Post 1 0.2 0 0 0 0.8 0 30 ±0.35 ±1.39
Post 2 0 14.6 6.47 0 0.67 0 ±25.29 ±5.98 ±0.59
Post 3 19.4 130.33 10.63 0 0.37 0 ±13.4 ±89.49 ±8.08 ±0.65 35 Post 4 74.2 82.63 29.03 0 1.30 0 ±76.73 ±5.16 ±26.59 ±2.25.
DK 161013 B
21
Tabel I (fortsat)
ANTI-PRP-RESPONS
Fastfase-radioimmunoafprøvning for igM oa IqG
PRP Difteri-toxoid Tetanus-toxoid
5 IaG* IaM IqG IqM IqG IqM
Gruppe 4
Præ 0 0 0 2.77 IG
±18.85 10 Post 1 0 15.6 2.67 30.87 ±27.02 ±0.85 ±27,14
Post 2 0 0 37.2 26.2 ±10.94 ±24.30
Post 300 210.00 19,63 15 ±0 ±17.06
Post 400 298.27 0 ±207.70
Gruppe 5
Præ 0 0 IG
20 Post 100 Post 200 Post 30 0
Post 40 0
Gruppe 6 25 Præ 0 0 0 0
Post 1 6.23 135.00 0 0 +2.56 +81.41
Post 2 54.2 182.00 0.93 0 ±14.73 ±0 ±1.62 30 Post 3 57.6 182.00 3.05 0 ±22.91 ±0 ±4.31
Post 4 39.6 91.20 5.95 0 ±25.17 ±0 ±8.41 * IgG og IgM udtrykkes som μg antistof pr. ml serum. Alle 35 værdier er middelværdier og standardfejl.
# Ig-niveauer under sensitiviteten for prøven angives med værdien 0 (overalt).
Hvis der er niveauer højere end området for prøven, gives denne en værdi lig den øvre grænse for prøven.
40 IG = Ikke gennemført.
Claims (3)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat, der er i stand til at frembringe T-celle-afhængig antistof-5 reaktion mod polysaccharid fra Haemophilus influenzae b, med en molekylvægt mellem 140.000 og 4.500.000 Dalton og med et ribose/protein-forhold mellem 0,25 og 1,0, kendetegnet ved, at man a) opvarmer et kapsulært polysaccharid af Haemophilus 10 influenzae b bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og phosphat, indtil mere end 60% af polysac-charidet har en molekylvægt mellem 200.000 Dalton og 2.000.000 Dalton, b) aktiverer det fremkomne størrelsesregulerede poly-15 saccharid med cyanogenbromid, c) fjerner i det væsentlige alt uomsat cyanogenbromid, og d) omsætter det aktiverede produkt med et adipinsyre--hydrazid-derivatiseret diphtheriatoxoid.
2. Hapten, i det væsentlige frit for protein og nucle- insyre, til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er fremstillet ud fra kapsulært Haemophilus influenzae b-polysaccharid, bestående af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder ribose, ribitol og 25 phosphat, ved opvarmning, indtil mindre end 20% af polysac-charidet har en molekylvægt under 200.000 Dalton, og mindre end 20% har en molekylvægt over 2.000.000 Dalton med deks-transtandard som reference ved gelpermeeringschromatografi.
3. Hapten ifølge krav 2, kendetegnet ved, 30 at polysaccharidet er til stede som natriumsalt.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39574382 | 1982-07-06 | ||
| US06/395,743 US4496538A (en) | 1982-07-06 | 1982-07-06 | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
| PCT/US1983/001007 WO1984000300A1 (en) | 1982-07-06 | 1983-07-01 | Haemophilus influenzae b polysaccharide exotoxoid conjugate vaccine |
| US8301007 | 1983-07-01 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK93584A DK93584A (da) | 1984-02-23 |
| DK93584D0 DK93584D0 (da) | 1984-02-23 |
| DK161013B true DK161013B (da) | 1991-05-21 |
| DK161013C DK161013C (da) | 1991-10-28 |
Family
ID=23564316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK093584A DK161013C (da) | 1982-07-06 | 1984-02-23 | Fremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat samt hapten, i det vaesentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved fremgangsmaaden |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4496538A (da) |
| EP (1) | EP0098581B1 (da) |
| JP (2) | JPS59501360A (da) |
| KR (1) | KR880001098B1 (da) |
| AT (1) | ATE19734T1 (da) |
| AU (1) | AU561978B2 (da) |
| CA (1) | CA1210695A (da) |
| DE (1) | DE3363505D1 (da) |
| DK (1) | DK161013C (da) |
| ES (1) | ES523905A0 (da) |
| FI (1) | FI79024C (da) |
| IE (1) | IE55268B1 (da) |
| IL (1) | IL69165A (da) |
| NZ (1) | NZ204771A (da) |
| WO (1) | WO1984000300A1 (da) |
| ZA (1) | ZA834939B (da) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4673574A (en) * | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| US5360897A (en) * | 1981-08-31 | 1994-11-01 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad |
| US4902506A (en) * | 1983-07-05 | 1990-02-20 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| US5097020A (en) * | 1983-07-05 | 1992-03-17 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| US4761283A (en) * | 1983-07-05 | 1988-08-02 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| US4762713A (en) * | 1983-07-05 | 1988-08-09 | The University Of Rochester | Boosting of immunogenic conjugate vaccinations by unconjugated bacterial capsular polymers |
| US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
| US4808700A (en) * | 1984-07-09 | 1989-02-28 | Praxis Biologics, Inc. | Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers |
| GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| IT1187753B (it) * | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
| US5374426A (en) * | 1986-09-03 | 1994-12-20 | University Of Saskatchewan | Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions |
| US5173294A (en) * | 1986-11-18 | 1992-12-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae |
| NZ223009A (en) * | 1986-12-31 | 1990-06-26 | Nl Rivm Of Thoven | Oligosaccharides containing d-ribose d-ribitol and phosphate units mimicing haemophilus influenzae type b antigens |
| US5785973A (en) * | 1988-02-01 | 1998-07-28 | Praxis Biologics, Inc. | Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines |
| EP0378929A3 (en) * | 1988-12-23 | 1990-08-01 | Connaught Laboratories Limited | Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type b |
| DE69033600T2 (de) * | 1989-03-09 | 2001-04-05 | American Cyanamid Co., Madison | Verfahren zur Isolierung von Haemopnilus influenzae Protein-E |
| WO1991001146A1 (en) * | 1989-07-14 | 1991-02-07 | Praxis Biologics, Inc. | Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines |
| GB8924473D0 (en) * | 1989-10-31 | 1989-12-20 | Connaught Lab | Outer membrane protein p1 and peptides of haemophilus influenzae b |
| DE69019164T2 (de) * | 1989-12-14 | 1995-09-07 | National Research Council Of Canada, Ottawa, Ontario | Verbessertes meningokokkale polysaccharidkonjugatvakzin. |
| GR1001220B (el) * | 1990-08-06 | 1993-06-21 | Praxis Biolog Inc | Φορεις κυτοκινης και ορμονης για συζευγμενα εμβολια. |
| US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
| CA2059692C (en) * | 1991-01-28 | 2004-11-16 | Peter J. Kniskern | Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine |
| CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
| US5476929A (en) * | 1991-02-15 | 1995-12-19 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
| US5965141A (en) * | 1991-02-15 | 1999-10-12 | Uab Research Foundation | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a |
| DK0571538T5 (da) * | 1991-02-15 | 2002-03-04 | Uab Research Foundation | Strukturgen for pneumokokprotein |
| US5980909A (en) | 1991-02-15 | 1999-11-09 | Uab Research Foundation | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A |
| AU685047B2 (en) * | 1992-02-11 | 1998-01-15 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Dual carrier immunogenic construct |
| CA2105629A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-15 | Robert S. Becker | Potentiation of immunogenic response |
| US5604108A (en) * | 1992-09-14 | 1997-02-18 | Connaught Laboratories, Inc. | Test for determining the dose response of a conjugated vaccine |
| US5686078A (en) * | 1992-09-14 | 1997-11-11 | Connaught Laboratories, Inc. | Primary and secondary immunization with different physio-chemical forms of antigen |
| US5955089A (en) | 1993-04-20 | 1999-09-21 | Uab Research Foundation | Strain selection of pneumococcal surface proteins |
| NZ275772A (en) * | 1993-11-08 | 1998-04-27 | Connaught Lab | Haemophilus transferrin receptor genes and proteins including production and use |
| US6361779B1 (en) | 1993-11-08 | 2002-03-26 | Aventis Pasteur Limited | Transferrin receptor genes |
| AU699913B2 (en) * | 1993-11-10 | 1998-12-17 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Compositions and method for stimulating antibody release by B lymphocytes |
| WO1996020012A2 (en) * | 1994-12-23 | 1996-07-04 | Middlesex Sciences, Inc. | Methods for preparing and purifying macromolecular conjugates |
| NZ304715A (en) * | 1995-03-22 | 1999-07-29 | Jackson H M Found Military Med | Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten |
| DE122009000056I1 (de) * | 1995-03-22 | 2010-01-28 | Jackson H M Found Military Med | Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden |
| US5811102A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-22 | National Research Council Of Canada | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |
| US6432669B1 (en) | 1998-10-07 | 2002-08-13 | Aventis Pasteur Limited | Protective recombinant Haemophilus influenzae high molecular weight proteins |
| US6342232B1 (en) | 1999-03-03 | 2002-01-29 | Aventis Pasteur Limited | Multi-component vaccine comprising at least three antigens to protect against disease cased by Haemophilus influenzae |
| US6335182B1 (en) | 1999-03-16 | 2002-01-01 | Aventis Pasteur Limited | Recombinant Haemophilus influenzae adhesin proteins |
| US7785609B1 (en) | 1999-03-16 | 2010-08-31 | Sanofi Pasteur Limited | Recombinant Haemophilus influenzae adhesin proteins |
| US6391313B1 (en) | 1999-07-15 | 2002-05-21 | Aventis Pasteur Limited | Multi-component vaccine to protect against disease caused by Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis |
| AU2000278267A1 (en) * | 2000-09-01 | 2002-03-22 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Vibrio cholerae o139 conjugate vaccines |
| GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| FI114275B (fi) * | 2002-05-31 | 2004-09-15 | Nokia Corp | Taajuudenvälisten kanavavaihtojen hallinta |
| WO2005000884A1 (en) * | 2003-06-05 | 2005-01-06 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Poly-gamma-glutamic conjugates for eliciting immune responses directed against bacilli |
| CN1984679B (zh) * | 2004-06-04 | 2013-05-15 | 美国政府健康及人类服务部 | 制备免疫原性结合物的方法 |
| US7625736B2 (en) | 2004-06-04 | 2009-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for preparing immunogenic conjugates |
| RU2487890C2 (ru) | 2007-04-16 | 2013-07-20 | МинерваКС Апс | Слитый белок, способный индуцировать защитный иммунитет против стрептококка группы в, и вакцина, содержащая такой белок |
| MX2012006961A (es) * | 2009-12-17 | 2012-10-03 | Fina Biosolutions Llc | Reactivos quimicos para la activacion de polisacaridos en la preparacion de vacunas conjugadas. |
| US9804618B2 (en) | 2014-03-26 | 2017-10-31 | Ethicon Llc | Systems and methods for controlling a segmented circuit |
| WO2017117539A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Northwestern University | Cell-free glycoprotein synthesis (cfgps) in prokaryotic cell lysates enriched with components for glycosylation |
| US10829795B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-11-10 | Northwestern University | Method for rapid in vitro synthesis of glycoproteins via recombinant production of N-glycosylated proteins in prokaryotic cell lysates |
| EP3323424A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-23 | Cyanimal IP | Cyaa polypeptides as immune enhancer |
| WO2018144799A1 (en) | 2017-02-03 | 2018-08-09 | SCHADECK, Eva, Barbara | Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof |
| US12257295B2 (en) | 2017-10-04 | 2025-03-25 | Pogona, LLC | Saccharide-polypeptide conjugate compositions and methods of use thereof |
| US11530432B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-12-20 | Northwestern University | Compositions and methods for rapid in vitro synthesis of bioconjugate vaccines in vitro via production and N-glycosylation of protein carriers in detoxified prokaryotic cell lysates |
| CA3126492A1 (en) | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Northwestern University | Bioconjugate vaccines synthesis in prokaryotic cell lysates |
| US12226410B2 (en) | 2019-10-18 | 2025-02-18 | Northwestern University | Methods for enhancing cellular clearance of pathological molecules via activation of the cellular protein ykt6 |
| US12503715B2 (en) | 2019-10-25 | 2025-12-23 | Northwestern University | Cell-free extract preparation protocol for enrichment of membrane vesicles and increased glycoprotein yields |
| WO2021176409A1 (en) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | Sanofi Healthcare India Private Limited | Preservative combination for vaccine composition |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4185090A (en) * | 1972-02-02 | 1980-01-22 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| FR2407262A1 (fr) * | 1977-10-27 | 1979-05-25 | Cassenne Lab Sa | Nouveaux polysaccharides extraits de corps microbiens d'haemophilus influenzae, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouveaux produits |
| US4196192A (en) * | 1977-10-28 | 1980-04-01 | American Cyanamid Company | Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine |
| US4220717A (en) * | 1977-12-22 | 1980-09-02 | American Cyanamid Company | Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b. |
| US4264764A (en) | 1979-01-12 | 1981-04-28 | Merck & Co., Inc. | Meningitis vaccine |
| US4307080A (en) * | 1979-09-24 | 1981-12-22 | Merck & Co., Inc. | Meningitis vaccine |
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
-
1982
- 1982-07-06 US US06/395,743 patent/US4496538A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-06-30 NZ NZ204771A patent/NZ204771A/en unknown
- 1983-06-30 CA CA000431535A patent/CA1210695A/en not_active Expired
- 1983-07-01 AU AU18227/83A patent/AU561978B2/en not_active Expired
- 1983-07-01 JP JP58502510A patent/JPS59501360A/ja active Granted
- 1983-07-01 WO PCT/US1983/001007 patent/WO1984000300A1/en not_active Ceased
- 1983-07-05 IE IE1574/83A patent/IE55268B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-07-05 IL IL69165A patent/IL69165A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-07-05 KR KR1019830003069A patent/KR880001098B1/ko not_active Expired
- 1983-07-05 DE DE8383106552T patent/DE3363505D1/de not_active Expired
- 1983-07-05 EP EP83106552A patent/EP0098581B1/en not_active Expired
- 1983-07-05 AT AT83106552T patent/ATE19734T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-07-06 ES ES523905A patent/ES523905A0/es active Granted
- 1983-07-06 ZA ZA834939A patent/ZA834939B/xx unknown
-
1984
- 1984-02-23 DK DK093584A patent/DK161013C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-03-05 FI FI840874A patent/FI79024C/fi not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-30 JP JP3056227A patent/JPH07121872B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1822783A (en) | 1984-02-08 |
| DK161013C (da) | 1991-10-28 |
| DK93584A (da) | 1984-02-23 |
| NZ204771A (en) | 1987-03-06 |
| AU561978B2 (en) | 1987-05-21 |
| FI79024C (fi) | 1989-11-10 |
| JPH07121872B2 (ja) | 1995-12-25 |
| US4496538A (en) | 1985-01-29 |
| ES8500745A1 (es) | 1984-11-01 |
| FI79024B (fi) | 1989-07-31 |
| JPS59501360A (ja) | 1984-08-02 |
| ATE19734T1 (de) | 1986-05-15 |
| JPH0347253B2 (da) | 1991-07-18 |
| IL69165A (en) | 1987-11-30 |
| WO1984000300A1 (en) | 1984-02-02 |
| EP0098581A3 (en) | 1984-02-15 |
| ES523905A0 (es) | 1984-11-01 |
| DK93584D0 (da) | 1984-02-23 |
| KR840005488A (ko) | 1984-11-14 |
| DE3363505D1 (de) | 1986-06-19 |
| IE55268B1 (en) | 1990-07-18 |
| IE831574L (en) | 1984-01-06 |
| JPH05262668A (ja) | 1993-10-12 |
| FI840874A7 (fi) | 1984-03-05 |
| ZA834939B (en) | 1984-08-29 |
| CA1210695A (en) | 1986-09-02 |
| IL69165A0 (en) | 1983-11-30 |
| KR880001098B1 (ko) | 1988-06-29 |
| EP0098581B1 (en) | 1986-05-14 |
| FI840874A0 (fi) | 1984-03-05 |
| EP0098581A2 (en) | 1984-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK161013B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt covalent polysaccharid-diphtheria-toxoid-konjugat samt hapten, i det vaesentlige frit for protein og nucleinsyre, til anvendelse ved fremgangsmaaden | |
| US4619828A (en) | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines | |
| US4711779A (en) | Glycoproteinic conjugates having trivalent immunogenic activity | |
| US4644059A (en) | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine | |
| DK171421B1 (da) | Polysaccharidforbindelse og fremgangsmåde til fremstilling deraf | |
| US5681570A (en) | Immunogenic conjugate molecules | |
| DK171420B1 (da) | Kovalent-modificeret bakterielt polysaccharid/protein-konjugat, fremgangsmåde til fremstilling deraf og præparat omfattende et polysaccharid/protein-konjugat | |
| EP0658118B1 (en) | Vaccines against group c neisseria meningitidis | |
| NO300759B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et kovalent konjugat av et oligosakkarid og et bærerprotein | |
| KR920014829A (ko) | 뉴모코커스 다당류 결합체 백신 | |
| US5192540A (en) | Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine | |
| EP0117783A2 (en) | Coupled haemophilus inflenzae type B vaccine | |
| WO2000033882A1 (en) | A vi-repa conjugate vaccine for immunization against salmonella typhi | |
| JPH0561255B2 (da) | ||
| AU627455B2 (en) | Haemophilus influenza type B oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine | |
| Polotsky et al. | Comparison of conjugates composed of lipopolysaccharide from Shigella flexneri type 2a detoxified by two methods and bound to tetanus toxoid | |
| Karakawa et al. | Immunochemical analysis of a Smith-like antigen isolated from two human strains of Staphylococcus aureus | |
| US10172928B2 (en) | Purification of streptococcal capsular polysaccharide | |
| CN115006522B (zh) | 一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法 | |
| NO157603B (no) | Fremgangsmÿte for fremstilling av et vannopplelig kovale nt polysakkarid difteri/toksoid konjugat samt et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |