DK161021B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af fluorerede diaminoheptynderivater eller farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

! DK 161021B

O

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte, farmaceutisk anvendelige fluorerede diaminoheptynderivater, der in vivo er inhibitorer af et decarboxylaseenzym, der indgår i poly-5 amindannelse i organismer.

Decarboxylering af ornithin til putrescin, en reaktion, der katalyseres af enzymet ornithindecarboxylase (ODC), er det første trin i biosyntesen af de polyaminer, der er kendt som spermidin og spermin. Spermidin dannes 10 ved overføring af en aktiveret aminopropylmolekyldel fra S-adenosyl-S-methylhomocysteamin til putrescin, medens spermin dannes ved overføring af en anden aminopropylgruppe til spermidin. S-Adenosyl-S-methyl-homocysteamin dannes ved decarboxylering af s-adenosylmethionin (SAM), en reak-15 tion, der katalyseres af enzymet S-adenosylmethionindecar- boxylase (SAM-DC).

Polyaminerne, der findes i dyrevæv og mikroorganismer, vides at spille en vigtig rolle ved cellevækst og celledeling. Igangsætningen af cellevækst og celledeling er for-20 bundet med både en udpræget forøgelse af ODC-aktivitet og en forøgelse i putrescins og polyaminernes niveau. Selv om man ikke kender den nøjagtige mekanisme ved polyaminernes rolle ved cellevækst og celledeling, synes det, at være således, at polyaminerne kan lette makromolekylære frem-25 gangsmåder såsom DNA-, RNA- eller proteinsyntese. Man ved, at polyaminniveauer er høje i fostervæv, i testikler, i ventral prostata og thymuskirtel, i tumorvæv, i psoriasishudlæsioner og i andre celler, hvori der foregår hurtig vækst eller celledeling.

30 Eftersom putrescin er forstadiet til både spermidin og spermin, skulle en blokering af omdannelsen af ornithin til putrescin, såsom ved inhibering af ODC, hindre ny biosyntese af disse polyaminer og således give gavnlige fysiologiske virkninger.

35 I engelsk patentskrift nr. 2.003.876A anføres det bl.a., at forbindelser med nedenstående formel A er inhibitorer af ornithindecarboxylase:

DK 161021 B

2

O

CF H,-p A

i P 3 H2N(CH2)3-CH-NH2 hvor p er 1 eller 2.

5 Desuden er det anført i engelsk patentskrift nr.

2.001.058A, at forbindelserne med nedenstående formel B

Y

h2n(ch2)3-ch-nh2 B

10 hvor Y er ethynyl (dvs. CH=C-), er ornithindecarboxyl-aseinhibitorer.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af fluorerede diaminoheptyn-derivater med den almene formel 15 Y CF H- . . P 3-p

h2n-ch-ch2-ch2-ch-nh2 I

hvor Y er CH=C-, og p er 1 eller 2, 20 eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

Forbindelserne med formlen I inhiberer ornithin-decarboxylasenzym (ODC) in vitro og in vivo og frembringer en nedgang i putrescin- og spermidinkoncentrationer i celler, hvor den aktive biosyntese af polyaminer finder 25 sted. Forbindelserne med formlen I er derfor anvendelige til hos pattedyr at regulere uønsket cellevækst eller celledeling. Forbindelserne med formlen I er anvendelige farmakologiske midler til behandling af sådanne sygdomme eller tilstande, der er kendetegnet ved høj ODC-aktivitet.

30 Især er forbindelserne anvendelige til systemisk at regulere vækst af tumorvæv hos pattedyr, til behandling af godartet prostatahypertrofi og til regulering af væksten af patogen parasitprotozoer hos inficerede husdyr og mennesker.

35 Forbindelserne med formlen i kan også anvendes til at undersøge tilstedeværelsen og den fysiologiske funktion

DK 161021B

3 jl i af ODC-inhibering i biologiske systemer og disses forbindelse med patologiske processer.

Forbindelserne med formlen I, der fremstilles ifølge opfindelsen, adskiller sig fra de fra GB 2.003.876 A kendte 5 forbindelser derved, at de har en ethynylgruppe i 5-stillin-gen i pentankæden. Det er fagfolk bekendt, at det ikke med nogen sikkerhed er muligt at forudsige den mulige enzymin-hiberende aktivitet af nye klasser forbindelser. Der er i GB 2.003.876 A ingen angivelser om virkningen af en indføring 10 af to aktive steder (dvs. mono- eller difluormethyl og ethynyl) i det samme molekyle. Forbindelserne ifølge GB skriftet er derivater af putrescin, hvor kun én aminogruppe er aktiveret ved tilstedeværelsen på det tilstødende C-atom af en fluoreret methylgruppe. Tilsvarende omtales der i GB 15 2.001.058 A, jfr. ovenfor, derivater af putrescin (dvs.

1,4-diamino-butan), hvor kun én aminogruppe er aktiveret ved tilstedeværelsen af en ethynylgruppe på det tilstødende C-atom.

I begge de fra de nævnte GB skrifter kendte forbindel-20 sesklasser er 5-amionogruppen ikke aktiveret, og der findes i skrifterne ingen angivelser om den mulige eller sandsynlige virkning på enzymaktiviteten af forbindelserne ved aktivering af den nævnte aminogruppe. Skrifterne indeholder i øvrigt intet forslag om aktivering af 5-aminogruppen.

25 Det bemærkes, at man antager, at den ornithindecar- boxylase-inhiberende aktivitet af de ovennævnte, kendte forbindelser indebærer fjernelse af et H-atom fra den fluore-rede methylgruppe eller fra ethynylgruppen. Denne fjernelse fører til dannelse af en Michael-acceptor ved det enzymaktive 30 sted. Det resulterende elektrofile molekyle reagerer med en nucleofil rest på det enzymaktive sted til inaktivering af enzymet. Forud for hydrogenfjernelsen går der en dannelse af en Schiff'sk base med pyridoxalphosphat ved aminogruppen i α-stilling til den fluorerede methylgruppe eller ethynyl-35 gruppen. Virkningen på denne mekanisme af en aktivering af 5-aminogruppen kunne ikke forudses eller forudsiges.

DK 161021B

4

Det er således overraskende, at de her omhandlede forbindelser I har den angivne virkning.

De her omhandlede forbindelsers ODC-aktivitet kan bestemmes in vitro ved den metode, der er beskrevet af B.Metcalf 5 m.fl. i J. Am. Chem. Soc., 100, 2551 (1978). ODC-akti-viteten af forbindelserne med formlen I kan bestemmes in vivo ved hjælp af den metode, der er beskrevet af C. Danzin i Biochemical Pharmacology, 2J3, 627 (1979) .

I ovennævnte almene formel I er Y ethynyl 10 (dvs. CH=C-).

I formlen I er p 1 eller 2. Det er klart, at når p er 1, er forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, mono-fluormethylderivater, og når p er 2, er de dif luormethylderivater. Det foretrækkes# ,at p er 1.

15 Eksempler på farmaceutisk acceptable salte af de omhandlede forbindelser omfatter ikke-toksiske syreadditionssalte dannet med uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrinte-syre, svovlsyre og phosphorsyre, eller med organiske syrer såsom organiske carboxylsyrer, f.eks. salicylsyre, maleinsyre, O Λ malonsyre, vinsyre, citronsyre og ascorbinsyre, samt organiske sulfonsyrer, f.eks. methansulfonsyre.

Ved en foretrukket! udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås der forbindelser med nedenstående almene formel IA: 25 C=CH CF H- i » P 3-p h2n-ch-ch2-ch2-ch-nh2 hvor p har den ovenfor anførte betydning, eller farma-30 ceutisk acceptable salte deraf.

Eksempler på forbindelser, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er nedenstående: l-Fluor-2,5-diamino-6-heptyn, og 1,l-difluor-2,5-diamino-6-heptyn.

35 Man mener, at forbindelserne med formlen I er sub strat-inducerede irreversible inhibitorer af ornithindecarboxy-

O

5 DK 161021 B

lase. Sådanne inhibitorer er også kendt som "enzym -aktiverede irreversible inhibitorer", "selvmordsenzyminhibitorer", K -

Celt -inhibitorer" eller "på mekanisme baserede inhibitorer".

For at en forbindelse skal være en substrat-induceret irre-5 versibel enzyminhibitor, skal forbindelsen være substrat for målenzymet, og forbindelsen skal indeholde en latent reaktions-dygtig gruppe, der er i stand til at blive afdækket som et resultat af enzymets normale katalytiske virkning. Afdækningen af den latent reaktionsdygtige gruppe ved hjælp af enzymets 10 indvirkning danner en reaktionsdygtig funktion, der alkylerer en nucleophil rest, der er til stede ved enzymets aktivitetssted. Der dannes således en covalent binding mellem inhibitoren og enzymet ved aktivitetsstedet, hvilket resulterer i irreversibel inaktivering af enzymet. Sådanne inhibitorer 15 er yderst specifikke, eftersom inhibitoren skal udgøre et substrat for målenzymet, og eftersom bioomdannelsen af inhibitoren ved hjælp af målenzymet er nødvendig, før enzymet inaktiveres. Selv om man mener, at forbindelserne med formlen I i almindelighed udøver deres virkning ved hjælp 20 af en substratfremkaldt mekanisme, kan der forekomme inhibering ved hjælp af andre mekanismer, såsom konkurrerende inhibering.

Som anvendt her, betyder "tumorvæv" både godartede, og ondartede tumorer eller neoplasmer og indbefatter leukæmi, 25 lymphomer, melanomer og sarcomer. Udtrykket "regulering af vækst af tumorvæv" som anvendt her betyder forhaling,· afbrydelse, tilbageholdelse og standsning af væksten af en hurtigt celledelende tumor hos et varmblodet dyr. Det skal forstås, at indgivelsen af en forbindelse med formlen I 30 ikke udgør nogen "helbredelse" af tumoren i den betydning, at tumorvævet ødelægges eller totalt elimineres fra det dyr, der behandles.

Til regulering af vækst af tumorvæv kan en forbindelse med formlen I indgives til patienten kombineret med 35 ♦ andre terapeutiske metoder eller kombineret med cytotoksiske præparater, der er kendt som værende anvendelige til cancer- 0

c DK 161021B

ο kemoterapi. Således kan en forbindelse med formlen I indgives kombineret med kururgisk fjernelse af tumoren eller med stråleterapi, hormonbehandling, immunoterapi eller lokal varmeterapi. Desuden kan en forbindelse med formlen I 5 indgives til en patient kombineret med et kemisk cyto- toksisk middel, der er kendt som værende anvendeligt til tumorkemoterapi. Når der benyttes en sådan kombineret terapi til behandling af en tumor, kan det cancer-kemoterapeutiske middel indgives i en dosis, som vides at være effektiv 10 til behandling af tumoren. Imidlertid kan en forbindelse med formlen I frembringe en additiv eller synergistisk virkning sammen med et kemoterapeutisk middel over for en bestemt tumor. Når der således anvendes en sådan kombineret antitumorterapi, kan doseringen af det indgivne kemotera-15 peutiske middel være mindre end den, der indgives, når midlet anvendes alene. Sammen med en forbindelse med formlen I kan det kemoterapeutiske middel derfor indgives i et lavere dosisniveau eller med længere intervaller i forhold til, når det kemoterapeutiske 20 middel anvendes alene.

Kombineret med en forbindelse med formlen I kan et hvilket som helst cancer-kemoterapeutisk middel anvendes. Præparater, der almindeligvis anvendes til cancer-kemoterapi, er beskrevet i The Medical Letter, bd. 22, nr. 24 (udgivelse 25 571), 28. november 1980, offentliggjort af the Medical Letter

Inc., New Rochalle, N.Y., 10801. Eksempler på cytotoksiske kemoterapeutiske midler er cyclophoshamid, methotrexat, prednison, 6-mercaptopurin, procarbozin, daunorubicin, vineristin, vindesin, vinblastin, chlorambucil, cytosin-30 -arabinosid, 6-thioguanin, thio-TEPA, 5-fluoruracil, 5-fluor-2-deoxyuridin, 5-azacytidin, nitrogensennep, 1,3--bis(2-chlorethyl)-1-nitrosourinstof (BCNU), l-(2-chlor-ethyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourinstof (CCNU), busulfan, adriamycin, bleomycin, eyeloleuein eller methylglyoxan-35 -bis-(guanylhydrazon) (MGBG). Andre cancer-kemoterapeutiske midler vil være kendt af fagfolk.

7 DK 161021B

O

Virkningen af forbindelserne med formlen I med hensyn til bekæmpelse af væksthastigheden i hurtigt celledelene tumorvæv kan bedømmes ved standard-dyretumormodeller efter oral eller parenteral indgivelse. Således kan antitumorvirk-5 ningerne f.eks. påvises ved følgende modellers (a) L1210-leu-kæmi hos mus, (b) EMT 6-tumor hos Balb/C-mus, (c) 7,12-dime-thylbenzantracen-fremkaldt (DMBA-fremkaldt) brysttumor hos rotoer eller (d) Morris 7288 C eller 5123 hepatom hos Buffalo--rotter. Desuden kan forbindelsernes antitumorvirkninger kombi-10 neret med kemoterapeutiske midler påvises ved dyreforsøg.

Når en forbindelse med formlen I til behandling af en malign neoplastisk sygdom indgives kombineret med et kemoterapeutisk middel, kan den terapeutiske virkning af det kemoterapeutiske middel potentieres derved, at den 15 remission, der fremkaldes af det kemoterapeutiske middel, kan forøges, og genvækst af tumorvævet kan forhales eller hindres. Anvendelse af en sådan kombinationsterapi tillader derfor mindre doser og færre enkeltdoser af det kemoterapeutiske middel, der skal anvendes. På denne måde 20 gøres de skadelige og/eller svækkende bivirknigner af det kemoterapeutiske middel så små som muligt, medens samtidig antitumorvirkningerne forøges. Udtrykket "kombinationsterapi" omfatter indgivelse af en forbindelse med formlen I umiddelbart før påbegyndelsen af kemoterapi, sideløbende 25 med kemoterapi eller i tidsrummet straks efter ophør eller afbrydelse af kemoterapi.

Når kemoterapi resulterer i remission af tumoren, og alle tumorceller ikke er ødelagt, kan genvækst af tumoren hindres eller forhales i ubestemt tid ved fortsat behand-3° ling med en forbindelse med formlen I. Således kan en forbindelse med formlen I indgives for at standse eller forhale tumorvæksten i de perioder, hvor kemoterapi med et cytotoksisk middel midlertidig afbrydes.

Et foretrukket cytotoksisk middel til kombinations-35 terapi med en forbindelse med formlen I er methylglyoxal- -bis-(guanylhydrazon), her omtalt som MGBG, der også er

O

8

DK 161021B

inhibitor af S-adenosylmethionindecarboxylase. MGBG's aktivitet som kemoterapeutisk middel ved behandling af neoplastiske sygdomme er veldokumenteret. Således rapporterer W.A. Knight m.fl. i Cancer Treat. Rep., 43, 1933 (1979), 5 at en dosis MGBG, der indgives intravenøst én eller to gange om ugen til patienter med et fremskredent stadium af carcinom i blære, oesophagus, lunge, pancreas, colon, nyre, bryst og prostata, "havrecelle"-carcinom, adenocarcinom, lymphom, hepatom, melanom, leukæmi eller Edwing's sarcom, 10 fremkalder en målelig regression af tumoren hos mange patienter, der behandles, og fuldstændig forsvinden af sygdommen hos 2 af 65 behandlede patienter.

Den mængde MGBG, der skal indgives, kan være den samme, som den mængde man ved er effektiv ved tumorterapi.

15 Effektive og ikke-toksiske doser fastsættes af lægen i hvert tilfælde, idet den enkelte patients tilstand tages i betragtning. Således kan en dosis på 250-500 mg/m kropsoverflade gives som infusion én eller to gange ugentligt i 100 ml 5%'s dekstroseopløsning i løbet af et tidsrum 20 på 30 minutter. Kombinationsterapi med en forbindelse med formlen I forbedrer tumorvævets reaktion på MGBG's cytotoksiske virkning og tillader anvendelse af en mindre individuel dosis MGBG og et kortere behandlingsforløb, end hvis der anvendes MGBG alene.

25 Egnede doseringer af forbindelserne med formlen I

til anvendelse til kombinationsterapi med MGBG eller andre cancer-kemoterapeutiske midler kan være en hvilken som helst mængde, der er effektiv til tilstrækkelig inhibering af polyaminbiosyntesen til at bekæmpe tumorens væksthastighed 30 eller opnå forøget respons på det cytotoksiske middel, der indgives samtidig hermed.

Udtrykket "bekæmpelse af vækst af patogene parasitiske protozoer", som det anvendes her, betyder forhaling, afbrydelse, bremsning eller standsning af protozoreplika-35 tionen hos en inficeret værtsorganisme. Forbindelserne med formlen I er særligt anvendeligt overfor T.b. brucei (der

DK 161021 B

9

O

fremkalder trypanosomiase hos kvæg), T.B. rhodensi- ense {der fremkalder sovesyge hos mennesker), cocci- dier, f.eks. Eimeria tenella (der forårsager coccidiose i mavetarmskanalen hos fjerkræ (f.eks. høns, kalkuner og 5 ænder) og en exoerythrocytisk form for plasmodi, f.eks. plasmodium falciparum (der giver malaria hos mennesker).

Den antiprotozoiske aktivitet hos forbindelserne med formlen I kan påvises in vivo eller in vitro ved mikrobiologiske standardprøvemetoder. Således kan forbindelsernes aktivitet over for T.b.brucei og T.b. rhodesiense f.eks. konstateres hos inficerede mus ved at indgive prøveforbindelsen ad lib daglig (3-15 dage efter inficering) som en opløsning i drikkevandet. Aktiviteten viser sig som en forøgelse 15 i overlevelsestid (sammenlignet med ubehandlede kontroldyr) eller ved, at der ikke forekommer parasiter i blodet. Forbindelsernes aktivitet overfor coccidia kan konstateres hos inficerede kyllinger, f.eks. inficeret med E. tenella, ved indgivelse af prøveforbindelsen daglig ad libitum 20 (fra én dag før inficering til 5 dage efter inficering) som en opløsning i drikkevandet. De caecale læsioner bedømmes ved en standardpointmetode af læsionerne.

(Jfr. Reid. Am. J. Vet Res., 3J3, 447 (1969) og Avian

Coccidiosis, P. Long, udg., British Poultry Science, Ltd., 25

Edinburgh). Forbindelsernes aktivitet over for malaria (p. faleiparum) kan konstateres ved en in vitro standard pladedyrkningsprøve (jfr. K. Rieckmannm.fi., Lancet, 1, 22 (1978)). Antimalaria-aktivitet kan også konstateres hos særlige musestammer, der er inficeret med den 30 exoerythrocite form af p. berghei. Ved denne prøve indgives forbindelsen ad libitum i drikkevand, begyndende to dage før inficering og fortsættende til 28 dage efter inficering. Aktiviteten måles ved en signifikant nedgang i dødsfald sammenlignet med kontroldyrene eller 35 ved en signifikant forøgelse af overlevelsestid.

O

10 DK 161021 B

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan indgives på flere forskellige måder for at opnå den ønskede virkning. Forbindelserne kan indgives alene eller i form af farmaceutiske præparater enten oralt eller parenteralt, 5 f.eks. subcutant, intravenøst eller interperitonealt.

Den indgivne mængde forbindelse kan Variere og kan være en hvilken som helst effektiv mængde. Afhængigt af patienten, den lidelse, der behandles, og indgivelsesmåden kan den effektive dosis af den indgivne forbindelse variere fra 10 ca. 5 mg/kg til ca. 500 mg/kg legemsvægt af patienten pr.

dag. Enhedsdoser af disse forbindelser kan f.eks. indeholde fra ca. 10 mg til ca. 500 mg af forbindelserne og kan f.eks. indgives 1-4 gange daglig.

Udtrykket "enhedsdoseringsform" anvendes her i 15 betydningen en dosisform indeholdende en enkelt eller flere doser med en vis mængde aktivt stof blandet med eller på anden måde kombineret med fortyndingsmiddel eller bærestof, idet denne mængde er afpasset således, at én eller flere forudbestemte enheder i reglen er nødvendige 20 til en enkelt terapeutisk indgivelse. Når det drejer sig om dosisformer med flere doser, såsom væsker eller tabletter med delespalte, kan den forudberegnede enhed være en brøkdel, såsom en mængde på 5 ml (teske) væske eller en halv eller en kvart tablet med delespalte, af dosisformen 25 med flere doser.

Forbindelserne kan anvendes i farmaceutiske præparater, hvilket er den form, hvori de aktive forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmåden, normalt anvendes. Sådanne præparater fremstilles på i og for sig 30 kendt måde inden for farmacien og indbefatter i reglen mindst én aktiv forbindelse som her omhandlet blandet med eller på anden måde kombineret med en farmaceutisk acceptabel bærer eller et fortyndingsmiddel. Til fremstilling af disse præparater blandes det aktive stof i 35 reglen med et bærestof eller fortyndes med et fortyndingsmiddel eller indelukkes eller indkapsles i en kapsel, 11

DK 161021 B

o beholder, oblatkapsel, papir eller anden beholder. Bærestoffet eller fortyndingsmidlet kan være fast, halvfast eller flydende materiale, der fungerer som bærestof, excipiens eller medium for det aktive stof. Egnede bære-5 stoffer eller fortyndingsmidler er kendte.

Præparaterne kan være tilpasset enteral eller parenteral anvendelse og kan indgives patienten i form af f.eks. tabletter, kapsler, suppositorier, opløsninger eller suspensioner.

10 Fremgangsmåderne til fremstilling af forbindelserne med formlen I vil nu blive beskrevet. Hvis en aminogruppe i en reaktant i et af de her beskrevne reaktionstrin kunne blive inddraget i en uønsket reaktion under de pågældende reaktionsbetingelser, vil aminogruppen blive beskyttet 15 på i og for sig kendt måde ved indførelse af en passende beskyttelsesgruppe. Beskyttelsesgruppen vil blive valgt under hensyn til den pågældende reaktions art og til, at den nemt skal kunne fjernes fra aminogruppen. Beskyttelsesgruppen kan f.eks. vælges blandt acyl, såsom lavere 20 alkanoyl, f.eks. acetyl, propionyl eller trifluoracetyl, aroyl, f.eks. benzoyl, eller toluoyl, lavere alkoxycarbonyl, f.eks. methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl eller tert.butoxy-carbonyl, carbobenzoxy, benzensulfonyl og tosyl. Begge aminohydrogenatomer kan være substitueret med en enkelt 25 beskyttelsesgruppe, f.eks. phthalyl. Beskyttelsesgrupperne indføres på i og for sig kendt måde, f.eks. omsætning af aminen med et lavere alkanoyl- eller aroylchlorid, anhydrid, sulfonylchlorid, tert.butoxycarbonyloxyimino-2-phenyl- acetonitril (BOC-ON) eller di-tert.butyldicarbonat ((BOC^O).

30

Fjernelse af beskyttelsen, efter at den nødvendige reaktion er afsluttet, kan ske på i og for sig kendt måde for den pågældende beskyttelsesgruppe. I reglen vil fjernelse ske ved hydrolytisk fraspaltning ved hjælp af en stærk organisk eller mineralsyre, f.eks. trifluoreddikesyre 35 eller saltsyre, eller med hydrogenchloridgas under vandfri betingelser. Anvendelsen af betingelser, der vil bevirke

DK 161021 B

12

O

reduktion af den umættede binding, eller af reaktanter, såsom brombrintesyre, der vil reagere med den umættede dobbeltbinding, skal undgås. Opløsningsmidler, der anvendes, skal vælges i overensstemmelse med betingelserne for 5 fjernelse af beskyttelsesgruppen. F.eks. kan ethere såsom diethylether anvendes til fraspaltning ved hjælp af hydrogen-chloridgas.

Når det drejer sig om tilfælde, hvor en acetylenisk gruppe skal beskyttes, er den foretrukne beskyttelsesgruppe 10 trialkylsilyl, især trimethylsilyl, der let kan indføres ved omsætning af den frie acetyleniske gruppe med et trialkylsilylchlorid. Trialkylsilylgruppen kan let fjernes ved basehydrolyse, så at den acetyleniske gruppe frigøres.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig 15 ved, at et amino- og acetylen-beskyttet derivat af propargyl-amin alkyleres med et halogenid med den almene formel CF Η- Λ « P 3-p

X-CH2-CH2-CH-NH2 III

20 hvor X er brom, chlor eller iod, og p er 1 eller 2, hvorefter de beskyttende grupper fjernes, og den dannede forbindelse om Ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

25 I ovenstående formel III er X fortrinsvis iod.

Den foretrukne acetylen-beskyttende gruppe er trialkylsilyl, især trimethylsilyl, og den foretrukne amino--beskyttende gruppe er tert.butoxycarbonyl.

30 Reaktionen forløber via carbanionen af den beskyt tede propargylamin. Carbanionen kan passende dannes ved anvendelse af overskud af stærk base, såsom et alkyllithium-eller lithium-dialkylamid, især lithium-di-isopropylamid, i et aprot organisk opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran, 35 ved ca. -70°C i nærvær af et lithium-kopleksdannende middel, f.eks. tetramethylethylendiamin.

DK 161021 B

13

O

Halogenidreaktanten sættes til opløsningen af carbanionen fremstillet som beskrevet ovenfor til udvirkning af alkyleringen. Reaktionstemperaturen er passende ca. -70°C.

De beskyttede halogenider svarende til formlen III 5 kah fremstilles på i og for sig kendt måde ud fra de tilsvarende beskyttede hydroxyaminer med nedenstående formel: CFH-. P 3-p

ho-ch2-ch2-ch-nh2 IV

10 hvor p er 1 eller 2.

Således kan hydroxyaminen behandles med methansul-fonsyreanhydrid eller paratoluensulfonylchlorid til dannelse af hfiv. mesyloxy- eller tosyloxyderivatet, der derefter behand-15 les med magnesiumiodid til opnåelse af det ønskede iodid.

Hydroxyaminerne med formlen IV kan fremstilles på i og for sig kendt måde ved at reducere den tilsvarende syre med formlen CF Η n n

20 ' P 3"P

ho2c-ch2-ch-nh2 V

hvor p er 1 eller 2, eller en ester deraf.

Fortrinsvis reduceres svren med diboran eller methylesteren reduceres med lithiumaluminiumhydrid efter beskyttelse af aminogruppen.

Syrerne med formlen V er kendt, og deres fremstilling er omhandlet i engelsk patentskrift nr. 2.058.052A.

Det skal bemærkes, at rækkefølgen af nogle af reaktionstrinnene i de fremgangsmådeveje, der er beskrevet oven-30 for, kan ændres.

Forbindelserne med formlen I forekommer som stereo-isomere. Fremgangsmåder til adskillelse af stereoisomerene af en bestemt forbindelse vil være kendt for fagfolk på 35 området. Således kan de individuelle optiske isomere adskilles på i og for sig kendt måde ved anvendelse af optisk

DK 161021B

14

O

aktive syrer eller baser. Især kan aminogruppen distalt i forhold til den fluorerede methylgruppe beskyttes ved anvendelse af et (C2_5-alkoxycarbonyl)-phthalimid i et opløsningsmiddel, f.eks, tetrahydrofuran, diethylether 5 eller C^^-alkanol, f.eks. methanol eller ethanol. Det beskyttede aminderivat opdeles derefter ved hjælp af en chiral syre. Den opdelte phthalimidoforbindelse befries derefter for beskyttelse ved hjælp af f.eks. hydrazin eller methylamin til fjernelse af phthalimid-10 gruppen. De således opdelte aminer kan anvendes til fremstilling af de enkelte isomere af andre af de her omhandlede forbindelser på den ovenfor beskrevne måde.

Forbindelserne, der fremstilles ved de ovenstående fremgangsmåder, kan isoleres enten per se eller som syre-15 additionssalte deraf.

Syreadditionssaltene er fortrinsvis farmaceutisk acceptable, ikke-toksiske additionssalte med passende syrer såsom de i beskrivelsen tidligere omtalte. Bortset fra farmaceutisk acceptable syreadditionssalte kan der også 20 fremstilles andre salte, f.eks. med picrinsyre eller oxalsyre; de kan fungere som mellemprodukter ved rensningen af forbindelserne eller ved fremstilling af andre, f.eks. farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, eller er anvendelige til identificering eller karakteristik af 25 baserne.

Et således fremstillet syreadditionssalt kan omdannes til den frie forbindelse ved kendte metoder, f.eks. ved behandling med et alkali- eller jordalkali-metalhydroxid eller -alkoxid, med et alkalimetal- eller 30 jordalkalimetalcarbonat eller -hydrogencarbonat, med trialkylamin eller med en anionbytterharpiks.

Et således fremstillet syreadditionssalt kan også omdannes til et andet syreadditionssalt ved kendte metoder; et salt med en uorganisk syre kan f.eks. behandles med 35 et natrium-, barium- eller sølvsalt af en syre i et passende fortyndingsmiddel, hvori det fremkomne uorganiske

DK 161021B

15

O

salt er uopløseligt og således fjernes fra reaktionsmediet.

Et syreadditionssalt kan også omdannes til et andet syreadditionssalt ved behandling med et anionbytterharpiks. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det 5 følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler.

Alle NMR-målinger er anført på ^-skalaen (dvs. tetra-methylsilan « 0).

Eksempel 1 10 l-Fluor-2,5-diamino-6-heptyn-dihydrochlorid

C=CH CH2F

H2N-CH-CH2“CH2-CH-NH2 2HC1 15 A) Fremstilling af 4-hydroxy-2*(N-tert.butoxycarbonylamino) -1--fluor-butan

En 1 molær opløsning af bortri fluor idetherat (10 m3 10 mmol) sættes til en suspension af 0,75 g 3-amino-4-flu-or-butansyre under tilbagesvaling i 15 minutter. En opløs- 20 ning af diboran i tetrahydrofuran (THF) (5,5 ml opl 1 molær, 5,5 mmol) tilsættes og tilbagesvales i løbet af yderligere 2 timer. 6N HCl-opløsning tilsættes, og blandingen inddampes under formindsket tryk. En opløsning af 1,1 g (5 mmol) di- -tertbutyldicarbonat og 1,4 ml (10 mmol) triethylamin i 20 ml 25 dichlormethan tilsættes. Opløsningen omrøres i 12 timer ved stuetemperatur, fortyndes med 100 ml ether og vaskes med 2 x 50 ml vand. Den i overskriften nævnte alkohol renses ved søjlechromatografi (ether/petroleumether 40:60). Udbytte 0,8 g, 80%.

30 NMR:él,38 (9H, s), 1,71 (2H, m) , 3,5 (2H, t, J = 5 Hz), 4,38 (2H, dd, = 46 Hz, J2 = 4 Hz).

Analyse: Beregnet for CgHlgN03F: C 52,16, H 8,74, N 6,76 35 Fundet: C 52,13, H 8,77, N 6,59.

16 DK 161021 B

O

B) Fremstilling af 4-iod-2-(N-tert.butoxycarbonylamino)-1--fluor-butan

En opløsning af 0,19 g (1,1 iranol) methansulfonsyre-anhydrid i 5 ml dichlormethan sættes til en isafkølet op-5 løsning af 0,21 g (1 ifimol) 4-hydroxy-2(N-tert.butoxycarbonyl-amino) -1-fluor-butan, fremstillet som i trin A ovenfor, og 0,16 ml (1,1 mmol) triethylamin i 5 ml dichlormethan. Opløsningen omrøres i 10 minutter ved 0°C, fortyndes med 100 ml ether og vaskes først med 50 ml af en IN opløsning af eddike-10 syre, derefter en mættet vandig opløsning af natriumbicarbo-nat og endelig saltvandsopløsning. Det organiske lag tørres (MgSO^) og inddampes under formindsket tryk. Det rå mesylat, der vejer 0,25 g, fortyndes med 10 ml tør ether og afkøles til 0°C, hvorefter der langsomt i løbet af 10 minutter tilsættes 15 en 0,1N opløsning (20 ml, 2 mmol) af magnesiumiodid i ether. Efter yderligere 10 minutter ved stuetemperatur tilsættes 100 ml vand, og produktet ekstraheres med 2 x 50 ml ether. Det organiske lag tørres (MgSO^) og inddampes under formindsket tryk. Det i overskriften nævnte iodid (0,3 g) kan anvendes 20 uden yderligere rensning.

NMR:£l,4 (9H, s), 2,13 (2H, m) , 3,13 (2H, t), 3,5 (IH, m) , 4,33 (2H, dd, J = 48 Hz, J2 = 3 Hz, ca. 5 (IH, m) .

C) Fremstilling af l-fluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbonylami-no)-7-trimethylsilyl-6-heptyn 25 En opløsning af 2,3 g (0,01 mol) N-tert.butoxycar- bonylamino-3-trimethylsilyl-prop-2-ynylamin i 10 ml tør THF sættes til 100 ml af en THF opløsning af lithiurri-di-iso-propylamin (LDA) (0,04 mol) og 6 ml N,N,N1 ,N'-tetramethyl-ethylendiamin (0,04 mol) ved -78°C. Opløsningen omrøres 30 en time ved -78°C, og derefter tilsættes en opløsning af 4-iod-2- (N-tert.butoxycarbonylamino) -1-fluor-butan, fremstillet i trin B ovenfor (0,01 mol) i 10 ml THF. Efter en times forløb ved -78°C tilsættes 2,5 ml eddikesyre efterfulgt af tilsætning af 200 ml vand og 300 ml ether. Det organiske 35 lag vaskes med 3 x 100 ml vand, tørres (MgSO^) og inddampes under formindsket tryk. Det i overskriften nævnte rå pro-

17 DK 161021 B

O

dukt kan anvendes til næste trin uden yderligere rensning.

D) Fremstilling af l-fluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbonylami-no)-6-heptyn 120 ml af en 0,1 molær natriumhydroxidopløsning 5 sættes til en opløsning af det rå l-fluor-2,5-di-(N-tert.but-oxycarbonylamino)-7-trimethylsilyl-6-heptyn, fremstillet i trin C ovenfor, i methanol (20 ml) ved stuetemperatur. Efter 2 timer afdampes methanolen, og der tilsættes 100 ml ether. Produktet vaskes med 2 x 25 ml vand og tørres (MgSO^). Den i 10 overskriften nævnte forbindelse renses ved middeltrykssøjle-chromatografi (ether/petroleumether 20:80), 2 g, 60%.

NMR:tfl,41 (18H, s), 1,73 (3H, m), 2,26 (IH, d), 3,56 (IH, m), 4,33 (2H, dd, = 46 Hz, J2 = 4 Hz).

Analyse: Beregnet for ci7Hi9N2°4F: c 59,28, H 8,48, N 8,13.

15 Fundet; C 58,82, H 8,36, N 7,91.

E) Fremstilling af l-fluor-2,5-diamino-6-heptyn-dihydrochlorid 10 ml af en mættet opløsning af tørt hydrogenchlorid i tør ether sættes til l-fluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbo-nylamino)-6-heptyn, fremstillet som i trin D ovenfor, (1 mmol) 20 og henstår natten over ved stuetemperatur. Det dichlorhydrid, der dannes som krystaller, filtreres, vaskes med ether og tørres, hvilket giver 0,21 g af den i overskriften nævnte forbindelse.

NMR:«fl,96 (4H, m) , 3,1 (IH, d, J = 2Hz) , 4,15 (2H, 25 m), ca. 4,6 (2H, dd, = 50 Hz, J2 = 4 Hz).

Analyse: Beregnet for C7Hi5N2FC12: C 38,72, H 6,96, N 12,90.

Fundet: C 38,80, H 7,06, N 12,73.

30 35

DK 161021 B

18

O

Eksempel 2 1,1-Difluor-2,5-diamino-6-heptyn-dihydrochlorid C=CH CHF2 s h2n-ch-ch2-ch2-ch-hh2.2hci A) Fremstilling af 4-hydroxy-2(N-tert.butoxycarbonylamino)--1,1-difluor-butan 10 ml (10 mmol) af en 1 molær opløsning af bortri-10 fluoridetheret sættes til 0,8 g af en suspension af 3-ami-no-4,4-difluor-butansyre under tilbagesvaling i 15 minutter.

5,5 ml (5,5 mmol) 1 molær opløsning af diboran i tetrahydro-furan tilsættes og tilbagesvales i yderligere 2 timer. Der tilsættes 6N HC1-opløsning, og blandingen inddampes under for-15 mindsket tryk. 1,1 g (5 mmol) af en opløsning af di-tert.bu-tyldicarbonat og 1,4 ml (10 mmol) triethylamin i 20 ml dichlor-methan tilsættes. Opløsningen omrøres i 12 timer ved stuetemperatur, fortyndes med 100 ml ether og vaskes med 2 x 50 ml vand. Den i overskriften nævnte alkohol renses ved søjlechro-20 matografi (ether/petroleumether 40:60). Udbytte 0,85 g, 75%.

B) Fremstilling af 4-tosyl-2-(N-tert.butoxycarbonylamino)-1,1--difluor-butan

En opløsning af 4-hydroxy-2(N-tert.butoxycarbonylamino) -1,1-difluor-butan, fremstillet som i trin A ovenfor 25 (1/25 g, 5 mmol), 0,9 g (5 mmol) tosylchlorid og 2,5 ml py- ridin i 25 ml dichlormethan omrøres natten over ved stuetemperatur. Opløsningen fortyndes med 100 ml ether og vaskes med 2 x 50 ml af en IN opløsning af eddikesyre. Det vandige lag tørres (MgSO^) og inddampes under formindsket tryk. Det i 30 overskriften nævnte tosylat krystalliseres i ether/pentan (1,5 g).

NMR <51,42 (9H, 2), 1,91 (2H, m) , 2,41 (3H, s), 3,58 (IH, m), 4,08 (2H, t), 5,25 (IH, td, ^ = 26 Hz, J2 = 2 Hz), 7,41 (3H, m).

35 Analyse: Beregnet for ci5H22NS^5F2: ^ H 6/11» N 3,69.

Fundet: C 50,70, H 6,33, N 3,95.

DK 161021B

19

O

C) Fremstilling af 4-iod-2-(N-tert.butoxycarbonylamino)-l,l--difluor-butan

En opløsning af det i trin B ovenfor fremstillede tosy lat (0,37 g, 1,1 mmol) i 5 ml ether sættes til en 5 isafkølet opløsning af magnesiumiodid i ether (20 ml, 0,1N, 2 mmol). Efter 10 minutter ved 0°C vaskes opløsningen med 100 ml vand, tørres, (MgSO^) og inddampes under formindsket tryk. Det i overskriften nævnte iodid, der vejer 0,31 g, kan anvendes til den efterfølgende alkylering uden yderligere rens-10 ning.

NMR:6l,43 (9H, s), 2,16 (2H, m), 3,2 (2H, t), 4,05 (IH, m), 5,76 (IH, td, = 54 Hz, J2 = 3 Hz), 4,66 (IH, m).

D) Fremstilling af l,l-difluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbonyl-amino)-7-trimethylsilyl-6-heptyn 15 En opløsning af 2,3 g (0,01 mol) N-tert.butoxycar- bonylamino-3-trimethylsilyl-prop-2-ynylamin i 10 ml tør THF sættes til 100 ml THF-opløsning af LDA (0,04 mol) og 6 ml (0,04 mol) N,N,N1,N'-tetramethylethylendiamin ved -78°C. Opløsningen omrøres i en time ved -78°C, og derefter tilsættes 20 en opløsning af 0,01 mol 4-iod-2-(N-tert.butoxycarbonylamino)--1,1-difluor-butan, fremstillet som i trin C ovenfor, i 10 ml THF. Efter en time ved -78°C tilsættes 2,5 ml eddikesyre efterfulgt af tilsætning af 200 ml vand og 300 ml ether. Det organiske lag vaskes med 3 x 100 ml vand, tørres (MgSC>4) og 25 inddampes under formindsket tryk. Det i overskriften nævnte rå produkt kan anvendes til næste trin uden yderligere rensning.

E) Fremstilling af l,l-difluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbonyl-amino)-6-heptyn 30 120 ml af en 0,1 molær opløsning af natriumhydroxid sættes til en opløsning af det rå l,l-difluor-2,5-di-(N-tert.butoxycarbonylamino)-7-trimethylsilyl-6-heptyn, fremstillet i trin D ovenfor, i 20 ml methanol ved stuetemperatur.

Efter 2 timer afdampes methanolen, og der tilsættes 100 ml 35 ether. Produktet vaskes med 2 x 25 ml vand og tørres (MgSO^). Den i overskriften nævnte forbindelse renses ved middeltrykssø jlechromatograf i (ether/petroleumether 20:80), 1,9 g, 53%.

20 DK 161021 B

O

NMR:<fl,41 (18H, s), 1,75 (4H, m) , 2,28 (IH, d, J = 2 Hz), 3,83 (1H, m), 5,66 (1H, td, Jt = 55 Hz, = 2 Hz) .

Analyse: Beregnet for C 56,34, H 7,78, N 7,73.

5 Fundet: C 56,57, H 7,87, N 7,78.

F) Fremstilling af l,l-difluor-2,5-diamino-6-heptyn-dihydro-chlorid

En mættet opløsning af tørt hydrogenchlorid i tør ether (ίο ml) sættes til l/l-difluor-2,5-di-(N-tert.butoxy-10 carbonylamino)-6-heptyn, fremstillet som i trin E ovenfor, (1 mmol) og henstår natten over ved stuetemperatur. Dichlor-hydratet, der dannes som krystaller, filtreres, vaskes med ether og tørres, hvilket giver 0,23 g af den i overskriften nævnte forbindelse.

15 Analyse: Beregnet : C 35,75, H 6,00, N 11,91

Fundet: G 35,32, H 5,63, N 11,37.

Den ODC-inhiberende aktivitet hos forbindelserne med formlen I kan påvises in vivo ved hjælp af følgende 20 metode:

Hanrotter af Sprague-Dawley-stammen (legemsvægt 200-220 g) købt hos Charles River får foder og vand ad libitum under konstant 12 timers lys og 12 timers mørke.

Præparater injiceres intraperitonealt (opløst i 0,9%'s 25 saltvandsopløsning) eller gives via mavesonde (opløst i vand). Rotter, der får saltvandsopløsning eller vand, fungerer som kontroldyr. 5-6 Timer efter præparatindgivelse aflives dyrene ved halshugning, og ventralprostata, testikler og brissel fjernes hurtigt og oparbejdes straks.

30 Vævet homogeniseres med tre volumendele 30 mmol natrium- phosphatpuffer (pH 7,1) indeholdende 0,1 mmol EDTA, 0,25 mol saccharose, 0,1 mmol pyridoxalphosphat og 5 mmol dithiothreitol. Ornithin-decarboxylaseaktiviteter bestemmes på et 1000 g ovenpå flydende lag af homogenat af testikler og prostata og på et homogenat helt af brissel, i det væsentlige som beskrevet af Ono m.fl.

(Biochem. Biophys, Acta, 284, 285 (1972)).

21 DK 161021 B

O

Aktiviteten af forbindelserne med formlen I som inhibitorer af ornithin-decarboxylase (ODC) kan påvises in vitro ved hjælp af følgende metode:

Der fremstilles ornithin-decarboxylase (ODC) 5 af levere fra rotter, der er blevet injiceret med thio-acetamid (150 mg/kg legemsvægt) 18 timer før aflivning, og den renses ca. 10 fold ved syrebehandling ved pH 4,6 som beskrevet af Ono m.fl. i Biochem. Biophys. Acta 284, 285 (1972). Grundopløsningen af ODC består af protein 10 (16 ml/ml), natriumphosphatpuffer (30 mmol, pH 7,1), dithiothreitol (5 mmol) og pyridoxalphosphat (0,1 mmol).

Den grundopløsnings specifikke aktivitet er 0,12 nmol C02/min pr. mg protein. Til et typisk eksperiment blandes 320 μΐ af denne grundopløsning på tidspunktet 0 med 15 80 μΐ af en opløsning af inhibitoren i vand, og dette inkuberes ved 37°C. På forskellig tidspunkter overføres 50 μΐ aliquote mængder til et l-ml-prøvemedium indeholdende 30 mmol natriumphosphat (pH 7,1), dithiothreitol (5 mmol), pyridoxalphosphat (0,1 mmol), L-ornithin (0,081 μπιοί) og 20 DL- [l-14-C]ornithin (0,043 μπιοί), 58 Ci/mol, Amersham) i en lukket beholder, hvori er indpasset et filtrerpapir fugtet med 50 μΐ hyaminhydroxid (1 mol). Reaktionen får lov at forløbe i 60 minutter ved 37°C og afsluttes derefter ved tilsætning af 0,5 ml 40%'s trichloreddikesyre.

25 Efter yderligere 30 minutter tælles det C02, der er absorberet på filtrerpapiret, i en standard-scintillations-væske. Kj (tilsyneladende dissocieringskonstant) og ^50 (halveringstid ved uendelig koncentration af inhibitor) beregnes ifølge den af Kitz og Wilson i 30 J. Biol. Chem., 237, 3245 (1962) beskrevne metode.

Når forbindelsen ifølge eksempel 1 og 2 afprøves ifølge ovenstående metode, fås de nedenfor viste resultater.

Halveringstid (t-j^) ved 10 μιηοΐ er også anført.

35

DK 161021 B

«

' 22 O

Eksempel Κχ (μΜ) ^Q(min.) t-^Cmin.) 1 50 3,7 22 2 1500 3,7 >200 5 10 15 20 25 30 35

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af fluorerede diaminoheptynderivater med den almene formel Y CF Η, Λ k i t P 3”P

5 H2N-CH-CH2-CH2“CH-NH2 i hvor Y er CH=C-, og p er 1 eller 2, eller farmaceutisk acceptable salte deraf, kende- 10 tegnet ved, at et amino- og acetylenbeskyttet derivat af propargylamin alkyleres med et amino-beskyttet derivat af et halogenid med den almene formel CF H-. Λ i P 3—p X-CH2-CH2-CH-NH2 III 15 Δ hvor X er brom, chlor eller iod, og p er 1 eller 2, hvorefter de beskyttende grupper fjernes, og den dannede forbindelse om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af l-fluor-2,5-diamino-6-heptyn eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at N-tert.butoxycarbonylamino-3-methylsilyl-prop-2- -ynylamin alkyleres med 4-iod-2-(N-tert.butoxycarbonyl- 25 amino)-l-fluorbutan, hvorefter de beskyttende grupper fjernes, og den dannede forbindelse om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 30 35