DK161326B - 2-amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-alkoxymethyl-4(3h)-pteridinoner og farmaceutisk praeparat, som omfatter en saadan - Google Patents

Description

DK 161326 B

Den foreliggende opfindelse angår en gruppe pte-ridiner, der er kendt som pteriner, og som er tetrahy-drobiopterinanaloger og farmaceutiske præparater indeholdende disse forbindelser. Mere specielt angår op-5 findelsen visse biopterinanaloger, som kan anvendes ved behandlingen af Parkinsonisme (og andre sygdomme, der skyldes en mangel på biogenicaminer (f.eks. catechol-aminer og serotonin) i hjernen og det perifere nervesystem) og phenylketonuri (atypisk PKU), der skyldes te-10 trahydrobiopterinmangel.

I britisk patentskrift nr. 1 405 246 beskrives blandt andet pteridiner med formlen (0)

O

15 ,/γΥ A. Jk (0) 1 H A1 20 hvori A betegner en C-]__4 alkylgruppe, som eventuelt er substitueret med en hydroxygruppe eller et halogenatom, og A1 og A^ er ens eller forskellige og betegner hver en 01-4 alkylgruppe. Disse forbindelser er inhibitorer for enzymet hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki-25 nase og hæmmer derfor væksten af mikroorganismer, og yderligere potentierer de den antimikrobielle virkning af et p-aminobenzosyrekonkurrerende stof og/eller en inhibitor for dihydrofolatreduktase. Det anføres ikke, at disse forbindelser skulle have nogen virkning på 30 centralnervesystemet.

Europæisk patentansøgning 0079 574-A1 angår to forbindelser, nemlig 11,2'diacyl-(6R,S)-5,6,7,8-te-trahydro-l-biopterin og 11,2'-diacyl-l-biopterin. Disse forbindelser beskrives som mulige midler ved behandling 35 af atypisk phenylketonuri.

Ved nærværende opfindelse tilvejebringes hidtil- 2

DK 161326 B

ukendte pterinforbindelser og deres farmaceutisk acceptable salte, der virker som cofaktorer for hepatisk phenylalanin-hydrolase, og i hjernen virker som co-faktorer for tyrosin og tryptophanhydrolase. Disse 5 forbindelser er anvendelige til behandling af Parkin-sonisme og af tetrahydrobiopterinmangel forårsaget phe-nylketonuri.

Opfindelsen tilvejebringer 2-amino-5,6,7,8-te-trahydro-6-alkoxymethyl-4(3H)-pteridinoner med formlen 10 I

O

Sv ch20R

HN |T

“ *" » I

hvori R betegner en ligekædet eller forgrenet alkyl-gruppe med 1-8 carbonatomer, eller farmaceutisk accep-20 table salte deraf. Alle stereoisomere er også omfattet.

Mest foretrukket af forbindelserne med formlen I er (+-)-2-amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-methoxymethyl-4-(3H) -pteridinon og (+-)-2-amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-nbutoxymethyl-4(3H)-pteridinon eller farmaceutisk ac-25 ceptable salte deraf. Det er almindeligt anerkendt, at visse stoffer, der er kendt som neurotransmittere, kræves i de mikroskopiske regioner, kendt som synapser, mellem nerveceller (neuroner) for transmission af nerveimpulser gennem legemet.

30 Over tredive stoffer er kendt som, eller formo des at være neurotransmittere, og hvert især har en karakteristisk simulerende eller hæmmende virkning på neuroner. Overskud af eller mangel på disse transmittere kan give sig til kende som moderate til alvorlige 35 neurologiske eller mentale sygdomme. Der findes neuroner i hele legemet, men mangel på balance med hensyn 3

DK 161326 B

til neurotransmittere ved neuronsynapser i hjernen er langt den mest kritiske tilstand og frembringer de mest udtalte virkninger.

Af de mange neurotransmittere man ved eller for-5 moder opererer ved synapser, har en mindre gruppe, der under ét er kendt som biogene aminer, været genstand for det mest indgående studium. Særlig vigtige medlemmer af denne gruppe er catecholaminerne, såsom dopamin og norepinephrin (noradrenalin), og indolaminen, sero-10 tonin.

Tetrahydrobiopterin (BH4) er en væsentlig cofaktor for de hastighedsbegrænsende enzymer for syntese af biogen amin, tyrosin- og tryptophanhydroxylaser, og for leverenzymet, der omdanner phenylalanin til tyrosin 15 (Kaufman, S. and Fisher, D. B., Molecular Mechanisms of Oxygen Activation, Hayaishi, O. Ed., Acad. Press, N.Y. (1974)).

Kendskabet til den kemiske pathologi hvad angår neurologiske sygdomme er blevet udvidet enormt i løbet 20 af de sidste to tiår. Der er f.eks. blevet beskrevet neurologiske sygdomme, hvis symptomer kan sættes i forbindelse med sænkning af antallet af catecholamin- og/ eller serotonin-molekyler, der frigøres ved visse syn-aptiske logi. Som kategori kan man opfatte dem som 25 "catecholaminmangel-sygdomme". Et eksempel herpå er Parkinson's sygdom (også kendt som Parkinsonisme), hvor en mangel på hjernedopamin er blevet sat i forbindelse med symptomerne rigiditet, tremor og akinesia. Et andet eksempel er kronisk preganglionisk autonom insuffi-30 ciens kendt som Shy-Drager-syndromet, der står i forbindelse med såvel perifer sympatisk dysfunktion som en degeneration af hjerneneuroner i basalganglierne. Den perifere sympatiske dysfunktion genspejler højst sandsynligt et tab af dannelse og frigørelse af pressor ca-35 techolaminen norepinephrin, medens rigiditeten og akinesia højst sandsynligt genspejler et tab af evnen til 4

DK 161326 B

at danne dopamin i visse hjerneregioner.

I alle disse tilfælde dannes catecholaminerne, hvis niveauer nedsættes, ved virkning af tyrosinhy-droxylase, der er hastighedsbegrænsende for deres dan-5 nelse. Dette enzym kræver tyrosin, oxygen og en reduceret pterin-cofaktor, tetrahydrobiopterin (BH4), for at virke. Medens oxygen og tyrosin normalt ikke er begrænsende for tyrosinhydroxylase, kan BH4-niveauerne normalt ligge ret langt under det niveau, der kræves 10 til mætning af dette enzym. Der findes faktisk rapporter indenfor den videnskabelige litteratur, der angiver, at niveauerne af denne cofaktor er alvorligt nedsat ved Parkinson's sygdom og ved Shy-Drager-syndromet (Nagatsu, T., Neurochem. Intern., 5, 27 (1983)). Det 15 ville være logisk at antage, at hastigheden af dopamin-biosyntese ville forøges ved omstyring af denne mangel. Administrering af BH4 har vist sig næsten at fordoble striataldopaminsyntese, såvel som noradrenalinsyntese i perifere nerver (Nagatsu, vide supra samt Cloutier, G.

20 og Weiner, N., J. Pharm. Exp. Ther., 186, 75 (1973)).

Det er faktisk blevet rapporteret, at BH4-administre-ring kan reducere symptomerne på Parkinson's sygdom (Narabayashi, H., Kondo. T., Nagatsu, T., Sugimoto, T. og Matsuura, S., Proc. Japan Acad., 58, Ser. B, 283 25 (1982)). En gruppe psykiatriske sygdomme kendt som endogen depression involverer måske også reduceret neu-ronaldannelse af catecholaminer og serotonin. Det er således for nylig blevet vist, at BH4 reducerer symptomerne på depression hos adskillige patienter (Curtius, 30 H., Muldner, H. og Niederwieser, A., J. Neurol. Transmission, 55, 301 (1982)). Denne naturlige cofaktor er imidlertid kostbar og ustabil, og den gennemtrænger hjernen dårligt. Tidligere kendte syntetiske cofaktorerstatninger for BH4 bevirker alle, at tyrosinhydroxy-35 lase (TH) binder sit substrat tyrosin svagere. Administrering af disse tidligere kendte syntetiske cofakto- 5

DK 161326 B

rer til acceleration af dopamin-biosyntese ved behandlingen af catecholaminmangel bevirker således, at TH bliver umættet med tyrosin.

Det har uventet vist sig, at forbindelser med 5 formlen I ikke nedsætter bindingen af tyrosin til tyro-sinhydroxylase, og at de fremmer dopamindannelse ved hjælp af dette enzym med hastigheder, der svarer til de hastigheder, der er iagttaget for den naturlige cofaktor BH4. Endvidere træder forbindelserne med formlen I 10 lettere ind i hjernen end BH4 og accelererer dopamin-biosyntese bedre end den naturlige cofaktor, når de administreres perifert (oralt). Administrering af forbindelser med formlen I ved catecholaminmangel vil således accelerere dopamin-biosyntese uden co-administre-15 ring af exogent tyrosin.

Endogen (psychotisk) depression menes at involvere nedsatte niveauer af serotonin og noradrenalin ved hjernesynapser. Forbindelserne med formlen I virker som co-faktorer for tyrosin- og tryptofanhydroxylaser.

20 Disse forbindelser vil således reducere symptomerne på endogen depression ved at fremme syntesen af såvel ca-techolaminer som serotonin i hjernen.

Foruden at virke på det centrale nervesystem, kan forbindelserne med formlen I erstatte BH4 i leveren 25 og fremme hydroxyleringen af phenylalanin. En lille procentdel af alle patienter med phenylketonuri lider faktisk af en form for phenylketonuri, der skyldes te-trahydrobiopterinmangel. Denne "atypiske PKU" er med godt resultat blevet behandlet med store mængder BH4 30 (Nagatsu, vide supra). Da forbindelserne med formlen I er mere lipofile og har bedre biotilgængelighed end BH4, kan der benyttes betydeligt mindre doser til behandling af denne atypiske PKU. Forbindelserne med formlen I har mindst 2 fordele. For det første kan de 35 virke som cofaktorer for hepatisk phenylalaninhydroxy-lase til reduktion af plasma-phenylalanin-niveauer.

6

DK 161326 B

For det andet kan de virke indenfor hjernen som cofak-torer for tyrosin- og tryptofanhydroxylase, til korrektion af reduktioner af cerebrale catecholamin- og sero-toninniveauer, der skyldes BH^-mangel, og som også ses 5 ved atypisk PKU. Paradoksalt nok hæmmer store mængder phenylalanin phenylalaninhydroxylase med BH4 som cofak-tor. I modsætning hertil viser forbindelserne med formlen I ikke denne substrat-hæmning, og det kan forventes, at de vil forblive effektive i nærværelse af 10 store cirkulerende niveauer af phenylalanin.

Tetrahydropteriner giver, ved reaktion med tyro-sin-, tryptofan- eller phenylalanin-hydroxylase, anledning til et ustabilt quininoidt mellemprodukt, der tilbagereduceres til tetrahydroformen ved hjælp af di-15 hydropteridin-reduktase (DHPR). Forbindelserne med formlen I recirkuleres af DHPR med hastigheder, der er tre gange større end den naturlige cofaktors. Dette træk må formodes at udstrække disse forbindelsers nyttige biologiske liv, resulterende i en gunstig varighed 20 af virkningen.

Tetrahydropteriner kan, efter enzymatisk eller kemisk oxidation med molekylær oxygen, også hurtigt danne 7,8-dihydropterin-strukturen, som ikke kan reduceres af DHPR. Dihydrofolatreduktase (DHFR) vil redu-25 cere visse 7,8-dihydropteriner til de tilsvarende tetrahydropteriner. 7,8-Dihydrobiopteriner (7,8-BH2) kan reduceres med en hastighed, som er 2,5% af hastigheden for di-hydrofolat, det naturlige substrat. Hidtil kendte THcofaktor-analoge reduceres med hastigheder, 30 der er endnu langsommere end hastigheden for 7,8-BH2, hvilket for-korter deres levetid in vivo. Overraskende reduceres dihydropterinerne afledt af forbindelser med formlen I af DHFR med hastigheder, der er 8 gange og mere hurtigere end BH2. DHFR forøger således den ef-35 fektive in vivo-levetid af forbindelser med formlen I, hvilket forbedrer deres effektivitet.

7

DK 161326 B

Forbindelser med formlen I og deres salte kan syntetiseres ved fremgangsmåder, der er kendt indenfor teknikken til syntese af forbindelser med analog struktur.

5 Forbindelser med formlen I kan fremstilles ved omsætning af en forbindelse med formlen IIA med et reduktionsmiddel, der er i stand til at afgive hydrogen, såsom H2/katalysator, natriumcyanoborhydrid eller na-triumborhydrid, alle i et passende opløsningsmiddel un- 10 der betingelser, som sædvanligvis anvendes for disse reagenser. Forbindelser med formlen I kan også fremstilles ved reduktion af forbindelser med formlen UB, 7,8-BH2-forbindelserne, in vitro eller in vivo med et egnet enzym, såsom dihydrofolatreduktase.

15 0

.CK20R

HN jT^ IIA

η2μ/^Κ'/^ϊτ,η 20 0

Av^K\/CK20R

25 HK II Ί

"V Ji JsH »IB

ά Η 30 Forbindelser med formelerne II kan fremstilles ved hydrolyse af en forbindelse med formlen III med et passende middel, såsom en vandig natriumhydroxidopløsning.

35

DK 161326 B

8 KK2

yJr\ N CH2OR

M II I

5 A A ^Au . in h2h n^n^h

Forbindelser med formlen III kan fremstilles ved 10 kondensation af forbindelsen med formlen IV med forbindelser med formlen V i nærværelse af en base, f.eks. na-triumalkoxid i en alkohol. Et specifikt eksempel er natriummethoxid i methanol.

15 «up

K2'> “V IV Til V

«Η 20 Forbindelser med formlen V kan fremstilles ved tilbagesvaling af en forbindelse med formlen VI i en alkohol med formlen VII.

25 VI

h2n n h

ROH

30 VII

Forbindelser ifølge opfindelsen kan benyttes til behandling af Parkinsons sygdom, endogen depression, orthostatisk hypotention, muskulær dystonia og andre sygdomme, der skyldes mangel på catecholaminer og sero-35 tonin ved de pre-synaptiske logi ved neuronale forbindelsessteder. Disse forbindelser kan også benyttes 9

DK 161326 B

til behandling af phenylketonuria (atypisk PKU), der skyldes BH4-mangel.

Den mængde af den aktive forbindelse, dvs. en forbindelse med formlen I, der kræves ved ovennævnte 5 sygdomme, vil naturligvis variere med administreringsvejen, den tilstand der behandles og den person der behandles, men bestemmes i sidste ende af lægen. En egnet dosis til behandling af disse sygdomme ligger imidlertid indenfor området på 0,5 til 20 mg pr. kg legems-10 vægt pr. dag, fortrinsvis fra 1 til 10 mg/kg legemsvægt pr. dag og mest foretrukket fra 2 til 7 mg/kg legemsvægt pr. dag, idet en typisk foretrukken dosis er 5 mg/kg legemsvægt pr. dag.

Den ønskede dosis gives fortrinsvis som mellem 15 en og fire subdoser, der indgives med passende mellemrum i dagens løb. Såfremt der benyttes tre subdoser, vil hver således ligge i området fra 0,17 - 6,7 mg/kg legemsvægt. En typisk dosis til mennesker er 1,7 mg/kg legemsvægt.

20 Om ønsket kan catecholamin- og serotonin-precur- sorerne 1-tyrosin eller 1-tryptophan indgives samtidig med en forbindelse med formlen I i en mængde på 25 mg/kg til 1000 mg/kg legemsvægt. Disse aminosyrer kan indgives i samme farmaceutiske formulering, f.eks. en 25 tablet eller kapsel, som en forbindelse med formlen I, eller som separate farmaceutiske formuleringer.

Selvom det er muligt at indgive den aktive forbindelse eller de aktive forbindelser alene som de rå kemikalier, foretrækkes det at give den eller de aktive 30 forbindelser som farmaceutiske formuleringer. Formuleringer ifølge den foreliggende opfindelse indeholder en forbindelse med formlen I sammen med en eller flere farmaceutisk acceptable bærere og eventuelt vilkårlige andre aktive terapeutiske bestanddele.

35 Bæreren eller bærerne må være farmaceutisk ac ceptable i den forstand, at de er forenelige med de an- 10

DK 161326 B

dre bestanddele i formuleringen og ikke er skadelige for patienten. Bæreren kan indeholde et konserveringsmiddel, såsom ascorbinsyre.

Formuleringerne omfatter præparater egnede til 5 oral, rektal eller parenteral (derunder subkutan, in-tramuskulær og intravenøs) administrering.

Formuleringerne kan passende foreligge i enhedsdosisform og kan fremstilles ved en vilkårlig af de indenfor farmacien kendte metoder. Alle fremgangsmåder 10 indbefatter det trin at bringe den aktive forbindelse i forbindelse med en bærer, der består af et eller flere hjælpemidler. I almindelighed fremstilles formuleringerne ved at bringe den aktive forbindelse på ensartet og grundig måde i forbindelse med en findelt- fast bærer 15 og derpå, om nødvendigt, forme produktet til de ønskede formuleringer eller pakke det i en egnet beholder.

Formuleringer ifølge opfindelsen, der er egnet til oral administrering, kan foreligge som adskilte enheder, såsom kapsler, oblater, tabletter eller pastil-20 ler, der hver især indeholder en forudbestemt mængde af den eller de aktive forbindelser, som et pulver eller granulat, eller som en suspension i en ikke-vandig væske, såsom en sirup, en eleksir, en emulsion eller en mikstur. Den eller de aktive forbindelser kan også fo-25 religge som en stor pille eller depotformulering.

En tablet kan fremstilles ved presning eller formning, eventuelt med et eller flere hjælpemidler. Pressede tabletter kan fremstilles ved presning i en egnet maskine, idet den aktive forbindelse er i frit-30 flydende form, såsom pulver eller granulat, eventuelt blandet med et bindemiddel·, smøremiddel, indifferent fortyndingsmiddel, overfladeaktivt middel eller disper-geringsmiddel. Formede tabletter kan fremstilles ved formning i en egnet maskine, der indeholder en blanding 35 af den eller de pulveriserede aktive forbindelser og en vilkårlig egnet bærer.

11

DK 161326 B

Formuleringer til rektal administrering kan foreligge som et suppositorium med en sædvanlig bærer, såsom kakaosmør.

Formuleringer til parenteral administrering kan 5 steriliseres og pakkes som tørre, faste stoffer i lukkede, sterile, med nitrogen udskyllede beholdere. Når der skal foretages parenteral administrering, sættes en bestemt mængde sterilt vand til lægemiddelformuleringen, og den resulterende opløsning af den administreres 10 til patienten med mindst mulig forsinkelse, idet forbindelserne med formlen I er tilbøjelig til at blive ustabile i vandig opløsning i løbet af en vis tidsperiode.

Foruden de ovenfor nævnte bestanddele kan formu-15 leringerne ifølge den foreliggende opfindelse yderligere indeholde et eller flere hjælpemidler valgt blandt fortyndingsmidler, puffere, aromastoffer, bindemidler, overfladeaktive midler, fortykkelsesmidler, smøremidler, konserveringsmidler (derunder antioxidanter) og 20 lignende.

Forbindelser med formlen I er særlig nyttige til at forøge syntesen af tyrosin, dopamin, norepinephrin og serotonin hos pattedyr, såsom rotter og mennesker.

Sådanne virkninger frembringes ved administrering for-25 trinsvis oralt eller parenteralt.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

Eksempel 1 30 (+-)-2-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-methoxymethyl-4(3H)-pteridinon.

0,95g 2-Amino~3cyano-5-chlormethylpyrazin blev under tilbagesvaling omsat med et stort overskud af tør 35 methanol, under nitrogen, i ca. 18 timer. Den resulterende reaktionsblanding blev filtreret, og filtratet 12

DK 161326 B

blev inddampet til tørhed. Der blev opsamlet en gul rest, som blev ekstraheret to gange med kogende methy-lenchlorid. Disse ekstrakter blev filtreret, og opløsningsmidlet blev afdampet, hvorved der opnåedes 2-amin-5 o3-cyano-5-methoxymethylpyrazin, som derefter blev behandlet med et overskud af guanidin i methanol ifølge Taylor's metode (J. Org. Chem., 2817, 38, (1973)).

Størstedelen af produktet fra denne reaktion udfældedes og blev samlet ved filtrering. Filtratet blev blandet 10 med silicagel, befriet for opløsningsmiddel ved afdampning, og remanensen blev påført en silicagel-søjle.

Denne søjle blev elueet med methanol (5%) i ethylace-tat, hvorved opnåedes et yderligere udbytte af produkt, der blev sat til det i forvejen opsamlede. De forenede 15 udbytter blev omkrystalliseret fra methanol til opnåelse af 2,4-diamino-6-methoxymethylpteridin (smp. 248-251°C).

Diaminopteridinen, se ovenfor, blev hydrolyseret i IN NaOH ved 70°C i tre timer. Den resulterende basi- 20 ske opløsning blev derpå syrnet med eddikesyre, og det gule produkt blev frafiltreret, vasket med 95%'s etha nol og ethylether og tørret under vakuum natten over til opnåelse af 0,5g (83%) 2-amino-6-methoxymethyl-4-(3H)-pteridinon som et gult pulver: UV (0,1N NaOH) 25 Vax 255 1)1(1 (22300)' 277,5 nm sh (6200), 364 nm (7100); NMR (DMSO-dg) 3,36 δ (s, OMe) , 4,53 (s, CH20) , 7,32 (brs, NH2), og 8,63 (s, 7-H).

Analyse beregnet for CgHgN502 , 7/10H2O: C, 43,72; H, 4,77; N, 31,86.

30 Fundet: C, 43,77; H, 4,77; N, 31,63.

Den fremstillede pteridinon (0,5g, 2,4 x 10"3

mol), se ovenfor, blev hydrogeneret under 1 atmosfære H2 i 30 ml destilleret trifluoreddikesyre over 0,02 g Pt02 i en time. Blandingen blev fortyndet med 25 ml 6N 35 HCl, filtreret og inddampet. Det rå produkt, tetrahy-droforbindelsen, blev omkrystalliseret to gange fra 6N

13

DK 161326 B

HCl/acetonitril til opnåelse af 2-amino-5,6,7,8-tetra-hydro6-methoxymethyl-4(3H)-pteridinon i form af et lysebrunt fast stof (0,6g, 85%): UV (0,1N HCl) Xmax 215,5 nm (19800); 264 nm (19900); IR(KBr) 3300, 1665, 5 1570, 1540, 1470, 1365, 1300, 1150, 1110, 1005, 955 og 750 cm-1; NMR(DMSO-d6) 3,29 6(S,OMe), 3,4(m, CH'S), 3,6 (br s, OCH2), 8,0 (NH);

Analyse beregnet for CqH13N502, 2HC1, %H20: C, 32,78; H, 5,50; N, 23,89; Cl, 24,19.

10 Fundet: C, 32,75; H, 5,54; N, 23,80; Cl, 24,21.

Eksempel 2 (+-)-2-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-n-butoxymethvl-4(3H)-15 pteridinon.

Denne forbindelse blev fremstillet på lignende måde, som den i eksempel 1 beskrevne, se ovenfor, bortset fra følgende to større afvigelser: n-butoxymethyl- pyrazinen blev fremstillet ved at opvarme chlormethyl-20 pyrazinen VI i n-butanol i stedet for methanol, og gua-nidinomsætningen blev udført i opvarmet n-butanol i stedet for methanol under tilbagesvaling.

De tre mellemprodukters og slutproduktets spektre og mikroanalytiske data var følgende: 25 2-Amino~3-cyano-5-n-butoxymethylpyrazin.

NMR (Me2SO-d6) δ 0,89 (t, 3H), 1,1 - 1,8 (m, 4H), 3,43 (t, 2H), 4,35 (S, 2H), 7,22 (brs, 2H), 8,25 (s, IH); IR (CHCl3) 3694, 3526, 3414, 2930, 2866, 2220 (CN), 1723, 30 1612, 1463, 1377, 1275, 1088 cm-1.

2,4-Diamino-6-n-butoxymethylpteridin.

Smp. 237-238°C, sønderdeling; NMR (Me2SO-d6) δ 0,87 (t, 3H), 1,0 - 1,7 (m, 4H), 3,51 (t, 2H), 4,58 (S, 35 2H), 6,63 (br s, 2H), 7,59 (br s, 2H), 8,73 (s, IH).

Analyse beregnet for CnHi6N60: 14

DK 161326 B

C, 53,21; H, 6,50; N, 33,85.

Pundet: C, 53,02; H, 6,51; N, 33,75.

2-Amino-6-n-butoxymethyl-4(3H)-pteridinon.

5 Smp. > 300°C, UV (0,1 N NaOH) Xmax 256 (27.400), 276.5 sh (11.300), 364,5 (7.200) nm; NMR (Me2SO-d6) δ 0,87 (t, 3H), 1,0 - 1,8 (m, 4H), 3,50 (t, 2H), 4,57 (s, 2H), 6,97 (br s, 2H), 8,67 (s, IH) (ring NH udveksling som følge af at en stor mængde H20 er til stede).

10 Analyse beregnet for C11H15N5°2' 0,3 H2* C, 51,87; H, 6,17; N, 27,50.

Fundet: C, 51,80; H, 6,17; N, 27,55.

(+-)-2-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-n-butoxymethyl-4(3H)-15 pteridinon.

Smp. 211-212°C, sønderdeling; UV (0,1 N HCl) kmax 265 (15.800) nm; NMR (Me2SO-dg) δ 0,88 (t, 3H), 1,0 - 1,7 (m, 4H) , 3,0 - 3,8 (m, 7H), 4,95, 6,85, 7,45, 10.5 (br toppe).

20 Analyse beregnet for * 1/75 HCl · H20: C, 39,42; H, 6,84; N, 20,90; Cl, 18,52.

Fundet: C, 39,40; H, 6,74; N, 21,06; Cl, 18,61.

25 Eksempel 3

Biologiske data.

Tyrosinhydroxylase blev delvis renset gennem en 25-45%'s ammoniumsulfattraktion. Den specifikke akti-30 vitet af dette præparat med tetrahydrobiopterin var 4,0 nmol/mg protein (min.). Enzymet blev testet ved en modifikation af den af Nagatsu, T., Levitt, M., og Udenfriend, S. beskrevne metode (Anal. Biochem. 9, 122, (1964)), hvori Dowex-kromatografitrinnet blev erstattet 35 med en trækulekstraktion.

Tryptophanhydroxylase blev testet ved en modifi- 15

DK 161326 B

kation af den af Renson, J., et al beskrevne metode (Biochem. Biophys. Acta 25: 504 (1966)). Præparatet af tryptophanhydroxylase var en rå 30.000 x g supernatant, der var blevet afsaltet på en Sephadex G-25 (Handels-5 navn) søjle (Boadle-Biker, M.C., Biochem Pharmacol. 28: 2129 (1979). Den specifikke aktivitet af denne tryptophanhydroxylase, under anvendelse af BH4 som cofaktor, var ca. 100 pmol pr. mg protein pr. minut ved 37°.

Phenylalaninhydroxylase blev målt som beskrevet 10 af Shiman, R. et al., (J. Biol. Chem. 254: 11300 (1979)) bortset fra, at reaktionsproduktet (tyrosin) blev målt fluorometrisk under anvendelse af den af Waalkes, T.P. og Udenfriend, S. beskrevne metode (J.

Lab. Clin. Med. 50: 733 (1957). Phenylalaninhydroxyla-15 se blev fremstillet ud fra rottelever under anvendelse af hydrofob kromatografi (Shiman, R. et al. (J. Biol.

Chem. 254: 11300 (1979)). Enzymets specifikke aktivitet under anvendelse af BH4 som cofaktor var 1,0 pmol/ mg protein pr. minut ved 37°.

20

Dihydrofolatreduktase-forsøg:

Disse forsøg blev udført på 7,8-dihydropterin-analogerne af forbindelserne med formlen I, som var te-trahydropteriner. 7,8-dihydropterinerne blev indkøbt 25 (i tilfælde af dihydrobiopterin) eller syntetiseret ud fra den tilsvarende forbindelse med formlen I. Syntese af 7,8-dihydropteriner omfattede kombination af 0,27 pmol af en forbindelse med formlen I, 20 pg pebberrod-peroxidase, 0,6 pmol hydrogenperoxid i 0,1 ml 0,5 M ka-30 liumfosfatpuffer, pH 7,5. Efter 3 minutter ved stuetemperatur blev tilsat 10 pg bovin levercatalase. Fremstillingen af 7,8-dihydropterinen blev bekræftet ved U.V.-spektroskopi.

Forsøget blev udført med bovin lever DHFR under 35 anvendelse af en modifikation af den af Bailey og Ayling (J. Biol. Chem., 253, 1598 (1978)) beskrevne fremgangs-måde, idet den ønskede dihydropterin erstat- 16

DK 161326 B

tede dihydrobiopterin, og det anvendte HPLC-system bestod af en anerob 0,1 M eddikesyre (med eller uden 10% acetonitrit) som opløsningsmiddel på en 25 cm x 4,6 mm Dupont TMS-Zorbax-søjle. Ved forsøgene reduceredes di-5 hydrobiopterin med en hastighed på 2,5% af hastigheden for det naturlige substrat dihydrofolat.

Dihydropteridinreduktase blev afprøvet ved den af Craine et al (J. Biol. Chem., 247, 6082 (1972)) beskrevne metode.

10 Til· forklaring af nedenstående Tabel I bemærkes, at Km betegner den internationalt anerkendte Michaelis-konstant, som er et udtryk for bindingen af et enzym til dets substrat, idet en lav Km-værdi angiver en kraftig binding, medens en høj Km-værdi angiver en for-15 holdsvis svag binding. udtrykket Vmax angiver turn-over-tallet for et enzym. μΜ betegner enheden 10”® mol.

Da dopamin dannes ved en virkning af tyrosinhy-droxylase, ses det af Tabel 1, at Km til substratet er 20 tilnærmelsesvis ens for forbindelsen med formel I og for tetrahydrobiopterin. I modsætning dertil er Km for forbindelsen ifølge opfindelsen til tyrosinhydroxylase lavere end for den naturlige co-faktor tetrahydrobiopterin, hvilket angiver en kraftigere binding.

25 30 35

DK 161326 B

17

TABEL I

Biopterincofaktor-analoge

Forbindelse 5 Tyrosin- 6-Methoxymethyl- Tetrahydro- hydroxylase tetrahydropterin biopterin

Km substrat (υΜ) 21,9 16,0

Km pterin (μΜ) 65 110 10 Vmax (%)_124_100_

Phenylalanin-hydroxylase

Km substrat (μΜ) 111 123 15 Km pterin (μΜ) 12,9 7,9

Vmax (%)_ 79_100_

Tryptophan- hydroxylase 20 Km substrat (μΜ) 28 15

Km pterin (μΜ) 103 82

Vmax (%)____54_100_ (Quinonoid- (Quinonoid- d ihyd ro) d ihyd ro) 25

Dihydropteridin- reduktase

Km pterin (μΜ) 7 1,8 30 vmax (%)__295_100_ (7,8-dihydro) (7,8-dihydro)

Dihydrofolat- reduktase 35 V(%)__800_100_ i 18

DK 161326 B

Eksempel 3

Farmaceutiske formuleringer A. Kapsel 5

Bestanddele Mængde pr. kapsel (mg)

Forbindelse (la) 325,0

Ascorbinsyre 174,0

Majsstivelse 100 mg 10 Stearinsyre 27 mg

Den fint formalede aktive forbindelse blev blandet med de pulveriserede fyldstoffer lactoce, majsstivelse og stearinsyre og fyldt i en gelatinekapsel.

15 B. Tablet

Bestanddele Mængde pr. tablet (mg)

Forbindelse I 325,0 20 Ascorbinsyre 125,0

Majsstivelse 50,0

Polyvinylpyrrolidon 3,0

Stearinsyre 1,0

Magnesiumstearat 1,o 25

Den aktive forbindelse blev finformalet og omhyggeligt blandet med de pulverformige fyldstofferlac-tose, majsstivelse, polyvinylpyrrolidon, magnesiumstearat og stearinsyre. Formuleringen blev derefter sam-30 menpresset til opnåelse af en tablet, der vejede 505 mg.

35 19

DK 161326 B

A. Suppositorium

Bestanddele Mængde pr. suppositorium

Forbindelse (la) 325,0 mg 5 Butyleret hydroxy- toluen (BHT) 25 mg

Kakaosmør eller

Wecobee +-base q.s. 2,0 g 10 +Wecobee er handelsnavn for en hydrogeneret carboxylsyre.

Claims (2)

1. 2. Forbindelse ifølge krav 1, udvalgt fra gruppen omfattende: (±)-2-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-methoxymethyl-4(3H) -pteridinon og 20 (+)-2-Amino-5,6,7,8-tetrahydro-6-n-butoxymethyl-(4(3H)- pteridinon.
2. 3. Farmaceutisk præparat, der som aktivt stof omfatter en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, som tidligere define- 25 ret, sammen med en eller flere farmaceutisk acceptable bærere.