DK162105B

DK162105B - Sporstofmaerkede konjugater af metallothionein eller et fragment deraf og et antistof eller et fragment deraf, fremgangsmaader til deres fremstilling og mellemprodukt til deres fremstilling

Info

Publication number: DK162105B
Application number: DK480284A
Authority: DK
Inventors: Glen Lewis Tolman
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1983-10-06
Filing date: 1984-10-05
Publication date: 1991-09-16
Also published as: AU578428B2; IE55709B1; EP0137457A2; ZA847797B; EP0137457A3; US4732864A; NO166267C; DK480284A; DK162105C; DK480284D0; DE3469536D1; FI81263C; FI81263B; NO844017L; JPS60166625A; GR80560B; NZ209788A; JPH01294700A; FI843930L; EP0137457B1

Description

DK 162105 B

Den foreliggende opfindelse angår sporstofmærkede konjugater af metallothionein eller et fragment deraf og et antistof eller et fragment deraf, fremgangsmåder til deres fremstilling og mellemprodukter til deres fremstilling.

5 Anvendelsen af radioaktivt mærkede, målsøgende, biolo gisk aktive molekyler, der lokaliseres selektivt i visse organer, væv eller celler hos et pattedyr, (i det følgende betegnet BAM), især antistoffer og andre proteiner, til diagnostiske og terapeutiske formål er et særdeles aktivt 10 område. Vedrørende en diskussion af sådan radioaktiv mærkning se Eckelman et al., "Radiolabelling of Antibodies",

Cancer Research, 40, 3036-3042 (1980), og Sfakianakis et al., "Radioiiranunodiagnosis and Radioixnmunotherapy", J. Nucl. Med. 2J3, 840-850 (1982). Den mest udbredt an-15 vendte metode til radioaktiv mærkning af antistoffer har været direkte iodering med 1-131, 1-125 eller 1-123. Imidlertid har disse radionuklider visse dosimetriske og billeddannelsesmæssige ulemper. Visse metalliske radionuklider, såsom Tc-99m og In-111, er mere egnede til scintigrafisk 20 billeddannelse. Imidlertid har det hidtil været vanskeligt

at binde disse metalliske radionuklider direkte til de fleste BAM, da der generelt er utilstrækkelig affinitet mellem radionuklidet og BAM. I nogle tilfælde, hvor en sådan binding har været mulig, medfører bindingen af radionuklidet 25 endvidere undertiden delvist eller fuldstændigt tab af den biologiske aktivitet af BAM

Af disse grunde er det af mange blevet foreslået af radiomærke BAM med metalliske radionuklider ved covalent konjugation under anvendelse af et metalchelateringsmiddel.

30 For eksempel beskriver Khaw et al., Science 209, 295-297 (1980), antistoffer mod hjerte-myosin, der er mærket med In-lll-diethylentriaminpentaeddikesyre (DTPA) , og anvendelse af de mærkede antistoffer til billeddannelse ved myocardieinfarkter. Krejcarek et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 77, 581-585 (1977), beskriver anvendelse af DTPA til mærkning af proteiner som humant serumalbumin (HSA) med metal-radio- 2

DK 162105 B

nuklider. Pritchard et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

151, 297-302 (1976), beskriver konjugering af antistoffer til forskellige midler, der kan chelatere In-111, såsom transferrin, D-penicillamin og deferoxamin. Yokoyama et al., 5 EP-patentansøgning nr. 35.765, offentliggjort i 1981, beskriver deferoxamin som et bifunktionelt chelateringsmiddel til radiomærkning af forskellige BAM, herunder proteiner (f.eks. HSA, urokinase, fibronogen), antibiotika (f.eks. bleomycin, kanamycin), hormoner, saccharider og fedtsyrer.

10 Haber et al·., EP-patentansøgning nr. 38.546, offentliggjort i 1981, beskriver DPTA, ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og ethylendiamin som bifunktionelle chelateringsmid-ler til radiomærkning af proteiner, herunder antistoffer, antigener og antistoffragmenter. Yokoyama et al., US-patent-15 skrift nr. 4.287.362, udstedt i 1981, beskriver 3-carboxy--2-oxopropionaldehyd-bis(N-methvlthiosemicarbazon) (OPBMT) og analoge som bifunktionelle chelateringsmidler til radiomærkning af proteiner. Sundberg et al., US-patentskrift nr. 3.994.966, udstedt i 1976, Meares et al., US-patentskrift 20 nr. 4.043.998 og Leung et al., Int. J. App. Radiation and Isotopes 29, 687-692 (1978), beskriver bifunktionelle EDTA-analoge som 1-(p-benzendiazonium)-EDTA og 1-p-amino-phenyl-EDTA til proteinmærkning. Paik et al., J. Radioanal.

Chem. 57, 553-564 (1980), beskriver et azoderivat 25 af DPTA kaldet DTTA-azo-imidat som et bifunktionelt chelateringsmiddel og dets anvendelse til mærkning af HSA med In-111. Hver af de hidtil beskrevne bifunktionelle chelateringsmidler er imidlertid generelt blevet udformet til at koordinere et specifikt metallisk radionuklid. Det 30 ville derfor være ønskeligt at udvikle et chelateringsmiddel, der er i stand til at koordinere forskellige metalkationer og i stand til konjugation med BAM under bibeholdelse af den biologiske aktivitet af BAM.

Endvidere er gængse intravaskulære radiografiske 35 kontrastmidler baseret på ioderede aromatiske forbindelser.

Disse forbindelser viser sig imidlertid ofte ikke at være 3

DK 162105 B

fysiologisk acceptable i anvendelige koncentrationer. Derfor ville det være ønskeligt at udvikle fysiologisk acceptable alternativer til sådanne ioderede forbindelser.

Også inden for NMR-billeddannelsesområdet, hvor der 5 sker en hurtig udvikling, ville anvendelige kontrastmidler være værdifulde, især hvis de er i stand i konjugation med BAM. Brasch (Radiology 147, 781-788 (1983)) anfører i sin gennemgang af metoder til forbedring af kontrasten ved NMR-billeddannelse blandt kriterierne for det "ideelle" 10 kontrastforbedrende middel, at forbindelsen bør have en stærk NMR-aktivitet ved lave koncentrationer, være ikke-reaktiv in vivo og være ugiftig i diagnostiske doser.

Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes metallo-thionein som bærer for spor-mærknings-metal ved mærkning af 15 BAM. Ud over det store udvalg af metaller, som metallothio-nein vil koordinere, har det den fordel, at det binder så mange som 10 gramatomer metal pr. molekyle. Derfor vil metal-lothionein binde et stort udvalg af spormærkningsmetaller og giver mulighed for at inkorporere fra 1 til 10 mol metal 20 pr. mol bifunktionelt chelateringsmiddel. Overraskende sætter konjugation af metallothionein til BAM ikke den biologiske aktivitet af BAM på spil.

Opfindelsen angår således konjugater af et antistof eller et fragment deraf og metallothionein eller metallo-25 thioneinfragmenter, hvori i det mindste en del af metallet i metallothioneinet eller fragmentet er et spormærkningsmetal med tilstrækkelig affinitet til metallothioneinet eller metallothioneinfragmentet til at blive bundet dertil. Sådant spormærkningsmetal vælges fortrinsvis blandt In, Pb, Tc, 30 Ru, Hg, Ag, Au, Pd, Cu, Re, Sb, Bi, Ga, Pt, W, Co, Ni, Rh og Os.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af konjugaterne ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 35 a) et metallothionein eller fragment deraf omsættes med et salt eller saltkompleks af et spormærkningsmetal, 4

DK 162105 B

der har tilstrækkelig affinitet til metallothioheinet eller fragmentet til, at der bindes dertil, hvorved spormærkningsmetallet erstatter i det mindste en del af metallet i metal-lothioneinet, hvorefter 5 b) metallothioneinet konjugeres til antistoffet eller fragmentet deraf.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af konjugaterne ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 10 a) et thionein omsættes med et metalsalt eller salt kompleks, hvori i det mindste en del af metallet er et spormærkningsmetal, hvorved thionein omdannes til et metallo-thionein indeholdende i det mindste en del spormærkningsmetal , hvorefter 15 b) metallothioneinet konjugeres til antistoffet eller fragmentet deraf.

Opfindelsen angår endelig også et mellemprodukt til brug ved en fremgangsmåde til fremstilling af konjugater ifølge opfindelsen, hvilket mellemprodukt er ejendommeligt 20 ved, at det består af et konjugat af et antistof eller et fragment deraf og et metallothionein eller metallothionein-fragment, hvori alt metallet i metallothioneinet eller fragmentet a) er ikke-radioaktivt og 25 b) har en mindre affinitet til metallothionein end kationer valgt blandt Tc, Ag, Au, Hg og Cu(II).

Mellemproduktet ifølge opfindelsen er anvendeligt til fremstilling af de sporstofmærkede konjugater ifølge opfindelsen ved mærkestofudveksling, dvs. ved erstatning af 30 i det mindste en del af ikke-spormærkningsmetallet med en metallisk sporstofmærkning.

35 5

DK 162105 B

0 Metallothioneiner.

Metallothioneiner er beskrevet i Metallothioneins: Proceedings of the First International Meeting on Metallothio-nein and Other Low Molecular Weight Metal-Binding Proteins/

Zurich/ 17.-22. juli 1978/ redigeret af Kagi og Nordberg, 5 Birkhauser Verlag, Basel, 1979 (i det følgende betegnet "Kagi og Nordberg"). Side 46-92 i Kagi og Nordberg er særlig relevant for den foreliggende opfindelse og er sammenfattet i det følgende. Metallothionein blev opdaget i 1957. Det cadmium- og zinkholdige protein blev isoleret fra hestenyre.

10 Hovedsagelig det samme protein blev senere fundet hos kaniner, mennesker, aber, kvæg, får, svin, hunde, hamstere, rotter, mus og sæler. Heste-metallothionein blev karakteriseret som havende en molekylvægt på 6000-7000, et højt metalindhold, et højt cysteindhold, ingen aromatisk aminosyre, optiske 15 træk som metalthiolater (mercaptider) og en fast fordeling af cysteinyl-rester. Det blev tiltrådt af plenum ved The First International Meeting on Metallothioneins, som der er henvist til ovenfor, at proteiner, der ligner hestenyre-metallothionein på flere af disse punkter, 20 kan betegnes "metallothionein" (Kagi og Nordberg, side 48), og dette er den måde, hvorpå udtrykket anvendes i den foreliggende beskrivelse. Naturligvis er metallo-thioneinfragmenter også anvendelige til den foreliggende opfindelses formål ligesom funktionelt lignende 25 polypeptider med mindst ca. 6 aminosyre-rester.

Generelt er metallothioneiner proteiner med lav molekylvægt, der produceres in vivo og chelaterer et stort udvalg af metalioner med høj affinitet. Den fysiologiske funktion af metallothioneiner er ikke helt klarlagt, 30 men det er generelt accepteret, at de har en funktion ved homøstasis af essentielle metaller og afgiftning af tungmetaller. Metallothioneiner er allestedsnærværende hos j højere hvirveldyr, hvirvelløse dyr og eukaryotiske og prokaryotiske mikroorganismer. Udsættelse af mange organismer 35 for metalioner af f.eks. Cd, Hg, Zn eller Cu fremkalder en 6

DK 162105 B

O hurtig syntese fra grunden af metallothioneiner ved forøget produktion af mRNA for apoprotein-thionein. Molekyler som cadystin, der produceres af visse mikroorganismer som reaktion på Cd-injektion, påtænkes derfor også anvendt ved den foreliggende opfindelse.

5 Alle pattedyr-thioneiner indeholder 60-61 aminosyre- -rester og kan binde 7 gramatomer divalent eller op til 10 gramatomer monovalent metalion pr. mol. Thioneiner indeholder ingen aromatiske rester eller histidinrester, og 20 af aminosyreresterne i pattedyr-thioneiner er cysteiner. .

10 Spektroskopiske undersøgelser viser, at thioneinets binding af metal næsten udelukkende sker via sulfhydrylgrupperne i cysteinerne.

Da sulfhydrylgrupperne i metallothioneiner er bundet til metalioner, står de i almindelighed ikke til rådighed 15 som funktionelle grupper til konjugation til BAM, men andre grupper, såsom -NH2, -OH og -COOH står til rådighed og metallothioneinerne kan således blive konjugeret covalent til BAM ved anvendelse af reagenser og metoder, der udnytter disse grupper, som beskrevet mere detaljeret nedenfor.

20 Fuldstændige aminosyresekvenser er blevet bestemt for flere metallothioneiner. De er anført i Kagi og Nordberg, side 60, og udvalgte sekvenser er gengivet nedenfor: 25 30 35

7 DK 162105 B

O

Tabel I

Aminosyresekvenser af metallothioneiner (MT) _ 1 10 20 30 40 50 60

O

Humant ΜΓ-2

Ac-MDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCCSCA~OH

10 Heste-MT-1A

Ac-MDPNCSCPTGGSCTCAGSCKCKECRCTSCKKSCCSCCPGGCARCAQGCVCKGASDKCCSCA-OH

Muse-MT-1

15 Ac-MDPNCSCSTGGSCTCTSSCACKDCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKACQGCVCKGAADKCTCCA-OH

Neurospora-MT

H-GDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK-OH

2Q Anvendte symboler: A = Alanin C = Cystein D = Asparaginsyre E = Glutaminsyre G = Glycin 25 I = Isoleucin K = Lysin L = Leucin M = Methionin N = Aspåragin 3q P = Prolin Q = Glutamin R = Arginin S = Serin T = Threonin 35 V = Valin

Ac = Acetyl H = Fri amino-terminus OH = Fri carboxyl-terminus.

DK 162105 B

O

8

Det ses, at cysteinresterne er fordelt over kæden, og at der er et antal -C-X-C-rester, hvor X betyder en anden aminosyre end cystein. Tabellen omfatter et metallothionein fra Neurospora crassa med en meget lavere molekylvægt end 5 pattedyr-metallothioneiner. Som rapporteret på side 55 i Kagi og Nordberg er metallothioneiner med højere molekylvægt (9500-10.000) blevet isoleret fra andre mikroorganismer. Alle disse metallothioneiner er omfattet af den foreliggende opfindelse, selv om pattedyr-metallothioneiner foretrækkes.

10 Til in-vivo-diagnostiske og terapeutiske formål foretrækkes det især at anvende et metallothionein fra samme art som det pattedyr, der behandles.

Metalbindende fragmenter af thionein, f.eks. som rapporteret af Yoshida et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

15 USA 76, 486-490, og af Kondo et al., Tetrahedron Letters 24, 925-928, kan også anvendes ved den foreliggende opfindelse. Fragmenterne af muse-thionein, der er blevet syntetiseret af Yoshida et al., har følgende aminosyresekvenser, hvori symbolerne har den samme betydning som i Tabel I ovenfor.

20

1. H 2n-k-C-T-C-C-A-OH

2. h2n-a-c-k-d-c-k-c-t-oh 3. h2n-s-c-t-c-t-s-s-c-a-oh

4. H2N-G-C-S-K-C-A-Q-G-C-V-OH

25 5. H2N-G-C-V-K-G-A-A-D-K-C-T-C-A-OH

Metalbundne fragmenter af thioneiner (dvs. metallo-thioneinfragmenter) som de, der er syntetiseret af Yoshida et al., er egnet til anvendelse ved den fore-3Q liggende opfindelse, omend komplette metallothioneiner er foretrukne i øjeblikket.

35 o 9

DK 162105 B

Metalliske spormærkestoffer.

Blandt de kendte diagnostiske og terapeutiske radionuklider er følgende anvendelige ved den foreliggende opfindelse (halveringstid angivet i d = dage, h = timer): 5

Tabel II

Diagnostisk radionuklid Halveringstid

Ruthenium-97 2,9 d

Technetium-99m 6,0 h 10 Kviksølv-197 2,7 d

Gallium-67 77,9 h

Gallium-68 1,1 h

Osmium-191 15 d

Indium-111 2,8 d 15 Indium-113m 1,7 h

Bly-203 52 h

Terapeutisk radionuklid Halveringstid

Palladium-103 17,0 d 20 Sølv-111 7,5 d

Antimon-119 1,6 d

Guld-198 2,7 d

Kobber-67 2,6 d

Rhenium-188 17,0 h 25 Bismuth-212 1,0 h

De diagnostiske radionuklider er gamma-emittere og/eller positron-emittere, der udsender energier mellem 30 KeV og 1 MeV og har halveringstider på mellem ca. 1 minut og 30 8 dage. Disse radionuklider er anvendelige i forbindelse med

konventionelle radioscintigrafiske billeddannelsesmetoder baseret på f.eks. plane, enkeltfoton- eller positron-tomo- I

grafiske metoder. De terapeutiske radionuklider udsender alfa-, beta- gammastråling, omdannelseselektroner eller 35 Auger-elektroner med energier mellem 100 eV og 2 MeV og ! er i stand til at dræbe celler in vivo.

o 10

DK 162105 B

Det vil forstås af en fagmand, at ved de diagnostiske og terapeutiske anvendelser af disse forskellige radionuklider vil de anvendte doser afhænge af mange variable. Ved anvendelse af radionukliderne til billeddannelsesformål skal den 5 anvendte dosis blot være høj nok til, at der fås diagnostisk anvendelige billeder, sædvanligvis i området 0,1-20 raCi/70 kg legemsvægt. Derimod kan der til terapeutiske formål anvendes højere doser, sædvanligvis i området 0,1-500 mCi/70 kg legemsvægt. Naturligvis vil den anvendte dosis i sidste 10 instans afhænge af de fysiske egenskaber af radionuklidet, såsom halveringstiden, strålingstypen, strålingsenergien og det radiomærkede middels farmakokinetiske forhold.

Af de kontrastmidler, der er kendt som værende anvendelige til NMR-billeddannelse, betragtes cobalt, 15 nikkel, kobber og ruthenium som anvendelige ved den foreliggende opfindelse.

Af de kontrastmidler, der er kendt som værende anvendelige til radiografisk billeddannelse, betragtes de metalliske grundstoffer med nr. 72 til 83 som anvendelige ved den 20 foreliggende opfindelse, og bismuth, bly, kviksølv, guld, platin, rhenium og wolfram foretrækkes.

Sporstofmærkning af metallothionein

Der er generelt to procedurer, der kan anvendes til 25 fremstilling af sporstofmærket metallothionein. Den første er direkte mærkning af thionein. Den anden er udvekslingsmærkning af et metallothionein, såsom Zn-metallothionein, ved anvendelse af et ønskeligt metal-spormærkestof.

Den første procedure, dvs. direkte mærkning af 30 thionein med et spormærkestof, ligner den, der er beskrevet af M. Vasak og J. Kagi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6709 (1981). Generelt opløses pattedyr-thionein ved en pH-værdi på 2, og eventuelt foreliggende uopløseligt materiale fjernes ved filtrering. Til denne opløsning 35 af thionein sættes metal-spormærkestoffet og eventuelt ønsket metalkation, som ikke er spormærkestof. Den samlede koncentration af metalkation i form af spormærkestof og o 11

DK 162105 B

ikke-spormærkestof bør være tilstrækkelig til at sikre, at der foreligger mindst 7 divalente eller 10 monovalente metalkationer pr. thionein eller passende kombinationer af divalente og monovalente kationer til at udfylde alle 5 metalbindingssteder på metallothioneinet. På grund af de enestående egenskaber af thionein kan der fremstilles metallothioneiner indeholdende mere end én metalkation.

Da det er muligt at udfylde alle thioneinets metalbindende steder med metal-spormærkestof, kan der fremstilles spor-10 mærkede metallothioneiner med meget høj koncentration.

Ved anvendelse af et radionuklid som metal-spormærkestof afhænger koncentrationen af tilsat radionuklid af den specifikke aktivitet, der er nødvendig til den pågældende kliniske anvendelse. Til diagnostiske anvendelser kan 15 forholdet mol radionuklid/mol thionein være så lille som 1 eller mindre. Til terapeutiske anvendelser kan dette forhold være højere. Ikke-radioaktive metalkationer kan tilsættes i tilstrækkelige mængder til at optage de metalbindende steder, der ikke er optaget af radioaktive 20 kationer. Efter tilsætning af radionuklider og eventuelt ikke-radioaktiv metalkation afgasses den fremkomne opløsning omfattende til fjernelse af oxygen og neutraliseres i indifferent atmosfære, indtil pH-værdien er større end 7.

Under denne neutralisation folder thioneinet sig omkring 25 radionuklidet og ikke-radioaktive metalkationer til dannelse af det ønskede radiomærkede metallothionein. Det mærkede metallothionein kan derefter renses ved konventionelle metoder, såsom dialyse, størrelsesudelukkelse eller ion-bytningschromatografi. Indholdet af ikke-radioaktivt 30 metal i det radiomærkede metallothionein kan bestemmes ved atomabsorption, og indholdet af radionuklid kan vurderes ved tælling af det radioaktive henfald. Dette rensede radio-nuklidmærkede metallothionein kan derefter kobles direkte til et antistof eller fragment deraf ved anvendelse af 35 bifunktionelle koblings- eller tværbindingsmidler, der beskrives nedenfor. På grund af den tid, der er nødvendig

O

12

DK 162105 B

til fremstilling af radionuklidmærket metallothionein og kobling af dette til det ønskede antistof eller fragment deraf, foretrækkes radionuklider som Ru-97 og Hg-197 med halveringstider på mere end 24 timer ved denne direkte mærkningsmetode.

5 Den anden mærkningsprocedure involverer udveksling af alle eller en del af ikke-sporstofmærknings-metalkationerne i metallothionein med spormærkningsmetalkation. Det er nødvendigt for at opnå et godt resultat af denne udvekslingsreaktion, at spormærkningskationen har en højere affinitet 10 til metallothioneinets mercaptider end ikke-spormærknings-kationen i det forud dannede metallothionein.

Ved anvendelse af radionuklider som metal-spormærkestof har f.eks. zinkkationer lavere affinitet til mercaptiderne i metallothionein end kationer af technetium, kviksølv og sølv.

15 I nærværelse af kationer af technetium-99m’, kviksølv-197 eller sølv-111 forskydes Zn(II)-kationerne i Zn-metallo- thionein (MTh) let til dannelse af henholdsvis Zn/^^c-MTh, 197 111

Zn/ Hg-MTh eller Zn/ Ag-MTh. Da Zn-MTh let fremstilles ved proceduren ifølge Vasak et al., supra, kan udvekslings-

20 mærkning af Zn-MTh eller et konjugat af Zn-MTh-BAM

gennemføres ved at blande Zn-MTh eller Zn-MTh-BAM-konjugat med et opløselig udvekslelig form af et radionuklid, f.eks. ^^Tc-gluco-197 111 + heptonat, HgC^ eller AgiNH^)^ * Efter udvekslingen kan det radiomærkede metallothionein renses ved konven-25 tionelle metoder, såsom dialyse, størrelsesudelukkelse eller ionbytningschromatografi. Udbyttet af udvekslingsmærkningen kan bestemmes ved tælling af det radioaktive henfald og repræsenterer den procentdel af den totale radioaktivitet, der er inkorporeret i 30 metallothioneinet. Cobalt(II)-, nikkel(II)- og zink(II)-kationer danner metallothioneiner, der kan anvendes ved en udvekslingsmærkningsproces, der involverer de i tabel II anførte radionuklider, men zink(II)-kationer er de foretrukne ikke-radioaktive 35 kationer til denne udvekslingsmærkning. Anvendelsen af 13

DK 162105 B

o udvekslingsmærkningsproceduren er specielt nyttig, når der anvendes radionuklider med halveringstider på mindre end 24 timer, fordi denne udvekslingsmærkning kan gennemføres på anvendelsesstedet. Som diskuteret nærmere nedenfor muliggør udvekslingsmærkning af et Zn-MTh-BAM-konjugat 5 med kortlivede radionuklider indføring af radionuklider umiddelbart før anvendelsen, og derved undgås det ellers uundgåelige tab af radioaktivitet ved henfald.

Blandt de ovennævnte radionuklider er ^^Tc mest foretrukket til udvekslingsmærkning ved den foreliggende 10 opfindelse på grund af dets relativt korte halveringstid, dets lette tilgængelighed fra Mo-99/Tc-99m-generatorer og de ønskelige fysiske egenskaber af radionuklidet. Radio-nukliderne Ag-111, Au-198 og Hg-197 er mest foretrukne til både direkte mærkning af thionein og udvekslingsmærkning 15 på grund af den lethed, hvormed begge mærkningsprocedurer kan gennemføres. Radionukliderne Ru-97, Pd-103 og Sb-119 anvendes bedst ved direkte thionein-mærkningsprocedurer.

Metoder, der er analoge med dem, der er beskrevet til radiomærkning af metallothionein, kan anvendes til 20 inkorporering af ikke-radioaktive metalliske spormærke- stoffer. Bland dem, der vil være anvendelige til radiografisk kontrast, dvs. Bi, Rh, Hg, Au, Pt, Re og W, kan kviksølv og guld inkorporeres i metallothionein ved udvekslingsmærkning eller ved direkte konjugation til apoproteinet. Inkor-25 porering af de øvrige grundstoffer opnås ved direkte mærkning. Blandt dem, der vil være anvendelige til NMR--billeddannelse, dvs. Co, Ni, Cu(II) og Ru, inkorporeres kobber(II) bedst i metallothionein ved udvekslingsmærkning, medens cobalt, nikkel og ruthenium inkorporeres 30 ved direkte mærkning.

35 14

DK 162105 B

Antistoffer oa fragmenter deraf.

Ved den foreliggende opfindelse anvendes antistoffer (især monoklonale antistoffer) eller Fab-, Fab'- og F(ab,)2_ -fragmenter af antistoffer, der lokaliseres i bestemte or-5 ganer, væv eller celler i et pattedyrs krop.

Det har overraskende vist sig, at f.eks. de monoklonale antistoffer anti-THY l.l (L.L. Houston, R.c. Nowinski og I.D. Bernstein, J. Immunology 125. 837 (1980) og anti-(humant brystcarcinom B6.2) (D. Colcher et al., Proc. Natl.

10 Acad. Sci. USA 78, 3199 (1981) såvel som andre kan konjugeres til Zn-metallothionein, og at konjugatet kan udvekslingsmærkes med f.eks. Tc-99m uden væsentlig nedsættelse af immunreaktiviteten.

15 Konjugation

Antistoffet eller fragmentet deraf kan konjugeres til metallothioneiner enten før eller efter radiomærkning af metallothioneinet. Det foretrækkes generelt at radiomærke før konjugationen, fordi der kan anvendes strengere betin-20 gelser til radiomærkning end til konjugation. Når det ønskes at radiomærke ved udveksling med et kortlivet radionuklid, såsom Tc-99m, umiddelbart før den kliniske anvendelse, foretrækkes imidlertid konjugation før radiomærkning, som eksemplificeret nedenfor.

25 Pattedyr-metallothioneiner indeholder typisk følgende aminosyrerester, som har funktionelle grupper, via hvilke metallothioneiner kan konjugeres direkte til et antistof eller fragment deraf: cystein, 20 thiolgrupper (-SH); lysin, 8 aminogrupper (-NH2); asparagin/glutaminsyre, 4 eller 5 30 carboxylgrupper (-C00H); og serin/threonin, 10 til 14 hydr-oxylgrupper (-0H). Ikke alle aminosyrerester i metallothio-nein står til rådighed for konjugation, da nogle deltager i forskellige funktioner i selve metallothioneinet. Cystein--SH-grupperne er involveret i metalbinding og reagerer gene-35 relt ikke med reagenser, der er rettet mod thioler, under normale betingelser. Anvendelsen af delvis metalleret metal- 15

DK 162105 B

lothionein eller fragmenter af metallothionein muliggør omsætning af SH-grupper, der ikke anvendes til metalbinding. Fjernelse af en del af metallet fra metallothioneinet for at gøre sådanne SH-grupper tilgængelige for direkte konjugation 5 kan gennemføres ved behandling med stærke chelaterings-midler, såsom EDTA eller DPTA. Lysin- og argininresterne er i stort omfang utilgængelige for konjugation/ fordi de deltager i elektrostatiske bindinger med de meget negative metalgrupper i metallothioneiner. Omend nogle (1 til 3) 10 af lysinresterne normalt er tilgængelige, fører udsættelse af metallothionein for opløsninger med høj ionstyrke til nedbrydning af elektrostatiske bindinger og medfører en større tilgængelighed af lysin- og argininrester. Carboxyl-og hydroxylgrupperne på overfladen af metallothionein står 15 generelt til rådighed for konjugation til antistof eller -fragment og kan derfor være mest foretrukne til konjugation. Bindingen af antistof eller -fragment til radiomærkede metallothioneiner dannet ved direkte mærkning af thionein eller ikke-radioaktive metallothioneiner til efterfølgende ud-20 vekslingsmærkning med radionuklider kræver konjugation af de tilgængelige SH-, NH2-, -NHC(=NH)NH2-, COOH- eller OH--grupper i metallothioneiner til komplementære funktionelle grupper på antistoffet eller fragmentet deraf. Hvis der er tale om et moniklonalt antistof, vil det indeholde de samme 25 funktionelle grupper som metallothionein, dvs. -SH, -NH2, -OH, -COOH og -NHC(=NH)NH2. Når der er tale om antistoffer eller antistoffragmenter, der ikke indeholder sådanne grupper, kan en af disse grupper inkorporeres syntetisk, således at der kan ske konjugation med metallothionein. Metodologien 30 vil variere stærkt fra et antistof eller antistoffragment til et andet, som det er velkendt for en fagmand, idet der primært skal tages hensyn til bevarelsen af biologisk specificitet og affinitet. Vedrørende en generel diskussion af sådanne syntetiske modifikationer, se Means og Feeney, 35 "Chemical Modification of Proteins", Holden Day, Inc. (1971). Derefter kan metallothionein og antistof eller antistoffrag- 16

DK 162105 B

ment konjugeres direkte ved anvendelse af passende reagenser og metoder. Til konjugation af proteiner til metallothionein samt til modifikation af metallothioneiner eller proteiner til konjugation kræves der generelt milde betingelser for 5 at undgå denaturering af metallothioneinet og protein og tab af biologisk aktivitet. pH-værdien ved reaktionen bør være i området ca. 3-11, fortrinsvis 5-9, temperaturen i området 0-60°C, og koncentrationerne af protein hhv. metallothionein i området 10*" ^ til 10~6M, fortrinsvis ca. 10”4M.

10 Det foretrukne opløsningsmiddel er generelt vand, selv om forskellige mængder af opløsningsmidler som dimethylsulfoxid kan tilsættes til opløsning af ikke-polære konjugationsmidler.

Hvis metallothioneinet og antistoffet eller antistof-15 fragmentet ikke indeholder komplementære konjugerende grupper, er det muligt i stedet for syntetisk modifikation af metallothionein og/eller antistoffet eller antistoffragment at anvende tværbindingsmidler til at tilvejebringe den ønskede konjugation. Tværbindingsmidlet bør indeholde to kemisk 20 forenelige reaktive grupper X og Y, der danner covalente bindinger med funktionelle grupper på metallothioneinet og antistoffet eller fragmentet deraf og er forbundet med en alkyl- og/eller arylkæde, dvs. X-Cn-Y, hvor Cn betyder alkyl eller aryl. De reaktive grupper X og Y skal være kemisk 25 forenelige, dvs. de må ikke reagere med hinanden til dannelse af polymere forbindelser. Da metallothionein og de fleste antistoffer og fragmenter deraf indeholder NH2~, SH- og OH--grupper, er alkylerende og acylerende grupper blandt de foretrukne reaktive grupper for X og Y. De foretrukne alky-30 lerende grupper for X og Y er -halogensyrer, -halogenestere eller -halogenamider, arylhalogenider og maleimider. Tværbinding ved anvendelse af reduktiv alkylering af NH2-grupper på metallothioneinet og antistoffet eller fragmentet deraf er også foretrukket. Tværbindingsmidler som glutaraldehyd, 35 hvor X og Y er aldehyder, og n = 3, har vist sig at være anvendelige til binding af radiomærkede metallothioneiner 17

DK 162105 B

til monoklonale antistoffer ved reduktiv alkylering af sådanne Ni^-grupper. Foretrukne acylerende midler for X og Y omfatter aktiverede carboxylfunktionaliteter, såsom chlorider og anhydrider, imidoestere, thiolestere og 5 N-hydroxysuccinimidestere. I almindelighed foretrækkes acylering af amin snarere end hydroxyl, da amider er kendt for at være mere stabile in vivo end estere.

De foretrukne grupper for X og Y ved dannelsen af covalente bindinger med -NHC(=NH)NH2-grupper omfatter 10 1,2- og 1,3-dicarbonylforbindelser som malondialdehyd, cyclohexan-1,2-dion og campherquinon. Reaktionen af arginin-rester med disse reagenser er meget selektiv og er reversibel .

Den foretrukne gruppe for X og Y ved anvendelse af 15 carboxygrupper i metallothionein og antistof eller antistoffragment til tværbinding er amingruppen. Efter aktivering med et vandopløseligt carbodiimid, såsom l-cyclohexyl-3-(2--morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid eller l-ethyl-3-(3-di-methyl-aminopropyl)-carbodiimid, vil den aktiverede car-20 boxylgruppe i metallothionein eller antistof eller antistof-fragment reagere med X og/eller Y = NH2 i et tværbindingsmiddel til dannelse af en amidbinding. Reaktionen af sådanne carboxylgrupper i metallothionein og antistof eller antistoffragment med tværbindingsmidler indeholdende aminogrupper 25 er en foretrukken metode til binding af metallothionein til antistof eller antistoffragment.

Generelt kan carbonkæden, der adskiller X og Y, være enten alkyl eller aryl med n = 1-12. Valget af kædelængde afhænger af naturen af det antistof eller antistoffragment, 30 der bindes. Med store antistoffer eller antistoffragmenter kan en længere kæde være nødvendig for at muliggøre en optimal covalent bindingsdannelse mellem tværbindingsmidlet bundet til metallothionein og de funktionelle mål-grupper på det store protein. Med små antistoffer eller antistof-35 fragmenter kan en meget lang carbonkæde være nødvendig for at muliggøre, at antistoffet eller antistoffragmentet bundet 18

DK 162105 B

til metallothioneinet kan vekselvirke med sin celleoverfladereceptor. Kædelængden kan således varieres til.enten optimering af tværbindingsprocessen eller til maksimering af bevarelsen af biologisk aktivitet af metallothionein-5 -antistof(fragment)-konjugatet.

Nogle kommercielt tilgængelige tværbindingsmidler foretrækkes til binding af metallothioneiner til monoklonale antistoffer. Eksempler på foretrukne tværbindingsmidler omfatter glutaraldehyd, N-(2-chlorethyl)-maleimid, disuccini-10 midy1-tartrat, succinimidyl-4-p-maleimidophenyl)-butyrat, 2-iminothiolan og dimethyl-adipimidat.

De spormærkede konjugater ifølge opfindelsen anvendes på samme måde som kendte spormærkede antistoffer eller antistoffragmenter. De kan frysetørres til oplagring og forsen-15 delse, og derefter rekonstrueres i normal fysiologisk saltopløsning og injiceres intravenøst til diagnostisk billeddannelse eller terapi, eller de kan fremstilles umiddelbart før anvendelsen ved udvekslingsmærkning. De kan også anvendes til in vitro-bestemmelser og kliniske diagnostiske metoder 20 på samme måde som kendte spormærkede forbindelser.

Eksempel 1

Fremstilling af kviksølv-203-mærket metallothionein ud fra 25 thionein.________

Thionein fås ud fra kaninlever ved metoden ifølge M. Vasak et al., Biochemistry 2Q_, 2852 (1981). Dette thionein (3-5 mg) opløses i 1 ml metalfri 0,1N saltsyre og filtreres til fjernelse af eventuelt uopløst materiale. Koncentrationen 30 af det fremkomne thionein bestemmes spektrofotometrisk, idet der til beregning anvendes en absorptionskoefficient ved 220 nm på 7,9 mg 1 ml/cm \ Til en opløsning af dette 203 thionein (0,5 mg/ml) sættes 0,76 mCi af HgCl~ (specifik 2 ^203 aktivitet = 8,76 x 10 mCi/mrnol). Den fremkomne thionein/ 35 HgCl2~opløsning afgasses grundigt til fjernelse af oxygen ved skiftevis frysning og optøning af blandingen i vakuum.

19

DK 162105 B

O 203

Under en argonatmosfære neutraliseres thionein/ HgCl2 med metalfri 0,5M tris(hydroxymethyl)aminomethan-puffer (tris-puffer) til en pH-værdi større end 7. Det fremkomne 203

Hg-MT vurderes ved størrelsesudelukkelses-HPLC under 5 anvendelse af en I-60-gelfiltreringssøjle (fra Waters assoc.,

Inc. Milford, Mass.), idet der elueres med 0,025 M phosphat- puffer (pH-værdi 7,0) med 2,0 ml/min. Efter chromatografering 203 203 er 98% af den tilsatte Hg-radioaktivitet tilbage i Hg-MT.

Da der ikke er nogen isotopeffekt med hensyn til metallo- 197 10 thioneinpræparermgen, vil erstatning med HgCl2 give sammenlignelige resultater.

Eksempel 2

Fremstilling af Zn/99mT c-metallothionein ved udvekslingsmærk-1 o ning af Zn-metallothionein._

Zn-metallothionein fremstilles ved metoden ifølge M. Vasak og J. Kagi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 28, 6709 (1981), ved anvendelse af ikke-radioaktivt ZnS0^,7H20 og 20 dialyseres ved anvendelse af "Spectra Por 6"-dialyserør (afskæring ved en molekylvægt på 2000) fra Spectrum

Medical Instruments, Inc., Los Angeles, Calif., mod 0,01M phosphatpuffer (pH-værdi 6,5). Til 0,5 mg Zn- — 4 9 9τη -metallothionein (1,0 ml, 10 M) sættes 9,7 mCi Tc-"Glucoscan" 25 (New England Nuclear Corp.), der fremstilles ved tilsætning af 48,7 mCi 99mTc-pertechnetat i 0,5 ml fysiologisk saltopløsning, der fås fra det oxidantfri eluat fra en 99Mo/99mTc-radionuklidgenera tor. Den fremkomne udvekslingsblanding rystes og inkuberes i 30 minutter. Det udvekslingsraærkede Zn/99raTc-metallo-30 thionein renses ved størrelsesudelukkelses-HPLC som i eksempel 1. Efter rensningen er 88% af technetium-99m-aktiviteten, som er sat til Zn-metallothioneinet, tilbage i Zn/99mT c-MT. Idet det antages af technetium-99m er bærerfrit, inkorporeres 16 pmol technetium-99m i 0,5 mg Zn-metallo-35 thionein.

20

DK 162105 B

0 Eksempel 3

Fremstilling af Zn/^^mAg-metallothionein ved udvekslings- mærkning af Zn-metallothionein._

Zn-metallothionein fremstilles som beskrevet i 5 eksempel 2 og dialyseres ("Spectra Por 6" (afskæring ved en molekylvægt på 2000)) mod 0,01M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0). 110mAgNo3 i 0,5M HN03 fra New England Nuclear Corp. (specifik aktivitet = 1017 mCi/mmol) neutraliseres til en pH-værdi på 7,0 ved tilsætning af 0,5N NH.OH. Til 0,5 mg m -4 4 1U Zn-metallothionein (0,5 ml, 10 M) sættes 50yUCi af 110mAg(NH3)2+· Efter 30 minutters inkubering renses det udvekslingsmærkede Zn/^^Ag-MT ved størrelsesude-lukkelses-HPLC som i eksempel 1. Efter rensningen er 70% af sølv-110-akti vi teten tilsat som ^^mAg (NH3) 3+ 15 tilbage i Zn/^^mAg-MT, dvs. 34 nmol sølv-llOm inkorporeres i 0,5 mg Zn-MT. Da der ikke er nogen isotopeffekt med hensyn til metallothioneinpræparering, vil erstatning af ^^^mAg (NH3) 2+ med ^^Ag (NH3) ^ sammenlignelige resultater.

20

Eksempel 4

Fremstilling og vurdering af Zn/^^Tc-metallothionein (MT)/anti-THY 1.1-konjuqat._ nr Q Qrn a) Fremstilling af Zn/ Tc-MT/anti THY 1.1-konjugat -4

Til Zn-metallothionein (1,0 mg/ml, 10 M) i 0,01M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) sættes glutaraldehyd -2 (1 mg, slutkoncentration 10 M). Efter 1 time ved stuetemperatur fjernes det uomsatte glutaraldehyd ved dialyse 30 ("Spectra Por 6" (afskæring ved en molekylvægt på 2000)) i 6 timer mod 0,01M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0). Til 0,5 ml af dette glutaraldehydbehandlede metallothionein -4 (10 M) sættes i 0,5 ml 0,2M hydrogencarbonatpuffer (pH-værdi 9,5) 1 mg af det monoklonale antistof (MAb) anti-THY 1.1.

35

Reaktionen mellem anti-THY 1.1 og glutaraldehydbehandlet Zn-metallothionein fortsættes ved 4°C og en pH-værdi på 9,3 21

DK 162105 B

0 i 18 timer, hvorefter der tilsættes 0,1 ml af en opløsning af 0,5M tris/Ο,ΙΜ NaBH^. Efter reduktion i 1 time ved stuetemperatur dialyseres Zn-metallothionein/anti-THY

1.1-konjugatet i 24 timer ("Spectra Por 6" (afskæring ved en molekylvægt på 50.000)) mod 0,01M phosphatpuffer (pH-værdi 6,8) 5 til fjernelse af uomsat natriumborhydrid og .glutaraldehyd-behandlet Zn-metallothionein. Til 0,1 mg af dette konjugat sættes 3,5 mCi 99mTc-"Gluooscan" (New England Nuclear Corp.), og blandingen inkuberes i 30 minutter. Det udvekslingsmærkede Q Qm

Zn/ Tc-metallothionein/anti-THY 1.1-konjugat renses ved 10 HPLC under anvendelse af en BioRad "TSK-250"-gelfiltreringssøjle (fra BioRad Corp.), idet der elueres med 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) ved 1,0 ml/min. Efter rensningen Q Qrn Q Qrn er 0,53 mCi af Tc tilbage i Zn/ Tc-MT/anti-THY 1.1-konju-gatet (0,1 mg).

15 b) Binding af Zn/99mTc-MT/anti-THY 1.1-konjugat til muse-SLl- og -SL2-tumorceller_

Reaktiviteten af Zn/99mTc-MT/anti-THY 1.1-konjugatet over for antigen vurderes ved anvendelse af cellebindings--bestemmelsen beskrevet af L.L. Houston, R.C. Nowinski og 20 I.D. Bernstein (J. Immunol. 125, 837 (1980)), idet AKR/Jackson-og AKR/Cumberland—thymocyter erstattes med muse-SLl- og -SL2-tumorceller. Tumorcellerne SL1 (THY 1.1. antigen-negative) og SL2 (THY 1.1. antigen-positive) (R.C. Nowinski et al., Virology 81, 363 (1977)) dyrkes ved 37°C i en 25 befugtet inkubator med 6% CC>2 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 20% hesteserum og 20 mM L-glutamin. (ellernes vækst er ca. 3 gange pr. dag for SL1 og 5 gange pr. dag for SL2. Tumorcellerne til anvendelse ved bestemmelsen isoleres, gensuspenderes 30 i RPMI 1640 medium og tælles ved anvendelse af standardmetoder. Både SLl- og SL2-celler inkuberes med Zn/99inTc-MT/-anti-THY 1.1 (28nCi af konjugat, 5 raCi/mg) eller Zn/99mTc-MT (482 nCi af MT, 395 mCi/mg) i 30 minutter, skilles fra ikke-bundet MAb ved centrifugering og vaskes, 35 Gg ^^Tc-aktiviteten bestemmes ved tælling. Ca 55% af det 99mTc_mærkede anti-THY 1.1 er bundet til de antigen-posi- 22

DK 162105 B

O tive SL2-celler, medens lidt eller intet ^^Tc-mærket konju-gat er bundet til de antigen-netative SLl-celler. En grafisk afbildning af 99inTc-mærket anti-THY 1.1 mod koncentrationen af det undersøgte antigen viser faktisk ingen tegn på udfladning ved 55% binding. Der er ringe eller ingen 5 binding af ukonjugeret 99:raTc-mærket MT til SLl- og SL2-tumorcellerne. Følgelig er bindingen af anti-THY 1.1 af antigen i det store og helt upåvirket af dets konju- Q Qyirt gations-MT, og Zn/ Tc-MT/anti-THY 1.1-konjugatet bibeholder den specificitet for antigen, der observeres 10 med anti-THY 1.1. Derfor har tilsætningen af 99mTc-MT overraskende lille effekt på den biologiske specificitet af anti-THY 1.1.

Eksempel 5 15

Fremstilling og vurdering af Zn/99mTc-metallothionein/anti- -(humant brystcarcinom B6.2.) ._ a) Fremstilling af Zn/99ltlTc-metallothionein/B6.2-konjugat. Proceduren beskrevet i eksempel 4 til fremstilling af 20 9 9m

Zn/ Tc-metallothionein/anti-THY 1.1 følges, idet der anvendes 0,6 mg Zn-MT (5 x 10~5M), 1 mg glutaraldehyd og 3 mg anti-(humant brystcarcinom B6.2). Efter slutdialyse af Ζη-ΜΓ/B6.2 mod 0,01M phosphatpuffer indeholdende 0,15M NaCl (pH-værdi 8,0) i 6 timer og derefter mod 0,01M

25 phosphatpuffer indeholdende 0,15M NaCl (pH-værdi 7,0) i 18 timer ("Spectra Por 6" (afskæring ved en molekylvægt på 50.000)) udvekslingsmærkes konjugatet (2 mg) ved tilsæt- 9 9 τη ning af 150 mCi Tc-"Glucoscan" (New England Nuclear Corp.) og blanding i 30 minutter. Det 99mTc-MT-mærkede B6.2 30 renses ved størrelsesudelukkelses-HPLC under anvendelse af en BioRad "TSK-250,,-gelfiltreringssøjle, idet der elueres med 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) ved 1,0 ml/- min. Efter rensning er der 30 mCi af 99inTc tilbage i

Zn/99mTc-MT/B6.2-konjugatet.

35 23

DK 162105 B

b) Binding af Zn/99inTc-MT/B6.2 til humane MCF-7- og A375-tumorceller.__

Virkningen, som konjugation af MT har på evnen af MAb B6.2 til at binde det antigen, som det er rettet mod, vurderes ved en cellebindingsbestemmelse, hvorved der anvendes 5 to humane tumorcellelinier, der holdes i vævskultur, nemlig humant brystcarcinom MCF-7 (H.D. Soule, J. Vasguerz, A. Long, S. Alberg og M. Brennan, J. Natl. Cancer Inst.

51, 1409-1416 (1973)) og humant melanom A375 (D.J. Giard, S.A. Aaronson, G.J. Tordaro, P. Arnstein, J.H. Kersey, 10 H. Dosik og W.P. Parks, J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417 (1973)). MCF-7-tumorcellerne har det antigen, som B6.2 bindes til (D. Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3199 (1981), medens A375-cellerne ikke har det. De tjener til kontrol af uspecifik binding af radiomærket B6.2. Tumorcellerne til anvendelse ved bestemmelsen fås ved følgende procedure.

Tre til fire dage efter podning sættes et trypsin/EDTA-reagens (kat.nr. 610-5300, Gibco Laboratories, Grand Island, New York) til monolag af tumorceller i stedet for vækstmedium. Efter omrystning i 1-2 minutter fjernes trypsin/EDTA-blandingen og erstattes med en frisk portion af samme blanding.

Den fremkomne blanding inkuberes ved 37°C i 5-10 minutter for at sikre fuldstændig frigørelse af cellerne. Cellerne suspenderes i RPMI 1640-medium indeholdende 1% kvægserum- albumin (BSA) og tælles ved anvendelse af standardmetoder.

25 MCF-7- og A375-cellerne, der er fremstillet på denne måde, inkuberes med Zn/99raTc-MT/B6.2 (0,01665^uCi konjugat, I, 53 mCi/mg) ved 37°C i 2 timer i mikrocentrifugerør overtrukket med BSA. Efter inkuberingen skilles cellerne fra ubundet MAb ved centrifugering, vaskes 3 gange med 30 g RPMI 1640-medium (+1% BSA), og Tc-aktiviteten bestemmes ved tælling. Ca 70% af det Tc-mærkede B6.2 bindes til antigenpositive MCF-7-celler i enkeltcellesuspension, medens mindre end 5% 99inTc-aktivitet er knyttet til A375-kontrolcellerne. Som observeret med anti-THY 1.1 MAb 35 medfører konjugation af MT til B6.2 dannelse af et kompleks, hvis specificitet for antigenet generelt bibeholdes.

24

DK 162105 B

0 c) In-vivo-farmakokinetik af Zn/99laTc-metallothio- nein/B6.2.____

Det er blevet vist, at radioioderet B6.2 bindes til humant brystcarcinom indpodet i mus uden thymus in vivo (D. Colcher, M. Zalutsky, W. Kaplan, D. Kufe, F. Austin og 5 J. Schlom, Cancer Research 43, 736 (1983)). Til bestemmelse af den indflydelse, som konjugation af MT har på evnen af B6.2 til at bindes til humant bryst- Q Qrn carcinom, vurderes Tc-mærket MT/B6.2 hos mus uden thymus, der bærer faste Clouser- eller A375-tumorer.

10 Clouser-tumorer (B.C. Giovanella, J.S. Stehlin, L.J. Williams, S.S. Lee og R.C. Shepart, Cancer 47, 2269 (1978)), der er B6.2-antigenpositive, og A375-tumorer (D.J. Giard, S.A. Aaronson, G.J. Todaro, P. Arnstein, J.H. Kersy, H. Dosik og W.P. Parks, J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417 15 (1973)), der er B6.2-antigennegative, dyrkes på et subcutant sted på rygoverfladen af mus uden thymus. Hver mus (17-25 g) bærende en 200-600 mg's tumor modtager en injektion af 50yUCi af Zn/99inTc-MT/B6.2, og musene aflives på forskellige tidspunkter (3-4 mus pr. tidspunkt) i løbet af 48 timer.

20 Udvalgte organer fjernes og vejes, og 99mTc-aktiviteten bestemmes ved tælling. Procentdelen af den injicerede dosis

Q Οτλ X

pr. g Zn/ TC-MT/B6.2, der findes i antigenpositive (ag )

Clousertumorer og uspecifikt antigennegative (ag ) A375-kontroltumorer er anført i tabel III. Det fremgår 25 af resultaterne i tabel III, at Zn/99mTc-MT/B6.2 bibeholder evnen af B6.2 til at bindes til humant brystcarcinom in vivo, især ved 24 timers tidspunktet, hvor forholdet mellem optagelsen i Clousertumoren og optagelsen i A375-tumoren er ca. 3:1. I sammenligning med publicerede bio-fordelings-30 data for radioioderet B6.2 (Colcher et al., supra (1983))

Q

fjernes det Tc-mærkede B6.2 meget hurtigere fra blodet. Sammenfattende nedsætter konjugation af MT til B6.2 ikke dets evne til at blive lokaliseret specifikt i humant brystcarcinom, men fremskynder fjernelsen af det 35 radiomærkede B6.2 fra blodet.

O

25 DK 162105 B

Tabel III

^^Tc-Metallothionein/B6.2 (% injiceret dosis/g]

Tumor- Tid 5 type Organ (Timer] 16 24 48

Clouser Tumor 3.37i0.39 7.7213.38 17.00+4.50 6.18+1.01

Blod 33.62±2.83 13.5812.29 7.74+6.04 2.5310.24 10 Milt 13.99+3.36 14.1713.06 34.66114.48 5.64:0.49

Lever 15.72+1.78 14.5310.97 21.9314.74 3.61:0.71

Nyre 18.07:0.91 14.2712.42 18.54:2.34 3.50:0.59

Muskel 0.9610.14 0.86:0.11 2.92:2.00 0.52:0.16

Lunge 10.2511.53 4.7610.68 2.11:0.46 1.17:0.14 15 A375 Tumor 2.63+1.30 1.98:1.06 5.41+0.47 2.15:0.24

Blod 31.0513.80 17.1311.06 6.49:7.57 6.9510.08

Milt 17.43:9.33 9.5814.05 23.53H0.43 6.25:4.30

Lever 15.42l6.08 12.9412.39 16.28:5.87 5.70:0.72 20 Nyre 17.06:2.44 13.54:1.52 18.01:2.01 5.95:0.75

Muskel 1.62+0.92 1.03:0.25 2.3112.02 0.47:0.66

Lunge 7.2410.69 6.14:0.32 3.89:1.38 2.69:0.12 Q 9m d) Tumordetektion ved anvendelse af Zn/ Tc/MT/B6.2 .

9 9 τη 25 For at vise, at Tc-mærket B6.2 vil være anvendeligt til påvisning af brystcarcinom, injiceres 200^,uCi Zn/^^Tc-MT/-B6.2 intravenøst i mus uden thymus, der bærer Clouser- eller A375-tumorer. Der tages et billede af hvert dyr ved anvendelse af et standard-gammakamera med en 5,0 ram hul-kollimator.

30 Så tidligt som 6 timer efter injektion er der tegn på synlig specifik akkumulering af Ζη/^^ο-ΜΤ/Ββ .2 i Clouser-tumoren (ag+), medens der ikke er nogen tydelig optagelse i A375-tumorerne (ag ). Det eneste andet organ, der viser sig på billedet, er leveren. 24 Timer efter injektion er 35 Clouser-tumoren klart aftegnet. ^^Tc-tællingen, der observeres i tumoren, viser sig at være den samme som den, der observeres

O

26

DK 162105 B

i leveren. Der er også aktivitet i blære og nyre. Derimod er der ingen synlig akkumulering af 99mTc-mærket B6.2 i A375-tumorer. Disse resultater viser den hurtige og specifikke lokalisering af et 99inTc-mærket MT/B6.2 i brysttumor- 9 9m 5 væv in vivo og den anvendelighed, som Tc-mærket MAb kan have ved diagnosticeringen og bestemmelsen af stadiet af brystcancer hos mennesker.

Eksempel 6 10 Q Οτη t

Fremstilling og vurdering af Zn/ Tc-metallothionein/anti- -humant brystcarcinom B6.2 Ftab1^-_ a) Fremstilling af Zn/99mTc-MT/B6.2 F(ab1),,·

En opløsning af pepsin (60^ug, Sigma Chemical Company, 15 St. Louis, Missouri) og anti-humant brystcarcinom B6.2 (3 mg) i 3 ml 0,1M natriumacetatpuffer (pH-værdi 4,0) inkuberes ved 37°C natten over. De dannede proteolytiske fragmenter skilles fra B6.2 Fiab'^ ved dialyse ved 4°C ("Spectra Por 6" med afskæring ved en molekylvægt på 20 50.000) mod 0,05M natriumphosphatpuffer (pH-værdi 7,0) indeholdende 0,15M natriumchlorid. B6.2 Fiab1^ analyseres ved størrelsesudelukkelses-HPLC under anvendelse af en BioRad "TSK-250"-søjle, idet der elueres med 0,1M natriumphosphatpuffer (pH-værdi 7,0) ved 1,0 ml/min. og ikke-redu-25 cerende SDS-polyacrylamid-gelelektroforese. Efter en 2. dialyse for at bringe B6.2 Ffab'^ over i 0,2M carbonat/-hydrogencarbonat-puffer (pH-værdi 9,5) gennemføres konjugationen med Zn-MT som beskrevet for B6.2 i eksempel 5, idet der anvendes 0,6 mg Zn-MT og 1 mg glutaraldehyd.

30 Det fremkomne Zn-MT/B6.2 Fiab'^ (1/56 mg) udvekslingsmærkes ved tilsætning af 165 mCi 99inTc-,,Glucoscan" (New England Nuclear Corp.) og blanding i 30 minutter. Efter rensning ved størrelsesudelukkelses-HPLC under anvendelse af en BioRad "TSK-250"-gelfiltreringssøjle, idet der elueres 35 med 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) ved 1,0 ml/min., er 17,6 mCi af 99mTc tilbage i Zn/99mTc-MT/B6.2 F(ab')2.

O

27 DK 162105 B

b) Binding af Zn/99mTc-MT/B6.2 F(ab*) ^-konjugat.

Virkningen af konjugation af MT på reaktiviteten af F(ab')2“dimeren af B6.2 over for antigenet, som B6.2 er rettet mod, vurderes ved anvendelse af cellebindings- 9 9m 5 bestemmelsen beskrevet i afsnit b, eksempel 5. Zn/ Tc-MT/- B6.2 F(ab')2_konjugatet (2,29 ng, specifik aktivitet = 11,3 ^,uCi/yug) inkuberes med forskellige koncentrationer af MCF-7-celler (ag+) og A375-celler (ag ), og mængden i procent af bundet 99mTc-mærket konjugat bestemmes. Resul- 9 9m 10 taterne viser, at 70-80% af det Tc-mærkede konjugat bindes til MCF-7-cellerne, medens mindre end 5% bindes til A375-cellerne. Konjugation af Zn-MT til Fiab'^ af B6.2 nedsætter således ikke dets binding til antigenet eller ændrer dets specificitet for antigenet.

15 c) In-vivo-farmakokinetik af Zn/99mTc-MT/B6. 2 F (ab ') 2 ♦

Evnen af radioioderet B6.2 Ffab'^ til at bindes til humant brystcarcinom indpodet i mus uden thymus er demonstreret af Colcher et al. (Colcher et al., supra (1983)).

Ved anvendelse af Clouser- og A375-tumorbærende mus uden 20 thymus bestemmes specificiteten og farmakokinetikken in vivo Q Qm af Zn/ TC-MT/B6.2 F(ab')2· Hver tumorbærende mus modtager en injektion med 48,5^uCi af 99mTc-mærket F(ab1) 2”konjugat (specifik aktivitet = 6,7^uCi/^,ug) , og procentdelen af den injicerede dosis pr. g bestemmes på forskellige tids-25 punkter. Resultaterne er anført i tabel IV. Forholdet mellem optagelsen i Clouser- og A375-tumorer på 24-timers tidspunktet er ca. 2:1, hvilket klart viser bibeholdelsen af tumorspecificiteten af B6.2 F(ab')~ efter MT-konjugation.

Q Qrn

Fjernelsen fra blodet af Tc-mærket B6.2 Ftab'^ er ora-30 trent den samme som den, der er observeret med det ^^c--mærkede intakte B6.2. Specificiteten af 99mTc-mærket B6.2 F(ab')2 °9 dets hurtige fjernelse fra blodet viser således, at fragmenter af B6.2 mærket med MT er anvendelige til binding in vivo til tumorer på lignende måde som observeret 35 for Zn/99inTc-MT/intakt B6.2.

O

28

DK 162105 B

Tabel IV

Q Qm

Tc-Metallothionein-B6.2-F(ab')2 (% injiceret dosis/g) TUMOR— Tid TYPE ORGAN (timer) 5 1_4_16_26

Clouser Timor 3.98+0.56 6.45+1.36 6.08+0.68 4.54±0.64

Blod 32.54±12.95 27.71+3.05 11.47±1.27 7.35+1.36

Milt 5.71+0.53 6.00+0.58 6.20+0.99 4.81+0.39

Lever 38.20+5.01* 45.60+13.46 36.09+10.06 53.72** 10 Nyre 7.45+1.00* 6.78+1.59 5.89±2.46 2.28**

Muskel 2.91+2.50 1.84+0.20 1.3910.47 2.1811.37

Hjerte 10.66+3.64 10.38+2.26 4.7610.76 2.9910.88 n= 3 3 3 3 15 A375 Tumor 2.5611.30· 3.46+1.73 2.9710.54 2.07 **

Blod 30.7015.41 27.6311.73 10.9510.64 5.72

Milt 7.23+0.77 7.22+0.49 6.28+0.79 4.01

Lever 51.53+10.77 46.96Π8.98 33.45H3.10* 9.06 20

Nyre 6.60+1.08 8.6013.23 6.5510.32* 10.24

Muskell .76+0.49 2.0010.82 2.2911.88 0.90

Hjerte 8.01+1.38 9.3712.27 3.1911.66 4.33 n= 3 3 3 1 25 *n=2 **n=1 30 35

Claims

1. Konjugater af et antistof eller et fragment deraf og metallothionein eller metallothioneinfragment, hvori i det mindste en del af metallet i metallothioneinet eller 5 fragmentet er et spormærkningsmetal med tilstrækkelig af- ! finitet til metallothioneinet eller metallothioneinfragmentet til at blive bundet dertil.

2. Konjugater ifølge krav 1, kendetegnet i ved, at spormærkningsmetallet er valgt blandt In, Pb, Tc,

3. Konjugater ifølge krav 1,kendetegnet ved, at spormærkningsmetallet er et radionuklid.

4. Konjugater ifølge krav 3,kendetegnet 15 ved, at radionuklidet er valgt blandt Tc-99m, In-111, In- -113m, Pb-203, Ru-97, Hg-197, Ag-111, Au-198, Pd-103, Cu--67, Re-188, Sb-119, Bi-212, Ga-67, Ga-68 og Os-191.

5. Konjugater ifølge krav 3, kendetegnet ved, at radionuklidet er valgt blandt Tc-99m, Hg-197, Ag- 20 111, Au-198, Pd-103, Cu-67, Re-188, Sb-119 og Ru-97.

6. Konjugater ifølge krav 3, kendetegnet ved, at radionuklidet er valgt blandt Tc-99m, Hg-197, Ag--111 og Au-198.

7. Konjugater ifølge et af kravene 1-6, kende-25 tegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof.

8. Konjugater ifølge krav 7,kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er valgt blandt anti-THY 1.1 og anti-humant brystcarcinom B6.2.

9. Konjugater ifølge et af kravene 1-8, kende- 30 tegnet ved, at metallothioneinet eller metallothionein-fragmentet er fra et pattedyr.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af konjugater ifølge krav 1-9, kendetegnet ved, at a) et metallothionein eller fragment deraf omsættes 35 med et salt eller saltkompleks af et spormærkningsmetal, der har tilstrækkelig affinitet til metallothioneinet eller DK 162105B fragmentet til, at det bindes dertil, hvorved spormærkningsmetallet erstatter i det mindste en del af metallet i metal-lothioneinet, hvorefter b) metallothioneinet konjugeres til antistoffet eller 5 fragmentet deraf.

10 Ru, Hg, Ag, Au, Pd, Cu, Re, Sb, Bi, Ga, Pt, W, Co, Ni, Rh og Os. I

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at spormærkningsmetallet er et radionuklid.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt anti- 10 stof.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er valgt blandt anti-THY 1.1 og anti-humant brystcarcinom B6.2.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendeteg-15 net ved, at radionuklidet er valgt blandt Tc-99m, Ag- -111, Au-198 og Hg-197.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af konjugater ifølge krav 1-9, kendetegnet ved, at a) et thionein omsættes med et metalsalt eller salt-20 kompleks, hvori i det mindste en del af metallet er et spormærkningsmetal, hvorved thionein omdannes til et metallo-thionein indeholdende i det mindste en del spormærkningsmetal , hvorefter b) metallothioneinet konjugeres til antistoffet eller 25 fragmentet deraf.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er valgt blandt 30 anti-THY 1.1 og anti-humant brystcarcinom B6.2.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 15, 16 eller 17, kendetegnet ved, at spormærkningsmetallet er et radionuklid.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendeteg-35 net ved, at radionuklidet er valgt blandt Ru-97, Pd-103 og Sb-119. DK 162105 B

20. Mellemprodukt til brug ved en fremgangsmåde til fremstilling af konjugater ifølge krav 1-9, kendetegnet ved, at det består af et konjugat af et antistof eller et fragment deraf og et metallothionein eller metal-5 lothioneinfragment, hvori alt metallet i metallothioneinet eller fragmentet a) er ikke-radioaktivt og b) har en mindre affinitet til metallothionein end kationer valgt blandt Tc, Ag, Au, Hg og Cu(II).

21. Mellemprodukt ifølge krav 20, kendeteg net ved, at det ikke-radioaktive metal er Zn.

22. Mellemprodukt ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof.

23. Mellemprodukt ifølge krav 22, kendeteg net ved, at det monoklonale antistof er valgt blandt anti-THY l.l og anti-humant brydtcarcinom B6.2.

24. Mellemprodukt ifølge et af kravene 20-23, kendetegnet ved, at metallothioneinet eller metallo- 20 thioneinfragmentet er fra et pattedyr.

25. Mellemprodukt ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at metallothioneinet eller metallo-thioneinfragmentet er fra et pattedyr.