DK163639B

DK163639B - Synergistisk farmaceutisk blanding af vaevsplasminogenaktivator og et prostaglandin, farmaceutisk praeparat indeholdende blandingen samt anvendelse af blandingen til fremstilling af et laegemiddel mod blodpropper

Info

Publication number: DK163639B
Application number: DK405887A
Authority: DK
Inventors: Brendan Joseph Richard Whittle
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1986-08-05
Filing date: 1987-08-04
Publication date: 1992-03-23
Also published as: DE3773805D1; DK405887D0; CA1297010C; JPH0460586B2; US4839169A; AU7657287A; ZA875755B; EP0257859B1; EP0257859A3; DK405887A; GB8619098D0; NZ221328A; EP0257859A2; AU589283B2; DK163639C; JPS63115823A

Description

DK 163639 B

Den foreliggende opfindelse angår en synergistisk farmaceutisk blanding af vævsplasminogenaktivator og et prostaglandin, farmaceutiske præparater indeholdende disse, og deres anvendelse til fremstilling af et læge- 5 middel mod blodpropper hos pattedyr.

Der eksisterer en dynamisk ligevægt mellem det enzymsystem, der er i stand til at danne blodstørkninger, koagulationssystemet, og det enzymsystem, der er i stand til at opløse blodstørkninger, det fibrino-10 lytiske system, der opretholder et intakt tydeligt vasculært lag. For at begrænse blodtab fra skader dannes blodstørkninger i det beskadigede kar. Efter naturlig heling af skaden bliver overskud af blodstørkninger opløst ved det fibrinolytiske systems 15 indvirkning. Undertiden dannes blodpropper uden traumatisk skade, og disse kan sætte sig fast i store blodkar resulterende i partiel eller endog total blodstrømningsobstruktion. Når dette sker i hjerte, lunge eller hjerne, kan resultatet blive en myocardial 20 infarkt, pulmonær emboli eller slagtilfælde. Disse tilstande kombineret er den fremherskende årsag til sygelighed og dødelighed i de industrialiserede nationer.

Blodstørkning^ består af et fibernetværk, der 25 kan opløses af det proteolytiske enzym plasmin.

Enzymet er afledt af det inaktive proenzym, plasminogen, en komponent i blodplasma, ved indvirkning af en plasminogenaktivator. Der er to immunologisk forskellige pattedyrplasminogenaktivatorer. Intern plas-30 mingenaktivator, også kendt som urokinase, er et enzym, der produceres af nyrerne og kan isoleres fra urin. Det kan også fremstilles ud fra en række væv-kulturkilder. Ekstern plasminogenaktivator, også kendt som vasculær plasminogenaktivator og som væv-35 plasminogenaktivator (t-PA), kan isoleres fra mange vævhomogenater (navnlig human uterus), den vasculære cellevæg og fra cellekulturer. Foruden disse to typer plasminogenaktivator findes også et bakterielt produkt, streptokinase, fremstillet af beta-hæmolytiske strep- 2

DK 163639 B

tococci. En væsentlig ulempe ved både urokinase og streptokinase er, at de er aktive i hele kredsløbet og ikke blot på stedet for en blodstørkning. De kan for eksempel ødelægge andre blodproteiner, såsom fibrinogen, prothrombin, faktor V og faktor VIII, og 5 således nedsætte blodstørkningsevnen og forøge risikoen for hæmoragi. I modsætning hertil er den biologiske aktivitet af t-PA afhængig af tilstedeværelsen af fibrin, hvortil den binder, og hvor den aktiveres. Maksimal aktivitet udvikles således kun på stedet 10 for en blodstørkning, dvs. i nærværelse af fibrin-netværket, der skal opløses, og herved undgåes i høj grad risikoen for hæmoragi.

Prostaglandin E^ (3-hydroxy-2-(3-hydroxy-l-octe-nyl)-5-oxocyclopentan-heptansyre) er et naturligt 15 forekommende prostaglandin og var et af de første, der blev isoleret og karakteriseret. Det er kommercielt tilgængeligt til behandling af perifer vasculær sygdom.

Prostacyclin (også kendt som epoprostenol og 20 PGI2) er °9S^ et naturligt prostaglandin, der forekommer inden i arterievæggen hos pattedyr. Det har kraftige vasodilator- og antiblodplade-egenskaber og er kommercielt tilgængeligt som dets natriumsalt, natrium-epoprostenol, til anvendelse i ekstracorporale 25 kredsløb under cardiopulmonært omløb, nyredialyse og trækul-hæmoperfusion. En række nyere publikationer inden for litteraturen lader formode, at prostacyclin også kan have fibrinolytisk aktivitet (J.Pharmac.Exp.

Therap. 1982, 222(3), 544 til 549, og Thrombos-Res., 30 1983, 2J9, 655 til 660). Lignende rapporter er også forekommet for den prostacyclin-analoge iloprost (Brit.J.Pharmac., 1985, 8£,8138, og Thromb.Haemost., 1983, jj£, 893). Det er også foreslået, at prostacyclin forøger den thrombolytiske aktivitet af streptokinase 35 (J.Cardiovasc.Pharmac., 1985, 1_, 739 til 746).

En række prostacyclin-analoge er også blevet syntetiseret og vurderet som antithrombotiske eller antiblodplade-midler (Circulation, 1985, 72 (6), 1219 til 3

DK 163639 B

1225, og Progress in Medicinal Chemistry, 1984, 21, 237 til 279).

Det har nu vist sig, at en blanding af t-PA og et prostaglandin har thrombolytisk aktivitet, og at niveauet for denne aktivitet er potenseret signifi-5 kant sammenlignet med aktiviteten af t-PA eller prosta-glandinet per se. Den synergistiske farmaceutiske blanding ifølge opfindelsen er følgelig ejendommelig ved, at den udgøres af t-PA og et prostaglandin, der er PGE^, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, eller 10 en forbindelse med formlen I: 4 ftv* HO V { OH _.cor.

/m 4 20 hvor Rx er -(CH2)3COR4 eller , hvor R4 er hydroxy, (C1~C4)alkoxy, amino, (C1~C4)alkylamino eller di(C^-C4)alkylamino, R2 er n-pentyl, cyclopentyl, cyclohexyl eller l-methyl-3-pentynyl, R^ er hydrogen eller methyl, og X er oxygen eller methylen, eller 25 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Blandingen ifølge opfindelsen kan anvendes til at fjerne en blodstørkning og også til at forebygge dannelse af en blodprop i en patient, hvor den er tilbøjelig til at forekomme, for eksempel efter rekanali-30 sering af et blodkar hos en patient. Selvom blandingen ifølge opfindelsen kan anvendes til at fjerne eller forebygge dannelse af en blodprop i et hvilket som helst blodkar, er den særligt anvendelig til at fjerne eller forebygge dannelsen af en coronar blodprop.

35 Det t-PA, der anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse,kan være et hvilket som helst bioaktivt protein, der i væsentlige svarer til patte- 4

DK 163639 B

dyr—-t-PA, og navnlig humant t-PA, og omfatter former med eller uden glycosylering. Det kan være énkæde- eller tokæde-t-PA eller en blanding deraf, som beskrevet i europæisk patentpublikation EP-A-112 122, og har, 5 i tilfælde af fuldt glycosyleret humant t-PA, en tilsyneladende molekylvægt på polyacrylamidgel på ca.

70.000 og et isoelektrisk punkt på mellem 7,5 og 8,0. t-PA'en har fortrinsvis en specifik aktivitet på ca.

500.000 IU/mg (internationale enheder/mg, idet den 10 internationale enhed er en aktivitetsenhed defineret af WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6RB, U.K.).

Aminosyresekvensen af t-PA svarer fortrinsvis i det væsentlige til sekvensen vist i Fig.l. Sekvensen er således identisk med sekvensen i Fig.l eller viser én eller flere aminosyre-deletioner, -substitutioner, -insertioner, -inversioner eller-additioner af allelisk oprindelse eller anden, idet den resulterende sekvens 20 har mindst 80%, og fortrinsvis 90%, homologi med sekvensen i Fig.l og bevarer essentielt de samme bio- / logiske og immunologiske egenskaber som proteinet.

Navnlig er sekvensen identisk med den i Fig. 1 eller er den samme sekvens, men idet aminosyren i position 25 245 fra serin-N-terminus1 en er valin i stedet for methionin, hvorhos begge sekvenser eventuelt er uden en hvilken som helst af de første tre aminosyrer eller eventuelt har en yderligere N-terminal polypeptid-præsekvens af Gly-Ala-Arg.

Aminosyresekvensen vist i Fig.l har 35 cystein-grupper og har således potentialet for dannelse af 17 disulfidbroer. Baseret på analogi med andre proteiner, hvis struktur er blevet bestemt mere detaljeret, er den postulerede struktur for sekvensen (stammende fra disul-

*3 C

J fidbindingsdannelse) mellem aminosyren i position 90 og prolin-C-terminus'en vist i Fig.2. Strukturen af den N-terminale region er mindre sikker, omend nogle forslag er fremsat (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 5

DK 163639 B

269-273; og Proc.Natl.Acad.Sci., 1984, 81, 5355-5359).

De vigtigste træk ved strukturen af t-PA er de to kringleregioner (mellem aminosyrerne ved positionerne 92 og 173 og mellem aminosyrerne ved positionerne 180-5 261), der er ansvarlige for proteinets binding til fibrin, og serinprotease-regionen, der omfatter hovedparten af B-kæden, og som er ansvarlig for aktiveringen af plasminogen. Aminosyrerne af speciel betydning i se-rin-proteaser er den katalytiske triade, His/Asp/Ser.

10 I t-PA forekommer disse ved positionerne 322, 371 og 463. Disulfidbroen mellem cysteinaminosyregrupperne ved positionerne 264 og 395 er også vigtig ved, at den holder A- og B-kæderne i tokædeformen af t-PA sammen.

I Fig.l og 2 er anvendt de konventionelle 15 én- og tre-bogstavskoder for aminosyregrupperne, som nedenfor angivet:

Asp D Asparaginsvre Cys C. Cystein Arg R Arginin

Thr T Threonin Val V Valin Lys K Lys in

Ser S Serin lie. I Isoleuoin Trp W Tryptophan 20 Glu E Glutaminsyre Leu L Leucin Gin Q Glutanin

Pro P Prolin Tyr Y Tyrosin Met M Methionin-

Gly G Glycin Phe F Phenylalanir. Asn N Aspar agin

Ala A Alanin His H Histidin 25 t-PA*et kan vindes ved en hvilken som helst af de tidligere beskrevne eller kendte fremgangsmåder.

For eksempel kan den vindes fra en normal eller neo-plastisk cellelinie af typen beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153, EP-A-41 766 30 eller EP-A-113 319. Det foretrækkes imidlertid, at t-PA vindes ud fra en dyrket transformeret eller transficeret cellelinie, der er vundet ved anvendelse af rekombinant DNA-teknologi, som beskrevet i for eksempel EP-A-93 619, EP-A-117 059, EP-A-117 060, 35 EP-A-173 552, EP-A-174 835, EP-A-178 105, EP-A-225 177, EP-A-225 286, WO 86/01538, WO 86/05514 eller WO 86/05807.

Det er særligt foretrukket, at anvende kinesisk hamsterovarie (CHO) -celler til fremstillingen af t-PA, og at 6

DK 163639 B

disse er vundet på måden beskrevet i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759. På denne måde bliver det klonede gen sammen med genet, der koder for dihydrofolat-reduktase (dhfr), cotransficeret ind i 5 dhfr CHO-celler. Transformanter, der eksprimerer dhfr, udvælges på medier, der mangler nucleosider, og udsættes for stigende koncentrationer af methotrexat. dhfr- og t-PA-generne bliver således co-forstærkede, hvilket fører til en stabil cellelinie, der er i stand 10 til at eksprimere høje niveauer af t-PA.

t-PA'et renses fortrinsvis ved anvendelse af en hvilken som helst fremgangsmåde, der er tidligere beskrevet eller kendt, såsom fremgangsmåden beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; 15 J.Biol.Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur.J.Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 eller GB-A-2 122 219.

En foretrukket underklasse af prostaglandiner til anvendelse i forbindelse med den foreliggende 20 opfindelse omfatter PGE^, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, eller en forbindelse med formlen I, hvor R^, R2, R3 og X er som ovenfor defineret, og R^ er hydroxy, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. Eksempler på et farmaceutisk acceptabelt salt 25 omfatter alkalimetal- og jordalkalimetalsalte. Det mest foretrukne eksempel er natriumsaltet.

Specifikke eksempler på særligt foretrukne prostaglandiner til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter PGE^, eller et farma-30 ceutisk acceptabelt salt deraf, eller en af de følgende forbindelser med formlen I, hvor: 1. R^ er -(CI^i^COR^, hvor R^ er hydroxy, R2 er n-pen-tyl, R^ er hydrogen, og X er oxygen (prostacyclin), 2. R^ er -(OE^^COR^, hvor R^ er hydroxy, R2 er n-pen-35 tyl, R^ er hydrogen, og X er methylen (carbacyclin), 3. R^ er -(C^J^COR^, hvor R^ er hydroxy, R2 er n-pen-tyl, R^ er methyl, og X er methylen (9-S-methylcarba-cyclin),

DK 163639 B

.7 4. R^ er -(CI^JgCOR^, hvor R^ er hydroxy, R2 er 1-methyl-3-pentynyl, R^ er hydrogen, og X er methylen (iloprost), 5. R·^ er -(CI^J^COR^, hvor R^ er hydroxy, R2 er cyclo-5 pentyl, R3 er hydrogen, og X er methylen, eller WC0R4 6. R^ er \__/ , hvor R^ er hydroxy, R2 er cyclojiexyi , R3 er hydrogen, og X er methylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

10 Prostaglandinet til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse kan fremstilles og renses ved en hvilken som helst egnet, tidligere beskrevet eller kendt fremgangsmåde, for eksempel J.Am.

Chem.Soc., 1969, 91, 535, britisk patentskrift 1583961, 15 GB-A 2 012 265, GB-A 2 013 661, GB-A 2 017 699, GB-A 2 070 596, US patentskrift 4 238 414, EP-A 105 651, EP-A 134 153, EP-A 153 822, WO 86/00808 , US patentskrift 4 510 323, US patentskrift 4 349 689 og US patentskrift 4 420 632.

20 Ved anvendelse af t-PA og et prostaglandin på måden ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes det at anvende dem i form af en farmaceutisk komposition. De aktive bestanddele kan anvendes i separate kompositioner eller i en enkelt kombineret komposition, 25 men i sidstnævnte komposition skal begge aktive bestanddele naturligvis være stabile og gensidigt kompatible i den særligt anvendte komposition. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor også en farmaceutisk komposition, der indeholder t-PA og et prostaglandin, 30 som ovenfor defineret, og en farmaceutisk acceptabel bærer.

t-PA og prostaglandinet vil i almindelighed blive anvendt ad den intravasculære vej, enten ved infusion eller ved bolus-injektion, og der kræves således en 35 parenteral komposition. Det foretrækkes at levere en lyofiliseret komposition til lægen eller dyrlægen, på grund af denne kompositions store transport- og lagringsfordele. Lægen eller dyrlægen kan derefter rekonstituere 8

DK 163639 B

den lyofiliserede kompostion i en passende mængde opløsningsmiddel, som og når nødvendigt.

Parenterale og lyofiliserede farmaceutiske kompositioner indeholdende t-PA kendes. Eksempler herpå er 5 EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 319, EP-A-123 304, EP-A-143 081, EP-A-156 169, EP-A-211 592, EP-A-217 379, EP-A-218 112, W086/01104, japansk patentpublikation 57-120523 (ansøgning 56-6936) og japansk patentpublikation 58-65218 (ansøgning 56-10 163145) . Yderligere eksempler omfatter GB-A-2 176 702, GB-A-2 176 703 og GB-A-2 184 354.

Parenterale og lyofiliserede kompositioner indeholdende et prostaglandin, som ovenfor defineret, er også kendt. Eksempler herpå omfatter de ovennævnte 15 britiske patentpublikationer og også EP-A-5 768.

Parenterale og lyofiliserede kompositioner indeholdende t-PA og prostaglandinet sammen i en enkelt, kombineret komposition kan fremstilles på en måde svarende til fremstillingen af kompositioner egnede til 20 t-PA eller prostaglandinet per se. Som ovenfor nævnt vil imidlertid stabiliteten og den gensidige kompatibilitet af de aktive bestanddele i en vis komposition kræve at blive taget i betragtning, og kompositionen skal indrettes derefter.

25 Intravasculære infusioner gennemføres normalt med den parenterale opløsning indeholdt i en infusionsbeholder eller -flaske eller i en elektrisk fungerende infusionssprøjte. Opløsningen kan leveres fra infusionsbeholderen eller -flasken til patienten ved tyngde-kraftens hjælp eller ved anvendelse af en infusionspumpe. Anvendelse af ved tyngdekraftens hjælp fungerende infusionssystemer giver ikke tilstrækkelig kontrol med tilførselshastigheden for den pareterale opløsning, og anvendelse af en infusionspumpe foretrækkes derfor 33 navnlig til opløsninger indeholdende relativt høje koncentrationer af aktive bestanddele. Særligt foretrukket er imidlertid anvendelse af en elektrisk fungerende indusionssprøjte, der giver bedre kontrol med anvendelseshastigheden.

9

DK 163639 B

Blandingen ifølge opfindelsen kan anvendes ved en fremgangsmåde til fjernelse eller inhibering af dannelsen af en blodprop i pattedyr, hvilken fremgangsmåde indebærer anvendelse til pattedyret af en 5 effektiv mængde af t-PA og et prostaglandin, som ovenfor defineret. Ifølge et alternativ tilvejebringer den foreliggende opfindelse en kombination af t-PA og et prostaglandin, som ovenfor defineret, til anvendelse inden for human og veterinær medicin, navnlig til 10 anvendelse ved fjernelse eller inhibering af dannelsen af en blodprop i et pattedyr.

Ved anvendelse af t-PA og et prostaglandin som ovenfor nævnt: kan de aktive bestanddele anvendes samtidigt eller i rækkefølge som separate blandinger 15 eller som en enkelt kombineret blanding. Hvis der benyttes sekventiel anvendelse, skal pausen før anvendelse af den anden af de aktive bestanddele ikke være så stor, at fordelen ved en synergistisk thrombolytisk eller anti-thrombotisk effekt hos kombinationen af de aktive 20 bestanddele går tabt.

En effektiv mængde af t-PA og et prostaglandin i henseende til at fjerne eller inhibere dannelsen af en blodprop i et pattedyr vil afhænge af en række faktorer omfattende for eksempel pattedyrets alder og 25 vægt, den præcise tilstand, der kræver behandling, og tilstandens alvor, anvendelsesvejen, den særlige form af t-PA og prostaglandin, der anvendes, og deres styrke, og anvendelsesmængden vil blive fastlagt af lægen eller dyrlægen. Det er imidlertid sandsynlig, at en effektiv 30 mængde, i tilfælde af t-PA, vil ligge fra 14.000 til 400.000 IU pr. kg pr. time, og i tilfælde af prostaglandin vil ligge fra 30 til 30.000 ng pr. kg. pr. time. For eksempel vil i tilfælde af prostacyclin en effektiv mængde sandsynligvis ligge fra 120 til 960 ng 35 pr.kg.pr.time. Til et voksent menneske på 70 kg vil en effektiv mængde pr. time således i almindelighed, i tilfælde af t-PA, ligge fra 1.000.000 til 25.000.000 IU og, i tilfælde af prostaglandinet, ligge fra 2100 til 2.100.000 ng.

DK 163639B

10

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 5:

Den thrombolytiske effektivitet af t-PA, prostaglandin og en kombination deraf blev vurderet på en in vivo-model af jugularvene-thrombosis.

Metodik 10 Anæstesi blev induceret i en kanin ved en intra venøs injektion af natriumpentobarbiton (30 mg/kg). Et konstant anæstesiniveau blev under forsøgets varighed opretholdt ved intravenøs infusion, som behøvet, af en fortyndet natriumpentobarbitonopløsning (1 mg/ml).

15 Et 10 cm ventralt midtlinie-indsnit i den cervicale region blev foretaget for at blotlægge trachea og den venstre eksterne jugularvene. Et trachealrtfr blev indført, og dyret blev ventileret kunstigt (40 bpm, 18 ml lungevolumen) med en gnaver-respirator for at opretholde 20 konstant repiration. Pemoralvenen og -arterien blev isoleret og kanyleret.

Kauterisation anvendtes til at isolere et segment af den eksterne jugularvene 2 cm i retning af hovedet fra forgreningen af facialvenen og 4 cm i nedad-25 gående retning (omtrentlige afstande). Alle venøse bistrønne blev ligeret eller kauteriseret på langs ad den blotlagte vene.

Facialvenen blev kanyleret med PE5Q-rør. Den blodlagte jugularvene blev forsynet med klemmer distalt og proximalt til bifurkationen for at isolere en sektion. En suturtråd 30 (2-0 bpc, Davis og Geck, Gosport, England) blev indført longitudinalt i luminet af det isolerede segment ved anvendelse af en rund suturnål (gauge 4, Ethicon Ltd., Edingburgh, Skotland). Blodstrømning blev derefter : genetableret. Da blødning ophørte fra nålepunkturerne, 35 blev jugularvenesegmentet re-isoleret og tømt for alt blod via facialvenekanylen. Thrombus'en blev derefter dannet ved følgende metode. Humant thrombin (500 enheder/ml, 10 yl) blev indført i venesegmentet.

Et volumen blod ækvivalent med den isolerede segmentka- 11

DK 163639 B

pacitet blev udtaget fra femoralarterien og sat til et 12x75 mm testrør indeholdende 10 yl (-1.900.000 dpm) 125 af I-mærket humant fibrinogen (Amersham International p.l.c., England). Blodet blev aspireret ind i en 1 ml sprøjte med henblik på efterfølgende injektion gennem 5 facialvenekateteret ind i det isolerede venesegment. Ethvert tilbageværende blod i facialvenekateteret blev skyllet ned med saltopløsning. Okkluderende størkninger dannedes hurtigt og fik lov at ældes i 30 minutter. På dette tidspunkt blev blodstrømmen genetableret gennem 10 venesegmentet ved fjernelse af klemmerne. Thyroidal optagning af radioiodid blev blokeret med en 1 ml intravenøs injektion af en 2% (vægt/vol.) natriumiodid (Mallinkrodt, Paris, KY)-opløsning forud for thrombus-dannelse.

15 t-PA'et vandtes fra en dyrket transficeret CHO- celleline, der var afledt ved anvendelse af metoden ifølge Molecular and Cellular Biology 1985, 5(7), 1750-1759, renset og oparbejdet som en vandig saltopløsning ved pH 3, som beskrevet i britisk patentpub-20 likation GB-A-2176703. Denne opløsning blev infuseret (24 ml) via en femoralvene i løbet af en 2 timers periode, der fulgte efter en "loading bolus" i en dosis på 1 ml i løbet af det første minut.

Prostacyclinet blev fremstillet som natriumsaltet 25 ved anvendelse af metoden fra britisk patentskrift nr. 1.583.961, opløst i 1M Tris-puffer (pH 9,6 ved 4°C) og fortyndet med isotonisk natriumbicarbonatopløsning (1,25% vægt/vol., pH 8,6, 4°C). Denne opløsning, der er beskrevet i europæisk patentpublikation EP-A-5 768, blev 30 infuseret intravenøst, enten via femoralvenen eller lokalt i ørevenen, over 2 timers perioden.

Resultater

Intravenøs infusion af t-PA forårsagede en dosis-relateret thrombolyse i denne model. Intravenøs 35 infusion af prostacyclin (0,1-0,4 yg kg min ^) inducerede ikke, hverken systemisk eller lokalt, en signifikant grad af thrombolyse. Imidlertid potenserede

DK 163639B

12 lokal intravenøs infusion af prostcyclin (0,4 yg kg ^ min 1) signifikant (p<0,001) den thrombolytiske virkning af en submaksimal dosis af t-PA (5 x 10^ IU kg ^) . Ligeledes medførte systemisk intravenøs infusion af prostacyclin 0,1-4,0 yg kg ^ min en dosis-relateret 5 stigning i thrombolyse induceret af t-PA (5 x 10^ IU kg "*) , idet den højeste dosis af prostacyclin inducerede signifikant (p<0,01) potensering af denne respons. Resultaterne er vist billedligt i Pig. 3

Claims

2. Blanding * ifølge krav 1, kendetegnet ved, at t-PA'et er i énkæde-formen.
3. Blanding - ifølge krav 1, kendetegnet ved, at t-PA'et er i tokæde-formen.
4. Blanding . ifølge et hvilket som helst af 25 kravene 1-3, kendetegnet ved, at t-PA'et har den i Fig. 1 viste aminosyresekvens eller har samme aminosyresekvens, men hvor aminosyren i position 245 fra serin-N-terminus'en er valin i stedet for methionin, hvorhos hver sekvens eventuelt er uden en hvilken som 30 helst af de første tre aminosyrer eller eventuelt har en yderligere N-terminal polypeptid-præsekvens af Gly-Ala-Arg.
5. Blanding ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at prosta- 35 glandinet er PGE^ eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, eller en forbindelse med formlen I, hvor R^ er hydroxy, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. DK 163639 B
6. Blanding ifølge krav 5, kendetegnet ved, at prostaglandinet er prostacyclin, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
7. Blanding ifølge krav 5, kendetegne t ved, at prostaglandinet er carbacyclin, eller 5 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
8. Blanding ifølge krav 5, kendetegnet ved, at prostaglandinet er 9-3-methylcarbacyclin, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
9. Blanding ifølge krav 5, kendeteg- 10 net ved, at prostaglandinet er iloprost, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
10. Blanding ifølge krav 5, kendetegnet ved, at prostaglandinet er en forbindelse med formlen I, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, 15 hvor er -(CH^J^COR^, hvor R4 er hydroxy, R2 er cyc-lopentyl, R^ er hydrogen, og X er methylen.
11. Blanding ifølge krav 5, kendetegnet ved, at prostaglandinet er en forbindelse med formlen I, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, 2° ^_j-C0R4 hvor R^ er , hvor R4 er hydroxy, R2 er cyclo- hyxyl, R3 er hydrogen, og X er methylen.
12. Farmaceutisk præparat , kendetegnet ved, at den indeholder en blanding · ifølge et 25 hvilket som helst af kravene 1-11 og en farmaceutisk acceptabel bærer.
13. Anvendelse af en ' blanding . ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 ved fremstilling af et lægemiddel til fjernelse eller inhibering af dannelsen 30 af en blodprop i et pattedyr.