DK163670B - Fremgangsmaade til fraskillelse og udvinding af nosiheptid - Google Patents

Description

DK 163670B

i

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fraskillelse og udvinding af nosiheptid, som er et antibiotikum, og opfindelsen angår nærmere bestemt en fremgangsmåde til fraskillelse og udvinding af nosiheptid 5 fra en dyrkningsblanding under anvendelse af særlige opløsningsmidler.

Nosiheptid (betegnet 9671RP) er et antibiotikum fremstillet ud fra stammer, der hører til slægten Strepto-myces (jf. JP-offentliggørelsesskrift nr. 880/1965), og er 10 kendt som et foderadditiv til dyr.

Til fremstilling af nosiheptid kendes dyrkningsmetoden, hvorved der anvendes en nosiheptidproducerende stamme tilhørende slægten Streptomyces, men fraskillelsen og udvindingen af nosiheptid fra dyrkningsblandingen er endnu 15 ikke blevet nærmere undersøgt. Generelt gennemføres fraskillelsen og udvindingen af antibiotikum fra dyrkningsblandingen ved blanding af dyrkningsblandingen med et opløsningsmiddel og fraskillelse af myceliet, der er uopløseligt i opløsningsmidlet. Ved denne proces er valget af det rigti-20 ge opløsningsmiddel meget vigtigt. Opløsningsmidlet skal have en god evne til at fraskille en opløsningsmiddel-uopløse-lig del, der har mycelium som hovedbestanddel, og skal have en god opløsende virkning på antibiotiket.

Opløsningsmidlet varierer alt efter myceliet eller an-25 tibiotiket, der skal fraskilles. For eksempel kendes en metode med anvendelse af acetone, methanol og ethanol (JP-offentliggørelsesskrift nr. 29157/73) til fraskillelse og udvinding af multhiomycin fra dyrkningsblandingen fremkommet ved dyrkning af en multhiomycinproducerende stamme tilhøren-30 de slægten Streptomyces.

Endvidere kendes en metode med anvendelse af chloroform eller en opløsningsmiddelblanding med chloroform som hovedbestanddel (JP-offentliggørelsesskrift nr. 26718/70) til fraskillelse og udvinding af thiopeptin B fra dyrknings-35 blandingen fremkommet ved dyrkning af en thiopeptin B-pro-ducerende stamme tilhørende slægten Streptomyces. Imidlertid er evnen af sådanne kendte opløsningsmidler til at op- 2

DK 163670 B

løse nosiheptid for lille til, at der opnås en tilstrækkelig effekt.

På baggrund af det ovenfor anførte er det formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en effektiv 5 metode til fraskillelse og udvinding af nosiheptid. Dette formål opfyldes ved en fremgangsmåde til fraskillelse og udvinding af nosiheptid, hvorved en dyrkningsblanding fremkommet ved dyrkning af en nosiheptidproducerende stamme tilhørende slægten Streptomyces blandes med et første opløs-10 ningsmiddel, hvorefter en uopløselig del, der har mycelium som hovedkomponent, fraskilles, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det første opløsningsmiddel er en cyc-lisk ether, og at der efter fraskillelsen af den uopløselige del tilsættes et andet opløsningsmiddel, der er fuldstændig 15 opløseligt i det første opløsningsmiddel, men tungtopløseligt eller uopløseligt i vand, i en mængde på 0,05-0,5 gange volumenet af det første opløsningsmiddel, hvorefter det dannede vandlag fraskilles, og nosiheptidet udvindes fra opløsningen. Opfindelsen beskrives detaljeret i det følgende.

20 Streptomyces actuosus (NRRL 2954; ATTC 25421) tilhø rende slægten Streptomyces eller dens mutanter er kendte som nosiheptidproducerende stammer.

Dyrkningsblandingen indeholdende nosiheptid fås ved at dyrke en sådan stamme ved f.eks. metoden, der er beskre-25 vet i JP-offentliggørelsesskrift nr. 880/1965. Dyrkningsblandingen indeholder kulhydrater, uorganiske salte, der hidrører fra sammensætningen af fermenteringsmediet, mycelium, nosiheptid og lignende. Nosiheptid akkumuleres på overfladen af dette mycelium, der hovedsagelig er sammensat 30 af actinomyceter, der har en kompliceret overfladestruktur.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen blandes en sådan dyrkningsblanding med en cyclisk ether (i det følgende betegnet "den første opløsningsmiddelbehandling").

Cycliske ethere omfatter tetrahydrofuran, dioxan og 35 lignende, og tetrahydrofuran foretrækkes.

Som dyrkningsblanding, der anvendes ved den første 0 3

DK 163670 B

opløsningsmiddelbehandling, anvendes der enten dyrkningsblanding underkastet en afvandingsbehandling ved hjælp af en mekanisk anordning, såsom en centrifugalseparator eller et filter, eller den rå dyrkningsblanding uden afvandings-5 behandling.

Det er vanskeligt at gennemføre en afvandingsbehandling af dyrkningsblandinger med mycelier, hvis overfladestruktur er kompliceret, men den cycliske ether, der anvendes ifølge opfindelsen, har en fremragende opløsende virk-10 ning på nosiheptid, selv når der anvendes en rå dyrkningsblanding med et højt fugtighedsindhold. Det er derfor økonomisk fordelagtigt at anvende rå dyrkningsblanding ved gennemførelsen af den første opløsningsmiddelbehandling.

Den anvendte mængde af den cycliske ether, som anven-15 des derved, afhænger af mængden af vand og nosiheptid i dyrkningsblandingen, og den vælges generelt til 0,5 til 5 gange, fortrinsvis 1,5 til 2,5 gange volumenet af dyrkningsblandingen .

Den første opløsningsmiddelbehandling gennemføres ge-20 nerelt under anvendelse af en omrøringstank med et udløb for uopløseligt materiale i bunden. Behandlingstiden er sædvanligvis 0,5-3 timer, fortrinsvis 1-2 timer, og temperaturen er sædvanligvis 5-80°C, fortrinsvis fra stuetemperatur til 60°C.

25 pH-værdien af dyrkningsblandingen, der anvendes ved behandlingen, varierer afhængigt af dyrkningstilstanden.

Det foretrækkes at indstille pH-værdien til 3-10, fortrinsvis 5-7, ved behandlingen. Denne indstilling forhindrer nosiheptid i at blive overført til vandlaget og gør udvin-30 dingsgraden højere, når vandlaget fraskilles til fjernelse af urenheder, hvilket beskrives nedenfor.

Efter den første opløsningsmiddelbehandling henstilles blandingen af dyrkningsblanding og opløsningsmiddel, og den deles i to dele, hvoraf den ene er en uopløselig del in-35 deholdende mycelium som hovedbestanddel, og den anden er 4

DK 163670 B

klart opløsningsmiddel indeholdende opløst nosiheptid (dette klare opløsningsmiddel indeholder meget vand og betegnes i det følgende "det første behandlings-opløsningsmiddel") . De to dele adskilles ved udledning af det udfældede 5 uopløselige materiale gennem udløbet i bunden af omrøringstanken .

Den ovenfor anførte behandling er sædvanligvis tilstrækkelig i sig selv, da den cycliske ether anvendt ifølge opfindelsen har en høj evne til opløsning af nosihep-10 tid, men det fraskilte uopløselige materiale kan om fornødent behandles med cyclisk ether igen.

Efter denne behandling tilsættes og iblandes et andet opløsningsmiddel, som er opløseligt i det første behandlingsopløsningsmiddel, men tungtopløseligt eller uopløseligt i 15 vand, i det første behandlingsopløsningsmiddel til dannelse af et lag af vand, som var opløst i det første behandlingsopløsningsmiddel, og derefter fjernes det vandige lag.

Benzen, toluen, xylen, hexan, heptan eller cyclohexan anvendes som vanduopløseligt opløsningsmiddel. Den anvendte 20 mængde varierer afhængigt af mængden af vand i det første behandlingsopløsningsmiddel. Mængden af i vand tungtopløseligt eller uopløseligt opløsningsmiddel er 0,05-0,5 gange, fortrinsvis 0,25-0,35 gange volumenet af det første behandlings-opløsningsmiddel. Når mængden af opløsningsmiddel 25 ligger under det ovenfor anførte område, er det ikke muligt at fraskile hele mængden af vand opløst i det første behandlings-opløsningsmiddel, og når denne mængde ligger over dette område, udfældes nosiheptid fra opløsningsmidlet.

Laget af vand, som var opløst i opløsningsmidlet, 30 kan dannes ved anvendelse af den nævnte omrøringstank, idet man efter fraskillelse af uopløseligt materiale tilsætter vanduopløseligt opløsningsmiddel og blander det i det første behandlings-opløsningsmiddel i omrøringstanken ved samme temperatur som ved den første opløsningsmiddelbehandling i 35 1-10 minutter.

Ved fraskillelsen af vandlaget fraskilles urenheder, 5

DK 163670 B

såsom kulhydrater og uorganiske salte, som var opløst i det første behandlings-opløsningsmiddel, sammen med vandet, og der kan direkte udvindes et højrenset nosiheptid fra opløsningen. På dette stadium vil lidt nosiheptid kunne gå tabt 5 ved overføring til vandlaget, men dette kan forhindres effektivt ved indstilling af pH-værdien af dyrkningsblandingen anvendt ved den første opløsningsmiddelbehandling inden for det ovenfor beskrevne område.

Fra opløsningsmiddelblandingen udvindes nosiheptid 10 enten ved udfældning af dette ved afdestillering af opløsningsmidlet og mekanisk udvinding eller ved udfældning af nosiheptid ved tilsætning af en tredie komponent til opløsningsmiddelblandingen, og det foretrækkes som tredie komponent at anvende det samme opløsningsmiddel som ved fra-15 skillelse af vandlaget.

Mængden af opløsningsmiddel (den tredie komponent), der kan anvendes til fraskillelse af nosiheptid, vælges i området 0,2-1,0 gange, fortrinsvis 0,4-0,6 gange volumenet af opløsningsmiddelblandingen efter fraskillelse af vandla-20 get.

Behandlingen gennemføres under de samme betingelser som fraskillelsen af vand, dvs. opløsningsmidlet sættes til omrøringstanken efter fraskillelsen af vand.

Udvindingen af nosiheptid, der er udskilt fra opløs-25 ningsmiddelblandingen, kan let gennemføres ved hjælp af centrifugalseparation eller filtrering.

Det således udvundne nosiheptid indeholder undertiden en lille mængde tungmetaller, såsom Fe, Co, Ni, Cu og Mn.

Hvis det er nødvendigt at fjerne tungmetal, bør nosiheptid 30 opløses i et passende opløsningsmiddel og behandles med aktivt kul, silicagel eller chelat-ionbytterharpiks.

Fraskillelsen af tungmetal kan også foretages fra opløsningsmiddelblandingen efter fraskillelse af vand.

Den foreliggende opfindelse gør det muligt at gen-35 nemføre fraskillelsen og udvindingen af nosiheptid fra dyrkningsblandingen på en økonomisk effektiv måde ved anvendelse 6

DK 163670 B

af særlige opløsningsmidler, hvilket udgør et teknisk fremskridt ved fremstilling af nosiheptid.

Den foreliggende opfindelse illustreres i det følgende eksempel.

5

Eksempel

En blandetank med et udløb i bunden fyldes med 100 volumendele dyrkningsblanding fremkommet ved dyrkning af Streptomyces actuosus og med 200 volumendele tetrahydrofu-10 ran, og der blandes under omrøring ved en temperatur på 60°C i 1 time.

Dyrkningsblandingen har følgende sammensætning: mycelium 7,5 vægt-% kulhydrater 2,0 vægt-% 15 uorganiske salte 0,5 vægt-% nosiheptid 0,5 vægt-% vand 89,5 vægt-% og den har en pH-værdi på 5,6.

Der henstilles i 5 minutter til udfældning af uoplø-20 seligt materiale efter den ovenfor anførte blanding, og derefter udledes det uopløselige materiale gennem udløbet. Mængden af uopløseligt materiale er 75 volumendele, og mængden af det første behandlings-opløsningsmiddel (tetrahydrofuranopløs-ning) i tanken er 225 volumendele. Resultaterne af en væske-25 chromatografisk analyse viser, at opløsningsmidlet indeholder 2,11 vægt-% nosiheptid (udbytte: 95 vægt-%).

Derefter sættes der 60 volumendele heptan til beholderen og blandes i 5 minutter, der henstilles i 10 minutter, og det dannede nedre vandlag bortledes gennem udløbet (mæng-30 den af udledt vand er 60 volumendele, og der bliver 225 vo-lumendele af opløsningsmiddelblandingen tilbage). Graden af fjernelse af kulhydrater og uorganiske salte med denne udledning af vand er henholdsvis 95 og 99 vægt-%.

Analyse af hver sammensætning til bestemmelse af den 35 ovenfor anførte fjernelsesgrad gennemføres på følgende måde.

Kulhydrater: Efter tilsætning af vand filtreres op- 7

DK 163670 B

løsningsmiddelblandingen til fraskillelse af udfældet nosi-heptid, og remanensen, der fås ved destillering og tørring af filtratet, opløses i vand. Efter tilsætning af farvereagenser måles absorbansen.

5 Uorganiske salte: Der gennemføres atomabsorptionsana lyse ved anvendelse af det første behandlings-opløsningsmiddel .

Derefter sættes der igen 100 volumendele heptan til tetrahydrofuranet efter fjernelsen af vandlaget og omrøres 10 i 5 minutter, og hele tankens indhold udledes og føres til en centrifugalseparator, hvorefter nosiheptid udvindes.

Der er kun spor af nosiheptid tilbage i det fraskilte opløsningsmiddel, og renheden af det udvundne nosiheptid er 95 vægt-% ifølge væskechromatografisk analyse.

15

Referenceeksempel.

Opløseligheden af nosiheptid i dyrkningsblandingen anvendt i eksempel 1 i forskellige opløsningsmidler som angivet i tabel I er målt og angivet i tabel I.

20 Opløseligheden er i overensstemmelse med "ministeriel bestemmelse vedrørende specifikation af foderkomponenter og foderadditiver".

Tabel I

25 Opløsningsmiddel Opløselighed ethanol meget tungtopløseligt isopropanol tungtopløseligt amylalkohol do.

toluen do.

30 chloroform do.

dichlormethan meget tungtopløseligt dichlorethan do.

ethylacetat do.

isobutylacetat do.

35 acetone tungtopløseligt methylisobutylketon do.

tetrahydrofuran opløseligt

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fraskillelse og udvinding af nosiheptid, hvorved en dyrkningsblanding fremkommet ved dyrkning af en nosiheptid-producerende stamme tilhørende 5 slægten Streptomyces blandes med et første opløsningsmiddel, hvorefter en uopløselig del, der har mycelium som hovedkomponent, fraskilles, kendetegnet ved, at det første opløsningsmiddel er en cyclisk ether, og at der efter fra-skillelsen af den uopløselige del tilsættes et andet opløs-10 ningsmiddel, der er fuldstændig opløseligt i det første opløsningsmiddel, men tungtopløseligt eller uopløseligt i vand, i en mængde på 0,05-0,5 gange volumenet af det første opløsningsmiddel, hvorefter det dannede vandlag fraskilles, og nosiheptidet udvindes fra opløsningen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at den cycliske ether er tetrahydrofuran.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at volumenet af det første opløsningsmiddel er 0,5-5 gange volumenet af dyrkningsblandingen. 20 25 1 35