DK164537B

DK164537B - Fremgangsmaade til inaktivering af hepatitis-b-virus eller non-a, non-b-hepatitisvirus i pattedyrsblodplasma eller pattedyrsplasmaproteinoploesninger

Info

Publication number: DK164537B
Application number: DK162983A
Authority: DK
Inventors: Alfred Mayer Prince
Original assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1982-04-14
Filing date: 1983-04-13
Publication date: 1992-07-13
Also published as: DK162983A; US4481189A; EP0099445A2; FI80211B; DK164537C; AU561900B2; NZ203878A; JPH0660105B2; FI831146L; EP0099445A3; ATE58835T1; NO831304L; AU1346283A; ZA832239B; JPS58222023A; CA1207229A; EP0099445B1; EP0099445B2; NO163514B; ES8403722A1

Description

i

DK 164537 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til inaktivering af hepatitis-B eller -non-A, -non-B-virus i pattedyrsblodplasma eller i pattedyrs-plasmaproteinopløsninger. Blodplasmaet eller plasmaproteinopløsningen bliver herved i det væsentlige fri for aktiv hepatitisvirus på en 5 sådan måde, at de værdifulde proteiner, som er til stede i blodplasmaet såsom faktor VIII, ikke væsentligt denatureres.

Der er gjort adskillige forsøg på at inaktivere virus såsom hepati-tis-B-virus (HBV) i blodplasma fra pattedyr, især mennesker. Det er praksis i nogle lande at forårsage inaktivering af hepatitis-B-virus 10 i blodplasma ved at lade plasmaet komme i kontakt med et virusinakti-verende middel af den type, der bliver tværbundet med den protein-holdige del af hepatitis-B-viruset, eller som samvirker med virusets nucleinsyre. Det er fx kendt at forsøge at inaktivere hepatitis-B-virus ved kontakt med et aldehyd såsom formaldehyd, hvorved der sker 15 en tværbinding til proteinet, og hepatitis-B-viruset inaktiveres. Det er også kendt at forårsage inaktivering af viruset ved kontakt med j9-propiolacton (BPL), et middel, der indvirker på virusets nucleinsyre. Det er endvidere kendt at anvende ultraviolet lys, især efter /J-propiolactonbehandling.

20 Uheldigvis har disse midler kun en begrænset evne til at inaktivere vira og har også en skadelig virkning på andre værdifulde proteiribe-standdele i plasmaet. Ved sådanne inaktiveringsmetoder inaktiveres eller denatureres fx faktor VIII i et omfang af 50-90% eller mere af den faktor VIII, der findes i ubehandlet plasma. På grund af de de-25 naturerende virkninger af disse virusinaktiverende midler er det nødvendigt ved fremstilling af derivater til administration til patienter at koncentrere store mængder plasma, for at det materiale, der administreres til patienten, har en tilstrækkelig koncentration af det udenaturerede protein til effektiv terapeutisk behandling.

30 Denne koncentration påvirker imidlertid ikke nedsættelsen af mængden af denatureret protein. Som følge heraf modtager patienten ikke alene det udenaturerede protein, men også en mængde denatureret protein, der ofte er mange gange højere end mængden af det udenaturerede protein.

2

DK 164537 B

Hvis der fx som følge af inaktivering af hepatitis-B-virus i humant blodplasma med /3-propiolacton fås et plasma, hvis faktor VIII er blevet inaktiveret med 75%, er de resterende 25% faktor VIII derfor til stede i en så lille koncentration, målt som en funktion af selve 5 plasmaet, at det er nødvendigt at koncentrere store mængder faktor VIII for at tilvejebringe en tilstrækkelig koncentration til, at den er af terapeutisk værdi. Da sådanne separationsteknikker ikke effektivt fjerner denatureret faktor VIII fra udenatureret faktor VIII, kan det materiale, der administreres til patienten, indeholde mere 10 denatureret protein end udenatureret protein. En sådan inaktivering er selvfølgelig værdifuld ud fra det synspunkt, at risikoen for hepatitis-B-virusinfektion nedsættes, men kræver forarbejdning af store mængder plasma og giver et væsentligt tab af værdifulde pro-teinbestanddele. Administration af store mængde denaturerede pro-15 teiner kan endvidere gøre disse antigene over for værten og således forårsage autoimmune sygdomme, fx rheumatoid arthritis, eller antistof over for selve den denaturerede faktor VIII.

Tabet af disse værdifulde proteiribestanddele er ikke begrænset til faktor VIII, som er det mest ustabile af de værdifulde proteiner i 20 pattedyrs blodplasma. En tilsvarende proteindenaturering finder sted med hensyn til de nedennævnte andre værdifulde plasmabestanddele: koagulations faktor II, VII, IX, X, plasminfibrinogen, IgM, etc.

Faktor VIII bliver imidlertid denatureret i større omfang end de øvrige værdifulde proteiner, der findes i blodplasma.

25 Som følge ;if det ovenstående er det undtagen ved fremstilling af serumalbumin og en stabil plasmaproteinopløsning, der kan tåle pasteurisering, for tiden praksis i USA, hvad angår forarbejdning af blodplasma og derivater deraf, at undgå at sterilisere plasmaet til inaktivering af hepatitisvirus. Som følge heraf er modtagere af faktor 30 VIII, gammaglobulin, faktor IX, fibrinogen, etc., nødt til at acceptere den risiko, at de værdifulde proteiribestanddele, der administreres, kan være kontamineret med hepatitisvirus. Som følge heraf er modtagerne i fare for at blive inficeret med disse virus og blive nødsaget til at udholde de skader, som viruset påfører leveren, med 35 den deraf følgende invaliditet og sygdom, som kan føre til døden.

3

DK 164537 B

Den ovenfor beskrevne BPL/UV inaktiveringsmetode er endnu ikke taget i brug i USA af flere grunde, bl.a. fordi mange forskere mener, at BPL i sig selv er skadelig, da det ikke kan fjernes fuldstændigt efter inaktiveringen og således kan forblive i plasmaet og plasma-5 derivaterne i ikke ubetydelige mængder. BPL har vist sig at være kræftfremkaldende hos dyr.

Der kendes andre metoder til inaktivering af hepatitis-B-virus i plasma, men disse er sædvanligvis upraktiske. En fremgangsmåde omfatter tilsætning af antistoffer til plasmaet, hvorved der dannes et 10 immuncomplex. De omkostninger, der er forbundet med antistofdannelse og- rensning, bidrager væsentligt til omkostningerne ved plasmaproduktion; endvidere er der ingen sikkerhed for, at en tilstrækkelig mængde hepatitis-B- eller non-A, non-B-virus inaktiveres. Der findes for tiden ingen test for non-A, non-B-antistoffer (selv om der er en 15 test for viruset), hvorfor det ikke er muligt at vælge plasma, der indeholder høje titre af anti-non-A, non-B-antistof.

Det er klart, at problemerne med inaktivering af hepatitisvirus i plasma er forskellige fra problemerne med inaktivering af selve virus som følge af, at plasmaet samtidig indeholder de ønskelige proteinbe-20 standdele. Medens det er kendt at inaktivere hepatitis-B- virus ved hjælp af tværbindingsmidler, fx glutaraldehyd, med nucleinsyrerea-gerende kemikalier, fx BPL eller formaldehyd, eller oxidationsmidler, fx chlorox (natriumhypochloritopløsning) etc., har man formodet, at disse metoder ikke egner sig til inaktivering af virus i plasma som 25 følge af den iagttagelse, at de fleste af disse inaktiverende midler (natriumhypochlorit, formaldehyd, /3-propiolacton) denaturerer de værdifulde proteinbestanddele i plasmaet.

Det er derfor ønskeligt at tilvejebringe en fremgangsmåde til sterilisation af blodplasma eller plasmaproteinopløsninger fra pattedyr, 30 hvilken fremgangsmåde i det væsentlige ikke forårsager denaturering af de værdifulde bestanddele i plasmaet, og som ikke medfører anvendelsen af et potentielt kræftfremkaldende middel. Det er især ønskeligt at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af blodplasma eller plasmaproteinopløsninger, i hvilke alle de tilstede- 4

DK 164537 B

varende hepatitisvirus er inaktiveret, og i hvilke denatureret protein såsom faktor VIII kun udgør en ringe mængde af den samlede mængde af disse proteiner i plasmaet eller i plasmaopløsningen.

En yderligere fordel ved de foreslåede fremgangsmåder er, at plasma 5 eller plasmaproteinopløsninger behandlet på denne måde er fuldstændig klare og gennemsigtige som følge af fjernelse af plasmalipider.

Endvidere bevares klarheden på ubestemt tid ved lagring ved 4°C.

Dette frembyder væsentlige fordele fremfor ubehandlet plasma eller plasmaproteinopløsninger, idet 10 1) det let bliver muligt at detektere kontaminering med bakterier ved eftersyn, hvilket er vanskeligt i uklare suspensioner, og 2) udvikling af mikroaggregater af udfældede lipoproteiner, der normalt opstår ved opbevaring i kulde af ubehandlet plasma eller plasmaproteinopløsninger, forhindres, hvorved de potentielt ugunstige virk-15 ninger ved infusion af sådanne mikroaggregater, der kan sætte sig fast i lunge-, nyre- eller hjernekapillærerne og blokere disse, undgås.

Sluttelig muliggør de foreslåede fremgangsmåder inaktivering af virusinfektioner i plasma eller i plasmaproteinopløsninger, som 20 stammer fra kroniske bærere af hepatitis- B-virus, hvilket muliggør en sikrere fremstillingsproces og et sikrere produkt. De ovenfor beskrevne ideer og bevæggrunde er vist i fig. 1.

Det har nu overraskende vist sig, at medens de fleste virus inaktive-rende midler denaturerer faktor VIII og andre værdifulde blodplasma-25 proteiner, har ikke alle virusinaktiverende midler en sådan virkning. Det har vist sig, at hvis blodplasmaet eller plasmaproteinopløsningen behandles med et præparat bestående af en ether og et ikke-ionisk detergent, inaktiveres de hepatitis-virus, der findes i plasmaet eller plasmapro teinopløsningen, i det væsentlige fuldstændigt, 30 uden at der sker nogen væsentlig denaturering af andre proteiner.

Fremgangsmåden er derfor ejendommelig ved, at plasmaet eller plasmapro teinopløsningen bringes i kontakt med et virusinaktiverende middel bestående af en ether og et ikke-ionisk detergent. Fremgangsmåden 5

DK 164537 B

efterfølges af fjernelse af de inaktiverende midler, og således bliver både hepatitis-B- og -non-A, -non-B- virus i det væsentlige inaktiveret, og vægtprocentdelen af den denaturerede faktor VIII i plasmaet eller plasmaproteinopløsningen er mindre end 30-50% baseret 5 på den samlede mængde af denatureret og udenatureret faktor VIII

deri. Før behandlingen har en pulje af humant blodplasma sædvanligvis et indhold af aktive hepatitis-B-virus på mellem 10^· og 10^ viruspartikler pr. ml samt væsentlige (10^--10^) mængder non-A, non-B-viru-spartikler. Efter behandlingen er der ikke nogen levende viruspartik-10 ler tilbage.

Ved sådanne fremgangsmåder tilvejebringes blodplasma eller plasmapro-teinopløsninger fra pattedyr, der indeholder faktor VIII, hvor vægtprocentdelen af denatureret faktor VIII i forhold til summen af udenatureret faktor VIII og denatureret faktor VIII er mindre end 15 30-50%, hvilke plasma eller plasmaproteinopløsninger ikke indeholder hepatitis-B- eller non-A, non-B-virus.

Pattedyrs blodplasma indeholder fortrinsvis mindre end 50 vægtprocent denatureret faktor VIII baseret på summen af denatureret og udenatureret faktor VIII deri. Det foretrækkes især, at denne værdi er min-20 dre end 15, fortrinsvis mindre end 10 vægtprocent. Ved hensigtsmæssig forarbejdning kan man reducere mængden af denatureret faktor VIII til mindre end 5 vægtprocent, især mindre end 3 vægtprocent, fortrinsvis mindre end 2 vægtprocent baseret på den samlede vægt af denatureret og udenatureret faktor VIII.

25 Ved inaktiveringsfremgangsmåden ifølge opfindelsen inaktiveres i det væsentlige alle hepatitisvirus i blodplasmaet eller plasmaproteinopløsningen. Metoden til bestemmelse af infektivitetsniveauer ved in vivo tests på chimpanser er beskrevet af Prince, A.M., Stephen, W.,

Brotman, B. og van den Ende, M.C., "Evaluation of the Effect of Beta-30 propiolactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/UV): Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by Factor IV Complex in Chimpanzees", Thrombosis and Haemostasis 44, 1980, side 138-142.

Det inaktiverede hepatitisvirus inaktiveres ved behandlingen med de her omhandlede specifikke inaktiverende midler og inaktiveres ikke på 6

DK 164537 B

grund af, at plasmaet indeholder antistoffer, der binder til hepatitisvirus og danner immuncomplexer, selv om dette også kan forekomme.

Behandling af plasmaet eller plasmaproteinopløsningen omfatter tilsætning af virusinaktiverende midler bestående af en ether og et 5 ikke-ionisk detergent. Som følge af denne behandling kan der være en lille restmængde tilbage af et sådant ikke-ionisk detergent eller ether. Blodplasmaet kan derfor indeholde en restmængde af ether eller ikke-ionisk detergent, men denne ether eller ikke-ioniske detergent findes i en koncentration på mindre end 1%, fortrinsvis mindre end 10 0,001%.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan plasma fra donorer samles i en pulje uden særlige forholdsregler for at sikre, at plasma, som indeholder aktivt hepatitis-B-virus, ikke sættes til puljen. Dette letter forarbejdningen af plasmaet og gør det muligt at eliminere 15 flere trin, herunder tidlig testning af hver halve liter blod, som modtages fra donoren. Dette gør det muligt at forarbejde store mængder plasma ledsaget af en nedsættelse af omkostningerne.

Ved forarbejdning af plasma inaktiveres hepatitisvirus ved behandling med et virusinaktiverende middel bestående af en ether og et ikke-20 ionisk detergent. Generelt benyttes i fremgangsmåden ifølge opfindelsen fortrinsvis mindst 0,1 vægtprocent virus inaktiverende middel baseret på rumfanget af det plasma eller de plasmaproteinopløsninger der skal behandles.

Etheren kan tilsættes i en mængde på 5-50 volumenprocent, fortrinsvis 25 20-40 volumenprocent, baseret på rumfanget af det plasma eller de plasmaproteinopløsninger, som skal behandles.

Opløsningen, dispersionen eller suspensionen af det inaktiverende middel har sædvanligvis en pH-værdi på 6,0-8,0.

Særligt foretrukne ethere til anvendelse ved inaktivering ved frem-30 gangsmåden ifølge opfindelsen er ethere med den almene formel rL-O-R2 7

DK 164537 B

hvor R.1 og uafhængigt af hinanden betegner ^g-alkyl eller -alkenyl, som kan indeholde et oxygen- eller svovlatora i kæden, især g-alkyl eller -alkenyl. Særligt foretrukne ethere er dimethyl-ether, diethylether, ethylpropylether, methylbutylether, methyliso-5 propylether og methylisobutylether.

Egnede ikke-ioniske detergenter omfatter sådanne, som ved omgivelsestemperatur dispergerer op til 0,1 vægtprocent fedt i en vandig opløsning, som indeholder 0,1 vægtprocent fedt, når der tilsættes 1 g pr. 100 ml detergent deri. Særligt velegnede detergenter omfatter 10 polyoxyethylenderivater af fedtsyrer, partielle estere af sorbitol-anhydrider, fx de produkter, der er kendt under navnet Tween®80 og Tween®20, ikke-ionisk olieopløseligt, vandopløseligt detergent som det, der sælges kommercielt under navnet Triton®X100. Natriumdeoxy-cholat er også egnet såvel som "Zwittergenterne", som er syntetiske 15 zwitterioniske detergenter, der er kendt som "sulfobetainer" såsom N-dodecyl-N,N-dimethyl-2-ammonio-l-ethansulfonat og dermed beslægtede forbindelser eller ikke-ioniske detergenter såsom octyl-)3-D-gluco-pyranosid.

Andre egnede ikke-ioniske detergenter er sådanne, som har ca. 15-35, 20 især ca. 18-33, oxyethylenenheder i molekylet, især i nærværelse af et mercaptanreduktionsmiddel såsom fx mercaptoethanol, dithiothrei-tol, dithioerythritol og dithiooctansyre. Egnede ikke-ioniske overfladeaktive midler er oxyethylerede alkylphenoler, polyoxyethylen-sorbitanfedtsyreestere, polyoxyethylensyrer, polyoxyethylenalkoholer, 25 polyoxyethylenolier og polyoxyethylen-oxypropylenfedtsyrer. Specifikke eksempler herpå er følgende: alkylphenoxypolyethoxy-(30)-ethanol, polyoxyethylen-(2)-sorbitan-monolaurat, polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monopalmitat, 30 polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monostearat, polyoxyethylen-(20)-sorbitan-tristearat, polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monooleat, polyoxyethylen-(20)-sorbitan-trioleat, polyoxyethylen-(20)-palmitat, 8

DK 164537 B

polyoxyethylen- (20) -laurylether, polyoxyethylen-(20)-cetylether, polyoxyethylen-(20)-stearylether, polyoxyethylen-(20)-oleylether, 5 polyoxyethylen-(25)-hydrogeneret ricinusolie, polyoxyethylen-(25)-oxypropylen-monostearat.

Behandling af plasma eller plasmaproteinopløsninger med det inaktiverende middel udføres ved en temperatur på mellem -5eC og 50°C, fortrinsvis mellem 1°C og 4°C i mindst 1 minut, fortrinsvis mindst 16 10 timer og sædvanligvis i 16-24 timer. Behandlingen er sædvanligvis effektiv ved atmosfærisk tryk, selv om subatmosfærisk og superatmosfærisk tryk også kan anvendes.

Efter behandling fjernes det virusinaktiverende middel sædvanligvis, selv om dette ikke i alle tilfælde er nødvendigt, afhængigt af det 15 virusinaktiverende middels karakter og den påtænkte yderligere behandling af plasmaet eller plasmaproteinopløsningen.

For at fjerne ether fra plasmaet eller plasmaproteinopløsningen udsættes disse sædvanligvis for en temperatur på 4-37eC, idet der anvendes et let vakuum for at fjerne den resterende ether. Fortrins-20 vis tilvejebringes der midler til at sprede plasmaet eller plasmaproteinopløsningen som en tynd film for at sikre maksimal kontakt og fjernelse af etheren. Andre fremgangsmåder til fjernelse af etheren i inaktiverende midler omfatter 1) gennembobling af nitrogengas, 25 2) diafiltrering under anvendelse af i ether uopløselige (fx Te flon®) mikroporøse membraner, der tilbageholder plasmaproteiner, 3) absorption af ønskede plasmakomponenter på chromatografiske eller affinitetschromatografiske underlag, 30 4) udfældning, fx ved udsaltning af plasmaproteiner, 5) lyofilisering, etc.

Når der anvendes ikke-ioniske detergenter i det inaktiverende middel, fj ernes de ved 2)-5) ovenfor.

9

DK 164537 B

Ether til stede, fjernes sædvanligvis før fjernelsen af detergent.

Etheren kan udvindes til genanvendelse ved anvendelse af hensigtsmæssige destillations/kondensationssystemer, som er velkendte inden for fagområdet.

5 Som beskrevet ovenfor kan blodplasmaet eller plasmaproteinopløsningen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen karakteriseres ved den relative mængde af denatureret faktor VIII i forhold til summen af denatureret og udenatureret faktor VIII. Især er mængden af denatureret faktor VIII i forhold til summen af denatureret og udena-10 toreret faktor VIII mindre end 50 vægtprocent. Detektering af mængden af denatureret faktor VIII bestemmes ved at bestemme forholdet mellem faktor VIII antigen (CAG)-indholdet (et mål for faktor VIII protein) og faktor VIII aktivitet (et mål for udenatureret faktor VIII).

Forholdet F VIII aktivitet og CAG antigen er ideelt 1,0, når der ikke 15 findes nogen denaturering, og det bør ikke være mindre end 0,5.

De ovennævnte assays udføres ved standardmetoder, fx som beskrevet i Haemostatis and Thrombosis, A.L. Bloom, D.P. Thomas, Edw. Churchill -Livingstone, London, 1981.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at samle humant 20 blodplasma i puljer og behandle det humane blodplasma, der er samlet i en pulje, som sådant. Den muliggør også at udvinde blodproduktder-ivater såsom plasmaproteinopløsninger indeholdende faktor VIII, gammaglobulin, faktor IX eller faktor IX-complexet (faktor II, VII, IX, X), fibrinogen og et hvilket som helst andet blodderivat (her-25 under HBsAg, som anvendes til fremstilling af HBV-vaccine), der alle ikke indeholder nogen resterende smitsom hepatitisvirus. Blodplasma eller plasmaproteinopløsninger fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder bestanddele, som er karakteristiske ved a) fravær af spormængder af et virusinaktiverende middel, 30 som tværbinder med den proteinlignende del af et virus eller indvirker på virusets nucleinsyre, og/eller 10

DK 164537 B

b) tilstedeværelsen af detekterbare mængder af virusinakti-verende middel bestående af en ether og eventuelt en alkohol og/eller et ikke-ionisk detergent i en mængde på mindre end 1 vægtprocent, og/eller

5 c) tilstedeværelsen af inaktiveret hepatitis-B og/eller non-A

non-B-hepatitisvirus, og/eller d) fravær af smitsomme (levedygtige) hepatitisvirus.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 10 Inaktivering af hepatitis-B- og non-A, non-B-virus i plasma A) Hepatitis-B-virus

New York Blood Center Standard HBV infektionsvirus (plasma 78-564 udvundet fra en kronisk bærer af viruset) blev fortyndet i forholdet 1:10 med frisk normal (chimpanse nr. 222) chimpanseplasma, som mang- 7 9 15 lede antistoffet HBsAg. Denne fortynding indeholdt 10 ’ chimpanseinfektionsdoser (CID^q) pr. ml. Der tilsattes Tween®80 indtil en slutkoncentration på 1% v/v og derefter ethylether (Malinskyodt, anæ-stetisk kvalitet) indtil en slutkoncentration på 20% v/v. Opløsningen blev blandet grundigt ved hvirvling og blev derefter holdt ved 4°C i 20 16 timer. Etheren blev derefter fjernet i vakuum, opløsningerne blev centrifugeret i 10 minutter ved 4000 omdr./minut, og det klare plasma blev udvundet. 1,25 ml heraf blev injiceret intravenøst i 2 seronegative chimpanser, der aldrig før var blevet brugt til forsøg. Dette blev efterfulgt af ugentlige tests af hepatitis-B-serologiske markø-25 rer (HBsAg, anti-HB, anti-HBs, og serumtransaminaseniveauer (AST, ALS)) i 12 måneder. Den resterende del af plasmaet blev testet for faktor VIII-prokoagulantaktivitet, faktor VIII-CAG-antigenaktivitet og for mængden af HBsAg (hepatitis-B-overfladeantigen). Yderligere 2 chimpanser modtog samme smitsomme plasma fortyndet 10'^, men ubehand-30 let. Resultaterne er vist i tabel I.

DK 164537 B

Tabel I

n

Inaktivering af HBV-smitte med Tween®80/ether uden inaktivering af faktor VIII og HBsAg

Chimpanse Aktivitet Behandling af Hepatitis nr. HBV inoku- plasma (ALT>50 leret dosis IU/L) (C1050) 134 106'9 ingen 137 106'9 ingen + 146 107/9 T ween®80 (-) 163 107,9 + ether (-)

Chimpanse Inkubations- Udvikling af Plasmaanalyse nr. periode til anti-HBs og faktor VIII1 dannelse af anti-HBc Akti- Anti- HBsAg HBsAg (uger) vitet gen (pgm/mL) (%) (%) 134 4 + 100 100 90 137 4 146 (-) (-) 96±92 3 4 95±94 8U184 163 (-) (-) 2

Udtrykt i procent af ubehandlet plasma 3

Justeret for fortyndinger for at anføre indholdet i det oprindelige plasma 4 i to standardafvigelser.

12

DK 164537 B

Begge chimpanser (nr. 134 og 137), som modtog ubehandlet HBV, blev angrebet af hepatitis-B-infektion med en inkubationstid på 4 uger. Opfølgende resultater af chimpanse nr. 134 og 137 er vist i fig. 2, hvor lukkede cirkler betegner HBsAg, åbne cirkler betegner Anti-HBs, 5 kvadrater betegner SGPT (Alaninaminotransferase, ALT), (-) betegner negativ test for Anti-HBc og (+) betegner positiv test for Anti-HBc.

I modsætning hertil viste intet af dyrene, som modtog Tween®80/ether- behandlet HBV smitsomt plasma, som i starten indeholdt 10 gange så stor en mængde af smitsom HBV, som der blev inokuleret i kontroldyre- 10 ne, nogen tegn på HBV-infektion, hvilket viste, at alle de smitsomme vira var blevet inaktiveret. Proceseffektiviteten af denne fremgangs- 7 9 måde er således større end eller lig med 10 ’ , dvs. mindst 100 millioner smitsomme doser kan inaktiveres. På trods af denne bemærkelsesværdige steriliserende virkning blev den procoagulerende aktivitet 15 af faktor VIII, faktor VIII-protein og HBsAg i det væsentlige fuldstændig bevaret. Det bør bemærkes, at bevaringen af HBsAg-aktivitet viste, at denne fremgangsmåde kan anvendes som en forbedret teknik til fremstilling af hepatitis-B-vaccine ud fra plasma fra HBV-bære-re.

20 B) Inaktivering af non-A, non-B-hepatitis virus i plasma

Dette forsøg blev udført parallelt med det ovennævnte forsøg og blev udført identisk hermed med undtagelse af, at 1 det smitsomme plasma var en 10fortynding af Hutchinson Strain (7-12-77) non-A, non-B-virus modtaget frosset i tøris fra Dr. Robert 25 Purcell, direktør for Hepatitis Laboratory, National Institute for Allergy & Infectious Diseases, N.I.H., Bethesda, Maryland. Dette materiale danner non-A, non-B-hepatitis hos chimpanser med en inkubationstid på ca. 5-7 uger før ALT-stigning. Dette materiale har vist sig at have en titer på ca. 10® CID^Q/ml hos chimpanser og ca. 10® 30 ID50 h°s silkeaber (Feinstone, S. & Purcell, R.H., Personlig meddelelse) . Det behandlede plasma, som indeholdt en 10fortynding af Hutchinson-plasmaet, havde således et indhold af det smitsomme virus på 104-106 ID50/ml.

13

DK 164537 B

2. De inokulerede chimpanser var før blevet anvendt til en sikkerhedstest af med formalin inaktiveret HBV-vaccine, men var ikke blevet anvendt i noget andet forsøg. De blev i 12 måneder fulgt med tests hver anden uge for alle de ovennævnte markører. Otte kontrolchimpan-5 ser blev inokuleret med det samme Hutchinson-stamme-podestof og fulgt på tilsvarende måde. Resultaterne er vist i tabel II.

Tabel II

Inaktivering af non-A, non-B-virus' smitsomhed uden inaktivering af faktor VIII-aktivitet 10 _

Chimpanser NANB-virus Behand- Hapatitis Analyse af plasma inokuleret ling (inkubation faktor VIII*· dosis tidsrum op Aktivi- Anti- (ID50) til ALT>50) tet, % gen, % 15 _ 8 chimpanser 104-10-* ingen 3-21 N.D. N.D.

157 104-106 Tween® (-) 97+102 98+102 164 80 + 20 ether (-)

Det viste sig igen, at det behandlede plasma var usmitsomt, men bevarede sin faktor VIII-aktivitet. Proceseffektiviteten til inaktivering af non-A, non-B-virus, som blev bedømt ud fra dette forsøg, er større 25 end eller lig med 104-10®, dvs. mindst 10.000-1.000.000 smitsomme doser kan inaktiveres.

EKSEMPEL 2 14

DK 164537 B

Tween®80/etherbehandling af koncentreret faktor VIII (Lyoc®, The New York Blood Center) med fuldstændig bevaring af den prokoagulerende aktivitet af faktor VIII

5 Lyoc® er et koncentrat af faktor VIII, som anvendes klinisk til behandling af hæmophili. Lyoc® fremstilles uden, at man forsøger at sterilisere hepatitisvirus deri, og det er således sandsynligvis i det store og hele smitsomt over for modtagere, som ikke er immune. En prøve af Lyoc® blev behandlet med Tween®80/ether som beskrevet oven-10 for for at bestemme, om indholdet af faktor VIII-aktivitet kunne bevares.

Resultaterne er vist i tabel III.

Tabel III

Virkningen af Tween®80/etherbehandling af et faktor VIII-koncentrat 15 på faktor VIII-aktivitet

Materiale Faktor VIII-prokoagulerende aktivitet (% af ubehandlet koncentrat) 20 Lyoc® - ubehandlet 100 + 10

Lyoc® - behandlet med

Tween®80/ether 110 ± 10

Aktiviteten af faktor VIII blev i det væsentlige fuldstændig bevaret.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til inaktivering af andre virus, der findes i blodet, såsom cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, laktisk dehydrogenase-virus, herpes-virus, rhabdovirus, leucovirus, myxovirus, alphavirus, arbovirus (gruppe B), paramyxovirus, arenavirus og coronavirus.

Claims

1. Fremgangsmåde til inaktivering af hepatitis-B-virus eller non-A-, non-B-hepatitisvirus i pattedyrsblodplasma eller pattedyrsplasmapro-teinopløsninger, 5 kendetegnet ved, at blodplasmaet eller plasmaproteinopløs-ningen bringes i kontakt med et virusinaktiverende middel bestående af en ether og et ikke-ionisk detergent.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at etheren har den almene formel R^-O-R^, 10 hvor Ri og R^ uafhængigt af hinanden betegner -alkyl eller -alkenyl, som kan indeholde et oxygen- eller svovlatom i kæden.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kontakten med ikke-ionisk detergent og ether er en successiv kontakt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaet eller plasmaproteinopløsningen forbliver i kontakt med det virus inaktiverende middel i et tidsrum på mindst 1 minut og holdes ved en temperatur på mellem -5°C og 50°C.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at de virusinaktiverende midler er til stede i en mængde på mindst 0,1 vægtprocent baseret på volumenet af det plasma eller den plasmaproteinopløsning, der skal behandles.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, 25 kendetegnet ved, at de virusinaktiverende midler er til stede i en mængde på mellem 0,1 og 50 vægtprocent baseret på plasmaets eller plasmaproteinopløsningens volumen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de virusinaktiverende midler fjernes 30 efter behandlingen. DK 164537 B

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pattedyrsblodplasmaet eller pattedyrs-plasmaproteinopløsningen er af human oprindelse.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, 5 kendetegnet ved, at det humane blodplasma er blodplasma, som er samlet i pulje, eller at plasmaproteinopløsningen er afledt af en sådan pulje.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det blodplasma eller den plasmaprotei-10 nopløsning, der udsættes for fremgangsmåden, indeholder non-A, non-B-hepatitisvirus.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaproteinopløsningen er et koncentrat af faktor VIII.