DK164874B - Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer - Google Patents
Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer Download PDFInfo
- Publication number
- DK164874B DK164874B DK053290A DK53290A DK164874B DK 164874 B DK164874 B DK 164874B DK 053290 A DK053290 A DK 053290A DK 53290 A DK53290 A DK 53290A DK 164874 B DK164874 B DK 164874B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- ala
- ile
- thr
- ser
- Prior art date
Links
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 58
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 46
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 17
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 16
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 6
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 6
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 6
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- LDLSENBXQNDTPB-DCAQKATOSA-N Ala-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N LDLSENBXQNDTPB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- 101710089743 Mating factor alpha Proteins 0.000 description 3
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 240000006345 Trifolium hybridum Species 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 101500022170 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) Rep1-3 Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i
DK 164874 B
Den foreliggende opfindelse angår syntetiske gær-leader-peptider, DNA sekvenser, der indkoder sådanne leader-peptider, vektorer og transformerede gærstammer samt en fremgangsmåde til fremstilling af proteiner i gær.
5 Gærorganismer danner en række proteiner, der syntetiseres intracellulært, men som har en funktion uden for cellen. Sådanne ekstracellulære proteiner kaldes secernerede proteiner.
Disse secernerede proteiner udtrykkes til at begynde med inde 10 i cellen i en precursor eller i en præprotein form, der indeholder en præsekvens, som sikrer, at det udtrykte produkt ledes effektivt gennem membranen i det endoplasmatiske retiku-lum (ER). Præsekvensen, der sædvanligvis kaldes et signalpeptid, spaltes almindeligvis fra det ønskede produkt under trans-15 lokation. Når proteinet er kommet ind i sekretionsbanen, transporteres det til Golgi-apparatet. Fra Golgi-apparatet kan proteinet følge forskellige veje, som fører til rum såsom cellevakuolen eller cellemembranen, eller det kan ledes ud af cellen for at blive secerneret til det ydre medium (Pfeffer, 20 S.R. og Rothman, J.E. Ann. Rev. Biochem. 56. (1987) 829-852).
Der er gjort mange forsøg på i gær at udtrykke og secernere proteiner, der er heterologe i forhold til gær. I EP offentliggørelsesskrift nr. 0088632A beskrives en fremgangsmåde, ved 25 hvilken proteiner, der er heterologe i forhold til gær, udtrykkes, spaltes og secerneres ved transformation af en gærorganisme med en ekspressionsvektor indeholdende DNA, som indeholder det ønskede protein, og et signalpeptid, ved fremstilling af en kultur af den transformerede organisme, 30 dyrkning af kulturen og udvinding af proteinet fra dyrkningsmediet. Signalpeptidet kan være det ønskede proteins eget signalpeptid, et heterologt signalpeptid eller en hybrid af et naturligt og heterologt signalpeptid.
35 Et problem, der kunne opstå i forbindelse med brugen af signalpeptider, der er heterologe i forhold til gær, er, at det heterologe signalpeptid ikke sikrer effektiv translokation
DK 164874B
2 og/eller spaltning efter signalpeptidet.
S. cerevisiae MFa (a-faktor) syntetiseres som en præ-pro-form med 165 aminosyrer, der indeholder et 19 aminosyrer langt 5 signal- eller præpeptid efterfulgt af et 64 aminosyrer langt "leader-" eller propeptid, der omfatter tre N-forbundne glykolyseringssteder efterfulgt af (LysArg(Asp/Glu,Ala)2.3a-faktor)4 (Kurjan, J. og Herskowitz, I. Cell 30 (1982) 933-943). Signalleader-delen af præ-pro-MFa er blevet anvendt i vid 10 udstrækning for at opnå syntese og sekretion af heterologe proteiner i S. cerevisiae.
Anvendelsen af signal/leader-peptider, der er homologe i forhold til gær, er bl.a. beskrevet i US patent nr. 4.546.082, 15 EP offentliggørelsesskrifterne nr. 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163592A og 0123289A og DK patentansøgning nr.
3614/83.
X EP 0123289A beskrives anvendelsen af S. cerevisiae a-faktor 20 precursoren, medens der i i DK 3614/83 beskrives anvendelse af Saccharomvces cerevisiae PH05 signalpeptid til sekretion af fremmede proteiner.
I US patentansøgning nr. 4.546.082, EP 0116201A, 0123294A, 25 0123544A og 0163529A beskrives fremgangsmåder, ved hvilke a- faktor signal-leaderen fra Saccharomvces cerevisiae (MFal eller MFa2) anvendes i sekretionsprocessen af udtrykte heterologe proteiner i gær. Ved at sammenføje en DNA sekvens, der indkoder S. cerevisiae MFa signal/leadersekvensen, med 5'-enden af genet 30 for det ønskede protein, påvistes sekretion og spaltning af det ønskede protein.
Et antal secernerede proteiner dirigeres således, at de udsættes for et proteolytisk spaltningssystem, som kan spalte 35 peptidbindingen på carboxyenden af to på hinanden følgende basiske aminosyrer. Denne enzymatiske aktivitet indkodes i S. cerevisiae af KEX 2 genet (Julius, D.A. et al., Cell 37 (1984b), 1075). Det er nødvendigt at spalte produktet med KEX
DK 164874 B
3 2 genproduktet for at secernere aktiv S. cerevisiae parringsfaktor a (MFa eller a-faktor), men denne spaltning er ikke nødvendig for at secernere aktiv S. cerevisia parrings faktor a.
5 Der er stigende evidens for, at sekretion er en tilbagefaldsrute ("default route") ved lokalisering af proteiner i eukaryote celler, idet konformationen af det protein, der skal secerneres, eller af dets precursor er den essentielle parameter for processens effektivitet (Pfeffer, S.R. og Rothman, 10 J.E., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 829-852); dette har udløst en søgen efter mere effektive leadere end MFa-leaderen til sekretion i S. cerevisiae.
Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at 15 tilvejebringe mere effektive leadere end a-faktor-leaderen til sekretion i gær af små proteiner.
I kompetitive forsøg af den af M. Egel-Mitani et al., Gene (1988) (under trykning) beskrevne type med insulinprecursorer 20 af den type, der er beskrevet i EP patentansøgning nr. 163.529, blev der fundet en begrænsende faktor i ekspressionen og sekretionen af insulinprecursoren, hvilken er forårsaget af den N-terminale ende af precursoren, sandsynligvis forårsaget af lysin-argininsekvensen, som adskiller signal-leaderen fra 25 insulirt-precursoren.
Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et sekretionssystem til heterologe proteiner i gær, som sikrer en meget effektiv spaltning af det modne protein ved 30 hjælp af KEX 2 indkodet endopeptidase på en dibasisk sekvens, og derved forhøje udbyttet af det modne produkt.
I et første aspekt angår den foreliggende opfindelse et hidtil ukendt syntetisk leader-peptid med nedenstående almene formel 35 (I)
DK 164874 B
4 Χ-,-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-X2-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-X3-X4-X5 hvori X1 er Ala eller Gin; 5 X2 er Ile, en peptidkæde med op til 10 aminosyrerester eller en peptidbinding; X3 er en peptidkæde med op til 5 aminosyrerester eller en peptidbinding, X4 og X5 er Lys eller Arg; og 10 hvor alle aminosyrerester er naturligt forekommende L-former.
Eksempler på leader-peptider ifølge den foreliggende opfindelse er følgende: 15
Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ser-Leu-lle-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-
Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg 20 Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg
Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-25 Ala-Lys-Arg og
Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-
Ala-Lys-Arg 30 I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse DNA-sekvenser, der indkoder leader-peptider med den ovenfor angivne formel (I).
35 Eksempler på sådanne DNA sekvenser er vist i fig. 9-10 og 12- 13.
I et tredje aspekt angår den foreliggende opfindelse en
DK 164874 B
5 replikerbar gærvektor, som indeholder en DNA sekvens, der indkoder et leader-peptid med den ovenfor angivne formel (I), hvilken DNA-sekvens er anbragt opstrøms for en DNA-sekvens, der indkoder det ønskede produkt, og som er operabelt forbundet med 5 egnede promotor- og signalsekvenser.
Promotoren kan være enhver DNA-sekvens, som udviser trans-scriptionel aktivitet i gær, og som kan stamme fra gener, der indkoder proteiner, som enten er homologe eller heterologe i 10 forhold til gær. Promotoren stammer fortrinsvis fra et gen, der indkoder et protein, som er homologt i forhold til gær. En egnet promotor kan eksempelvis være Saccharomvces cerevisiae MFal promotor. Andre egnede promotorer kan være S. cerevisiae TPI, ADH eller PGK promotorer.
15
Vektoren ifølge den foreliggende opfindelse indeholder sædvanligvis en signalpeptidsekvens, som er anbragt opstrøms for DNA-sekvensen, der indkoder det ovenfor angivne leader-peptid (I) . Signalpeptidet kan være ethvert signalpeptid, der sikrer, at 20 det udtrykte produkt ledes effektivt ind i cellens sekretionsbane. Signalpeptidet kan være et naturligt forekommende signalpeptid eller funktionelle dele deraf eller et syntetisk peptid. Egnede signalpeptider har vist sig at være α-faktor signalpeptidet, signalpeptidet fra musespytkirtel-amylase eller 25 et modificeret carboxypeptidasesignal. Musespytkirtel-amylase-signalsekvensen er beskrevet af O. Hagenbiichle et al., Nature (1981) 289. 643-646. Carboxypeptidasesignalet er beskrevet af L.A. Valls et al., Cell 48 (1987) 887-897.
30 Gener, der indkoder det ønskede produkt, og signal/leader-sekvensen kombineres med fragmenter, der koder for en promotor, f.eks. TPI promotor (PTPI), og en terminator, f.eks. TPI-terminatoren (Τγρι) (T. Alber og G. Kawasaki: Nucleotide
Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomv-35 ces cerevisiae J. Mol. Applied Genet 1 (1982) 419-434).
Ekspressionsplasmiderne omfatter endvidere 2 μ gærreplikationsgenerne REP1-3 og replikationsorigin og én eller flere
DK 164874 B
6 selekterbare markører, f.eks. Schizosaccharomvces pombe TPI genet, som beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 171.142.
Fremgangsmåderne, der anvendes til ligering af DNA-sekvenserne, 5 der indkoder signal- og/eller leader-peptidet ifølge opfindelsen, promotor- og terminatorsekvenserne og indsætning i egnede gærplasmider indeholdende den nødvendige information til gærreplikation, er alle velkendte fremgangsmåder inden for dette fagområde.
10 I et fjerde aspekt angår den foreliggende opfindelse gærstammer, som transformeres med en vektor ifølge den foreliggende opfindelse.
15 I et femte aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af proteiner i gær, ved hvilken en gærstamme, som er transformeret med en vektor indeholdende en DNA-sekvens, der indkoder et leader-peptid med den ovenfor angivne formel (I), som er anbragt opstrøms for en DNA-sekvens, 20 der indkoder det ønskede produkt, og som er operabelt forbundet med egnede promotor- og signalsekvenser, dyrkes i et egnet medium, hvorefter det secernerede produkt isoleres fra dyrkningsmediet .
25 Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte gærorganisme kan være enhver egnet gærorganisme, som producerer store mængder af det ønskede protein. Foretrukne gærorganismer er Saccharomvces cerevisiae og Saccharomvces kluweri. men der kan dog også anvendes andre gærorganismer, f.eks. Schizosaccharomy-30 ces pombe og Saccharomvces uvarum.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver mulighed for fremstilling af mange forskellige proteiner eller polypeptider i gær. Eksempler på sådanne forbindelser er human insulin-35 precursorer, insulinanalogprecursorer, som beskrevet i EP patentansøgning nr. 163.529, 194.864 og 214.826 og glucagon og aprotinin.
DK 164874B
7 I én udførelsesfonn af den foreliggende opfindelse forbindes en DNA sekvens, der indkoder et leader-peptid med den ovenfor angivne formel (I), direkte med genet for det ønskede produkt. Under sekretionen spaltes leader-peptidet fra det udtrykte 5 produkt, hvilket muliggør isolering af det ønskede produkt (f.eks. glucagon eller aprotinin) fra dyrkningsmediet, uden at der kræves yderligere in vitro omdannelse.
For at sikre en mere effektiv spaltning af leader-peptidet ved 10 de C-terminale Lys-Arg-rester under sekretionen kan det være fordelagtigt at udtrykke det ønskede produkt med yderligere en N-terminal aminosyresekvens. Denne yderligere aminosyresekvens skal senere spaltes fra den resterende del af molekylet ved in vitro omdannelse. Med henblik på sådan in vitro spaltning kan 15 det yderligere peptid forsynes med et selektivt spaltningssted beliggende N-terminalt i forhold til det ønskede produkt. Hvis det ønskede produkt ikke indeholder methionin, er cyanogen-bromid-spaltning ved methionin, som er nabostillet med det ønskede protein, effektiv. Dette omfatter også arginin- eller 20 lysin-spaltning ved en arginin eller lysin, som er nabostillet med det ønskede protein, med en trypsin-lignende protease.
Endelig kan den yderligere peptidkæde fraspaltes in vitro ved andre egnede proteolytiske enzymer, forudsat at den indeholder 25 et spaltningssted for sådanne enzymer.
I nærværende sammenhæng betegner udtrykket "proteiner, som er heterologe i forhold til gær" proteiner, som ikke naturligt dannes af gærorganismen. "Sekretion" betegner udledning af et 30 udtrykt produkt gennem cellevæggen ud i mediet eller i det mindste gennem cellemembranen. "Spaltning" betegner cellulær spaltning af signal/leader-peptidet fra det modne protein til fremstilling af det heterologe protein uden ledsagelse af nogen del af signal/leader-peptidet. "Signal/leader-peptid" betegner 35 en præ-pro-region, der sikrer, at det udtrykte produkt ledes ind i cellens sekretionsbane, og består af en N-terminal signalsekvens af hydrofob sammensætning efterfulgt af en hydrofob leader-region. "Modent protein" betegner proteiner,
DK 164874B
8 der indkodes af DNA-sekvensen indsat i ekspressionsvektoren.
Det modne protein kan være et aktivt protein eller polypeptid eller en precursor derfor, som yderligere omdannes til det aktive slutprodukt ved in vitro omdannelse.
5
Den foreliggende opfindelse er nærmere belyst under henvisning til den medfølgende tegning, hvor:
Fig. 1 viser pMT743 plasmidet og konstruktionen af plasmid 10 ρΤ7αΜΙ3,
Fig. 2 viser konstruktionen af plasmiderne pT7-178 og pLaC178, 15 Fig. 3 viser konstruktionen af plasmiderne pT7-193, pT7-194 og pT7-195,
Fig. 4 viser konstruktionen af plasmiderne pT7-200 og pLaC200, 20
Fig. 5 viser konstruktionen af plasmidet pT7-196,
Fig. 6 viser konstruktionen af plasmidet pLaC212spx3, 25 Fig. 7 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xba fragmentet fra pT7aMI3 og det tilsvarende protein angivet med étbogstavs-nomenklaturen nedenfor,
Fig. 8 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7-30 178 og det tilsvarende protein angivet med étbog stavs-nomenklaturen nedenfor,
Fig. 9 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7- 193 og det tilsvarende protein angivet med étbog- 35 stavs-nomenklaturen nedenfor,
Fig. 10 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7- 194 og det tilsvarende protein angivet med étbog-
DK 164874B
9 stavs-nomenklaturen nedenfor,
Fig. 11 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7-200 og det tilsvarende protein angivet med étbog-5 stavs-nomenklaturen nedenfor,
Fig. 12 viser DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pLaC212spx3 og det tilsvarende protein angivet med étbogstavsnomenklaturen nedenfor, 10
Fig. 13 viser konstruktionen af plasmiderne pKFN371, pT7212spx-3017 og pT7a-0174, og
Fig. 14 viser konstruktionen af plasmiderne pLaC212spx3~0174 15 og pKFN216.
Den foreliggende opfindelse belyses i nedenstående eksempler, der viser fremstillingen af visse insulinprecursorer.
20 1. Plasmider og DNA materialer
Alle ekspressionsplasmider er af C-POT-typen. Sådanne plasmider er beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 171.142 og er 25 ejendommelige ved at indeholde S. pombe triosefosfatisomerase-genet (POT) med henblik på plasmidstabilisering. Et plasmid, der indeholder POT genet, er tilgængeligt fra en deponeret E. coli stamme (ATCC 39685). Plasmiderne indeholder desuden S. cerevisiae triosefosfat-isomerasepromotor og -terminator (ΡγρΙ 30 og Ττρι) . De er identiske med pMT743 (M. Egel-Mitani et al. Gene (1988) (under trykning) (se fig. 1) bortset fra regionen defineret ved EcoRI-Xbal-restriktionsstedet, der indkoder en s ignal/leader/insulinprecursorsekvens.
35 Samlingen af de signal/leader/insulinprecursor-kodende fragmenter, som er beskrevet i denne sammenhæng, har af praktiske grunde fundet sted i et E. coli plasmid ρΤ7αΜΙ3. Dette plasmid (se fig. 1) er et pBR322 derivat, hvori EcoRI stedet er
DK 164874 B
10 elimineret ved religering af plasmidet, der er skåret med EcoRI og gjort stump-endet, med Klenow polymerase og dNTP, og hvori BamHI-Sphl fragmentet er udskiftet med 2,2 kb SphI-BamHI fragmentet fra ovennævnte pMT743. Sidstnævnte fragment inde-5 holder en sekvens, der indkoder en insulinprecursor B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) forbundet med MFa leaderen og -signalet og S. cerevisiae triosefosfat-isomerasepromotor- og terminator-sekvenserne (se fig. 1). I dette SphI-Bam HI fragment er sekvensen, der indkoder signal/leader/-insulinprecursoren 10 indeholdt i 0,5 kb EcoRI-Xbal fragmentet. Det almene princip for konstruktionsarbejdet beskrevet i de følgende eksempler er at udskifte MFa-leadersekvensen med en leader-sekvens ifølge den foreliggende opfindelse. Signalsekvensen samt sekvensen for det ønskede produkt kan også udskiftes. DNA-sekvensen af EcoRI-15 Xbal fragmentet af pT7aMI3 er vist i fig. 7.
Adskillige af konstruktionerne omfatter endvidere fragmenter fra S. kluweri a parringspheromon-genet (M. Egel-Mitani og M. Trier Hansen (1987) Nucl. Acid Res. 15, 6306).
20
Endelig er der anvendt en række syntetiske DNA fragmenter.
De syntetiske DNA fragmenter syntetiseres på et automatisk DNA-synteseapparat (Applied Biosystems Model 380A), idet der 25 anvendes phosphoramiditkemi og kommercielt tilgængelige reagenser (S.L. Beaucage og M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869). Oligonucleotiderne renses ved polyacrylamidgel-elektroforese under denaturerende betingelser.
30 Før sammenføjning blev de komplementære DNA-enkeltstrenge kinasebehandlet med T4 polynucleotidkinase og ATP.
Fragmenterne, som fremkommer ved denne fremgangsmåde, er følgende:
NOR243/244: ACCGGTGACGAAAGCTTCGTCGA
TGGCCACTGCTTTCGAAGCAGCTTTAA
35
DK 164874 B
11
NOR512/513: AATTCCTGAGGAATCTTT
GGACTCCTTAGAAACTAG
N0R308/309: AATTGATATCG
5 CTATAGC
NOR2 45/246: CTGAAAACTCCACTTTGGCTAAGAG
GACTTTTGAGGTGAAACCGATTCTCTAA
10 NOR348/350: TAACGTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTAAC
GCAGCGGTACCGATTCTCTAAGCAATTG
NOR217/218: CAACCAGTCAC
CCGGGTTGGTCAGTGGC
15
Alle andre anvendte fremgangsmåder og materialer er gængse fra den kendte teknik (T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning.
Cold Spring Harbor Press).
20 Følgende eksempler 1-4 viser ekspressionen og sekretionen af insulinprecursorer af typen B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) ved forskellige signal-leader-sekvenser ifølge den foreliggende opfindelse, og eksempel 5 viser ekspressionen og sekretionen af en insulinprecursor af ovennævnte type, men hvori aminosyrere-25 sten i position B(27) er erstattet med Arg, og aminosyreresten i position A(21) er erstattet med Gly. Som anvendt i den følgende tekst betyder B(l-29) en forkortet B-kæde af human insulin fra B(l)Phe til B(29)Lys, og A(l-2l) betyder A-kæden af human insulin.
30
DK 164874 B
Eksempel 1 12
Konstruktion af PLAC178 5 4,5 kb Sall-Xbal fragmentet, 1317 bp Sall-HincII fragmentet og 333 bp EcoRI*-XbaI fragmentet fra pT7aMI13 blev forbundet med det syntetiske fragment NOR243/244:
ACCGGTGACGAAAGCTTCGTCGA 10 TGGCCACTGCTTTCGAAGCAGCTTTAA
hvilket resulterede i pT7-172.
5.6 kb EcoRI-Xbal, 172 bp EcoRI-PvuII og 278 bp Hinfl-Xbal 15 fragmenterne fra pT7-172 blev forbundet med det syntetiske fragment NOR 245/246:
CTGAAAACACCACTTTGGCTAAGAG
GACTTTTGTGGTGAAACCGATTCTCTAA
20 hvilket resulterede i pT7-178.
Udskiftning af SphI-BamHI fragmentet fra pMT743 med 2,2 kb Sphl-BamHI fragmentet fra pT7-178 resulterede i pLaC178. Kon-25 struktionen af pLaC178 er vist i fig. 2.
DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7-178 er vist i fig. 8.
30 Konstruktion af oLaC193-194 5.6 kb EcoRI-Xbal og 203 bp PvuII-Xbal fragmentet fra pT7aMI3 blev forbundet med det syntetiske fragment NOR308/309:
35 AATTGATATCG
CTATAGC
Fra det resulterende plasmid blev 210 bp EcoRV-Xbal fragmentet
DK 164874 B
13 samlet med 138 bp EcoRI-Maelll og 5,6 bp EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7-l78, og de nedenfor angivne fragmenter fra S. kluvveri MFa-genet: 5 74 bp Maelll-EcoRV resulterede i pT7-193 47 bp MaeIII-Sau3A resulterede i pT7-194
De understregede restriktionsender blev udfyldt med Klenow polymerase og dNTP. Konstruktionen af disse plasmider er vist 10 i fig. 3.
Udskiftning af SphI-BamHI fragmentet af pMT743 med SphI-BamHI fragmenter af pT7-193-195-plasmider resulterede i plasmiderne pLaC193-194.
15
Plasmidet pLaC193 indkoder følgende leader-sekvens:
Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-20 Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg.
Signalsekvensen er en codon-optimeret s. cerevisiae signalsekvens (se Michi Egel Mitani et al., (1988) suora). DNA-sekven-sen af EcoRI-Xbal fragmentet af pT7-193 er vist i fig. 9.
25
Plasmidet pLaC194 indkoder følgende leader-sekvens:
Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg.
30
Signalsekvensen er som ovenfor angivet. DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet af pT7-l94 er vist i fig. 10.
35
DK 164874 B
Eksempel 2 14
Konstruktion af pLaC200 5 213 bp EcoRI-Ddel og 5,9 kb Hpal-EcoRI fragmentet fra pT7-194 blev samlet med det syntetiske fragment NOR348/350:
TAACGTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTAAC
GCAGCGGTACCGATTCTCTAAGCAATTG
10 resulterede i pT7-200. Udskiftning af SphI-BamHI fragmentet i pMT743 med 2,2 kb SphI-BamHI fragmentet fra pT7-200 resulterede i pLaC200. Konstruktionen af pLaC200 er vist i fig. 4.
15 Plasmidet pLaC200 indkoder følgende leader-sekvens:
Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-
Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-
Ala-Lys-Arg.
20
Signalsekvensen er den samme som i eksempel 1. DNA-sekvensen af EcoRI-Xbal fragmentet fra pT7-200 er vist i fig. 11.
Eksempel 3 25
Konstruktion af pLaC212spx3
Plasmidet pT7-178 blev mutageniseret in vitro ved dobbeltpr imermetoden, idet der anvendes det syntetiske DNA N0R544: 30 3' CTTACTTTCAGAAGATAAAAATGACG 5* i alt væsentligt som beskrevet af K. Norris et al. (1983) Nucl.
Acid Res. 11 5103-5112 (fig. 5).
Det resulterende plasmid indeholder nu et Xmnl spaltningssted, hvilket muliggør isolering af et 82 bp EcoRI-Xmnl fragment, som sammen med 37 bp XmnI-Apal fragmentet fra mPSA104 (0.
35
DK 164874 B
15
Hagenbtichle et al. Nature (1981) 289. 643-646), der indkoder musespytkirtel-amylase-signalpeptid-aminosyreresterne tre til femten, blev samlet ved en ligering, som yderligere inkluderede 251 bp Mspl-Xba og 5,6 bp EcoRI-Xba fragmenterne fra pT7-178 og 5 det syntetiske DNA fragment N0R217/218:
CAACCAGTCAC
CCGGGTTGGTCAGTGGC
10 hvilket resulterede i plasmidet pT7-196 (fig. 5) , som indeholder et modificeret musespytkirtel-amylasesignal (amino-syrerester 3-15).
Udskiftning af SphI-BamHi fragmentet fra pMT743 med 2,2 kb 15 SphI-BamHi fragmentet af pT7-l96 resulterede i pLaC196.
Det modificerede musespyt-amylasesignalpeptid blev yderligere mutageniseret ved udskiftning af XmnI-Apal fragmentet af pLaC196 med de syntetiske adaptorer NOR520T eller 52IT (fig.
20 6a) fremstillet ud fra
NOR520: tcccatctgttttcttgttattgtccttgatcggattctgctÆGGCCCA
N0R5 21: tcttcttgttattgtccttgatcggattctgctGGGCCCA 25 hvor nucleotiderne angivet med små bogstaver blev inkorporeret fra puljer sammensat af 91% af det angivne nukleotid og 3% af hver af de andre nukleotider. NOR520 og 521 blev autosammen-føjet (understregede 3'-ende), forlænget med Klenow-polymerase 30 og dNTP, hvilket giver dobbeltstrengede DNA fragmenter på henholdsvis 90 og 72 bp. Disse fragmenter blev spaltet med Apal, og de fremkomne fragmenter N0R521T på 47 bp og NOR521T på 38 bp blev oprenset ved polyacrylamid-gelelektroforese.
35 Plasmider fremkommet ved denne fremgangsmåde blev isoleret fra transformanter af en £. coli stamme og hver især transformeret ind i S. cerevisiae stammen MT663. De fremkomne gærtransfor-manter blev screenet for insulinprecursorsekretion ved koloni-
DK 164874 B
16 immunblotting med en monoklonal muse-antiinsulinprecursor og detekteret med peberrodsperoxidase-konjugeret kanin-antimus IgG. De transformanter, som giver den stærkeste respons, blev analyseret yderligere. Den bedste af disse indeholdt plasmidet 5 pLaC196spx3, hvori signalpeptidet var ændret til:
MKAVFLVLSLIGFCWA
Den nøjagtige nucleotidsekvens bestemt ved Maxam-Gilbert 10 sekventering fra EcoRI stedet mod Xabl er angivet i fig. 12.
spx3 signalpeptidet er i ovennævnte sammenhæng omtrent en faktor to bedre end det oprindelige signalpeptid i pLaC196, bestemt ud fra de opnåede secernerede insul inprecursorniveauer.
15
Overraskende nok er spx3, som stammer fra NOR520T mutagenese, to kodoner kortere end forventet, og den eneste forklaring på dette må være længdeheterogenitet i de oprindelige enkeltstren-20 ge af NOR520 eller et polymerasespring i forlængelsesreaktionen undervejs til NOR520T.
Udskiftning af Maelll-Xbal fragmentet, der indkoder leader-insulinprecursordelen af pLaC196spx3 med det analoge Maelll-25 Xbal fragment af pLaC200, resulterede i pLaC212spx3 (fig. 6b).
Plasmid pLaC212spx3 indkoder følgende leadersekvens:
Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-30 Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala-Lys-Arg.
Signalsekvensen er det muterede musespytkirtelamylasesignal. DNA-sekvensen af EcoRi-Xbal fragmentet af pLaC212spx3 er vist 35 i fig. 12.
Eksempel 4
DK 164874 B
17 DNA, der indkoder en precursor af en insulinanalog med henholdsvis Gin i position B(12), Arg i position B(27) og Gly i 5 position A(21), blev afledt af plasmidet pKFN126 (Markussen et al- (1987) Protein Engineering: 1, 215-223) ved at udskifte 90 bp Stul-Xbal fragmentet med følgende syntetiske DNA:
CCCAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTA 10 GGGTTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGGAGGTAGACGAGGAACAT
CCAATTGGAAAACTACTGCGGTTAAT
GGTTAACCTTTTGATGACGCCAATTAGATC
15 Fra det resulterende plasmid pKFN371 blev 124 bp Hindlll-Xbal fragmentet isoleret og anvendt til udskiftning af det analoge Hindlll-Xbal fragment fra pT7212spx3 og pT7aMI3 (se fig. 13). Herved blev DNA-sekvensen, der indkoder ovennævnte insulinanalog, ændret til en sekvens, der koder for en insulinanalog, 20 hvori B(27) er Arg, og A(21) er Gly. Ved at udskifte Sphl-BamHI fragmentet fra pMT743 med 2,2 kb Sphl-BamHI fragmentet fra plasmiderne pT7212spx3-0174 og pT7a-0174, som opstod ved disse konstruktioner, konstrueredes henholdsvis pLaC212spx3-0174 og pKFN216 (se fig. 14). I disse plasmider medierer henholdsvis 25 2l2spx3 og S. cerevisiae MFa leaderen sekretionen af insulina-nalogen.
Eksempel 5 30 Plasmider fremstillet som beskrevet ovenfor blev transformeret til S. cerevisiae stammer, som bærer deletioner i TPI genet, ved udvælgelse til vækst på glucose.
De transformerede gærstammer blev dyrket på YPD-medium (Sher-35 man, F. et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) . For hver stamme blev 6 individuelle 5 ml kulturvæsker rystet ved 30°C, indtil de nåede en OD600 på ca. 15 (ca. 48 timer) Efter centrifugering blev supernatanten fjernet
DK 164874 B
18 med henblik på HPLC-analyse, ved hvilken koncentrationen af secerneret insulinprecursor blev målt ved en fremgangsmåde beskrevet af Leo Snel et al. (1987) Chromatographia 24, 329-332.
5 Ekspressionsniveauerne for forskellige insulinprecursorer er opsummeret i følgende tabeller I og II.
I tabel 1 og 2 er ekspressionsniveauet af insul inprecur sorerne under anvendelse af en leadersekvens ifølge opfindelsen angivet 10 i procent af ekspressionsniveauet af den samme insul inprecursor udtrykt og secerneret i den samme gærstamme, men under anvendelse af MFa signal/leadersekvensen.
Tabel I 15
Ekspressionsniveauer for insul inprecursor B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l) i gærtransformanter.
Plasmid Ekspressionsniveau* 20 pMT7 4 3 100% pLaC193 160% pLaC194 200% pLaC200 170% pLaC212spx3 120% 25
Ekspressionsniveauerne er angivet i procent af ekspressionsniveauet for pMT743, som arbitrært fastsættes til 100%.
Tabel II
19
DK 164874 B
Ekspressionsniveauer for insulinprecursorer, hvori B(27) er 5 Arg, og A(21) er Gly.
Plasmid Ekspressionsniveau** pKFN216 100% pLaC212spx3-0174 150% 10 **Ekspressionsniveauerne er angivet i procent af ekspressionsniveauet for pKFN216, som arbitrært fastsættes til 100%.
Claims (17)
1. Syntetisk leaderpeptid til sekretion i gær, kendetegnet ved, at det har følgende almene formel (I) 5 Χ,,-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser- Leu-Ile-X2-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-X3-X4-X5 kendetegnet ved, at 10 X1 er Ala eller Gin? X2 er Ile, en peptidkæde med op til 10 aminosyrerester eller en peptidbinding; X3 er en peptidkæde med op til 5 aminosyrerester eller en peptidbinding,
2. Leaderpeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X2 er Ile, n er 1, og X,,, X3, X4 og X5 har de i krav 1 20 angivne betydninger.
3. Leaderpeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X2 er peptidkæden Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Asp-Asp-Ile, n er 1, og X1, X3, X4 og X5 har de i krav 1 angivne 2. betydninger.
4. Leaderpeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har følgende peptid-sekvens:
30 Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg.
5. Leaderpeptid ifølge krav 1, kendetegnet 35 ved, at det har følgende peptidsekvens: Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu- Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Lys-Arg DK 164874 B 21
6. Leaderpeptid ifølge krav l, kendetegnet ved, at det har følgende peptidsekvens: Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-5 Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala-Lys-Arg.
7. Leaderpeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har følgende peptidsekvens: 10 Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala-Lys-Arg.
8. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den indkoder et leaderpeptid med formlen (I) som beskrevet i krav 1.
9. DNA-sekvens ifølge krav 8, kendetegnet 20 ved, at den har nucleotidsekvensen fra nucleotid 133 til 246 i fig. 9.
10. DNA-sekvens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den har nucleotidsekvensen fra nucleotid 133 til 218 i fig. 25 10.
11. DNA-sekvens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den har nucleotidsekvensen fra nucleotid 133 til 233 i fig. 11. 30
12. DNA-sekvens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den har nucleotidsekvensen fra nucleotid 124 til 223 i fig. 12.
13. Replikerbar gærvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens, der indkoder et leaderpeptid med formlen (I) ifølge krav 1, anbragt opstrøms for en DNA-sekvens, der indkoder det ønskede produkt, og som er operabelt DK 164874 B 22 forbundet med promotor- og signalsekvenser.
14. Gærstamme, kendetegnet ved, at den er transformeret med en vektor ifølge krav 13. 5
15. Gærstamme ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den tilhører arten Saccharomvces cerevisiae.
15 X4 og X5 er Lys eller Arg; og hvor alle aminosyrerester er naturligt forekommende L-former.
16. Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner i gær, 10 kendetegnet ved, at en gærstamme, som er transformeret med en vektor ifølge krav 13, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og det ønskede proteinprodukt isoleres fra dyrkningsmediet.
17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at gærstammen tilhører arten Saccharomvces cerevisiae.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK053290A DK164874C (da) | 1987-09-07 | 1990-03-01 | Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK463887A DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Gaerleader |
| DK463887 | 1987-09-07 | ||
| PCT/DK1988/000147 WO1989002463A1 (en) | 1987-09-07 | 1988-09-06 | Synthetic yeast leader peptides |
| DK8800147 | 1988-09-06 | ||
| DK053290A DK164874C (da) | 1987-09-07 | 1990-03-01 | Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer |
| DK53290 | 1990-03-01 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK53290D0 DK53290D0 (da) | 1990-03-01 |
| DK53290A DK53290A (da) | 1990-03-01 |
| DK164874B true DK164874B (da) | 1992-08-31 |
| DK164874C DK164874C (da) | 1993-01-11 |
Family
ID=26064171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK053290A DK164874C (da) | 1987-09-07 | 1990-03-01 | Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK164874C (da) |
-
1990
- 1990-03-01 DK DK053290A patent/DK164874C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK164874C (da) | 1993-01-11 |
| DK53290D0 (da) | 1990-03-01 |
| DK53290A (da) | 1990-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0378567B1 (en) | Synthetic yeast leader peptides | |
| US5795746A (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| US5726038A (en) | DNA construct encoding the YAP3 signal peptide | |
| AU660161B2 (en) | A method of constructing synthetic leader sequences | |
| US5395922A (en) | Yeast processing system | |
| US6214547B1 (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| EP0946735B1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0868523B1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell | |
| DK164874B (da) | Syntetiske gaer-leader-peptider, dna-sekvens, der indkoder saadanne leader-peptider, vektorer og transformerede gaerstammer samt en fremgangsmaade til fremstilling af proteiner i gaer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |