DK164877B - Heparinbindende protein (hbp), terapeutisk praeparat indeholdende hbp, fremgangsmaade til fremstilling af proteinet hbp samt dna-sekvens og cdna, der koder for hbp - Google Patents

Description

i

DK 164877B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt hepa-rin-bindende protein (HBP) af højere mammal type, som i glycosyleret tilstand har en tilsyneladende molvægt på ca. 28 kDa, bestemt ved SDS-PAGE under reducerende betin-5 gelser, og udviser angiogene egenskaber in vivo. Endvidere angår opfindelsen et terapeutisk præparat indeholdende proteinet (HBP).

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til frem-10 stilling af proteinet samt en DNA-sekvens og cDNA, der koder for proteinet. Under normale betingelser er proteinet glycolyseret.

Det omhandlede heparinbindende protein er isoleret i to 15 varianter, nemlig HBP af den porcine type, som er genstand for krav 2, og HBP af den humane type, som er genstand for krav 3.

Den normale sårhelingsproces forløber sædvanligvis gennem 20 en række faser, som efter beskadigelsen resulterer i ny vævsdannelse.

Hvilende fibroblastre ved sårkanten deler sig og producerer collagen. Disse processer fortsætter, indtil sårkan-25 terne mødes. Epitelcellerne deler sig til sidst og dækker granulationsvævet, og helingen er afsluttet.

Blodpladerne er det første cellulære element af betydning for ophelingen af et akut sår inden for det første døgn.

30 Dernæst overtages ophelingsprocesserne af neutrofile gra-nulocyter fulgt af makrofager og lymphocyter, som alle kan iagttages at vandre ind i såret i de næste 2-3 døgn efter vævsbeskadigelsen. Det er disse inflammatoriske celler, der via en nøje afstemt frigørelse af parakrine 35 vækstfaktorer i sidste instans sikrer en korrekt sårophe-ling.

DK 164877 B

2

Inden for de senere år har man opdaget, at disse vækstfaktorer, som kaldes Platelet derived growth factor (PDGF), Transforming growth factor alpha (TGFa) og Transforming growth factor beta (TGFØ), deltager i sårhelings-5 processen. PDGF frigives initialt fra blodpladernes α- korn, når pladerne adhærerer til sårrandene i det friske sår og besidder stærk kemotaksi overfor fibroblastre (1) foruden at være mitogent overfor de samme celler i tilstedeværelse af enten TGFa eller epidermal growth factor 10 (EGF) (2).

PDGF aktiverer fibroblaster til afgivelse af collagenase (3) og bidrager dermed til remodellering af matrix, hvilket er et væsentligt element i sårophelingen, jvf.: 15 1. Grotendorst, G.R., Seppa, H.E., Kleinman, H.K., and

Martin, G.R. 1981. Proc. Matl. Acad. Sci. USA. 78: 3669-2672.

20 2. Deuel, T.F., Kimura, A., Maechama, S. and Tong, B.D.

1985 Cancer Surv. 4: 633-653.

3. Bauer, E.A., Cooper, T.W., Huang, J.S., Altman, J. and Deuel, T.F. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 25 4132-4136.

TGFØ findes i relativt høje koncentrationer i blodpladerne og syntetiseres og udskilles også fra a-granulater under koaguleringen. Denne vækstfaktor spiller en vigtig 30 rolle for matrix-dannelsen i sår og har desuden vist sig at have regulatorisk indflydelse på en række andre vækstfaktorer, såsom PDGF, EGF og TGFa.

TGF/J udviser kraftig kemotaktisk aktivitet overfor mono-35 cyter. Således vil vækstfaktorer, der umiddelbart efter dannelsen af såret frigives fra blodpladerne også spille en vigtig rolle ved stimulering af migrering af inflamma-

DK 164877 B

3 toriske celler til såret. TGF/5 kan rekrutere monocyter fra kredsløbet og følgelig aktivere dem til den sekreto-riske phenotype (Wiseman, D.M. et al., (1988) Biochemical and Biophysical Research Communications 157, 793-800).

5 Så snart monocyterne har udviklet sig til denne phenotype * og rettere kan kaldes makrofager, kan de vises at udskille de samme faktorer, som findes i blodpladerne plus mange andre af stor betydning for helingsprocessen.

10 Således udskiller monocyter/makrofager vækstregulerende faktorer, såsom Platelet derived growth factor (PDGF), Transforming growth factor beta (TGFØ), Transforming growth factor alpha (TGFe), Basic fibroblast growth fac-15 tor (BFGF). Insulin-like growth factor one (IGF-1) Bombesin, Granulocyte-stimulating factor (GSF), Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Monocyte stimulating factor (M-CSF) og Interleukin-1 (IL-1). Sekretionsprodukterne omfatter også proteaser, komplement-20 proteiner, monocyt-afledte neutrophil-aktiveringsfaktor, arachidonater og Tumor necrosis factor alpha (TNFa).

(Rom, W.N. et al., (1988) J. Clin. Invest. 82, 1685- 1693), Rappolee D.A. et al., (1988) Science 241, 708- 712), (for oversigt se Unanue, E.R. et al., (1987).

25 Science 236, 551-557).

Alle disse makrofag-afledte parakrine vækstfaktorer deltager i helingsprocessen, men mange detaljer vedrørende mekanismen og den komplekse samvirken blandt disse fak-30 torer er stadig dårligt opløst.

Under helingsprocessen er det af afgørende betydning, at vævet under væksten bliver tilfredsstillende forsynet med oxygen og næringsmidler. Dette sikres ved den komplicere-35 de proces, der er kendt som angiogenese, hvilket fører til dannelse af nye blodkar in situ. Denne proces omfatter styret migrering, proliferation og differentiering af

DK 164877 B

4 vaskulære celler (Folkman, M. et al., (1987). Science 235, 442). Initieringen af angiogenese ved direkte stimulering af endothelialt celleproliferation skyldes formentlig to polypeptid-mitogener: klasse I heparin-binden-5 de vækstfaktor (HBGF-1), også kendt som sur fibroblast vækstfaktor, og klasse II heparin-bindende vækstfaktor (HBGF-II) eller basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF).

(Thomas, K.A. (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 6409), 10 Esch. F. (1985) ibid: 6607). Disse faktorer findes ikke i blodplader, men basisk FGF udskilles af aktiverede mono-cyter/makrofager som ovenfor nævnt og har vist sig at inducere angiogenese i dyremodeller in vivo.

15 Det er derfor klart, at den initielle kraftige udvikling af blodplade-frigivelsen ved sårets opståen ikke omfatter direkte angiogene faktorer. Blodpladeekstrakter har dog vist at være angiogene ved in vivo eksperimenter, og dette kan vises at være et resultat af monocyt-aktiveringen, 20 som på sin side fører til udskillelse af de ovenfor nævnte relevante faktorer. Adskillige forsøg på at isolere og karakterisere en ikke-mitogen angiogen faktor fra blodpladerne har været gjort, men arten af denne faktor har ikke været kendt (Knighton, D.R. et al., 1986, Ann. Surg.

25 204, 323-331).

En nødvendig forudsætning for at angiogenese kan finde sted er tilstedeværelsen af heparin i sårområdet, og det er vist, at fjernelse af heparin med protamin helt for-30 hindrer angiogenese.

Terapeutiske præparater til anvendelse ved porcin eller human terapi er genstand for henholdsvis krav 4 og 5.

35 En fremgangsmåde til fremstilling af de heparinbindende proteiner er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 6 angivne.

DK 164877B

5

Proteinet HBP kan i stedet fremstilles ved biosyntetisk rekombinant teknik som angivet i krav 8. Hertil anvendes en DNA-sekvens eller cDNA, der koder for det heparinbin-dende protein, således som anført i krav 9 og 10.

5

Enhver faktor, der har evnen til at rekrutere monocyter fra blodkredsløbet til sårområdet og følgelig aktivere disse i tilslutning til at have heparin-bindende egenskaber vil derfor også have overordentlig stor betydning for 10 angiogenese og for den totale helingsproces.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes hidtil ukendte proteiner (human- og porcin-typerne betegnes i det efterfølgende som hHBP og pHBP), der er specifikt 15 egnede til at stimulere angiogenese og vævsheling af følgende grund: a) Proteinerne frigives fra blodpladerne, når disse celler aktiveres, således som det sker ved vævsbeskadi- 20 gelse.

b) Proteinerne binder til heparin.

c) Proteinerne er kemotaktiske for monocyter.

25 d) Proteinerne aktiverer monocyter morfologisk mod den sekretoriske phenotype.

e) Proteinerne aktiverer monocyter i kulturer til udskil- 30 lelse af mitogener for fibroblaster i kulturen.

f) Indføring af proteinerne giver anledning til angiogenese i hønseæg chorio-allantoisk membranmodel.

35 g) Proteinerne forøger epithealiseringshastigheden ved indføring i sårområdet af eksperimentelle modeller på rotter, bedømt ved makroskopiske og histologiske un-

DK 164877 B

6 dersøgelser.

h) Proteinerne forøger granuleringsvævsdannelsen i de samme sårområder, bedømt ved makroskopiske og histolo- 5 giske undersøgelser.

i) Proteinerne forøger blodkardannelsen i de samme sårområder på rottemodeller, bedømt ved makroskopiske undersøgelser.

10

To specifikke eksempler på hidtil ukendte proteiner er afledt af porcin og humane blodplader, idet aminosyre-sekvensen for porcin-typen er fuldt opklaret og genstand for efterfølgende krav 2. Human-typen er stærkt homolog 15 med porcin-typen, således som det fremgår ved sammenligning af aminosyresekvensen af porcin-typen angivet i krav 2 med aminosyresekvensen for den humane type angivet i krav 3.

20 En vigtig egenskab i relation til vævshelingen er de stærkt heparin-bindende egenskaber for proteinerne. Kort efter vævsbeskadigelsen kan det iagttages, at mastcellerne i bindevævet blandt adskillige vigtige bestanddele for inflammationen også frigiver store mængder heparin 25 (Qureshi, R. et al., (1988). The Journal of Immunology 141, 2090-2096).

De frigivne heparin vides at binde til collagen, og så snart dette er sket bliver de omhandlede heparin-bindende 30 proteiner (HBP) derved immobiliseret. Dette kan skabe en fast gradient og, som foreslået af Gustafson et al., af teoretiske grund og påvist eksperimentelt af Carter, har cellerne tilbøjelighed til at oparbejde en gradient for stigende substrat-adhæsion. Carter har foreslået, at det-35 te fænomen skulle kaldes "Haptotaxis" (græsk: haptein, at fastgøre; taxis, arrangement). På denne basis bliver cel-lemigreringen, der sker under morfogenese, inflammation, 7

DK 164877 B

sårheling, tumorinvasion samt alle vævscellebevægelser, betragtet som resultat af haptotaktisk respons af de involverede celler (Gustafson, T. et al., (1963). Intern.

Rev. Cytol, 15, 139), Carter, S.B. (1965), Nature 208, 5 1183-1187).

På dette grundlag vil de omhandlede heparin-bindende proteiner være enestående egnede til at rekrutere monocyter fra kredsløbet til de beskadigede vævsområder. Den efter-10 følgende aktivering til sekretorisk phenotype finder sted in situ, dvs. den komplette cocktail af monocyt/makrofag-afledt cytokiner frigives i nærheden af de beskadigede celler i såret og letter helingsprocessen.

15 De omhandlede heparin-bindende proteiner kan anses for særlige velegnede til at stimulere heling af kroniske sår på mennesker. Det antages sædvanligvis, at den vigtigste patogene faktor for kroniske skinnebenssår og decubitus på ældre patienter er manglen på neovaskularisation (an-20 giogenese).

På basis af de nævnte egenskaber for heparin-bindende proteiner kan det forudses, at ekstern påføring af proteiner (fortrinsvis af den humane type) til kroniske sår 25 vil fremskynde helingen. Fjernelse af makrofager vil forsinke sårhelingsresponset (Leibovich, S.J. et al., (1975). Am. J. Pathol. 78, 71). I den humane terapi vil en sådan udtømning for makrofager fører til flere sygdomme, og det er også ofte et resultat af terapien. Således 30 iagttages alvorlige tilfælde af leucocytopenia på cancer patienter, der behandles med kemoterapi eller strålebehandling. Langsom heling efter kirurgisk behandling og fremkomsten af kroniske sår ses ofte på sådanne patienter. De specielle egenskaber, som de heparin-bindende 35 proteiner udviser, kan medføre terapeutisk fordel for sådanne patientgrupper.

DK 164877 B

8 HBP kan også anvendes i terapien for alvorlige forbrændinger. manglen på neovaskularisation resulterer i dårlig heling, og det beskadigede væv er modtagelig for infektioner. Derfor vil en komponent, der har monocytiske ak-5 tiveringsegenskaber, være af stor fordel. Aktiverede mo- nocytere eller "makrofager" virker som udrensningsmidler, og ved phagocytose fjerner de beskadigede vævsrester, hvilket er en væsentlig funktion i forbindelse med forbrændinger.

10 I nyere tid har den vækstregulerende rolle for makrofager i forbindelse med tumorvækst tiltrukket sig betydeligere opmærksomhed.

15 Høje koncentrationer af aktiverede makrofager er cytosta-tiske overfor neoplastiske celler, og denne effekt er rettet selektivt mod neoplastiske mål-celler. Det formodede sekretoriske produkt fra makrofater i denne sammenhæng antages at være TNFa (Diegelmann, R.F. et al., 1981, 20 Plastic and Reconstructive Surgery 1968, 107-113).

De omhandlede heparin-bindende proteiner kan have terapeutiske anvendelser i forbindelse med tumor-terapien.

HBP, der injiceres i faste tumorer, kan tilføre cirkule-25 rende monocyter til tumorområde og ved efterfølgende aktivering formidle en cytotoxisk effekt.

Farmaceutiske præparater til anvendelse ifølge opfindelsen til klinisk brug som ovenfor foreslået omfatter ind-30 føring af human HBP i cremer, salver, geler, skum, dressingmaterialer, plastre, underlag, kunstig hud, vandige medier for imprægnering af gazebind, tørre kvældbare pulvere eller sutur-overtræk.

35 Formuleringer, der kan anvendes til at optage HBP, er frysetørrede underlag eller en hydrocolloid dækkende forbinding. Det foretrækkes at anvende en medicinsk forbin-

DK 164877B

9 ding, der giver en kontrolleret frigivelse af HBP.

Geler, som kan anvendes, består af en vandig base, som er gjort højviskos ved tilsætning af vandopløselige etheri-5 ficerede cellulosederivater, såsom alkylcellulose, hydr- oxyalkylcellulose og alkylhydroxyalkylcelluloser, f.eks. methylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxymethylcel-lulose, hydroxypropylmethylcellulose og hydroxypropylcel-lulose. Hydroxyalkylcellulosederivaterne, såsom hydroxy-10 propylcellulose, hydroxyethylcellulose og hydroxypropyl methylcellulose, foretrækkes. Sædvanligvis opløses HBP i den vandige fase før gelatineringsmidlet tilsættes.

Et frysetørret underlag kan bestå af et hydroxycolloid 15 med coherent fibrøs struktur, dannet ved lyofilisering af en gel. Hydrocolloidet kan være et vandopløseligt etheri-ficeret cellulosederivat som ovenfor nævnt. Sædvanligvis optages HBP i underlaget forud for frysetørringen.

20 En medicinsk forbinding kan være en klæbende dækkende bandage, hvori der er inkorporeret HBP. Forbindingen omfatter et forseglingsmateriale, et klæbende middel som en kontinuert fase og en diskontinuert fase dispergeret i den kontinuerte fase, bestående af en eller flere i vand 25 opløselige eller kvældbare forbindelser, såsom etherifi-ceret cellulosederivater af ovennævnte type. Evnen af den diskontinuerte fase til at kvælde op i vand giver mulighed for gradvis frigivelse af forud fysisk indesluttet HBP. HBP kan også indgives i væskepræparater ved subkuta-30 nøs, intravenøs injektion. Endvidere kan indgiften af HBP også ske ad nasal, buccal, rectal eller intraperitoneal vej.

HBP kan ifølge opfindelsen fremstilles ud fra blodplader, 35 opnået fra svineblod eller humant blod. Nærmere bestemt fremstilles proteinet ved fraktionering af en blodplade-ekstrakt. Til dette formål er kolonnekromatografi under

DK 164877 B

10 anvendelse af Heparin-Sepharose hensigtsmæssig. Ved en sådan kromatografisk metode, hvor der udføres en gradi-ent-eluering med NaCl fra 0,5 M op til 3 M af en kolonne, hvorigennem der først er hældt en ekstrakt af blodpladen, 5 elueres to toppe. Den første top omkring 1,2 M NaCl kan måles ved 280 nm som en stor proteintop og er en i og for sig velkendt pladefaktor (PF^). Omkring 1,8 M NaCl er proteinmængden under detektionsgrænsen i det anvendte system, men fraktionerne i dette område har angiogen ak-10 tivitet. De aktive fraktioner oprenses yderligere ved mi-krobore-HPLC i reverse fase på C^-kolonne og ved 214 nm kan en fuldstændig ren proteintop detekteres, og dette protein er identisk med det omhandlede HBP, der enten er af porcin eller human type, afhængig af de benyttede 15 blodplader.

HBP kan også fremstilles ved rekombinant teknik. Bakterier, gær, svampe eller mammale cellelinier kan anvendes som værter for produktion af HBP ved transformation af 20 værtscellen med en egnet vektor indeholdende de nødvendige transskriptions- og translateringssignaler samt DNA-sekvensen, der koder for HBP, der kan opnås en produktion af HBP.

25 Man kan vælge mellem at producere produktet intracellu- lært eller få det udskilt i vækstmediet. Der kendes mange sekreteringssignaler. I USA patentskrift nr. 4 336 336 er der således beskrevet procaryoter, der anvendes med en leader-sekvens, der koder for ikke-cytoplasmisk protein, 30 som normalt transporteres til eller gennem celleoverfladen, hvilket resulterer i overførsel af fusionsprotein til det periplasmatiske rum. For så vidt angår gær beskriver Kurjan & Herskowitz i Cell (1981), 30, 933-943 en formodet α-faktor precursor indeholdende fire tandemkopi-35 er af moden α-faktor, hvilket beskriver sekvensen og postulerer en procesmekanisme. Denne signalsekvens har været anvendt til sekretering af vidt forskellige poly-

DK 164877 B

11 peptider fra gærarten Saccharomyces cerevisiae lige siden opdagelsen af signalsekvensen. Brake et al., PNAS USA, 81, (1984) 4642-4646 giver et eksempel herpå.

5 Bakterier er hverken i stand til at glycosylere proteiner eller, i de fleste tilfælde, at danne de korrekte disul-fidbroer i polypeptider af human oprindelse. De kan dog danne korrekte di sulfidbroer, men de glycosylerer ikke proteiner på samme måde som højere eucaryoter gør. Man 10 har isoleret gær mutanter, som glycosylerer på en måde svarende til mammale cellelinier, hvilket gør gær til en velegnet vært for glycosylerede proteiner i fremtiden.

Det omhandlede protein HBP migrerer i enkelte bånd i SDS-15 PAGE under reducerende betingelser (jævnfør fig. 1 og 2) og har et Mr på ca. 28 kDa.

Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere med henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 er et SDS-PAGE-diagram, bestemt under reducerende betingelser for heparin-bindende protein af porcin-typen.

Bane 1: Mr-markører 25 Bane 2: pHBP

fig. 2 er et SDS-PAGE-diagram under reducerende betingelser (se eksempel 2) for heparin-bindende protein af humantypen.

30

Bane 1: M -markører r

Bane 2: hHBP

fig. 3 illustrerer en test for angiogenese for HBP ved 35 anvendelse af kyllingefoster chorioallantoinmembran. Det te er forklaret nærmere i eksempel 5,

DK 164877 B

12 fig. 4, 5 og 6 er afbildninger af HBP-behandlede monocy-ter (8 ng/ml) (fig. 4), endotoxin-behandlede monocyter (100 ng/ml) (fig. 5) og PBS-behandlede monocyter (kontrolceller) (fig. 6) vist. Nærmere forklaring fremgår af 5 eksempel 6.

EKSEMPEL 1 500 g blodplader fra svineblod blev opslæmmet i 1,5 liter 10 PBS, frosset og tøet 3 gange ved hjælp af flydende nitrogen (^) og i det følgende kaldet Frys/Tø. Frys/Tø blev centrifugeret ved 40 000 x g i 30 minutter, og superna-tanten herfra underkastet ultracentrifugering ved 300 000 x g i 60 minutter. Supernatanten herfra blev dialyseret 15 over 2 døgn med 20 volumener 10 mM phospha tpuf fer, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Dialysatet blev pumpet på en 5 cm (I.D.) x 10 cm Heparin-Sepharose® C1-4B kolonne med en strømningshastighed på 120 ml/h. Søjlen blev vasket med samme puffer som prøven var dialyseret imod (puffer A), indtil der 20 ikke eluerede mere protein ud. Kolonnen blev dernæst elueret med en lineær gradient fra puffer A til puffer B = 10 mM phosphatpuffer, 3 M NaCl, pH 7,4 over 20 timer med en strømningshastighed på 1,7 ml/min. 200 fraktioner (å 6 minutter) blev opsamlet, og den angiogene effekt 25 blev testet. 50 fraktioner fordelt symmetrisk omkring 1,8 M NaCl-koncentrationen i gradienten viste aktivitet. Disse fraktioner blev sammenlagt og tilsat ovalbumin til en koncentration på 0,5 mg/ml. De samlede fraktioner blev dialyseret mod 20 volumener puffer A og dernæst pumpet på 30 en 0,6 ml Heparin-Sepharose® C1-4B kolonne med en strømningshastighed på 6 ml/h. Kolonnen blev elueret med en lineær gradient over 10 timer med en strømningshastighed på 0,04 ml/minut. 120 fraktioner å 200 ul blev opsamlet og testet for angiogen aktivitet og blev sammenlagt. De 35 sammenlagte fraktioner blev dernæst kromatograferet på en reversfase C^-søjle (0,1 ml volumen) med en lineær gradient fra 0 til 80% acetonitril indeholdende 0,1% trifluor-

DK 164877 B

13 eddikesyre (TFA) over 30 minutter med en strømningshastighed på 0,025 ml/minut. Den angiogene aktivitet blev detekteret i en basisliniesepareret top med en retentionstid på 26 minutter.

5 SDS-PAGE under reducerende omstændigheder viser, se tegningen, at toppen indeholder én komponent (HBP) med Mr på 28 000. Proteinet i samme top har den i krav 4 angivne sekvens.

10 EKSEMPEL 2

Produktion af HBP fra humane blodlegemer 15 100 portioner frisk fremstillet thrombocyt-koncentrater fra sunde bloddonorer blev blandet, og thrombocyterne fracentrifugeredes ved 1700 g i 15 minutter ved 25 °C.

De centrifugerede thrombocyter blev suspenderet i 3 rum-20 fang PBS, og suspensionen blev frosset og optøet 6 gange i flydende Suspensionen blev derefter centrifugeret ved 40 000 g x 60 minutter. Supernatanter herfra blev dialyseret i 2 dage overfor 20 rumfang 10 mM phosphatpuf-fer, 0,05 M NaCl, pH 7,4. Dialysatet blev pumpet på en 5 25 cm (invendig diameter) x 10 cm Heparin-Sepharose® C1-4B kolonne med en strømningshastighed på 50 ml/h. Kolonnen blev vasket overfor samme puffer, som prøven var dialyseret overfor (puffer A), indtil der ikke elueredes mere protein. Kolonnen blev elueret med en lineær gradient fra 30 puffer A til puffer B = 10 mM phospha tpuf fer, 3 m NaCl, pH 7,4 i 20 timer med en strømningshastighed på 0,90 ml/minut. 200 fraktioner (hver på 6 minut) blev opsamlet. Fraktionerne blev undersøgt ved Microbore Reversed Phase kolonne (Aquapore Butyl 100 x 2,1 mm, 7 u Brownlee 35 Labs) med følgende gradienter:

DK 164877 B

14

Puffer A Puffer B

Tid 0,1% TFA 70% CHgCN Strømnings- 0,085% TFA hastighed 5 - 0-5 minutter 60% 40% 200 ul/min 0-40 minutter 30% 70% 200 ul/min 10 Apparatet var en Applied Biosystems 130 A analysator, og proteinet blev målt ved 214 nm. Toppe med en retentions-tid på 20 minutter blev opsamlet. Efter tørring blev prø-_ verne fortyndet i 0,1 M Tris-Cl, 1 mM EDTA 2,5% SDS,

0,01% bromphenylblåt, 5% 2-mercaptoethanol, pH 8,0. Efter 15 5 minutter ved 95 °C blev prøverne underkastet SDS-PAGE

ved hjælp af Pharmacia Phast Gel udstyr med SDS Phast Gel (8-25%) geler og SDS puffer-strimler.

Prøverne blev kørt ved 250 V og 10 mA ved 15 °C i 60 Vh 20 (13). Fraktionerne fra 70-120 udviste et bånd med = r 28 000. Disse fraktioner blev opsamlet og dialyseret med 20 rumfang puffer A. Dialysatet blev pumpet på 1 ml Heparin-Sephar o se® C1-4B kolonne, og denne blev elueret med en lineær gradient fra puffer A til puffer B i 10 timer 25 med en strømning på 0,04 ml/minut. Fraktioner på 200 ul (120) blev opsamlet.

EKSEMPEL 3 30 Fremstilling af HBP fra humant materiale

Til dette formål anvendes en human cellelinie, K562. Denne cellelinie, der oprindeligt stammer fra en kronisk myeloid leukæmipatient, kan med 12-0-tetradecanoyl phor-35 bol-14-acetat (TPA) bringes til at differentiere i mega-karyoblastisk retning, som er et forstadium til de cirkulerende blodplader. Alitalo et al., (12) har vist, at ge-

DK 164877 B

15 net for PDGF induceres i disse celler, når de behandles med TPA.

K562 celler blev dyrket i 175-cm^ Nuclonflasker i RPMI 5 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og anti biotika. Celledensiteten blev justeret svarende til "300 000 celler pr. ml, og TPA (Sigma) opløst i DMSO blev tilsat til en koncentration på 3 nM. Efter 3 døgn blev cellerne høstet ved centrifugering ved 500 x g og blev 10 dernæst vasket 1 gang i 10 volumener PBS fulgt af nedcen-trifugering.

Til 10 g celler høstet på denne måde blev tilsat 3 voluminer PBS, og suspensionen blev frosset og tøet 6 gange i 15 flydende Suspensionen blev ultracentrifugeret ved 300 000 x g i 60 minutter, og supernatanten blev dernæst fortyndet til 300 ml med 10 mM Na-phospha tpuf fer pH 7,4 indeholdende 0,5 M NaCl. Den fortyndede prøve blev pumpet på en 0,5 ml Heparin-Sepharose© C1-6B i løbet af 72 20 timer. Søjlen blev dernæst elueret med en lineær gradient over 10 timer fra påsætningspufferen (puffer A) til puffer B = 19 mM Na-phosphatpuffer pH 7,4 indeholdende 3 M NaCl og 120 fraktioner å 200 μΐ blev opsamlet.

25 4 fraktioner symmetrisk omkring 1,8 M NaCl blev hver for sig kromatograferet på Microbore Reversed Phase C4 søjle (Aguapore Butyl 30 x 2, 1 mm, 7 am, Brownlee Labs) med en lineær gradient fra 0 til 80% acetonitril over 30 minutter, tilsat 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) og en strøm-30 ningshastighed på 25 al/minut.

En proteintop med en retentionstid på 26 minutter er identisk med retentionstiden for det porcine HBP.

35

DK 164877 B

16 EKSEMPEL 4

Påvisning af angiogene egenskaber for HBP

5 Hanrotter af Wistar stammen CRL:(WI)BR med en vægt på ca.

240 g og 80 dage gamle blev anvendt. Rotterne blev akkli-miatiserede 6 dage før brugen ved 21+1 °C, 60 + 10% relativ fugtighed med et luftskifte 10 gange i timen og lys fra 06.30 til 18.30. Rotterne blev opbevaret enkeltvis i 10 plast-bure med savsmuld i bunden. De blev fodret ad libitum med Altromin diæt 1324 og havde fri adgang til drikkevand .

Rotterne blev bedøvede med pentobarbital 50 mg/kg legems-15 vægt ved intraperitoneal injektion. Rotterne blev barberet på ryggen og desinficerede. Gennem et 3 cm snit dor-salt fritlagdes venstre nyre og HBP, der i forvejen var absorberet i 10 nl Affi-Gel® Blue 100-200 mash (wet) 75-150 u Bio-Rad indtørret på et 3 x 3 mm Gelfilm® absorba-20 bel gelatine-film Upjohn, blev lagt under nyrekapslen gennem et lille indsnit. Hudsåret blev lukket med 5 silkesuturer, og postoperativt blev givet Temgesic®, 0,1 ml doseret 2 gange daglig i tre dage. Fem dage postoperativt blev rotterne påny bedøvet med pentobarbital og venstre 25 nyre blev fritlagt. Området omkring implantatet viste tydelig ny kardannelse ved makroskopisk vurdering.

EKSEMPEL 5 30 Test for angiogenese for porcin og human HBP ved anvendelse af kyllingefoster chorioallantoisk membran

Befrugtede kyllingeæg på førstedagen efter befrugtningen blev anbragt i en fugtig inkubator ved 37 °C. På dag 7 35 blev der lavet et hul i den stumpe ende af ægget ved hjælp af en 25 GS/8 0,5 x 16 nål, og dyrkningen fortsattes. På dag 8 blev der skåret et vindue på 1 cm x 1 cm

DK 164877 B

17 gennem skallen i den spidse ende af ægget, og vinduet blev dækket med en Tegaderm®-folie. Inkubationen fortsattes, og på dag 11 blev HBP (5-30 n), absorberet forud i 3 nl Affi-Gel® Blue 100-200 mesh (våd) 75-150 u Bio-Rad 5 tørret under laminær luftstrøm på en 3 x 3 mm steril Gelfile® absorberbar gelatinefolie-Upjohn, anbragt på cho-riollantoinmembran med affigelen mod membranen, og vinduet blev lukket igen med Tegaderm. Efter 5 dages dyrkning ved 37 °C blev responset bekræftet mikroskopisk.

10 Både 30 og 5 ng HBP inducerede en kraftig forøgelse af densiteten af det mikrovaskulære lag i området for affigelen med tilsyneladende regression af større beholdere og typisk capillær-kugle-dannelser (se tegningen).

15 EKSEMPEL 6

Aktivering af humane monocyter 20 Monocyter blev isoleret fra "blodovertræk" fra citratbehandlede blodprøver fra sunde bloddonorer.

Mononucleære celler blev isoleret på følgende måde: de nævnte prøver af blodovertræk blev fortyndet med 1 rum-25 fang koldt RPMI 1640 og lagret på toppen af 15 ml Ficoll-Paque i 50 ml rør af typen Falcon. Efter centrifugering ved 500 x g i 30 minutter i en roterende centrifuge blev laget mellem Ficoll-Paque og RPMI 1640-pla_sma (indeholdende mononucleære celler og blodplader) fjernet, og pla-30 derne blev fjernet ved vask tre gange (10 minutter) ved 100 x g.

De mononucleære celler blev fraktioneret på en Percoll-gradient: 10 x MEM og RPMI 1640 blev sat til en stamop-35 løsning af Percoll (vægtfylde 1,13 g/ml) for at gøre den isotonisk med en tæt vægtfylde på 1,066 g/ml. En Percoll-gradient blev dannet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 18

DK 164877 B

minutter i en Hereaus medicinsk centrifuge med en rotor, der var indstillet i en fast vinkel på 35°. På toppen af denne gradient blev de mononucleære celler aflejret og centrifugeret ved 27000 x g i 20 minutter i en centrifuge 5 af ovennævnte type. I det øvre bånd fandtes monocyterne med en renhed på mere end 90%, bestemt ved ikke-specifik esterase-farvning. Monocyterne blev dyrket ved en tæthed på 1 x 106 celler/ml i skåle med 24 brønde i RPMI 1640 indeholdende penicillin/streptomycin. Mediet indeholdt 10 mindre end 6 pg/ml endotoxin.

MRC-5 human lunge-foster-fibroblaster blev dyrket i en plade med 96 mikrobrønde i MEM med 2% FCS ved en. start- 4 tæthed på 1 x 10 celler/ml i 4 dage før testning for mi-15 togen aktivitet i monocytdyrkningsmedium. Den mitogene aktivitet i 100 ul monocyt dyrkningsmedium blev bestemt 3 ved pulsemærkning af MRX-5 celler med H-thymidin (1 uCi/ml) fra 24 til 42 timer efter tilsætning af monocyt-mediet.

20

Resultater: Når monocyter dyrkes med 5 ng HBP, iagttages en morpholo-gisk ændring efter forløbet af 1-2 dage efter inkubering.

25 Monocyterne blev aflange (fig. 4) på samme måde som monocyter dyrket med 100 ng/ml endotoxinin indeholdende 1 mg/ml BSA (bovint serumalbumin) (fig. 5). Kontrolcellerne har ikke nogen aktiveret morphologi, idet de fleste celler stadig er ensartede afrundede i formen (fig. 6). De 30 morphologiske ændringer af monocyterne iagttages særligt tydeligt, når HBP afsættes og tørres på bunden af brønden, før monocyterne tilsættes. Dette kan indikere, at immobiliseret HBP er overlegen til at aktivere monocyter i sammenligning med ikke-immobiliseret HBP.

Når dyrkningsmediet fra monocyter afprøves for mitogen aktivitet overfor MRC-5 human fibroblastre viser det sig, 35

DK 164877 B

19 at monocyter inkuberet med HBP som beskrevet ovenfor for dag 2 udskiller ca. den dobbelte mængde mitogenaktivitet, som kontrol monocyterne gør. Monocyter dyrket med 100 ng/ml LPS og 21 mg/ml BSA viser ca. 5 gange så stor mito-5 gen aktivitet som kontrol monocyter gør.

EKSEMPEL 7

Topisk HBP formulering 10 HBP blev formuleret for topisk indgift i følgende præparat:

Bestanddele Vægt-% 15 - -

Destilleret vand 92,98

Hydroxyethylcellulose 4,0

Natriumchlorid 0,41

Di-natriumhydrogen- 20 phosphat-2-hydrat 0,83

Kaliumdihydrogenphosphat 0,28

Gelatine, hydrolyseret 0,5

Benzylalkohol 1,0 25 til 10 g af ovennævnte præparat sættes 250 ng HBP.

EKSEMPEL 8

Injicerbare præparater, som er egnede til parenteral ind-30 gift for HBP-holdige stabilisatorer, salte, puffere, pre-serveringsmidler og blandinger deraf. Et simpelt præparat, der stabiliserer HBP tilfredsstillende for opretholdelse af dens biologiske aktivitet, kan injiceres subkutant, intramuskulært eller intravenøst.

35 20

DK 164877 B

Injicerbart præparat

Et præparat til parenteral indgift af HBP blev fremstillet med følgende sammensætning: 5

Bestanddele Vægt-%

Glycin 0,15

Di-natriumhydrogenphosphat 0,026 10 Natriumdihydrogenphosphat 0,026

Mannitol 0,74

Destilleret vand 100

Præparatet kan også indeholde 0,9% (v/v) benzylalkohol 15 som preserveringsmiddel. Til 1 ml af ovennævnte præparat sættes 25 ng HBP.

EKSEMPEL 9 20 Effekt af porcin HBP på sårheling på rotter efter lokal indgift i sårområdet

RESUME

25 Ved et sårhelingsforsøg blev fire grupper på 25 rotter udstyret med sårområder efter fjernelse af huden på nat-tesiden af halsen ned til den muskulære fascia i et område på ca. 15 mm.i diameter. Grupperne blev doseret lokalt med heparin-bindende protein (HBP) 12,5 ng, 2,5 ng, 0,5 30 ng eller placebo, to gange dagligt i 8 dage. En opløsning af 0,9% saltopløsning med 0,1% rottealbumin blev anvendt som placebo og som fortyndingsmedium, og alle doser blev tilført i 100 ul rumfang. På de to højeste dosisniveuaer havde HBP en signifikant accelererende effekt på sårhe-35 lingen, bedømt på basis af graden af epithelialisering.

Sårene i gruppen med den største dosis blev rigt vaskula-riseret.

DK 164877 B

21

Materialer og metoder Forsøgsdyr 5 100 hunrotter af stammen Wistar, race CRL:(W1)BR 200 g legemsvægt og 80 dage gamle. Rotterne blev indkøbt fra Charles River, BRD, og var blevet akklimatiseret i 6 dage før anvendelsen ved 21 + 1 °C, 60 + 10% relativ fugtighed, luftudskiftning 10 gange pr. time og dagslys fra 10 klokken 06.30 til 18.30. Rotterne blev holdt enkeltvis i rektangulære plastbure af typen Orth med træbedding. De blev fodret ad libitum med Altromin diæt 1324 og havde fri adgang til drikkevand.

15 Drift

Rotterne blev anesthetiseret med pentobarbital, 50 mg/kg legemsvægt intraperitonealt. De blev barberet i nakkeskindet, og operationsstedet, 50 mm i diameter, blev vas-20 ket, desinficeret og strippet med klæbemiddel til at fjerne små partikler og hår. Sårområder bestående af en indre plastring og et nylonnet i klæbemiddel blev smurt på huden. Den indre diameter af sårområdet var 16 mm, og den totale diameter var 45 mm. Nylonnettet blev yderlige-25 re fikseret på huden med 12 silkesuturer, og huden inden for den indre plastring blev fjernet ned til det muskulære fascia. Sårene blev dækket med polyurethan-skiver, lagt på sårområdet med zinkpasta.

30 Efter operationen fik rotterne Temgesic®, 0,1 ml doser to gange daglig i 3 dage.

Dosering 35 pHBP blev indgivet to gange daglig i 100 m1 rumfang 0,9%

NaCl-opløsning med 0,1% rottealbumin (Sigma Δ4538). Opløsningsmediet blev anvendt som placebo.

DK 164877 B

22

Rotterne blev efter operationen fordelt tilfældigt i fire grupper med 25 rotter, der blev doseret som angivet i det efterfølgende, første gang på operationsdagen (dag 1) og to gange på dag 2-8: 5

Gruppe I: 12,5 ng pHBP

Gruppe II: 0,5 ng pHBP

Gruppe III: 2,5 ng pHBP

Gruppe IV: Placebo 10

Doserne blev indgivet lokalt netop under sårkammerlågene. Kanyler blev indført gennem lågene af polyurethan.

Iagttagelser 15

Rotterne blev vejet på dag 1, 3, 5, 7 og 9. På dag 9 blev sårkamrene fjernet under pentobarbital anæsthesi. Sårene blev undersøgt makroskopisk og fotograferet. Arealerne af og omkring operationsstedet blev dissekeret og fikseret 20 på phosphatpufret neutral 4% formaldehyd for senere histologisk undersøgelse. Til slut blev rotterne slagtet ved åreladning fra underlivsaorta. Der blev udtaget blodprøver til serum for IGF-I, PIIINP og hyaluronsyreanalyser.

25 Resultater

Tabel I viser den gennemsnitlige legemsvægt for de fire grupper af rotter. Alle rotterne led efter operationen et vægttab, idet den laveste vægt blev målt på dag 5. Ingen 30 væsentlig forskel i legemsvægt mellem de forskellige grupper blev iagttaget.

Som resultat af den makroskopiske undersøgelse af sårene blev arealerne af sårene og arealerne dækket med nyt 35 epithelium på dag 9 beregnet på følgende måde: De to diametre blev målt, cranialt-caudalt og fra venstre til højre, og middeldiameteren (D tal) blev anvendt til be- 23 regning af det totale sårareal: //^Dtotal^\ 5 I -1 x 3,14 = totalt areal

V ϊ J

Det nydannede epithelium blev målt fra kanterne de to steder, hvor det var henholdsvis bredest og snævrest. De 10 to resultater blev adderet og substraheret fra fra det åbne sår.

Arealet for det åbne sår blev beregnet efter følgende ligning:

15 /X

AåbenM2 -1 x 3,14 vy 20 og substraheret fra det totale areal til opnåelse af arealet dækket med nyt epithelium. Dette areal blev yderligere beregnet som procent af det totale areal. På tre rotter doseret med 12,5 ng x 2 HBP blev iagttaget den sædvanlige dannelse af epithelialiseret halvøer i det 25 åbne sårareal.

Resultaterne af målingerne og de beregnede arealer er vist i vedlagte rapport. En oversigt af, resultaterne fremgår af tabel II.

30 På mange af rotterne doseret med de højeste doser af HBP (12,5 ng) blev iagttaget en rød blodig zone netop inden for epithelkanten, og det totale sårområde viste sig stærkt vaskulariseret. En væsentlig højere grad af epi-35 thelialisering blev iagttaget for denne dosisgruppe og for middeldosisgruppen (2,5 ng). Det totale sårareal fra de forskellige var ikke væsentligt forskellige fra area-

DK 164877 B

24 let af placebogruppen.

Efter at de fibrin-dækkede sår var fjernet sammen med det meste af sårkammerlågene, blev låg plus fibrin fikseret 5 sammen med vævet for histologi.

Konklusion På basis af den makroskopiske undersøgelse af sårene kan 10 det konkluderes, at HBP, 12,5 og 2,5 ng indgivet to gange dagligt, accelererer sårhelingen betydeligt, bedømt ud fra graden af epithelialisering. Den højeste grad af vas-kularisering af sårene for brud med den største dosis skyldes den angiogene effekt af HBP.

15 20 25 30 35 25 Sårheling på rotter

TABEL I

5 Middellegemsvægt af gruppen af hunrotter med sårkamre doseret med pHBP eller placebo. Rotter blev opereret på dag 1.

Legemsvægt, g middel + S.E.M.

Præparation Antal -i—— - τ ·"- og dosis rotter Dag 1 Dag 3 Dag 5 Dag 7 Dag 9 pHBP, 12,5 ng 23 249 240 233 238 242 to gange daglig +3 +3 +3 +3 +3 pHBP, 0,5 ng 24 245 238 228 234 239 15 to gange daglig +2 +2 +2 +2 +3 pHBP, 2,5 ng 24 245 243 232 237 240 to gange daglig +2 +3 +3 +3 +3

Placebo (0,9% 23 245 240 228 233 241 saltopløsning med +2 +2 +2 +2 +2 0,1% rottealbumin 25 30 35

DK 164877 B

26 Sårheling på rotter

TABEL· II

5 Makroskopiske data opnået med pHBP

Epitheliaseret Dosis af Totalt sårareal pHBP ind- areal % totalt givet to (mm2) mm2 areal gange middel middel middel 1q Forsøg Placebo daglig +S.E.M. +S.E.M. +S.E.M.

0,9% salt- 12,5 ng 118,3 52,2* 46,3** vand med 6,3 4,1 3,6 VII 0,1% rotte----- albumin 2,5 ng 144,3 53,3* 39,6 7,8 4,2 3,0 15 0,5 ng 130,2 44,5 35,8 7,4 3,8 3,1 125,1 38,5 31,6 (Placebo) 6,2 4,2 3,4 20 25 30 35

SÅRHELING VII_ Gruppe I

27

Epitheliaseret sårareal 5 Sårareal Åbent sår- % af to- (total) mm^ areal mm^ talt areal 1 132.73 92.10 40.63 30.61 2 165.13 103.87 61.26 37.10 10 3 143.14 61.88 81.26 56.77 4 153.94 50.27 103.67 67.35 5 86.59 33.18 53.41- 61.68 6 165.13 122.72 42.41 25.68 15 7 ^ 8 153.94 86.59 67.35 43.75 9 95.03 50.27 44.76 47.10 10 95.03 44.18 50.85 53.51 11 113.10 70.88 42.22 37.33 20 12 78.54 50.27 28.27 35.99 13 143.14 122.72 20.42 14.27 14 78.54 28.27 50.27 64.01 15 132.73 103.87 28.86 21.74 16 122.72 95.03 27.69. 22.56 25 - 17 122.72 63.62 59.10 48.16 18 95.03 28.27 66.76 70.25 19 103.87 40.18 63.69 ‘ 61.32 20 56.75 12.57 44.18 77.85 30 21 143.14 103.87 39.27 27.44 22 95.03 50.27 44.76 47.10 23 Død 24 113.10 50.27 62.83 55.55 25 132.73 56.75 75.98 57.24 35 =- X 118.34 52.17* 46.24** S.E.M. 6.26 4.05 3.63

SÅRHELING VII _Gruppe I

28

DK 164877 B

Epitheliaseret sårareal 5 Sårareal Åbent sår- % af to- 2 2 2 (total) mm areal mm mm talt areal 26 201.06 165.13 35.93 17.87 27 132.73 86.59 46.14 34.76 3.0 ^- 28 113.10 86.59 26.51 23.44 29 188.69 113.10 75.59 40.06 30 132.73 95.03 37.70 28.40 31 103.87 70.88 32.99 31.76 15 32 143.14 70.88 72.26 50.48 33 103.87 44.18 59.69 57.47 34 122.72 50.27 72.45 59.04 35 50.27 28.27 22.00 43.76 36 132.73 65.75 75.98 57.24 20 - 37 103.87 78.54 25.33 24.39 38 95.03 56.75 38.28 40.28 39 95.03 63.62 31.41 33.05 40 86.59 28.27 58.32 67.35 25 41 153.94 113.10 40.84 26.53 42 113.10 70.88 42.22 37.33 43 176.71 153.94 22.77 12.89 44 103.87 86.59 17.28 " 16.64 45 143.14 78.54 64.60 45.13 - 46 143.14 95.03 48.11 33.61 47 143.14 103.87 39.27 27.44 48 Død 49 153.94 95.03 58.91 38.27 __ 50 188.69 165.13 23.56 12.49 OD ______ X 130.21 44.51 35.82 S.E.M. 7.37 3.79 3.06

SÅRHELING VII_Gruppe I

29

DK 164877 B

Epitheliaseret sårareal 5 Sårareal Åbent sår- % af to- 2 2 2 (total) mm areal mm mm talt areal 51 132.73 95.C3 37.70 28.40 52 63.62 44.18 19.44 30.56 10 53 201.06 122.72 78.34 38.96 54 132.73 56.75 75.98 57.24 55 103.87 44.18 59.69 57.47 56 153.94 70.88 63.06 53.96 57 165.13 70.88 94.75 57.08 15 - 58 153.94 78.54 75.40 48.98 59 132.73 78.54 54.19 40.83 60 86.59 38.48 48.11 55.56 61 113.10 50.27 62.83 55.55 20 62 226.98 188.69 38.29 16.87 63 122.72 78.54 44.18 36.00 64 132.73 113.10 19.63 14.79 65 122.72 70.88 51.84 42.24 66 176.71 143.14 33.57 19.00 25 - 67 153.94 78.54 75.40 48.98 68 153.94 95.03 58.91 38.27 69 201.06 132.73 68.33 - 33.98 70 113.10 63.62 49.48 43.75 30 71 176.71 153.94 22.77 12.89 72 176.71 132.73 43.98 24.98 73 113.10 78.54 34.56 30.56 74 Død 75 153.94 103.87 50.07 32.53 35 -- X 144.33 53.33* 39.56 S.E.M. 7.75 4.20 3.03

SÅRHELING VII_Gruppe I

30

DK 164877 B

Epitheliaseret sårareal 5 Sårareal Åbent sår- % af to- 2 2 2 ! (total) mm areal mm mm talt areal 76 Død 77 103.87 70.88 32.99 31.76 20 78 95.03 56.75 38.28 40.28 79 95.03 38.48 56.55 59.51 80 70.88 50.27 70.61 29.08 81 132.73 56.75 75.98 57.24 82 86.59 63.62 22.97 26.53 15 - 83 113.10 95.03 18.07 15.98 84 176.71 153.94 22.77 12.89 85 113.10 78.54 34.56 30.56 86 Død 20 87 113.10 63.62 49.48 43.75 88 122.72 44.18 78.54 64.00 89 132.72 63.52 69.11 52.07 • 90 103.87 70.88 32.99 31.76 91 153.94 132.73 21.21 13.78 25 92 153.94 113.10 40.84 .26.53 93 153.94 132.73 21.21 13.78 94 113.10 95.03 18.07 _ 15.98 95 176.71 153.94 22.77 12.89 3Q 96 113.10 95.03 18.07 15.98 97 153.94 78.54 75.40 48.98 98 132.73 103.87 28.86 21.74 99 176.71 132.73 43.98 24.89 100 113.10 70.88 42.22 37.33 35 X 126.12 38.50 31.62 S.E.M. 6.20 4.19 3.37 g i i l : C y» E x ti

C

C· X I ^ ί-j i· i ®CDC—τιηιηιηιηιηιηιηιη U"i ιΛνΛ ^ jr (N ri W O Ό (N OCOf^CT'COrMvOr-.r-.C^VDr'-Trr-iCO ææ £ | _ Π Π Π — ri r-

Q) CT

-O

-=t t 'b 3- in tn in tn tn tn ιλ in in m »r> ( ··*····* * 4- ) OJ O ri rH —I r-ι O Ο-ΐΟΟΟΟΠΟΟΟπίΜΟ-ΐΠ ΟΠ

C

CD

_Y

E

D

o ·~< 2 %

H X

DJ f.

Cd -n m tn m •3 Q . · ^ ,j LJ riorJrotnntN <-η(Ν<-ηη·ιπο<~Ίπι-<Γηυ·Γ4'3·π0Μ trn CO < > ω tf co H in t n t n t n tn tn tn ιΛ in t n 04 *··· · *···· O Ιχ π'τη-^-Ο'τ irririfNjomomnjnJnricomri mm ri ri ri ri ri ri rlrlrlrlrl^rlrlr^rlrlrl rit-· rlrl

CO

O

Di bi < 2

1 E

E

^ rvirrOJ-^OT o-nCTtOO'TOmmrvjO.-.ON-c-n <vjm 2 . Os) ri Π ri n ri ri Π ri ^Irlr-rlrlrlrlrlr- ΠΠ ,-Π

g I

H 0

Bi I

M CC

&< £ co Ϊ: 2 »c ω tn DJ c ^ tr - tn ^„.mtrOrnonirvjrncMnjcor'ir- ™ |2 CO n ~ -4 ~ ^ ^ ^

U

.øl I

i c c!

o }r\j /-. i/-, VJ2) f "· CO O'1 o — '“’M

C _ η, n <r O', ol n ro σ' — n| —! — —i n| —I —I — I - η.· γμ| n. nil m ml cr

DK 164877 B

£ *cr- c w n.*

C νΠ ιΑ iA tA lA lA in lA tA ιΛ <A lA

C£... . e .

CT ^ O O AJ ·—•O'iTvr^COXOCOOCOO'vDrsiON^OO·-^·—i —t ^3* n r*l i*^ *—H ^ p—H p~H »H M ^ «—-* »—« p—* <c T; "e

E

w m m tn tn tn«n in in tn in tn »n in in in -U fsj · ·· · ·· ·*··*·* c o^oo^orsicvioonjooonioooor-ioo o o co ε

D

•r4 I—;

X

O £ 2 *-

Lj α id m in m inmtninin in K I t t · · · * * · · · · · W ^>-·>-4(η^^-ιοιοι^τ·-<η]^ηι·-ΐ(Ν^Η(Νθ·-ιηΐΓν) θΜ m o

D

μ3 CO < > ω rjS in m in in in in tn tnminm in

Ise - .... - · .... .

JP ionfNino»-im^-tfMeeo^-i^H^O'3’f'Jin-Hmrnn -o· in

r*H ·—H iH »H ^ rM »H r—H ^ »H ρΉ rH r-H iH r“H

O

«

CO

O

PS

« < — s; ε *· ε * ^ u3srr\iinmcMm<M—<como·—ir\jcr*-'roJinrMc\]mm min

r«l ^ M ^ pH fH r-H fH r-H ^4 pH p4 pH pH p*H pH pH iH pH rH *-H

E-ι ω 2 Iri ω g

2 I

H -PH

a τ ω J: α. £ co « ω _ iDrMiMvDmrvj'rm^-aDmm^onJ-rnJin^-in'r's· mus Κ mm — ,-..-. — p- —· - — — <

CO

= 1

CJ O

H_> O \£3r-cocrvO<—^AiroHrLntOr-coo'vO-— cvr-iTr<ntor*-cDO'0 fy (M rsj (\ r\J i*A r-ι r-> r-i <—i ro <Ά <~Λ -«y -y <χ | «=- -r· -5* «5· -er V «Α £ u i.

•ro c Λ "7' in m m m m m m uiin ?, I „.r-^cocor-oiiJ'OOr-oomocMCTimo.-'rnonirmO —' ^-t ^- — ---1-1 —I r-t —· —·

«C X

1= 3 m in m in in in in mm m ψ · I * · * · * * * *-> oj _io«-<.-««-i»-<*-<oooo©oooor>irH«-i»-400i o

CO

X.

ε •f-1 o ai 2 x mmmm mm U Q # · · * · H ui r-i^-irnmnjm'3-mfnfn'=-^-icM»-'rn>-'CNCM<NrJO^-< I r>»

D

(0 J

{0 < >

M

^ mm m mm tT1 lx mcniDm^T'T-'Tmonjr-njmfsimrr'TmoJmmcJ -«a· 0J 1 ^ — .—1 .—I .—1 .—1 —1 —r —( .—1 ·—I ·—1 —' ·—I ·—1 <—I —I ·—< <—' >—> ·—' —1 ·”· 0 £

CO

O

£ £ < v

** E

1 -— mcr.'-ocN^-<'T'rmmoo^r~cNi'r'-im-^-inmrMm'c-nj r-> -, r-H ,—· ·—I *—I »—I r—« *—I ^-· ·—I ·—« «—I«—1^*.—1.-1,-1.-1.-1.-1 ·—>

£h c* t>J

2 “ S "ω S e

H CC

n< *«-i

Id -c (¾ i?

7? OCT

CO in £ W ^c-,vD'rcNirmmm»-<rMr^m<Mirm'c-miorsimvonj m --, ,—< ,—I,—(,—(,—(,—,,—(,—I.—I .—1 r—t r-~* ·—' «—< ·—' ·—(--,, ' ' < ,—< ’ ‘ £ ~ ·<

CO

-c

c E

c C

^1f\ii~i^rmiDr^cociO—<njm'«,mion'COcno—'njm ·<τ| m q minmminmminm\£>\DiOio\oi£>\øvDiDiDr'-r~r--r--r-~lr~ C£

DK 164877 B

E

£ DC C*

Ui ø ιΠ ιΓι in m in tn in C £ · - ø ct o\cor-“cocoo%«--CTsr-crvo^rnrsjmrw-^rr-Ho^fn^

-Q ,f“ fH rH r-H «Η «-^ <—I r-H r—H » 4 rM rH

< X

E

E

— t n m in in m in m in in £ ooojohoooo h<m—·οοοοοο—<·-ιοοο co

E

3

*H

O 1 2 ΰ m in m m m 05 ^ * - · .

Cd *-· c4 <N c*4 r-* m ·—i i o m CM rnoo'j.-iC'JO.-iOHm.-i.-icvj * 3 00 < > ω m tn in in m CO · · · · ·

Jr1 |x .-4.-Ir-I0l01004ino4 0404η^4^·^Γ^Γ04ΐηη·<3·ηΐηθ4 W »H ^ rM rM iH rH rH rH rH rH ^ »H H ^ rH rH rH rH »H r^

O

hi

CO

0 05 hi < _

2 E

E

1 ^ fsJr-«<Nc>n^^Hinoj r-crnr^r-irTTrHrovDrn^roofn

r, <N rH rH rH *—I rH rH *H rH rH rH rH rH Η rH rH rH rH *H rH rH

2 “

Cd v g i S £ ω u 0< ·πΓ· CO ^ hi

Cd ^i^oonojoitniM < ) θ\· r") rsj rr" *^r .r· n <—1 -C ·—'

+—· r-t rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH H r-H ·—< t—i r-H *H «Η r“H rH *—< «—( rH

os ·< co *- *C “C '

C c Q

G Q

Oi

jJ O

OP'-CDC'O—•«rsjr-i'C’LnOr-'-COCr'O^HrMrn-crLnor'-COCr'O

o r-r^r-r-COCOCOCOCOCOCDCOCOCO<7'C^Cr>OOOOCr\ ol O r— 35

DK 164877 B

Histologisk bedømmelse Materialer: 5 En 5 win tyk skive skæres ud i centrum (craniocaudal) fra de i paraffin indstøbte sår.

Skiven blev farvet i hematoxylin-cosin og bedømt i et lysmikroskop.

10

Resultater;

Som resultat af den mikroskopiske undersøgelse af sårene blev det nye epithelium på dag 9 beregnet på følgende 15 måde;

Diameteren af det totale sår blev målt, og diameteren af det åbne sår blev målt og fratrukket; 20 Totalt sår - Åbent sår - = nyt epithelium 2

En vurderingsskala blev anvendt for at kombinere en kvan-25 titativ og en kvalitativ histologisk bedømmelse af sårheling på rotter; revaluering Højde af 30 Nyt epithe- +/af granule- ♦ Kampe I * granule- ♦ Evaluering lium (mm) I tionsvev celler tionsvev af epithe- \^(0--4) (0--4 )J (mm) lium (0--4) Vurde- = rings- 4 tal

Arealerne af sårene og arealerne dækket med nyt epithelium på dag 9 blev beregnet på følgende måde: 35 36

DK 164877 B

/" Y

Totalt areal = / -- x 3,14 v 2 / 5 Nyt epithelium-areal = f åben sårdiameter \ ^

Totalt areal = I 1 x 3,14

V 1 J

Og det nye epitheliumareal blev yderligere beregnet som procent af det totale areal.

Resultaterne af målingerne og de beregnede vurderingstal 15 og arealer er vist i tabellerne.

Konklusion På basis af den mikroskopiske undersøgelse af sårene og 20 evalueringen af dataene i vurderingsskalaen kan det konkluderes, at p-HBP i dosisstørrelser på 12,5 ng og 0,5 ng har en effekt på sårhelingen.

Effekten fremgår af granulationsvævet, som er stort i 25 gruppe 1 og 2 ved doser på 12,5 ng og 0,5 ng pHBP (tabel II). I gruppe 1, dosis 12,5 ng pHBP er granulationsvævet mere modent i sammenligning med placebogruppen (tabel II). Af arealberegningerne fremgår det, at graden af epi-theliasering ikke viser nogen signifikant forskel mellem 30 grupperne.

35 37

DK 164877 B

Sårhelingseksperiment VII TABEL I

5 -

Vurderingsskala Gruppe Middel + S.E.M.

12,5 ng 2,53*** p-HBP 0,06 10 “ 0,5 ng 2,35* p-HBP 0,07 3 0,5 ng 2,26 p-HBP 0,07 15 - 4

Placebo 2,10 0,09 *** p *0,001 niveau for signifikant forskel fra placebo ** p *<0,01 20 * p o;o5 25 30 35

DK 164877 B

co

C

O

•H *K * tj | ^ ^ ^ ^ CO(Og VO Μ* H IS Ώ CM OO H 00 ΟΌΝ

HE CM in H H in H CO VD H N in H

Q) ^ N-^ o. V \ *. V V S K K V.WW

Ό d CM O O CM O O HOO HOO

n <d > ©· M ffi X O) > Ο) I ^ C Q)M<

•H A I

μ -μ o (UH'-' ooo ooo ooo ooo sa ooo ooo ooo ooo

l“l (D E V W h ^ V ^ ^ V < V V

id 3 M< O O 'ΨΟΟ m< o o m< o o >Ή·Η H IDH H H

μ J I c ω <d (0 -—' oo co co ό cm m oo co oo oo m< co

CQ A X E IS H CM Ml CM CM 00 H CM CO 00 CM

A EE » » » >. v s \ ^ » » S

Eh H 3 W CM h o cm h o cmho cm h o o an xj ω h o) o id

00 U H

co o) cd 4: * a

QH M* CO 00 00 CO lD CM 00 CO lD CTi O H

E H » M< O CM in O CM CD CM cm co m CO 3 fQ Q) O ». s «« s s s k < s s s ^

tsi O ·—· OHO OHO OHO HHO <H

H

. 0)

I > X

(d ffi "" * CQ

H > M· (OHM1 00 O O 00 OO O is O μ 3 CQ i os cm o in m h iocfH s m< h o C C O SV» vvs vvs vvs m

H Id CM O O CM o O CM O o CM Ο O

H k -ri μ > o -μ c (d +> x d μ * ·η

0) d ^ CM O'CD CO 00 CO CD CM O' ID O' <W

E 0) μ E in Η M1 CO 00 Ml LOOM1 COCOCO -ri *H «Q ®(0 S k k «* »***.*. *.vv »»KV ¢5 μ ·< CQ CD CM O CD CM O CD CM O in Η O O)

CD H

a cq

CQ

x μ Ο) H * * 0 CQ 10 ^ COHO CO CO 00 CO H CO CM in IS Ή ο μ μ E cm σ> m· cococo cohm1 cm co cm

fi 0 ®(d E s V V V V V V V V V V V D

•H E-< CO '— O' Η ο O' Η O CO CM O COHO (d Η φ Φ >

A H

μ 2 2 2 s c id Όω τ)ω -d κι ό ω

CO X CO CO X CO CO X CO CO X CO CO H

ο h in ooo a a a o » » » 0)3 d d xi ooo a a a a cu tty a mm mm mm o 3 -æ 'S id aaa

μ CM I O I Ο I H

ο η h a cm aco a m* a * * * K * ____*

Claims (10)

1 S 10 IS ^ Ile-Vil-Cly-Cly-Arg-t.ys-Al*-AC9-Pto-Ar9-Cln-Phc-I’co-Phe-Lc«-Al'»-S«r-!le-Cln-Asn il 2S 30 3: _ Cln-i:ly-Acg-His-Phe-Cys-Cly-Gly-Ali-Lcu-Hc-His-Aia-Ar9-Ph«-Vat-:*ei--‘"r-,'‘*-*-l* 10 ,-1 <1 <5 SO S» Scc-Cys-Ph«-Gln-Scf-Cln-Asn-Pco-Gly-V*l-Sec-Tht-val-val-L<w-Cly—'l«--yr-Asp-w«t. 61 6S 70 75 ®° Acg-Acg-Arg-Giu-Arg-Gln-Sef-Acg-Gln-Thr-Phe-Sec-I le-Ser-Ser-r.et-S«c-Glu-Asn-Gly ZED 15 61 85 90 9S # \ Tyc-ASp-PCo-Gln-Gln-Asn-Leo-Asn-Asp-L«u-Hec-Lcu-I.eu-Gln-t-eiJ-Asp-«r?-Glu-nla-Asx CHO CHO 101 \ 105 110 \ 11» . , . Leu-Thc-Set-Asx-Vai-Th£-Ile-I.eu-Pco-Leu-Pro-Leu-Gln-As*-Ala-Thc-vai-Gio-«ia-Giy· 50 121 125 130 135 l<° W Thr-Acg-Cys-Gln-val-Ala-Gly-Tcp-Gly-Sec-Gln-Arg-S«r-Gly-Gly-Arg-t.cu-Ser-Arg-Pne ._1 CKO 1 " 1 Kl \ ISO 1 i»s , , I Pco-Ar$-Phc-Val-Asx-Val-7hr-Val-Thr-Pro-Glu-Asp-Gln-Cys-At:<j-Pco-Asn~Asn-Vai-Cys 161 16S ' 170 175 180

25 Thr-Glv-Val-Leu-Thf-Arg-Arc-Gly-Gly-Ile-Cys-Asn-Glv-Asp-Cly-Cly-Thf-Pro-Leu-Val u i_:_. 185 190 195 | 30° Cys-Glu-Gly-Leu-Ala-Hls-Gly-Val-Ala-Ser-Phe-Scc-Leu-Gly-Pf o-Cys-Cly-Arg-Gly-Pro 201 205 210 · 21S 320 øø Asp-Phc-Phe-Thr-Arg-val-Aia-Leu-Phe-Arg-Asp-Tf p-1 l«-Asp-Cly-v*l - U«u-Asn-Asn-?ro 221 222 223 c i y-Xxx-Xx>: hvor X222 er Pro eller fraværende, og X223 er Gly eller fraværende. 35 DK 164877 B

1 S 10 IS 20 Z lo-Val-Cly-Cly-Acg-Arq-Ala-Glft-Pro-Cln-Glu-Phe-Pro-Fhe-Lcu-Ala-Sec-Ile—Gln-Lys- 15 U 2S 30 35 <0 Cln-Gly-Arg-Pro-Phe-Cys-Als-Gly-Als-Leu-val-Hi s-Pro-Afg-Phe-v*l-L«u-Thc-Ala-Al*- <1 <S SO SS 60 Scc-Cys-Phe-Arg-Gly-Lys-Asn-Sec-Gly-Ser-Ala-Se c-Vil-VAl-Leu-Gly-Ala-Tyr-Asp-Leu- 20 61 65 70 7S 80 Arg-Gln-Gln-Clu-Cln-Scr-Arg-Gln-Thr-Phc-Ser-Ile-Arg-Ser-Uc-$cc-Cln-Asn-Cly-Tyr- fil 85 SO SS 100 Asp-Pro-Arg-Gln-Asn-L«u-Asn-Asp-v*l-Lcu-L«u-Leu-Gln-Leu-ASp-Afg-Clu-Al*-Atg-Leu-

25 CKO 101 10S 110 \ 115 _ 120 TZir-Pfo-Se r-v* 1-Ala-Leu-Va 1-Pro-L«u-Pco-Pco-C ln-As »:-Ala—Th r-val—GIu-λΙλ -GI y-Thc- 121 125 130 13S KO Asn-Cys-Cln-Val-Ala-Gly-Trp-Gly-Thr-Gln-Acg-Lcu-Acg-Acg-Leu-Phe-Sec-Acg-Phc-Pco- __I * ______ i Hl \ KS ISO [ 1SS "" i 16° i Arq-vai-Lcu-Asx-Val-Thr-V4l-Thi-Ser-Asn-Fro-CyS-L«u-Pro-Arg-Asp-nec-Cyi-llc-G3y- 161 1GS 170 i^S " j *80 v^l-PSic-Se r-Arq-Arq-Cl y-Arq-11 e-Se r-Gln-Cl y-Asp-Arq-Gl v-Tii r-P co-Leu-''* 1-Cys-Asn- 35 161 165 190 19 S 200 Gly-Lcu-Ala-Cln-Cly-Va 1-Al i-Sc r-Phc-Lcu-Arq-Ar q-Ar q-Phe-Arq-Arq-Ser Set Cly Fhe 701 70S 210 KS 21? ri.c-Tlir-Arq-Val-A 1 a-Lcu-?!>c-a t q - Asn-T f p-1 1 c-Atp-Se i - v.«. 1 - Lcu - A 5 η-Λ *n Pro ro DK 164877 B

1. Heparin-bindende protein (HBP) af højere mammal type, 5 som i glycosyleret tilstand har en tilsyneladende molvægt på ca. 28 kDa, bestemt ved SDS-PAGE under reducerende betingelser, og udviser angiogene egenskaber in vivo, samt er kemotaktisk for monocyter.

2. Heparin-bindende protein ifølge krav 1, og af den por cine type, kendetegnet ved, at det har amino-syresekvensen:

3. Heparin-bindende protein ifølge krav 1, og af den humane type, kendetegnet ved, at det har amino-syresekvensen: 5

4. Terapeutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk aktiv mængde af det hepa-rin-bindende protein af porcin-typen ifølge krav 2.

5. Terapeutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk aktiv mængde af det hepa-rin-bindende protein af den humane type ifølge krav 3.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af de heparin-bindende 10 proteiner ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at thrombocyter ekstraheres, og at ekstrakten oprenses ved kromatografi på heparin-Sepharose og Reversed Phase HPLC til isolation af det heparin-bindende protein,

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at påsætningen af celleekstrakten på Heparin-sepha-rosen udføres i 0,5 molær NaCl-opløsning indstillet på en pH-værdi på 7,2-7,6, fortrinsvis 7,4.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et heparin-bindende protein ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at der anvendes biosyntetisk rekombinant teknik.

9. DNA-sekvens til kodning for det heparin-bindende pro tein til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 8.

10. cDNA, der koder for det heparin-bindende protein ifølge ethvert af kravene 1-3. 30 35