DK164884B - Fremgangsmaade til fremstilling af mikrobielle proteiner, som er opnaaet ud fra chlamydia trachomatis, til immunobestemmelse - Google Patents

Description

DK 164884 B

i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af mikrobielle proteiner, som er opnået ud fra Chamy-dia trachomatis, til immunobestemme1 se. Mere specielt angår opfindelsen brugen af detergenter til solubiliser ing af pro-5 tein for at udtrykke proteinets antigene egenskaber uden at ø-delægge evnen til at påvise proteinantigenet i en immunobe-stemmelse.

Detergenter har længe været kendt som reagenser til solubili-10 sering af mange biokemiske stoffer, især mikrobielle proteiner og proteinkomplekser. Denne evne er nyttig til frigørelse eller eksponering af antigener i proteinerne, som derefter kan påvises ved immunobestemmelsesteknik. Uheldigvis hæmmer detergent i en antigenopløsning immunobestemmelse ved at for-15 hindre bindingen af antigenet til et immobiliseret antistof i fast fase. Hidtil har der ikke eksisteret nogen praktisk billig metode til at eliminere denne skadelige virkning af detergent på immunobestemmelse. Simpel fortynding af prøven er utilfredsstillende. For eksempel, hvis immunobestemmelsesprøven 20 fortyndes efter opløseliggørelse, således at koncentrationen af detergent ikke længere påvirker bestemmelsesproceduren,-resulterer den ledsagende reduktion i antigenkoncentration i et antigenniveau, som er under bestemmelsens tærskelværdi for følsomhed. Forøgelse af den oprindelige koncentration af 25 antigen i immunobestemmelsesprøven, således at koncentrationen af antigen efter fortynding er over følsomhedstærskel-værdien, er som regel ikke praktisk, da prøveeksemplerne ofte nødvendigvis er små. Der er således et behov for en metode til detergentso 1 ubi 1 iser ing af proteiner, der ikke samtidig hæmmer 30 immunobestemme1 sesprocedurerne.

En særlig anvendelse, hvor detergenter kan bruges med godt resultat, er til solubi lisering af det vigtigste ydre membranprotein på Chlamydia trachomatis. Denne mikrooranisme er en af 35 de to arter af slægten Chlamydiaceae, ordenen Chlamydiales.

Den anden art er Chlamydia psittaci. Chlamydia trachomatis i dens ca. 15 forskellige stammer er det ætiologiske middel 2

DK 164884 B

for en række humane okulare og genitale sygdomme, herunder trachoma, inklusions-conjunctivitis, lymphogranuloma venereum, "uspecifik" eller ikke-gonokokkal urethritis og proctitis.

C.trachomatis-infektion har en tendens til at sprede sig gen-5 nem hele befolkningen. Det er f.eks. blevet anslået, at C.trachomatis er ansvarlig for flere millioner tilfælde årligt af ikke-gonokokkal urethritis.

Da C.trachomatis-formidlede sygdomme er vidt udbredt, er en 10 pålidelig, enkel og billig prøve for organismens tilstedeværelse meget ønskelig og af stor betydning, for at der kan foretages passende behandling. Den eneste serologiske test, der for tiden anvendes, er mikroimmunofluorescens-testen. Denne test kræver imidlertid, at stammerne af C.trachomatis anvendes som 15 serologisk test-antigen. Faciliteterne til udførelse af denne test er endvidere kun til rådighed i et begrænset antal laboratorier i verden. Testen er meget besværlig, tidsrøvende og vanskelig at udføre.

20 Fra Analytical Biochemistry, bind 100 (1979), side 64 - 69, kendes solubi1isering af uopløseligt protein i en natriumdode-cylsulfatopløsning, hvorefter overskud af natriumdodecylsulfat udfældes ved hjælp af et kaliumsalt. Da natriumdodecylsulfat generer farvestofbindende proteinanalytiske prøver, såsom 25 Bradford-proceduren, skal det overskydende natriumdodecylsulfat fjernes med henblik på opnåelse af maksimal følsomhed ved en proteinanalyse, som benytter farvestofbinding.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tager ikke 30 specielt sigte på anvendelse af kaliumsalte til udfældning af natriumdodecylsulfat, men giver mulighed for at anvende flere andre metaller i forbindelse med flere andre anioniske detergenter end natriumdodecylsulfat. Herved kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles mikrobielle proteiner, 35 der kan benyttes til immunobestemmelse eller immunoanalyse, hvilket kræver, at de fra mikroorganismer sol ubi 1 i serede antigener kommer til at foreligge i en immunokemisk bevaret form, hvori de kan genkendes af antistoffer, som er rettet mod dem.

3

DK 164884B

Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 5S.624 kendes anvendelsen af natriumdodesylsulfat og natriumdodecylsulfatlignende detergenter til solubilisering af Chlamydia-proteinantigener efterfulgt af frask i 11 el se af de sol ubi 1 i serede proteiner fra over-5 skud fra natriumdodesylsulfat ved anvendelse af hydroxyapatit-kromatograf i.

I modsætning hertil benytter fremgangsmåden ifølge opfindelsen en anderledes fraskil.lelse af detergenten, ved hvilken over-10 skud af detergent udfældes på simpel vis ved hjælp af kationer.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandles prøven forud for udførelse af en immunobestemme1 se, og den er særlig nyttig 15 til fremstilling af mikrobielle celleproteinprøver, såsom prøver af det vigtigste ydre membranprotein af Chlamydia trachomatis. Det har vist sig, at dette særlige protein er et artsspecifikt antigen, og at det derfor er nyttigt til en immuno-bestemmelse for tilstedeværelse af organismen i et inficeret 20 individ.

Før celleproteiner af organismer, såsom C.trachomatis, kan anvendes til en inmmnobestemmeIse, må cellevæggen indeholdende proteinet ændres, således at et passende antistof kan genkende 25 proteinet. Behandling med en detergent har vist sig effektiv til dette formål. Af særlig værdi til celleprotein-opløselig-gørelse er salte af den ikke-ioniske detergent laurylsulfat.

For at forhindre, at detergenten generer den senere udførelse af immunobestemmeise, går fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud på, at der er alkali- eller jordalkalimetal-ion i detergentopløsningen. Ved høje temperaturer er detergent opløselig i nærværelse af sådanne ioner. Ved lavere temperaturer, såsom stuetemperatur, udfælder detergenten og kan eventuelt fjernes før udførelse af immunobestemmelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 35 4

DK 164884B

blander en prøve af et mikrobielt protein, som er opnået ud fra Chamydia trachomatis, med en vandig opløsning af en proteinopløsende mængde af en ionisk detergent, som har en alkali-eller jordalkalimetalion som kation, til dannelse af en prøve-5 opløsning, inkuberer prøveopløsningen ved en forhøjet temperatur i tilstrækkelig tid til opløsning af proteinet, og 10 afkøler prøveopløsningen i nærværelse af en forbindelse, der har en alkali- eller jordalkalimetalion som kation, hvilken forbindelse fungerer som temperaturafhængig udfældende forbindelse og således bringer detergenter til udfældning af opløsningen ved stuetemperatur eller lidt derover, men ikke påvir-15 ker detergentens opløselighed ved forhøjede temperaturer, hvorhos forbindelsens kation er en anden end detergentens kation.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen indebærer anvendelse af et 20 temperaturafhængigt udfældningsmiddel til fjernelse af en protein-opløseliggørende mængde detergent fra et prøveeksemplar til immunobestemmeIse. Detergenter er meget effektive protein-opløseliggørende midler, især til mikrobielle celleproteiner, såsom det vigtigste ydre membranprotein på Chlamydia tracho-25 matis. Fordi de generer ved en immunobestemmelse ved at hæmme bindingen af antigen, må detergenter imidlertid effektivt fjernes fra prøveopløsningen før udførelse af bestemmelsen.

Det har vist sig, at inkludering i prøveopløsningen af en 30 forbindelse indeholdende en alkali- eller jordalkalimeta- ion meget nedsætter den vandige opløselighed af en detergent, såsom et dodecylsulfat,ved stuetemperatur eller lidt over (d.v.s. ved eller under ca. 30°C), men har ingen eller ringe virkning på opløseligheden ved forhøjede temperaturer. På 35 grund af deres evne til at bevirke temperatur-afhængig udfældning af detergent vil disse forbindelser i det følgende sommetider blive omtalt som udfældende forbindelser. Det

DK 164884 B

5 skal forstås, at denne betegnelse ikke betyder, at forbindelserne selv udfælder, men kun at de bevirker udfældning af detergent. Ved alkali- eller jordalkalimetaller menes grundstofferne i gruppe I og II i det periodiske system, som ind-5 befatter bl.a. lithium, natrium, kalium, magnium, calcium og barium. En vandig opløsning af et natrium- eller lithium-laurylsulfat og kalium-ion kan således anvendes til at opløseliggøre mikrobielt protein ved forhøjet temperatur. Opløsningen afkøles så til ca. stuetemperatur eller lidt over, hvil-10 ket bevirker, at detergenten udfælder. Detergenten kan eventuelt fjernes ved centrifugering eller filtrering. Hvad enten den udfældede detergent fjernes eller ej, udføres immuno-bestemmelsen så på prøven af protein, uden at detergenten generer. Da den udfældende forbindelse ikke spiller nogen rolle 15 i opfindelsen indtil afkølingstrinet, kan den sættes til opløsningen, efter at proteinet er opløseliggjort, i stedet for fra begyndelsen sammen med detergenten.

Egnede detergenter til anvendelse ifølge opfindelsen indbefat-20 ter dodecylsulfater, såsom natriumdodecylsulfat og lithium- dodecylsulfat. I almindelighed findes detergent i opløsningen i koncentrationer fra ca. 0,01 vægt% pr, rumfang til ca. 2,0 vægt% pr. rumfang. Hensigtsmæssigt er koncentrationen fra ca. 0,01 til ca. 1,0 vægt% pr. rumfang, idet fra ca. 0,05 25 til ca. 0,1 vægt% pr. rumfang foretrækkes.

Den udfældende forbindelse findes i opløsningen i koncentrationer fra ca. 0,01 M til ca. 2,0 M. Hensigtsmæssigt er koncentrationen fra ca. 0,01 M til ca. 1,0 M, idet fra ca.

30 0,05' M til ca. 1,0 M foretrækkes. Enhver vandopløselig for bindelse, der har en alkali- eller jordalkalimetal-ion som kation, kan anvendes. Forbindelsen kan være f.eks. et phos-phat, chlorid eller carbonat. Udvælgelsen af en speciel udfældende forbindelse påvirkes af den særligt anvendte deter-35 gent. For eksempel udfældes natriumdodecylsulfat lettest ved stuetemperatur med tilstrækkelige koncentrationer af kalium-, calcium- eller barium-ion, medens lithiumdodecylsulfat,

DK 164884 B

6 foruden af de ovennævnte ioner, vil blive tilstrækkeligt udfældet af ioner af magnium og natrium.

Den vandige opløsning af detergent og udfældende forbindelse 5 sættes til et prøveeksemplar, såsom en udpensling fra halsen eller urinrøret. Prøven blandes grundigt med den vandige opløsning af detergent og udfældende forbindelse til dannelse af en prøveopløsning. Ved blanding af prøveopløsningen ved stuetemperatur forbliver detergent uopløst. Opløsningen med 10 den uopløste detergent opvarmes fra stuetemperatur til en temperatur fra ca. 60°C til ca. 120°C og holdes ved denne temperatur i en periode fra ca. 5 minutter til ca. 30 minutter.

Ved denne inkubationstemperatur opløses detergenten, opløse-liggør det mikrobielle protein og eksponerer antigenet til 15 immunobestemmelsesformål.

Efter inkubation afkøles opløsningen hurtigt under anvendelse af et isbad eller andre egnede midler til en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til at muliggøre udfældning af deter-20 genten. Alternativt kan opløsningen afkøles langsomt, indtil den når stuetemperatur. En egnet stødpude, såsom et phosphat (f.eks. 0,2 M natriumphosphat, 0,1 vægt% pr. rumfang oksese rumalbumin, pH 7,4), kan tilsættes før eller efter inkubationen. Stødpuden vedligeholder opløsningens pH-værdi mellem 2 5 ca. 6,5 og ca. 8,0. Efter afkøling kan den udfældede detergent fjernes eller blive i prøven. Hvis den bliver deri, har detergenten ingen eller ringe virkning på immunobestemmelsen, fordi den ikke er i opløsning.

30 Som nævnt ovenfor består en særlig anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen i solubi 1 i ser ing af Chlamydia trachomatis. Det vigtigste ydre membranprotein på C.trachomatis omfatter ca. 60% af det samlede forbundne ydre membranprotein i mikroorganismen og har en størrelse eller en molekylvægt af 35 underenheden mellem 38.000 og 44.000 dalton med en middelmolekylvægt på 39.500 dalton. Af forenklingsgrunde vil denne vigtigste ydre membranprotein-gruppe af C.trachomatis i det 7

DK 164884B

følgende blive omtalt som MP 39,5, hvilket betyder: større ydre membranprotein med en gennemsnitsmolekylvægt af underenheden på 39.500 dalton. MP 39,5 er et artsspecifikt antigen, idet dette protein, når det afprøves over for C.tracho-5 matis-antistoffer fra alle serotyperne, reagerer med artsspecificitet. Som et antigen giver MP 39,5 basis for identifikation af alle C.trachomatis-serotyperne.

Artsspecifikke antistoffer mod et antigen, såsom MP 39,5, kan 10 udvikles ved passende podningsmetoder med laboratorie-dyr, såsom mus og/eller kaniner. De dyre-udviklede antistoffer kan anvendes til bestemmelser for infektion i andre pattedyr.

Disse bestemmelser kan udføres under anvendelse af velkendte metoder til bestemmelse af tilstedeværelsen af bakterielt anti-15 gen i det inficerede individ. Når først man har sikret sig en forsyning af monospecifikke antistoffer fra antigenpodede laboratorie-dyr, kan enten direkte eller indirekte bestemmelsesmetoder foretages med prøver fra pattedyr, der mistænkes for at huse infektioner. Bestemmelsesteknik, såsom enzym-20 bundet immunoabsorbentbestemmelse eller radioimmunbestemmelse, er egnet til disse formål *

Ved en direkte bestemmelsesmetode bliver monospecifikt antistof mod antigenet bundet covalent eller ikke-covalent til 25 et bærersystem i fast fase. Som sædvanligt ved denne teknik kan bærersystemet være glas, plast eller lignende. Bæreren i fast fase med vedhængende monospecifikt antistof kan inkuberes med en prøve fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og tidligere opnået fra et individ, der mistænkes for 30 at have en infektion.

Monospecifikt antistof, der tidligere er blevet radiomærket eller konjugeret med enzym ved kendt teknik, bringes så i ligevægt med bærersystemet. Eventuelt antigen, der findes i prø-35 ven, og som er blevet bundet til antistoffet på bærersysternet, vil på sin side binde til det radiomærkede eller enzymkonjugerede antistof. Hvis der anvendes radiomærket antistof, kan den relative rest-radioaktivitet i prøven derefter bestem-

DK 164884B

8 mes. Denne værdi sammenlignes med eksemplarer, som er· blevet påvist at være fri for antigenet. Hvis der anvendes enzymkonjugeret antistof, bliver et substrat, specifikt for enzymet, sat til reaktionsblandingen med den faste bærer, og den frem-5 komne farveændring registreres spektrofotometrisk. Denne farveændring sammenlignes med prøver, der vides at være fri-for antigenet. Tilstedeværelsen af et antigen, såsom MP 39,5, i pattedyr-arter kan således bestemmes direkte.

10 Alternativt kan der anvendes indirekte bestemmelsesmetoder. Specielt kan antigenet blive covalent eller ikke-covalent bundet til et egnet bærersystem i fast fase. Et eksemplar fra det individ, der mistænkes for at have en infektion, fremstilles som ovenfor beskrevet. Eksemplaret blandes så med 15 en kendt mængde radiomærket eller enzymkonjugeret antistof mod antigenet, der forud er blevet fremstillet af et labora-torie-dyr. Blandingen af eksemplar og antistof kan så inkuberes med et fast bærersystem og dets bundne antigen.

20 Radioaktiviteten af det faste bærersystem måles, eller farve-udvikling i det enzymkonjugerede system måles og sammenlignes med eksemplarer, der er behandlet på lignende måde som standarder, og som ikke indeholder antigen.

25 Evnen hos den kliniske prøve, der mistænkes for at indeholde en given mikroorganisme, til at hæmme bindingen af de radiomærkede eller enzymkonjugerede antistoffer til den faste bærer, afslører tilstedeværelse eller fravær af antigenet i det kliniske eksemplar. En eventuelt påvist hæmning viser tilstede- 30 værelse af infektion.

Andre egnede bestemmelsesmetoder og variationer vil være indlysende for fagfolk.

35 Eksempel 1 illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af C. trachomatis MP 39,5. Tabel I sammenligner en kontrol-immunobestemmelse med én, hvori eksemplaret er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

DK 164884 B

9 EKSEMPEL 1

Til en 450 prøve af Chlamydia trachomatis-stamopløsning i 5 phosphat-stødpude (0,2 M natriumphosphat, 0,1 vægt% pr. rumfang okseserumalbumin, pH 7,4) blev sat kaliumchlorid i tilstrækkelig mængde til at bringe kalium-ionkoncentrationen i prøven på 0,1 M. Ca. 50 af en 1 vægt% pr. rumfang opløsning af SDS (natriumdodecylsulfat) i vand blev derefter tills sat, efterfulgt af opvarmning af prøven til 100°C i en opvarmningsblok. Prøven blev inkuberet ved denne temperatur i 10 minutter og derpå afkølet til stuetemperatur i et isbad for at udfælde SDS. ImmunobestemmeIser på stamfortyndinger på 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 og 1:16 blev så udført uden fjernelse 15 af den udfældede detergent. En kontrol blev også fremstillet ved samme fremgangsmåde, med undtagelse af at tilsætningen af kaliumchlorid blev udeladt. Resultaterne i nedenstående tabel viser, at der kan fås en positiv indikation af Chlamydia ved meget højere fortyndinger under anvendelse af fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen, når man sammenligner med en kontrol, der ikke anvender det udfældende middel. Dette viser en betydelig gevinst i følsomhed.

Den bedste metode og de foretrukne udførelsesformer er blevet 25 beskrevet i det foregående.

TABEL

2) ___________EiA-r^ultøter_ _____________

Chlamydia Behandlet son Ubehandlet „ - stamopløsning 1 ifølge eksempel (kontrol) O u 1:16 0,53 0 1:8 0,94 0 1:4 1,31 0,11 35 1:2 1,65 0,27

Ufortynctet 1,81 0,45 1) 7

Ren, 5 x 10 elementarlegemer/ml i 0,02 M natriurnphosphat-stødpude.

2)

Udtrykt son S/N-forhold af optisk tæthed af absorbans ved 450 nm.

Claims (23)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af mikrobielle proteiner, 5 som er opnået ud fra Chamydia trachomatis, til immunobestem- melse, kendetegnet ved, at man blander en prøve af et mikrobielt protein, som er opnået ud fra Chamydia trachomatis, med en vandig opløsning af en prote-10 inopløsende mængde af en ionisk detergent, som har en alkali-eller jordalkalimetalion som kation, til dannelse af en prøveopløsning, inkuberer prøveopløsningen ved en forhøjet temperatur i til-15 strækkelig tid til opløsning af proteinet, og afkøler prøveopløsningen i nærværelse af en forbindelse, der har en alkali- eller jordalkalimetalion som kation, hvilken forbindelse fungerer som temperaturafhængig udfæIdende forbin-20 delse og således bringer detergenten til udfældning af opløsningen ved stuetemperatur eller lidt derover, men ikke påvirker detergentens opløselighed ved forhøjede temperaturer, hvorhos forbindelsens kation er en anden end detergentens kation . 25

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at detergenten findes i prøveopløsningen i en koncentration på ca. 0,01 - 2,0% (vægt/vol).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse findes i opløsningen i en koncentration på ca. 0,01 - 0,2 mol/1. Δ. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 35 at den udfældende forbindelse indeholder en kation, som er en natrium-, kalium-, calcium-, barium- eller magnesium i on. DK 164884 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at prøveopløsninen inkuberes ved en temperatur på ca. 60eC -120eC i ca. 5-30 minutter.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at detergenten findes i prøveopløsningen i en koncentration på ca. 0,01 - 1,0% (vægt/vol).

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 10 at forbi ndel sen f i ndes i en opløsning i en koncentration på ca. 0,01 - 1,0 mol/1.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at opløsningen indeholder en puffer til at holde opløsningens 15 pH-værdi på ca. 6,5 - 8,0.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at detergenten er et dodecylsulfat.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse er et vandopløseligt salt.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at detergenten er natriumdodecylsulfat, og at den udfældende 25 forbindelse indeholder en kation, som er en kalium-, calcium-eller bariumion.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at opløsningen inkuberes ved en temperatur på ca. 100°C i ca. 30 10 minutter.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse er ka1 iumch1 or id og findes i opløsningen i en koncentration på ca. 0,05 - 1,0 mol/1. 35

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at detergenten findes i en koncentration på ca. 0,05 - 0,1% (vægt/vol). DK 164884 B

15. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at detergenten er 1ithiumdodecylsulfat.'

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, 5 at opløsningen inkuberes ved en temperatur på ca. 100eC i ca. 10 minutter.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse er kaliumchlorid og findes i 10 prøveopløsningen i en koncentration på ca. 0,05 - 1 mol/1.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at detergenten findes i en koncentration på ca. 0,05 - 0,1% (vægt/vol). 15

19. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at prøveopløsningen undersøges ved hjælp af radioimmunbestem-melse.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at opløsningen undersøges ved hjælp af radioimmunbestemmelse.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse sættes til prøveopløsningen før 25 opvarmningen.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse sættes til prøveopløsningen efter inkubationen. 30

23. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse sættes til prøveopløsningen før opvarmningen.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at den udfældende forbindelse sættes til prøveopløsningen efter inkubationen.