DK165715B

DK165715B - Fremgangsmaade til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testproeve, testmiddel og testmateriale til anvendelse ved bestemmelsen samt materialets anvendelse

Info

Publication number: DK165715B
Application number: DK532085A
Authority: DK
Inventors: Carmine M Greene; Ibrahim A Ismail; Wen H Wu
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1984-11-19
Filing date: 1985-11-18
Publication date: 1993-01-04
Also published as: FI854514A0; DE3572733D1; NO854422L; AU4882285A; ES8609721A1; NO166346C; FI81451B; FI81451C; FI854514L; EP0184672A1; IL76323A0; DK165715C; AU562084B2; DK532085D0; NO166346B; DK532085A; ES549045A0; CA1254115A; EP0184672B1

Description

Ulv Ido/ I O D

Opfindelsen angår ikke-enzymatiske fremgangsmåder til semikvantitativ bestemmelse af glucose i almindelighed og ikke-enzymatiske, diagnostiske midler til kolorimetrisk bestemmelse af glucose i vandige testprøver i særdeleshed.

5 Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testprøve, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne, og opfindelsen angår tillige et testmiddel til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig test-10 prøve, hvilket middel er ejendommeligt ved det i krav 3's kendetegnende del angivne. Endvidere angår opfindelsen et testmateriale til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testprøve, hvilket materiale er ejendommeligt ved det i krav 5’s kendetegnende del angivne, og opfindelsen 15 angår også en fremgangsmåde til anvendelse af et selvindikerende testmateriale som angivet i krav 8 til semikvantitativ bestemmelse af i det mindste 1.000 mg glucose pr. dl i en vandig testprøve uden sammenligning med et farvekort, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 10's 20 kendetegnende del angivne.

Bestemmelsen af glucosekoncentrationen i vandige opløsninger er industrielt af betydning i sukkerindustrien og inden for medicinen. I medicinen er den semikvanti-tative bestemmelse af glucose i legemsvæsker, f.eks. urin 25 eller blod, af betydning som en offentlig sikkerhedsforanstaltning til undersøgelse af et stort antal personer for diabetes og er af særlig betydning for diabetikere, der skal kontrollere deres sukkerindtagelse. Af hensyn til tidlig diagnose og fortsat kontrol, der har så stor betyd-30 ning ved diabetes, skal en glucosetest, for at have størst værdi for lægen, klinikeren eller diabetikeren, der anvender testen hjemme hos sig selv, være hurtig og enkel nok til at kunne udføres bekvemt og alligevel følsom nok til at afspejle betydningsfulde variationer i glucoseindhol-35 det i urin eller blod.

Semikvantitativ bestemmelse af høje glucosekoncen- 2

DK 165715B

O

trationer, der her defineres som g lueo sekoncentrationer på 1.000 mg pr. dl og højere, er af betydning, fordi glucose-koncentrationen i urin hos diabetikere kan gå op til 5.000 mg pr. dl eller mere. Den kvantitative bestemmelse 5 af høje glucosekoncentrationer i urin er af betydning af i det mindste to årsager. Por det første er det i nødsituationer af betydning at kunne bestemme, hvorvidt en be-vistløshedstilstand kan tilskrives diabetisk coma, der vil indikeres af en høj glucosekoncentration i urinen. Por det 10 andet bliver glucoseniveauer i urin forøgede, såfremt der er blevet indgivet en utilstrækkelig mængde insulin. En test, ved hjælp af hvilken man kan bestemme høje glucosekoncentrationer i urin, kan derfor udnyttes ved den terapeutiske styring af insulinbehovet.

15 De fleste af de diagnostiske tests for glucose, der i øjeblikket udføres klinisk, er baseret på den enzymatiske indvirkning af glueoseoxidase på (3-D-glucose: fJ-D-glucose H202 + glueonsyre 20 + °2 + H20 og den resulterende oxidation af et chromogen (Chr) til dets oxiderede tilstand (Chrx), der er visuelt detekter-bar ved en farveændring: 25 h20 + Chr Iperoxidase] ^ ^ +

Der opnås en i høj grad bekvem test, når testmaterialet kan anvendes semikvantitativt til bestemmelse 30 af gluco seniveauer ved visuel sammenligning af den farve, der udvikles efter kontakt med en testprøve, med et passende farvekort. Sådanne semikvantitative bestemmelser kan også udføres instrumentelt ved måling af reflek-tansen af et materiale, der har reageret. Når imidlertid 35 koncentrationen af glucose forøges til over 1.000 mg pr. dl, er farven af de fleste chromogener, der anvendes i 3

Ulv I OD/ I O D

0 enzymatiske systemer, så mørk, at det ikke lasngere bliver muligt at skelne mellem høje koncentrationsniveauer.

I US patentskrift nr. 4.340.669 beskrives de iagttagne resultater med o-tolidin, tetramethylbenzidin og tetra-ethylbenzidin som chromogen ved koncentrationer på O, 50, 100, 250, 500 og 1.000 mg glucose pr. dl i den væske, der afprøves. Hvert af disse chromogener skifter farve fra gul til lysegrøn, når koncentrationen af glucose forøges fra O til 50 mg pr. dl. Når koncentratio-nen af glucose forøges til over 500 mg pr. dl, bliver farven af det oxiderede chromogen mørkere, således at de iagttagne farver af de respektive chromogener er oliven-sort, sort og dybtgrøn. Denne iagttagelse belyser i høj grad et problem i forbindelse med den seraikvantitati-. ve enzymatiske bestemmelse af glucose i vandige væsker, idet kendte chromogener ved høje koncentrationer viser sig sorte eller meget mørkegrønne, hvorved anvendeligheden af testmaterialerne til bestemmelse af glucose i koncentrationer på over 500 mg pr. dl begrænses. Omend problemet ikke 20 er så akut, såfremt farveændringen bestemmes instrumentelt, er det ikke desto mindre stadig til stede. Nogen succes ved forøgelse af det visuelt aflæselige område for glucose med enzymatiske kompositioner er blevet opnået ved tilsætning af sekundære chromogener, f.eks. m-anisidin, jfr.

25 US patentskrift nr. 4.340.669.

Ud over dårlig farvedifferentiering ved høje gluco-sekoncentrationer forekommer der interferens mellem glu-cosetests på basis af enzymer og ascorbinsyre (vitamin C), der er til stede i legemsvæsker, og disse tests er des-30 uden forbundet med høje omkostninger og med stabilitetsproblemer.

Ikke-enzymatiske metoder til måling af glucose er også blevet anvendt. Disse metoder omfatter instrumentelle metoder, der er baseret på en måleelektrode, jfr. f.eks.

35 US patentskrift nr. 4.127.448, samt endog et ikke-inva-sivt, automatisk glucose-sensorsystem, der scanner patientens øje for udstråling transmitteret gennem cornea, 4

DK 165715B

jfr. US patentskrift nr. 3.958.560. I US patentskrift nr. 4.278.438 er der beskrevet en fremgangsmåde og et apparat til analyse af saccharider. Der anvendes en alky-len-polyamin, der er fremstillet i en boratpuffer, til 5 eluering af saccharider fra en chromatografisk kolonne.

I US patentskrift nr. 4.371.374 er der beskrevet en fremgangsmåde til styring af glucose i blod ved adskillelse og kvantificering af ikke-enzymatiske glycosy-lerede aminosyrer, peptider eller blandinger deraf ved 10 behandling af en urinprøve med en egnet boronsyre til kompleksbinding af de glycosylerede forbindelser, fraskil-lelse deraf og analyse af det fraskilte, kompleksbundne materiale.

Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse kræ-15 ves der ikke kompliceret udstyr, men opfindelsen tillader ikke desto mindre bestemmelse af glucose op til ethvert ønsket koncentrationsniveau ved anvendelse af kompleksbinding af glucosen med bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal. Kompleksbinding af sukkerarter 20 med bor- og jordalkalimetal-dihydroxider er blevet beskrevet, jfr. S.A. Barker et al., Carbohydrate Research 26. (1973), 33-40 og N. Roy et al., Carbohydrate Research 24 (1972), 180-183, men dette fænomen er ikke blevet anvendt til løsning af problemet med semikvantitativ bestemmelse af glucosekon-25 centrationer i vandige testprøver.

I en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et selvindikerende materiale til bestemmelse af glucose, baseret på anvendelsen af kompleksdannelse af glucosen med et bordihydroxid eller et 30 dihydroxid af et jordalkalimetal. Det her omhandlede selvindikerende materiale tillader en visuel bestemmelse af koncentrationen af glucose uden sammenligning med et farvein-dikatorkort, og materialet er ejendommenligt ved det i krav 8's kendetegnende del angivne.

35 Et indikatormateriale, der kan bortkastes efter bru gen, til bestemmelse af cholesterol, er beskrevet i US pa-

DK 165715B

5 tentskrift nr. 4.042.329. Det beskrevne materiale tilvejebringer en indikation af koncentrationen af cholesterol i en given biologisk væske, og denne koncentration er direkte aflæselig i et tegnsystem.

5 Tegningen illustrerer reproducerbarheden af visu elle bestemmelser af glucosekoncentrationer under anvendelse af et ikke-enzymatisk testmateriale ifølge opfindelsen. Testmaterialer, der er sammensat til semikvanti-tativ bestemmelse af høje koncentrationer af glucose, 10 bringes i kontakt med tilvejebragte urin-testprøver inholdende fra 1 g glucose pr. dl til 8 g glucose pr. dl.

Kurven verificerer den lineære relation mellem glucose-koncentrationen G i g pr. dl med aflæsningen på instrumentet, R, i g pr. dl. Testmaterialerne fremstilles ved for-15 behandling af en bærematriks af papir med en boratpuffer fremstillet ud fra phenylboronsyre forud for inkorporering af et testmiddel omfattende en boratpuffer fremstillet ud fra borsyre og en pH-indikator.

Hed den foreliggende opfindelse tilvejebringes der 20 som nævnt en fremgangsmåde til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testprøve, et testmiddel, der kan anvendes til en sådan bestemmelse, et testmateriale samt en fremgangsmåde til dets fremstilling og anvendelse. Fremgangsmåden til bestemmelse af glucose i en vandig testprøve 25 omfatter følgende trin: a) fremstilling af en testopløsning ved tilvejebringelse af kontakt mellem den vandige testprøve og bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 er i stand til at danne et kompleks med glucose, idet det dannede kompleks 30 frigører en proton, samt b) bestemmelse af den endelige pH-værdi i testopløsningen. Testmaterialet omfatter a) bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 er i stand til at danne et kompleks af glucose, hvilket kompleks frigører en 35 proton, og b) en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolorimetrisk respons i et pH-

DK 165715 B

6 -område fra en pH-værdi på ca. 6,5 til en pH-værdi på ca.

12. En bærematriks kan inkorporeres sammen med testmidlet til tilvejebringelse af et særlig hensigtsmæssigt testmateriale. En foretrukken udførelsesform består i et selvin-5 dikerende testmateriale.

Et antal carbonhydrater, der indeholder en cis-di- ol-gruppe, danner en lang række komplekser med forbindelser, der indeholder en dihydroxidgruppe, jfr. f.eks. N.

Roy et al., Carbohydrate Research 24 (1972), 180-183, og 10 S.A. Barker et al., Carbohydrate Research, 26 (1973), 33--40. Det har vist sig, at denne kompleksdannelse kan udnyttes til opnåelse af en semikvantitativ bestemmelse af koncentrationen af glucose i en vandig testprøve ved fremstilling af en testopløsning ved tilvejebringelse af kontakt 15 mellem prøven og bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal ved en indledende pH-værdi på over 6,5, hvilket dihydroxid er i stand til at danne et kompleks med glucose, idet der ved kompleksdannelsen frigøres en proton i opløsningen, hvorpå testopløsningens endelige pH-værdi 20 bestemmes.

Egnede dihydroxider omfatter dihydroxiderne af barium, bor, calcium, magnesium og strontium (Ba(0H)2, Z--B(OH)2, Ca(0H)2, Mg(0H)2 og Sr(0H)2). Dihydroxider af bor og strontium foretrækkes. Særligt foretrukne er bor-dihy-25 droxider med den almene formel Z-B(OH)2 i hvilken Z betegner en elektrontiltrækkende gruppe, f.eks.

30 en nitrogruppe, eller en elektronstabiliserende gruppe, f.eks. en hydroxy- eller arén-gruppe. Når Z er en hydroxy- gruppe, er bor-dihydroxidet borsyre. Egnede bor-dihydroxi- der omfatter borsyre, pherylboronsyre, p-nitrophenylboronsy- re, 4-methoxyphenylboronsyre og a-naphthylboronsyre, naph-35 thylboronsyre samt andre aren-boronsyrer og deres deriva- 7 υΚΊΟΰ/ΊΟΒ i 0 ter. En aren-gruppe er defineret som enhver carbonhydrid-gruppe, der indeholder i det mindste én aromatisk ring.

Disse grupper kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, forudsat at den anioniske, negative form af dihydroxidet kan stabiliseres ved elektronresonans over 5 den aromatiske ring. Eksempelvis er forbindelsen phenyl-boronsyre, hvor Z betegner en phenylgruppe, særlig anvendelig i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Desuden er arfen-derivater, f.eks. p-nitrophenylboronsyre, der indeholder elektrontiltrækkende grupper som substituenter 10 på den aromatiske ring, også anvendelige.

Glucose kan bestemmes ved fremstilling af en testopløsning under anvendelse af en vandig testprøve og den nævnte dihydroxid-komponent, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 er i stand til at danne et kompleks med glu-15 cose, idet det dannede kompleks frigør en proton, hvorefter den endelige pH-værdi i testopløsningen måles. Testopløsningen kan almindeligvis fremstilles ved simpelthen at bringe dihydroxidet i kontakt med den vandige testprøve.

20

Barium-, bor-, calcium-, magnesium- og strontium- -dihydroxiderne danner i almindelighed komplekser med glucose i forholdet 1:1. Forholdet mellem dihydroxid og glucose i testprøven skal derfor omtrentligt være 1:1.

Til dannelse af en testopløsning af et bor-dihydroxid, 25 f.eks. borsyre, i en tilstrækkelig koncentration til bestemmelse af glucosekoncentrationer på ca. 500 mg pr. dl eller højere, kan det være nødvendigt at anvende en base, f.eks. kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, til opløsning af bor-dihydroxidet. En ækvivalent fremgangsmåde 30 vil være anvendelsen af saltformen af borsyre som en del af dihydroxid-komponenten. Det er åbenbart, at andre baser også kan anvendes, forudsat at de ikke interfererer med kompleksdannelsen mellem dihydroxidet og glucose.

Den endelige pH-værdi i testopløsningen kan måles konventionelt med et pH-meter eller visuelt eller instrumentelt efter tilsætning af en pH-indikator.

35

DK 165715B

δ ο

Den pH-ændring, der forekommer ved kompleksdannelsen mellem den nævnte dihydrdxid-komponent og glucose, kan modvirkes ved tilsætning af en puffer. Et testmateriale, der omfatter en puffer, der er i stand til at modvirke en pH-ændring over pH-området fra ca. 6,5 til ca. 12, 5 kan anvendes til bestemmelse af glucose over et bredere koncentrationsområde end et testmateriale uden en sådan puffer. Egnede puffere omfatter tris-(hydroxymethyl)--aminomethan, der almindeligvis betegnes TRIS, N,N-bis --(2-hydroxyethyl)-glycin, der er almindelig kendt som BICIN, samt N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsy-re, der er almindelig kendt under betegnelsen HEPES. Det er særlig bekvemt, når der anvendes et bordihydroxid, såsom borsyre eller phenylboronsyre, at anvende puffer-15 formen som dihydroxid-bestanddelen.

En borat-puffer er defineret som blandingen af syre- og baseformen af en Z-B (OH) 2-forbindelse. Ligevægten mellem de to former kan illustreres skematisk på følgende måde:

20 Θ OH

Z-B (OH) ~ + H,.0 ” N Z-+ H

OtT^OH

hvor Z kan være enhver af de tidligere omtalte grupper.

25 Borat-pufferen kan fremstilles ud fra borsyre (Z = OH) eller ud fra aren-boronsyre-derivater, f.eks. phenylboronsyre eller blandinger af Z-B (OH) 2-f orbindelser under anvendelse af almindeligt benyttede laboratoriemetoder, der er velkendte for fagmanden. Eksempelvis kan en 30 opløsning af bor syre-puf fer fremstilles ved titrering af borsyre med en base, f.eks. natrium- eller kaliumhydroxid, til en indledende pH-værdi inden for pufferområdet for den anvendte Z-B(OH)2~forbindelse. Dette puffer-område antages at falde mellem en pH-værdi på 6,5 og en pH-værdi på 12 35 for de fleste Z-B (OH) 2-forbindelser. Pufferen kan også fremstilles ved tilsætning af ækvimolære dele af syre?-

O

9

DK 165715B

og baseformerne af dihydroxidet og opløsning i vand.

Valget af den indledende puffer-pH-værdi kan påvirke det koncentrationsområde for glucose, der kan bestemmes med et bestemt testmateriale. Eksempelvis vil ef-5 fektiviteten af kompleksdannelsen mellem bordihydroxid og glucose formindskes, når pH-værdien for opløsningen falder under pKa-værdien for borat-pufferen. Tilsætningen af elektrontiltrækkende substituenter på en puffer fremstillet ud fra et aren-boronsyre-derivat ændrer pKa-værdi-10 en for pufferen og derfor dens effektive pH- og kompleks-dannelses-område. Eksempelvis har borsyre, der har en pKa-værdi på 9,2,en lavere kompleksdannelseskapacitet under ca. pH = 7,0, medens phenylboronsyre, der har en pKa-værdi på 8,8, vil danne kompleks med glucose ved en pH-værdi så 15 lav som 6,5. p-Nitrophenylboronsyre, der har en pKa-værdi på 7,4, har en endnu lavere, effektiv pH-værdi. En blanding af borat-puffere, f.eks. borsyre-puffer og phenylbo-ronsyre-puffer, kan udvide det effektive pH-område for borat-glucose-kompleksdannelsen og dermed det glucosekon-20 centrationsområde, der kan bestemmes. Når der anvendes en borsyre-puffer, foretrækkes der en indledende pH-værdi på over 8,0. Til bestemmelse af høje glucosekoncentratio-ner med en borsyre-puffer foretrækkes der især en indledende pH-værdi på over 9,0.

25 Pufferen er mest anvendelig ved en glucosebestem- melse, når den indledende pH-værdi ligger en lille smule over pKa-værdien. Pufferen kan naturligvis tilføres i tør tilstand ved fjernelse af vand, efter at den indledende pH-værdi er opnået. Pufferen er i stand til at tilveje-30 bringe denne pH-værdi, når den rekonstitueres.

Det er særlig bekvemt at tilvejebringe et testmiddel til bestemmelse af glucose indeholdende et dihydroxid som her defineret og en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolorimetrisk respons i 35 pH-området fra en pH-værdi på ca. 6,5 til en pH-værdi på ca. 12. Enhver pH-indikator, som ændrer farve inden for dette pH-område, eller enhver kombination af sådanne in- 10

DK 165715B

o dikatorer, kan anvendes. Anvendelige indikatorer omfatter m-cresoli-purpur, cresolrødt, neutralrødt, thymolblåt, phenolphthalein, o-cresol-phthalen, phenolrødt, bromthy-molblåt eller universelindikator, en blanding af indika-_ torer, der kan fås fra Kodak. Testmidlet kan anvendes til

O

bestemmelse af glucosekoncentration ved simpelthen at tilvejebringe kontakt mellem midlet og den vandige testprøve, hvorefter man iagttager det frembragte detekterba-re kolorimetriske respons.

En pH-indikator ændrer farve over et område af pH--værdier. pKa-værdien for en indikator repræsenterer omtrentlig midtpunktet for dens farveændringer. Den indledende pH-værdi af den valgte borat-puffer er relateret til den indikator, der anvendes. Eksempelvis ændrer m-cre- solpurpur farve fra purpur ved pH = 9,0 til gul ved pH = lo 7,4. Ved pH-værdier over 9,0 forbliver indikatoren purpur-farvet eller ændrer kun i meget ringe omfang farve ved en ændring af pH-værdien. Såfremt der anvendes en indledende pH-værdi på 9,0, vil et detekterbart respons være åben-2Q bart ved enhver pH-ændring. Såfremt der anvendes en indledende pH-værdi på 9,2 eller højere, vil midlet ikke ændre farve, dvs. at det ikke vil udvise et detekterbart respons på glucosekoncentrationen, indtil pH-værdien falder til under pH = 9,0. Midler indeholdende m-cresolpur-25 pur, der indeholder en puffer, som er i stand til at give en indledende pH-værdi på 9,0, vil derfor være mere følsomme over for en lavere glucosekoncentration end sådanne midler indeholdende en puffer, der er i stand til at tilvejebringe en indledende pH-værdi på 9,2. Såfremt der an-30 vendes en anden pH-indikator, kan en anden indledende pH--værdi foretrækkes. Eksempelvis har cresolrødt et pH-om-råde mellem ca. 8,8 (rød farve) og ca. 7,2 (gul farve).

En lavere indledende pH-værdi, f.eks. pH = 9,0, foretrækkes i' så fald til optimal ydeevne ved dette testmiddel.

35 Anvendelsen af mere end én indikator kan tilvejebringe en farveændring over et bredere pH-område og dermed over et bredere område for glucosekoncentrationen.

o 11

DK 16571oB

Et testmiddel, der er særlig velegnet til bestemmelse af høje koncentrationer af glucose, der her er defineret som mindst 1.000 mg glucose pr. dl, er en borat--puffer, der er i stand til at modvirke pH-ændringer i 5 et pH-område på fra ca. pH = 6,5 til ca. pH = 12, og en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et de-tekterbart kolorimetrisk respons i et pH-område fra en pH-værdi på ca. 6,5 til en pH-værdi på ca. 12.

I et foretrukkent middel, der fremstilles til be-10 stemmelse af høje glucosekoncentrationer i urin, er borat-pufferen en borsyre-puffer, der er fremstillet således, at den er i stand til at tilvejebringe en indledende pH-værdi på ca. 9,2. Ved denne høje indledende pH-værdi undgås u-specifikke pH-ændringer og interferens gennem pH-værdien 15 i urin og pufferkapacitet. Den således fremstillede puffer kan tilvejebringes i en tør tilstand ved frysetørring, eller den kan simpelthen tørres til fjernelse af det vand, der anvendes til fremstilling af pufferen.

Yderligere bestanddele, f.eks. fugtemidler, stabi-20 lisatorer eller fortykkelsesmidler, kan sættes til testmidlet, forudsat at de ikke interfererer med kompleksdannelsen mellem dihydroxidet og glucosen.

Ethvert af disse midler kan tilvejebringes i form af et reagens på flaske, en itubrydelig kapsel indeholden-25 de testmidlet på reagensform, en pille eller tablet.

Testmaterialet, der er en foretrukken udførelsesform for opfindélsen, fremstilles ved behandling af en egnet bærematrix med testmidlet i form af et flydende reagens, hvorefter der tørres.

30 Bærematrixen kan være ethvert materiale, der kan inkorporeres med bestanddelene af testmidlet, blot det er i det væsentlige indifferent med hensyn til testmidlet, porøst og/eller absorberende i forhold til den vandige prøve, der skal undersøges. Udtrykket "bærematrix" 35 referer til enten sugende eller ikke-sugende materialer, der er uopløselige og bibeholder deres strukturelle in- 12

DK 165715B

> tegritet, når de udsættes for vand eller andre fysiologiske væsker. Egnede sugende materialer, der kan anvendes, omfatter papir, cellulose, træ, flor af syntetisk harpiks, vævede og ikke-vævede materialer. Ikke-sugende materialer eller matrixer omfatter glasfibre, polymer-5 film og mikroporøse membraner.

Det vil således forstås, at man ved fremstillingen af et testmateriale ifølge opfindelsen kan anvende alle sådanne bærematrixer såvel som en række andre. Matrixen kan også omfatte et system, i hvilket bestandde- 10 lene af midlet er homogent kombineret i en flydende eller halvflydende tilstand, der senere hærdner eller stivner, hvorved bestanddelene inkorporeres. Andre matrixtyper kan også anvendes, herunder mikroporøse membraner eller matrixer af polymerfilm. Mikroporøse membraner er til-15 gængelige som forud tildannede membraner eller kan fremstilles ved sådanne metoder som faseinversion. Egnede polymerfilm kan fremstilles under anvendelse af kommercielt tilgængelige latexpræparater baseret på latexpolymersus-pensioner, f.eks. en sådan, som tildannes ud fra en copo- 20 lymer af styren og butadien i forholdet 60:40. Andre naturlige eller syntetiske polymere eller blandinger deraf kan også anvendes. Eksempler på sådanne filmpræparater kan findes beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.630.957 og nr. 4.312.834.

25

Den i øjeblikket foretrukne metode til fremstillingen består i imprægnering af en sugende bærematrix, f.eks. filtrérpapir, med en vandig opløsning af midlet, hvorefter der tørres, hvorpå den tørrede, imprægnerede matrix anbringes på en understøtning. Den imprægnerende opløsning fremstilles således, at den udviser den ønskede indledende pH-værdi. Når der skal undersøges en prøve af helblod, kan den tørrede, imprægnerede bærematrix overtrækkes således, at man kan afvaske eller aftørre overskud af prøven. Tørringen kan udføres ved hjælp af 35 enhver metode, der ikke på ødelæggende måde vil påvirke det inkorporerede middel, sædvanligvis ved hjælp af en

O

13

DK 165715B

luftovn. Inkorporeringen kan udføres ved hjælp af enhver egnet metode, f.eks. overtrækning, neddypning, udspredning, spraybehandling eller trykning, der tillader,at bærematrixen inkorporeres med bestemmelsesmidlet. Den tør-5 rede bærematrix kan derefter skæres i stykker og anbringes på den ene ende af den understøtning, f.eks. en stiv eller halvstiv polystyrenfilmstrixnmel. Dihydroxid-bestand-delen og/eller pufferen befinder sig på en sådan form, at de kan tilvejebringe en indledende pH-værdi på over 6,5 10 ved overfladen af den inkorporerede bærer, når bæreren fug tes. pH-værdien af den fugtede, inkorporerede bærer kan måles ved hjælp af overfladeelektroder. Udtrykket "inkorporeret bærer" refererer til en bærematrix, der er inkorporeret med testmidlet og tørret. Når der anvendes en trans-15 parent filmstrimmel, kan en instrumentaflæsning af et omsat materiale udføres fra hver side af strimlen. Anbringelsen af papiret på strimlen kan udføres ved anvendelse af et dobbeltsidet, adhæsivt stykke tape, f.eks. et sådant, der er kommercielt tilgængeligt fra 3M Co., St. Paul, MN., 20 under varemærket DOUBLE STICK ®.

Når der anvendes en papirbærematrix sammen med en borsyre-puffer, kan det være fordelagtigt at behandle papiret med en vandig opløsning af en anden borat-puffer, f.eks. den, der fremstilles ud fra phenylboronsyre ved en 25 indledende pH-værdi på over 6,5, forud for inkorporeringen af testmidlet indeholdende borat-pufferen. Det antages, at en sådan forbehandling hindrer en mulig interaktion mellem papiret og borat-pufferen i testmidlet.

Koncentrationsområderne for bestanddelene i den rea-30 gensopløsning, der anvendes til fremstilling af et testmateriale i fast tilstand, er følgende:

Arbejdsområde Foretrukkent område Borat-puffer: 0,1-0,9 M 0,1-0,4 M

35 pH-indikator: 0,025-0,2% 0,04-0,15%

O

14

DK 165715B

Disse koncentrationsområder og relative koncentrationer af bestanddelene kan anvendes, hvadenten opløsningen er en vandig imprægneringsopløsning eller en polymersuspension. En foretrukken reagensopløsning indeholder fra 5 0,10 til 0,30 M borat-puffer, titreret til en indledende pH-værdi på fra ca. 8,5 til ca. 9,5 samt fra 0,05% til 0,10% af en indikator såsom m-cresolpurpur. I en foretrukken udførelsesform imprægneres en papirmatrix med en vandig opløsning indeholdende fra 0,1 til 0,3 M borat-puffer, 10 titreret til en indledende pH-værdi over 6,5, inden inkorporering sammen med testmidlet. En foretrukken borat-puffer til forbehandling fremstilles ud fra phenylboronsyre.

Testmaterialet anvendes med fordel ved momentan neddypning deraf i en testprøve eller ved på anden måde at 15 påføre testprøven på bærematrixen, hvorved der fremkommer en detekterbar kolorimetrisk ændring, når glucose er til stede. Kontakt med testprøven kan også udføres ved hjælp af en pipette, en tampon eller en spatel. Omend neddypning er en i høj grad tilfredsstillende kontaktme-20 tode, når der anvendes urin, vil en serumprøve normalt kræve pipettering.

Semikvantitative glucosekoncentrationer kan bestemmes visuelt ved sammenligning med et egnet farvekort, eller der kan udføres målinger ved hjælp af instrumenter 25 ved reflektans fra hver side af materialet, såfremt der anvendes en transparent understøtning.

' En foretrukken udførelsesform for et glucosetest-materiale ifølge opfindelsen er et selvindikerende materiale, der tillader bestemmelse af koncentrationen af 30 glucose i en vandig testprøve, uden at der skal sammenlignes med et yderligere tilvejebragt farvekort. På grund af de grundlæggende kliniske forhold for de reagenser, der er involveret i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan der faktisk tilvejebringes et selvindike-35 rende materiale, hvor den eneste bestemmelse, der kræves

O

15

DK 165715B

af brugeren, er bestemmelsen af antallet af testmidler på et multipude-testmateriale, der har ændret farve. Et selvindikerende materiale kan konstrueres således, at hvert testmiddel, når det bringes i kontakt med en glu-5 cose-testprøve ved en koncentration, der er lig med eller større end den specificerede koncentration, for hvilken testmidlet er udformet til at reagere, vil ændre farve til omtrentlig den samme farve.

Det selvindikerende materiale fremstilles ved fast-10 gørelse af et antal testmatrixer på en bærer. Hver test-matrix fremstilles ved inkorporering af et testmiddel, der er udformet til at reagere med en forskellig, men forud fastsat koncentration af glucose, med en bærer. Testmidlet kan sammensættes som tidligere beskrevet, men sæd-15 vanligvis vil imidlertid de samme kemiske bestanddele være inkorporeret i hver matrix, og sammensætningen i hver testmatrix vil kun afvige med hensyn til koncentrationen af dihydroxid og den indledende pH-værdi. Ved en foretruk-ken sammensætning til høje glucosekoncentrationer fremstil-20 les det selvindikerende materiale ved inkorporering af et antal testmatrixer med en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolorimetrisk respons, og en borat-puffer, hvor koncentrationen af borat--puffer og den indledende pH-værdi for borat-pufferen er 25 forskellig i hver testmatrix.

Den selvindikerende udførelsesform er særlig fore-trukken til bestemmelse af glucose med en borat-puffer.

Ved optælling af det antal puder, der ændrer farve, kan brugeren angive den tilstedeværende mængde glucose, uden 30 at det er nødvendigt at anvende sammenligning med et farvekort. Puderne kan anbringes særskilt på en bærer, f.eks. Trycite, eller forbindes med hverandre. For en glucosekon-centration i en prøve, der er mindre end den koncentration, med hvilken testmidlet er udformet til at reagere, vil der 35 ikke være nogen farveændring. Brugeren kan på baggrund af o

DK 165715 B

16 den information, at en farveændring af 1-2 testmidler svarer til en normal aflæsning, medens en ændring af 3 eller flere testmidler indikerer en mulig patologisk tilstand, træffe passende foranstaltninger eller søge professionel 5 assistance, uden at det er nødvendigt at sammenligne pudens farve med et farvekort. I betragtning af forskellene med hensyn til skelnen mellem farver for forskellige individer og forskellene i skelnen mellem farver under forskellige belysningsbetingelser, er anvendelsen af den fo-10 religgende opfindelse i denne udførelsesform særlig fordelagtig .

I dihydroxid-kompleksdannelsessystemet vil kompleksdannelsen af glucose med dihydroxidet bevirke frigørelse af en proton, hvorfor systemets pH-værdi falder. Ved et en-15 kelt pudesystem (testmiddel) ændrer indikatoren farve over et pH-område, der frembringes ved kompleksdannelse af glucose over det koncentrationsområde for glucose, som systemet er udformet til at bestemme. Sædvanligv.is vælges der en indikator med en pKa-værdi, der ligger omtrentlig midt 20 i det pH-område, der forventes ved prøven. Faldet i pH--værdi med stigende glucosemængde kan modvirkes noget ved indstilling af den indledende pH-værdi af testmidlet; .til et punkt, der bedst modvirker den frembragte pE-ændring.

De fleste pH-indikatorer ændrer farve over et for-25 holdsvis bredt pH-område, men over mindre pH-områder inden for dette område er den farve, der er synlig for øjet, tilsyneladende den samme. Koncentrationen af dihydroxid og den indledende pH-værdi kan vælges således for hver testmiddel, at ved reaktion med enhver koncentration af glu-30 cose, der er lig med eller større end den, med hvilken testmidlet er udformet til at reagere, vil pH-ændringen, der er frembragt ved kompleksdannelsesreaktionen, bringe indikatoren til et punkt inden for det snævrere pH-områ-de, hvor farven tilsyneladende er den samme for det ube-35 væbnede øje. I en foretrukken udførelsesform, hvor der an- o 17

DK 165715B

vendes borat-puffer og cresolrødt, har det vist sig, at medens nuancen af det omsatte testmateriale kan være forskellig (dvs. ét omsat testmiddel kan tilvejebringe en lys gylden farve, medens et andet omsat testmateriale kan 5 tilvejebringe en dyb gylden farve), er den endelige farve af testmidler, der er udformet til at reagere med en koncentration, der er lig med eller mindre end den gluco-sekoncentration, der findes i testprøven, den samme. På den anden side vil farven af testmidler, der er udformet 10 til at reagere med glucosekoncentrationer, der er større end koncentrationen for testprøven, definitivt forblive den samme farve som et uomsat testmiddel (i tilfælde af cresolrødt er farven af det uomsatte testmiddel rød). Indikatorer til anvendelse med et selvindikerende materiale 15 med høj glucosekoncentration bør ændre farve inden for et pH-område fra ca. 6,5 til ca. 12. Til den selvindikerende udførelsesform foretrækkes det at anvende en indikator, f.eks. cresolrødt eller m-cresolpurpur, der har en defineret farve ved mere basiske pH-værdier (højere pH-værdier) 20 og ændres forholdsvis brat til en veldefineret og drastisk forskellig farve ved lavere pH-værdier. En lignende farveændring over et passende pH-område kan opnås med blandede indikatorsystemer.

I de følgende udførelseseksempler beskrives der 25 forsøg, der er blevet udført i forbindelse med udviklingen af opfindelsen. En foretrukken selvindikerende udførelsesform er beskrevet i eksempel 4. Eksemplerne tjener til til illustration af opfindelsen, og en fagmand vil være i stand til at foretage sådanne variationer, substitutioner 30 og ændringer i materialets bestanddele og i reaktionsparametrene, som vil være ønskelige.

35

O

18

DK 165715B

Forkortelser:

De følgende forkortelser anvendes i eksemplerne: mg milligram ml milliliter 5 dl deciliter M molær % % i vægt-% pr. 100 ml opløsning PVP-K90 poly-(vinylpyrrolidon) med gen nemsnitlig molekylvægt på 360.000 10 fra GAF Corp., New York, N.Y.

m-cresol-purpur meta-cresolsulfo.naphthalein cresolrødt o-cresolsulfonaphthalein neutralrødt 2-methyl-3-amino-6-dimethyl - ami- nophenazin 15 thymolblåt thymolsulfonaphthalein phenylphthalein 3,3 -b is-(p-hydroxypheny1)-phthalid phenolrødt phenolsulfonaphthalein.

bromthymolblåt dibromthymolsulfonaphthalein

Klucel LF hydroxypropylcellulose 20 Polyethylen polyethylenglycol med molekylvægt glycol 4000 40(χ)

Eksempler 1. Phenylboronsyre-puffer-forbehandling.

25 ' Whatman 54-filtrérpapir neddyppes i en vandig opløsning indeholdende 0,2 M phenylboronsyre-puffer, der har en indledende pH-værdi på 9,05. Det imprægnerede papir tørres derpå i 15 minutter ved 60°C i en luftovn. Det tørrede papir neddyppes i en vandig opløsning indeholdende 0,25 M 30 borat-puffer, indledende pH-værdi 9,05, og 0,08% m-cresol-purpur · (natriumsalt). En forrådsopløsning af 1% m-cresol-purpur anvendes til fremstilling af imprægneringsopløsningen. Borat-pufferen fremstilles ved opløsning af borsyre i vand, indstilling af pH-værdien på 9,05 med kaliumhydroxid-35 opløsning og fortynding til det ønskede rumfang. Det dobbelt- 19

DK 165715B

o imprægnerede papir tørres igen i 15 minutter ved 60°C i en luftovn.

Et stykke af det dobbelttørrede papir fastgøres til en polystyrenunderstøtning til bekvem håndtering.

5 Testmaterialerne afprøves ved neddypning i vandige testprøver indeholdende fra 1.000 mg glucose pr. dl til 8.000 mg glucose pr. dlt dvs. fra 1 g pr. dl til 8 g pr. dl. De data, der er vist på tegningen, viser en god lineær korrelation mellem glucosekoncentration i g pr. dl jo og strimmelaflæsningen.

2. Ingen forbehandling.

Whatmann 54-filtrérpapir neddyppes i en opløsning, der indeholder følgende bestanddele: 15

Borsyre-puffer 2,0 ml (1 M, indledende pH = 9,5) PVP K90 (15%) 1,0 ml

Phenolrødt (1M) 0,2 ml 20 Vand 10,0 ml

Det imprægnerede papir tørres i 15 minutter ved 60°C i en luftovn, og et stykke af det tørrede papir fastgøres til understøtninger, der er fremstillet af polysty-25 ren. Det færdige testmateriale giver god visuel opløsning mellem 1.000, 2.000, 3.000 og 5.000 mg glucose pr. dl. Farven ændres fra rød for negativ (mindre end 1.000 mg glucose pr. dl) til gul (5.000 mg glucose pr. dl).

30 3. Dobbeltindikatorsystem.

Et særligt foretrukkent testmateriale til bestemmelse af høje koncentrationer af glucose, dvs. koncentrationer på mindst 1.000 mg pr. dl, i en urin-testprøve fremstilles som følger: 35 0

DK 165715 B

20

Opløsning 1 (10% acetone i vand)

Phenylboronsyre 0/23 M

Puffer (indledende pH = 9,0) 5 Dodecylbenzensulfonsyre (natriumsalt) 0,04%

Opløsning 2

Borsyre-puffer 0,30 M

(indledende pH = 9,0) t 10 PVP-K 60 1/2%

Polyethylenglucol 4000 0,8%

Klucel LF 0,4% (i ethanol)

Tween 21 0,04% 15 Cresolrødt 0,03%

Bromthymolblåt 0,003% (i ethanol)

Opløsning 2 fremstilles i 10% acetone. Den endeli-20 ge opløsning indeholder 10% acetone og 10% ethanol.

Filtrérpapir, f.eks. Whatman 54 eller E & D 204, forbehandles ved dypning i opløsning 1 og tørring. Det tørrede og forbehandlede papir neddyppes i opløsning 2 og tørres. Det dobbelte indikatorsystem letter den se-25 mikvantitative differentiering af glucosekoncentrationer mellem 1.000 mg pr. dl og 10.000 mg pr. dl, eftersom forskellen i kolorimetrisk respons mellem de forskellige koncentrationsniveauer er større. Dette er særlig ønskeligt for et testmateriale til visuel aflæsning.

30 4. Selvindikerende glucosemateriale.

A. Indikatoren m-cresolpurpur anvendes til fremstilling af et testmateriale til bestemmelse af 1, 2, 4 og 8 g glucose pr. dl i urin.

Fire stykker Whatman 54-papir (med dimensionerne 35 2 5,4 x 5,08 cm) imprægneres med 0,2 M phenylborat ved

O

21

DK 165715B

en pH-værdi på 9,0 og tørres i 15 minutter ved 50°C.

Hvert stykke behandles derpå med en af de følgende opløsninger: 5 Borat-koncentration (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 (10 ml) 1% m-cresolpurpur (ml) 0,8 0,8 0,8 0,8 (i ethanol) pH-værdi 9,0 9,2 9,4 9,6 10

Papirerne tørres igen (i 15 minutter ved 50°C) , påføres dobbeltsidet adhæsiv og udskæres i bånd på 0,508 cm. Båndene påføres på Trycite til forøgelse af boratkoncentra-tion og pH-værdi (i retning mod håndgrebet) og skæres i 15 strimler på 0,508 cm.

Ved neddypning i en urinprøve indeholdende 6 g glucose pr. dl ændrer de tre testmaterialer farve fra purpur til gylden. Omend dybden af den endelige gyldne farve er forskellig, dvs. svagt lysgylden til dybgylden, for 20 hvert omsat testmateriale, kan alle de omsatte puder, der er udformet til bestemmelse af 6 g glucose pr. dl eller mindre, let identificeres som havende gylden farve. Det fjerde testmateriale, der er udformet til at reagere med 8 g glucose pr. dl, forbliver med en purpurfarve.

25 B. Et lignende selvindikerende materiale fremstil les under anvendelse af cresolrødt som indikator.

Fire stykker Whatman 54-papir (med dimensionerne 25,4 x 5,08 cm) behandles med 0,1 M phenylboratopløsning ved en pH-værdi på 8,0 og tørres dernæst i 15 minutter 30 ved 50°C. Hver prøve imprægneres derpå særskilt med en af de følgende fire forskellige opløsninger: 35

DK 165715 B

O

22

Boratkoncentration (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 (10 ml) 0,5% cresolrødt i vand 0,8 0,8 0,8 0,8 (ml) 5 pH-værdi 9,0 9,2 9,6 9,8

Testmaterialerne er beregnet til at reagere med henholdsvis 1, 2, 4 og 8 g glucose pr. dl i forbindelse med urin-^testprøver. Testmaterialerne monteres som tid-10 ligere beskrevet. Det selvindikerende materiale udviser ingen farveændring (forbliver rødt), når det neddyppes i en urinprøve indeholdende 0,5 g glucose pr. dl. Ved neddypning i en urinprøve indeholdende 3 g glucose pr. dl skifter to puder imidlertid farve (til gul).

15 20 25 30 35

Claims

23 DK 165715B PATENTKRAV.

1. Fremgangsmåde til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testprøve, kendetegnet ved, 5 at man a) fremstiller en testopløsning ved tilvejebringelse af kontakt mellem den vandige testprøve og bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 kan danne et kompleks med glu- 10 cose under frigørelse af en proton, samt eventuelt en puffer, der kan modvirke pH-ændringer i et område fra en pH-værdi på ca. 6,5 til en pH-værdi på ca. 12, og b) bestemmer den endelige pH-værdi i testopløsningen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at dihydroxidet er bor- eller strontiumdihy-droxid.

3. Testmiddel til semikvantitativ bestemmelse af 20 glucose i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at det omfatter a) bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 kan danne et kompleks med glucose under frigørelse af en proton, 25 og eventuelt en puffer, der kan modvirke pH-ændringer i et område fra en pH-værdi på ca. 6,5 til en pH-værdi på ca. 12, og b) en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolorimetrisk respons i et pH-område 30 på fra ca. 6,5 til ca. 12.

4. Testmiddel ifølge krav 3, kendetegnet ved, at dihydroxidet er bor- eller strontiumdihydroxid.

5. Testmateriale til semikvantitativ bestemmelse af glucose i en vandig testprøve, kendetegnet ved, 24 DK 165715B at det omfatter en bærematrix og et testmiddel inkorporeret deri, idet testmidlet omfatter (a) bordihydroxid eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som tilvejebringer en pH-værdi på over 6,5 på overfladen af bæreren, som indeholder 5 testmidlet, når denne fugtes, og som også kan danne et kompleks med glucose under frigørelse af en proton, og (b) en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detek-terbart kolorimetrisk respons i et pH-område fra ca. 6,5 til ca. 12. 10

6. Testmiddel ifølge krav 3 til semikvantitativ bestemmelse af mindst 1.000 mg glucose pr. dl i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at det indeholder (a) en boratpuffer, der kan modvirke pH-ændringer i et pH- 15 område fra ca. 6,5 til ca. 12, og (b) en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolometrisk respons i et pH-område fra ca. 6,5 til ca. 12.

7. Testmateriale ifølge krav 5 til semikvantitativ 20 bestemmelse af mindst 1.000 mg glucose pr. dl i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en bærematrix og et testmiddel inkorporeret deri, idet testmidlet omfatter (a) en borat-puffer, der kan modvirke pH-ænd-ringer i et område fra ca. 6,5 til ca. 12, og (b) en pH-in-25 dikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolorimetrisk respons i et pH-område fra ca. 6,5 til ca. 12.

8. Selvindikerende testmateriale til visuel semikvantitativ bestemmelse af glucosekoncentrationer i en vandig 30 testprøve uden anvendelse af et farvekort, kendetegnet ved, at dette materiale omfatter (a) et antal testmatrixer fastgjort til en understøtning, (b) idet hver testmatrix omfatter en bærematrix og 35 et testmiddel inkorporeret deri, (c) hvor hvert testmiddel indeholder bordihydroxid 25 DK 165715B eller et dihydroxid af et jordalkalimetal, som ved en indledende pH-værdi på over 6,5 kan danne et kompleks med glucose under frigørelse af en proton, samt en pH-indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart kolori-5 metrisk respons i et pH-område fra ca. 6,5 til ca. 12, (d) hvorhos hver testmatrix er inkorporeret med testmiddel, der er forskelligt fra det andet inkorporerede testmiddel gennem den anvendte indledende pH-værdi og gennem koncentrationen af bordihydroxid eller dihydroxid af jord-10 alkalimetal, der er inkorporeret, således at hver testmatrix er i stand til at give respons på en forskellig koncentration af glucose til tilvejebringelse af omtrentlig det samme visuelle kolorimetriske respons.

9. Selvindikerende testmateriale ifølge krav 8, kendetegnet ved, at dihydroxidet er bor- eller strontiumdihydroxid.

10. Fremgangsmåde til anvendelse af et selvindikerende 20 testmateriale ifølge krav 8 til semikvantitativ bestemmelse af i det mindste 1000 mg glucose pr. dl i en vandig testprøve uden sammenligning med et farvekort, kendetegnet ved, at man (a) bringer materialet i kontakt med en vandig test-25 prøve, der mistænkes for at indeholde glucose, og (b) bestemmer det antal bærematrixer, der har ændret farve.