DK165843B - Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af en sirup med et hoejt indhold af dextrose - Google Patents

Description

i

DK 165843 B

Den foreliggende opfindelse angår en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af en sirup med et højt indhold af dextrose og lav alkoholturbiditet eller -uklarhed ud fra et stivelseshydrolysat, hvilken fremgangsmåde er 5 ejendommelig ved, at stivelseshydrolysatet ved et pH i intervallet 4,5 til 8,0 bringes i kontakt med glucoamy-lase og et enzym afledt fra Bacillus megaterium, som udviser α-amylaseaktivitet.

10 Amylaser er en vigtig gruppe enzymer, som har en udbredt industriel anvendelse. De er karakteriseret ved evnen til at hydrolysere α-D-glucosidbindingen i stivelsesforbindelser, og kommercielt er deres hovedanvendelse inden for stivelsesbehandlingsteknologien. Stivelse, som er et 15 polysaccharid med betragtelig molekylvægt, kan hydrolyseres ved hjælp af en α-amylase til fremstilling af poly-saccharider med lavere molekylvægt indeholdende op til 10 monosaccharidenheder. Et sådant enzym betegnes et "flydendegørende" enzym, da det ved spaltning af stivel-20 sesmolekylet overfører en stivelsessuspension eller en tyk stivelsespasta til flydende form, der kaldes et stivelseshydrolysat. Andre amylaser katalyserer forskellige hydrolytiske operationer, f.eks. katalyserer 0-amylase hydrolyse af de ikke-reducerende ender af stivelse, gly-25 cogen- eller dextrinmolekyler afspalter fra et maltose-molekyle, mens glucoamylase katalyserer fjernelsen af glucose fra de ikke-reducerende ender af samme poly-eller oligosaccharider.

30 Enzymer, der udviser β-amylaseaktivitet, opnås fra en række forskellige naturlige kilder, f.eks. fra gærarter, svampe og bakterier, og skønt enzymer fra forskellige organismer har α-amylaseaktivitet og er i stand til at katalysere de hydrolytiske reaktioner, der generelt kata-35 lyseres af a-amylaser, afviger de ofte i henseende til de betingelser, under hvilke de opererer, specielt betingelser i henseende til temperatur og pH, og i industriel

DK 165843 B

2 praksis kan sådanne forskellige være af betydning.

I US patentskrift nr. 4 284 722 er der beskrevet en a-amylase fremstillet ud fra Bacillus stearothermophilus.

5 Dette enzym anvendes til at omdanne stivelse til et stivelseshydrolysat. Dette patentskrift nævner også, at enzymet kan anvendes med glucoamylase til fremstilling af en dextrosesirup. Det procentvise dextroseindhold baseret på faststoffer i siruppen fremstillet af denne enzym-10 kombination er imidlertid mindre end den procentdel dextrose, der opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Endvidere har den dextrosesirup, der fremstilles ved anvendelse af denne enzymkombination, en højere alkoholuklarhed end den, der opnås ved fremgangsmåden ifølge 15 opfindelsen.

Et højere udbytte af dextrose, selv så lidt som 0,5 %, er af betydning for industrielle producenter af dextrose, som fremstiller store mængder af denne sukkerart. En dex-20 trosesirup med lav alkoholuklarhed foretrækkes af kommer cielle producenter af sorbitol, som fremstiller dette produkt ved hydrogenering af dextrose. En dextrosesirup der udviser en lav alkoholuklarhed, giver bedre udbytte i denne proces.

25 I ansøgernes EP patentansøgning nr. 81 300 578.2 er der bl.a. beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer med amylaseaktivitet ud fra genetisk manipulerede mikroorganismer. Et antal donormikroorganismer er beskre-30 vet i patentansøgningen, som giver de genetisk manipulerede mikroorganismer gener, der koder for en række enzymer, som udviser amylaseaktivitet. En sådan donormikroorganisme beskrevet i EP patentansøgning nr. 81 300 578.2 er Bacillus megaterium NCIB 11568, skønt det enzym, der 35 fremstilles ud fra denne mikroorganisme, ikke er beskrevet som havende nogen egenskaber, som ville skille det ud fra de øvrige enzymer med amylaseaktivitet beskrevet som 3

DK 165843B

værende i stand til at kunne produceres ved fremgangsmåden ifølge nævnte EP patentansøgning. Det har imidlertid nu vist sig, at enzymet fra bacillus megaterium NCIB 11568, som har α-amylaseaktivitet, kan anvendes sammen 5 med glucoamylase til fremstilling af dextrosesirupper, der har højt dextroseindhold og lav alkoholuklarhed.

Følgelig angår opfindelsen en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af en sirup med højt indhold af dextrose 10 og lav alkoholuklarhed ud fra et stivelseshydrolysat, når stivelseshydrolysatet ved et pH i intervallet 4,5 til 8 bringes i kontakt med glucoamylase og et enzym afledt fra Bacillus megaterium, som udviser a-amylaseaktivitet.

15 For en given mængde glucoamylase kan forsukringstiden reduceres ved tilsætning af Bacillus megaterium a-amylase-enzym, eller for en given forsukringstid kan den mængde glucoamylase, der anvendes, reduceres ved tilsætning af Bacillus megaterium a-amylaseenzym. En højere koncentra-20 tion af opløste faste stoffer i stivelseshydrolysat-udgangsmaterialet kan anvendes (op til 10 vægt-% eller mere) til opnåelse af et produkt med samme dextrose-koncentration som den, der opnås, når glucoamylase anvendes alene. Alternativt eller samtidigt kan der ud fra et 25 standardstivelseshydrolysat-udgangsmateriale eller et udgangsmateriale med lidt forøget indhold af opløste faste stoffer fremstilles et produkt med en forøget dextrose-koncentration (forøget med 0,5 til 1 vægt-% baseret på fast stof) og en lavere koncentration af oligomere (DPn 30 reduceret til 0,2 vægt-% baseret på faste stoffer, hvor DPn står for dextrosepolymer, og n står for antallet af dextroseenheder i den polymere), forøget i forhold til den, der opnås, når glucoamylase anvendes alene eller i kombination med andre a-amylaser.

Alkoholuklarheden som nærmere defineret i det følgende reduceres. Alkoholuklarhed er en indikation for indholdet 35

DK 165843B

4 af oligomere komponenter i forsukringsproduktet.

Den proces, ved hvilken glucoamylase og a-amylaseaktivt enzym fra Bacillus megaterium anvendes sammen, udføres 5 foretrukkent ved en temperatur i området 40 til 65 °C, mere foretrukkent 55 til 60 °C. pH er foretrukkent 4,5 til 5,5, mere foretrukkent ca. 5. I almindelighed er temperaturen lavere jo lavere pH er og omvendt. Stivelseshydrolysat- f ødeblandingen kan indeholde 20 til 40 vægt-% 10 opløste faste stoffer, specielt 25 til 35 vægt-% opløste faste stoffer. Mængden af glucoamylase, som anvendes, er hensigtsmæssigt 0,05 til 0,40, foretrukkent 0,10 til 0,20 vægt-% af tørstofindholdet i maltodextrinen eller den flydendegjorte stivelse, og mængden af a-amylaseaktivt 15 enzym fra Bacillus megaterium er foretrukkent 0,02 til 10,0, mere foretrukkent 0,1 til 2,0 enheder/gram tørstof.

Det opnåede produkt kan indeholde mere end 96 vægt-% dextrose baseret på tørstof, foretrukkent mere end 97 vægt-%, især mere end 97,5 vægt-% dextrose baseret på 20 tørstof.

Udtrykkeisen af den Bacillus megaterium-amylaseaktive enzymkoncentration i enheder/gram tørstof er konventionel praksis i enzymteknologien og er nødvendig, fordi enzym-25 prøver kan udvise forskellige aktiviteter i afhængighed af f.eks. deres renhed etc. Aktiviteten af en given prøve bestemmes ved PHADEBAS-testen, som gør brug af et i handelen tilgængeligt testudstyr, og som er baseret på den optiske bedømmelse af styrken af en farve frigjort af 30 enzymet under omhyggeligt kontrollerede betingelser. Hvis aktiviteten af enzymet er fuldstændig ukendt, fortyndes prøver først med vand til fremstilling af et fortyndingsområde, som derpå afprøves ved metoden som beskrevet i det følgende for at finde den opløsning, som under prøve-35 betingelserne giver en optisk densitet af farvestoffet i det område, der er egnet til kvantitativ bestemmelse.

Prøven gentages derpå ved denne koncentration til sammen- 5

DK 165843B

ligning med en blankprøve.

Mere detaljeret anbringes 200 uliter fortyndet enzymprøve i et prøverør og blandes med 4 ml af en pufferopløsning.

5 Blankprøven består af 200 uliter demineraliseret vand og 4 ml pufferopløsning. Pufferopløsningen omfatter natriumacetat (20 mM) og calciumchlorid (2 mM) indstillet til pH

5. En PHADEBAS-tablet sættes derpå til hver prøve, prøven omrøres i 10 sekunder og anbringes i et godt omrørt vand-10 bad, hvor den holdes ved 55 °C i 15 minutter. En PHADEBAS-tablet indeholder et farvestof og en puffer, hvor virkningen af de to puffersysterner er en etablering af et endeligt pH på 6,3 i prøveopløsningen.

15 Efter 15 minutters forløb standses reaktionen ved tilsætning af 1 ml 0,5 molær natriumhydroxid, og prøven omrøres, før den centrifugeres ved ca. 1500 g i 5 minutter eller filtreres. Adsorbansen af prøven måles derpå ved 620 nm mod demineraliseret vand under anvendelse af en 20 cuvette med en lysvej på 1 cm. Adsorbansen af blankprøven subtraheres fra prøven, der undersøges, og amylaseenhe-derne for aktivitet bestemmes i enheder/liter ud fra PHADEBAS-standardkurven. Værdien i enheder/liter kan derpå overføres i enheder/gram tørstof.

25

Enzymer fra Bacillus megaterium kan også anvendes til at reducere alkoholuklarheden for dextrosesirupper, som er fremstillet ved glucoamylasehydrolyse. Disse sirupper bringes i kontakt med et α-amylase enzym fra Bacillus 30 megaterium under pH- og temperaturbetingelser som givet i det foregående for fremgangsmåden under anvendelse af dette enzym i kombination med glucoamylase. Alkoholuklarheden kan reduceres til et niveau, så at den kan elimineres helt ved påfølgende behandling med ionbyttere.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

35

DK 165843 B

6

Det anvendte apparatur i eksemplerne omfatter en række 500 ml Erlenmeyerkolber anbragt på en rysteramme i et termostatisk kontrolleret vandbad. I almindelighed omfattede fødematerialet 500 ml af en maltodextrinopløsning 5 indeholdende 0,02 molær natriumacetat som puffer for at hjælpe med at holde et stabilt pH. Opløsningen indeholdt også 80 mg Ca++/liter (i form af calciumchlorid). En indledningsvis pH-indstilling blev foretaget med eddikesyre og enzymet eller enzymerne tilsat for at initiere reak-10 tion. Reaktionens pH blev kontrolleret ved måling af pH for opløsningen med et pH-meter 2 gange dagligt og tilsætning af natriumhydroxid, hvis pH var faldet. En 100 ml prøve blev også udtaget for hver 24 timer, enzymet eller enzymerne blev denatureret ved kogning i 30 minutter, og 15 den denaturerede opløsning blev filtreret. Dextrose- indholdet i den filtrerede prøve blev derpå bestemt ved højtryksvæskechromatografi, og hvor det var hensigtsmæssigt, blev der udført en alkoholuklarhedsprøve.

20 Alkoholuklarhed måles ved: (a) anbringelse af en prøve i en 100 ml kolbe, således at der er 0,91 g opløst fast stof (som bestemt med re-fraktometer) til stede, 25 (b) tilsætning af demineraliseret vand, således at det totale tilstedeværende vandindhold er 3,39 g, (c) tilsætning af 27 ml ethanol med en renhed på 99,8 %, 30 (d) kogning under omrøring og tilbagesvaling i 9 til 10 minutter, (e) afkøling under rindende vand og 35 (d) måling af den optiske massefylde ved 578 nanometer i en 4 cm celle.

DK 165843B

7

Den i eksemplerne anvendte glucoamylase var "OPTIDEX® 150" fra Miles-Kali Chemie.

Indholdet af glucoamylase og dextrose er baseret på tør-5 stofindholdet i opløsningerne, og a-amylaseindholdet er enzymenheder pr. g tørstof, overalt i det følgende.

EKSEMPEL 1 10

Virkning af det a-amylaseaktive enzym fra Bacillus mega-terium NCIB nr. 11568 på den glucoamylase-katalyserede hydrolyse af 18 DE-maltodextrin til dextrose 15 Fødeopløsningen indeholdt 25 vægt-% opløste faste stoffer, og temperaturen blev holdt på 55 °C. Hydrolysen med glucoamylase alene blev udført ved pH 4,2, der betragtes som det optimale pH for denne reaktion. Når bacillus me-gaterium-enzymet blev tilsat, blev pH forøget til 5,0 i 20 optimet for omsætning med dette enzym. Følgende tabel giver dextroseindholdet for det efter 48 timers forløb opnåede produkt.

25 TABEL 1

Glucoamylase, Bacillus megaterium- Dextroseindhold, vægt-% enzym, enheder/gram vægt-% 30 - 0,10 - 95,0 0,14 · - 95,9 0,10 1,5 96,6 0,13 1,5 96,8 35 - EKSEMPEL 2

DK 165843 B

8

Virkning af et stigende indhold af opløst fast stof i reaktionsblandingen på hydrolysen af 18 DE-maltodextrin 5 til dextrose med det a-amylaseaktive enzym fra Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 og glucoamylase

Hydrolysen blev udført ved 60 °C og pH 5. Mængden af tilsat glucoamylase var 0,075 vægt-%, og mængden af Bacillus 10 megaterium-enzym 1,5 enheder/gram. Resultaterne fremgår af tabel 2.

TRBÉL 2 15

Opløste faste Dextroseind- stoffer, vægt-% Tid, timer hold, vægt-% 20 15 48 ' 95,6 15 96 97,9 25 48 94,0 25 96 97,0 35 48 91,6 25 35 96 95,7 30 35 EKSEMPEL 3

DK 165843 B

9

Virkning af glucoamylasekoncentrationen på hydrolysen af 18 DE-maltodextrin ved 60 aC med det a-amylaseaktive en-5 zym fra Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 og glucoamy-lase

Opløsningen indeholdt 25 % opløste faste stoffer, pH var 5, og koncentrationen af Bacillus megaterium-enzym var 10 1,5 enheder/g. Resultaterne efter 72 timers forløb var som følger i tabel 3.

TABEL 3 15

Glucoamylase, Dextroseindhold, vægt-% vægt-% 20 0,10 97,2 0,08 96,9 0,05 93,1 25 30 35 10 EKSEMPEL 4

DK 165843B

Virkning af varierende pH på hydrolysen af 12 DE-malto-dextrin ved 55 °C med det g-amylaseaktive enzym fra 5 Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 og glucoamylase

Pufferen i denne række eksperimenter var 0,1 molær natriumacetat, koncentrationen af glucoamylase 0,15 vægt-% og Bacillus megaterium-enzymet 1,5 enheder/gram.

10

Resultaterne efter 48 timers forløb fremgår af tabel 4 i det følgende.

TABEL 4 15

Dextroseindhold, pH vægt-% 20 4,6 96,0 4,8 96,6 5,0 96,8 5,2 96,4 5,4 96,1 25 -:- 30 35 11 EKSEMPEL 5

DK 165843B

Virkning af det a-arnylaseaktive enzym fra Bacillus mega-terium NCIB nr. 11568 på den glucoamylase-katalyserede 5 hydrolyse af 12 DE-maltodextrin ved 55 “C og pH 5 med varierende mængder glucoamylase og Bacillus megaterium-enzym

Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel 5.

10 TABEL 5 ' "" ........ "I—· ............... I ' I ......... I ...... J ' 15 Glucoamylase, vægt-% 0,10 0,075 0,05 0,04 0,03

Bacillus mega-terium-enzym, enheder/g 0,75 1,5 0,75 1,5 1,5 3,0 6,0 6,0 20_________

Timer 72 72 96 96 96 96 96 96

Dextrose- indhold, 25 vægt-% 97,1 97,0 97,5 97,3 97,397,7 95,8 93,1 30 35

DK 165843B

12 EKSEMPEL 6

Sammenlignende forsøg under anvendelse af en i handelen tilgængelig α-amylase i kombination med glucoamylase 5

Reaktionsbetingelserne var som i eksempel 1 dvs., at forsøgene med Termamyl tilsat blev gennemført ved pH 5,0 med undtagelse af, at fødeopløsningen indeholdt 32 vægt-% opløste faste stoffer. Resultaterne efter 96 timers forløb 10 fremgår af tabel 6 og viser, at ulig det a-amylaseaktive enzym afledt fra Bacillus megaterium giver den i handelen tilgængelige e-amylase ingen forbedring af glucoamylase-hydrolysen, selv efter 96 timers forløb.

15 TABEL 6 0,18 vægt-% glucoamylase plus 20 -- 0,18 vægt-%

glucoamylase A B

Dextrose i pro- 25 dukt, vægt-% 93,7 93,6 94,3

Alkohol-uklarhed 0,240 0,490 0,043 30 A = 5,6 enheder/gram "Termamyl", en i handelen tilgængelig a-amylase B = 1,5 enheder/gram af det a-amylaseaktive enzym fra 35 Bacillus megaterium NCIB nr. 11568.

DK 165843 B

EKSEMPEL 7 13

En prøve dextrosesirup, som var blevet fremstillet ved en glucoamylase-katalyseret hydrolyse, indeholdt 95,8 vægt-% 5 dextrose og havde en alkohol-uklarhed på 1,550.

Prøven blev delt i to og underkastet behandling ved 55 °C og pH 5,0 i 24 timer med (a) det α-amylaseaktive enzym fra Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 og (b) "Termamyl", 10 en i handelen tilgængelig α-amylase. Behandlingsresultaterne fremgår af tabel 7.

TABEL 7 15 --- a-Amylaseaktivt enzym fra Bacil- I handelen tilgængelus megaterium lig a-amylase 20 0,025 U/g 0,5 U/g 0,075 U/g 0,15 U/g 0,3 U/g

Dextrose 95,5 95,3 95,7 95,5 95,3

Alkohol- 25 uklarhed 0,176 0,045 1,410 1,380 1,240 U/g = enheder/gram 30 35

Claims (10)

1. Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af en sirup 5 med højt indhold af dextrose og lav alkoholuklarhed ud fra et stivelseshydrolysat, kendetegnet ved, at stivelseshydrolysatet ved et pH i intervallet 4,5 til 8,0 bringes i kontakt med glucoamylase og et enzym afledt fra Bacillus megaterium, som udviser α-amylaseaktivitet. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Bacillus megaterium er Bacillus megaterium NCIB nr. 11568.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller krav 2, kende tegnet ved, at den gennemføres ved en temperatur i intervallet 40 til 65 °C.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 20 ved, at temperaturen ligger i intervallet 55 til 60 °C.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kende t. egnet ved, at pH ligger i intervallet 4,5 til 5,5. 25

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at pH er ca. 5,0.

7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-6, 30 kendetegnet ved, at stivelseshydrolysatet er en maltodextrin eller en flydendegjort stivelse.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegne t ved, at maltodextrinen indeholder 20-40 vægt-%, foretruk- 35 kent 25 til 35 vægt-% opløste faste stoffer. DK 165843B

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at den mængde glucoamylase, som anvendes, ligger i intervallet 0,05 til 0,40, foretrukkent 0,10 til 0,20 vægt-% af tørstofindholdet i maltodextrinen eller 5 den flydendegjorte stivelse.

10. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 7-9, kendetegnet ved, at den mængde enzym afledt fra Bacillus megaterium, der anvendes, ligger i interval- 10 let 0,02 til 10,0, foretrukkent 0,1 til 2,0 enheder pr. g tørstof af maltodextrinen eller den flydendegjorte stivelse. 20 25 30 35