DK167882B1 - Atypisk stamme af bacillus stearothermophilus med evne til at danne alginat-lyase, fremgangsmaade til fremstilling af alginat-lyase, alginat-lyase, enzymadditivindeholdende alginat-lyase, samt fremgangsmaade til bekaempelse af forurening af et koelevandssystem under anvendelse af alginat-lyase - Google Patents

Description

DK 167882 B1

Denne opfindelse angår en hidtil ukendt atypisk stamme af Bacillus stearothermophilus med evne til at danne alginat-lyase, en fremgangsmåde til fremstilling af alginat-lyase, en hidtil ukendt alginat-lyase, et enzymadditiv indeholdende alginat-lyasen, samt en fremgangsmåde til bekæmpelse af forurening 5 af et kølevandssystem under anvendelse af alginat-lyasen.

Det er kendt, at ukontrolleret vækst af mikroorganismer i et kølevandssystem (der recirkulerer vandet) kan føre til dannelse af aflejringer, der frembringer forurening, korrosion og belægninger. Slim kan tilstoppe rør, hindre varmetilførsel eller i det hele taget forstyrre kølevandssystemets drift. Man har fundet ud af, at 10 tilstedeværelse af algerne Chroococcus, Oscillatoria og Chlorococcus i kølevandssystemer har været årsag til forurening. Ydermere lader det til, at algeslim bliver voksested for korrosive bakterier og måske patogene bakterier.

Alginsyre (alginat), som er et polysaccharid, udgør hovedbestanddelen af algecellevægge. I nogle algearter såsom Fucus distichus udgør alginat op til 60% 15 af den totale cellevæg. Udover alger danner nogle bakterier, der er almindeligt forekommende i koldt vand, f.eks. Pseudomonas spp., en extracellulær poly-saccharidpolymer (slim), hvilket resulterer i forurening, dannelse af gasarter og beskyttelse af korrosive bakterier i kølevandssystemer. Man har identificeret den extracellulære polysaccharidpolymer (slim), fremstillet af nogle Pseudomonas spp., 20 som alginat (L.R. Evans et al., J. Bacteriol. 1973,116:915-924).

Alginat er en copolymer af tre strukturblokke, poly-ø-D-mannuronsyre (poly-M), poly-a-L-guluronsyre (poly-G) samt blokke, i hvilke begge uronsyrer er tilstede, hvad der anses som værende en alternerende sekvens (poly-MG) (A. Haug et ak, Acta Chem.Scand. 1967, 21:691-704).

25 Virkningen af enzymer såsom alginat-lyaser, der er i stand til at depolymerisere alginat i alge-cellevæggen og slim fra Pseudomonas spp., kan således medføre nedbrydning af disse organismer og/eller forøge disses modtagelighed overfor de kemiske biocider, der almindeligvis findes i kølevandssystemer.

Et hvilket-som helst af resultaterne gør disse generende mikroorganismer 30 ulevedygtige, hvilket er højst ønskeligt ved en optimal drift af kølevandssystemer.

DK 167882 B1 2

Opfindelsens formål er tilvejebringelsen af en alginat-lyase, der har forbedret termostabilitet og er effektiv i køievandssystemer.

Yderligere formål og fordele ifølge opfindelsen vil fremgå klart af beskrivelsen heraf i det følgende.

5 Alle alginat-lyase-enzymer, der er karakteriseret før datoen for denne beskrivelse, inklusive de fra ikke-bakterie-kilder, synes at katalysere en eliminase-reaktion, ved hvilken der under spaltning af uronsyrepolymeren dannes en ikke-reducerende Δ 4,5 umættet binding (I.W. Sutherland In I. Sutherland (ed.), "Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell", 1977, s. 209-245, Academic Press, Inc., 10 London). Forskellige alginat-lyaser viser en præference for guluronat- eller mannuronatblokke i alginat-polymeren; De kan således karakteriseres som guluronidase eller mannuronidase (I.W. Davidson et al., J. Gen. Microbiol., 1977, 98:223-229).

Adskillige bakterier vides at producere enzymer, der kan nedbryde 15 alginat, men de fleste af disse alginat-lyase-producerende bakterier er havisolater (R.S. Doubet et al., Appl.Environ. Microbiol. 1982, 44:754-756 og V.L. von Riesen, Appl.Environ.Microbiol., 1980, 39:92-96). Enkelte karakteriserede alginat-lyaser er blevet isoleret fra bakterier af terrestrisk oprindelse: eksempler herpå omfatter sådanne fra Klebsiella aerogenes (J. Boyd et al., Carbohydr.Res., 1977,57:163-171) 20 og Bacillus circulans (J.B. Hansen et al., Appl.Environ.Microbiol., 1984,47:704-709). Der er hidtil ikke rapporteret om termofile, gram-positive alginat-lyase-producenter.

Alginat-lyasen ifølge opfindelsen fremstilles extracellulært fra en termofil Bacillus sp. Den har bedre termostabilitet end kendte alginat-lyaser og bevarer 100% af sin aktivitet efter 4 timers behandling ved 60°C uden tilstedeværelse af substrat.

25 Den foretrukne producer-stamme (W36-7-4) (NRRL B-18394) til alginat- lyasen ifølge opfindelsen er taksonomisk bestemt som en stamme af Bacillus stearo-thermophilus, der er atypisk ved at gro ved pH 5,7. Det betydelige antal af andre B. stearothermophilus stammer, der er blevet testet, producerer ikke alginat-lyase. Ti stammer blev testet, nemlig NRRL B5407, ATCC 12980-typestamme; ATCC 7953,

30 10149, 31783, 31195, 31196, 31197, 81198 og 31199. Endvidere danner andre Bacillus sp. stammer, der blev testet, ikke alginat-lyase, d.v.s. B. coagulans ATCC

DK 167882 B1 3 7050; B. licheniformis ATCC 14580; B. subtilis ATCC 6633; og B. cereus ATCC 11778. Således er den atypiske S. stearothermophilus stamme, hvor alginat-lyasen er et frit extracellulært enzym, der kan tilføres, også atypiske ved, at den kan danne enzymet.

5 Den detaljerede redegørelse for alginat-lyasen ifølge opfindelsen angår anvendelsen af lyasen som et algebekæmpelsesmiddel og slimhæmmer i kølevandssystemer (hvori vandet recirkulerer). Der kan findes andre anvendelser af alginat-lyasen, f.eks. ekstrahering af cellulære bestanddele fra alger.

Til yderligere forståelse af opfindelsen henvises der til tegningerne, hvori: 10 Figur 1 grafisk viser aktiviteten af alginat-lyasen fra atypisk Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4, (NRRL B-18394) som en funktion af pH og temperatur.

Figur 2 grafisk viser en sammenligning af termostabiliteten ved 60°C mellem alginat-lyaser fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 (·), Bacillus circulans (ATCC 15518) (□) and Xanthomonas maltophilia (ATCC 13637) (X).

15 Som det fremgår af figur 2 var alginat-lyasen ifølge opfindelsen overlegen hvad angår termostabilitet i forhold til alginat-lyaser fra Bacillus circulans (ATCC 15518) og fra Xanthomonas maltophilia (ATCC 13637). Efter fire timers varmebehandling ved 60°C i fraværelsen af substrat beholdt enzymet ifølge opfindelsen 100% af dets oprindelige aktivitet, hvorimod enzymet fra Bacillus circulans totalt 20 tabte dets oprindelige aktivitet, og enzymet fra Xanthomonas maltophilia tabte 88% af dets oprindelige aktivitet.

Kendetegnene for termostabiliteten af alginat-lyasen ifølge opfindelsen, dvs at den er stabil ved 60°C, er den væsentligste fordel, da 60°C ligger i den høje ende af det sædvanlige temperaturområde, ved hvilket kølevandssystemer drives.

25 Således er evnen til at depolymerisere alginat-komponenten af algecellevægge og slim fremstillet ved hjælp af Pseudomonas spp. i kølevandssystemer, som alginat-lyasen ifølge opfindelsen er i besiddelse af, ledsages af et ønskværdigt højt niveau af (termo) stabilitet i sådanne systemer.

DK 167882 B1 4 Når en algecellesuspension (opnået fra et kølevandstårn) blev behandlet med alginat-lyasen ifølge opfindelsen, opnåedes en kvantitativ frigørelse af umættet uronsyreenheder (vist i tabel I). Resultaterne viser, at alginat-komponenten af algecellevæggende nedbrydes af alginat-lyasen. Efter 60 minutters enzymbehandling 5 kan man under mikroskop se algecellevæggen med meget små huller.

Således omfatter denne opfindelse endvidere en fremgangsmåde til bekæmpelse af forurening af et kølevandsystem med alger og Pseudomonas spp., kendetegnet ved, at man tilsætter en effektiv mængde af alginat-lyasen ifølge opfindelsen.

10 Det er ikke blot alger, der påvirkes af alginat-lyasen. Det ses tydeligt (se tabel III), at alginat-lyasen også kan depolymerisere alginat-polymeren fremstillet ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), hvilken alginat-polymer også er en plagsom mikrobe, der er tilstede i kølevandssystemer. P. aeruginosa's modstandsdygtighed mod behandling af kølevandssystem med biocider menes at 15 skyldes en hinde som indeholder alginat. Behandling af Pseudomonas aeruginosa med alginat-lyasen ifølge opfindelsen fjerner polymerlaget, og det menes at forbedre modtageligheden overfor organismerne mod biociderne.

Udover alginat indeholder algecellevægge også laminarin, en polysac-charid, der kan depolymeriseres ved hjælp af ø-glucanase. Man kan opnå en 20 kombination og evt. en synergistisk effekt til nedbrydning af algecellevægge ved tilsætning af både en kommerciel tilgængelig ø-glucanase (f.eks. Ceremix® 2X L) og alginat-lyasen ifølge opfindelsen som vist i tabel II. Faktisk er Ceremix® 2X L en blanding af enzymaktiviteter, især Ø-glucanase, a-amylase og proteaseaktiviteter, men kommercielt tilgængelige enzymprodukter indeholder ofte en væsentlig del af 25 bi-aktivitetsenzymer.

Følgelig omfatter denne opfindelse endvidere en fremgangsmåde til bekæmpelse af forurening af et kølevandssystem med alger og Pseudomonas spp., hvori man tilsætter en effektiv mængde alginat-lyase ifølge opfindelsen og yderligere en effektive mængde ø-glucanase til vandet. En foretrukken Ø-glucanase er 30 Ceremix®, der med fordel vil virke på grund af tilstedeværelsen af andre ønskværdige enzymaktiviteter. Evt. kan der sammen med de to enzymer ellerfor den DK 167882 B1 5 sags skyld i stedet for ø-glucanase være biocidkemikalier tilstede (f.eks. glutaraldehyd, hydrazin), der ikke virker hæmmende på enzymet (enzymerne).

Med fordel er alginat-lyasen ifølge opfindelsen forenelig med de forskellige kemikalier, der almindeligvis anvendes nu om dage ved brug til 5 behandling af kølevandssystemer, f.eks EDTA, glutaraldehyd. Som angivet i tabel IV beholder alginat-lyasen 100% af dets enzymaktivitet efter 16 timers inkubation med cheleringsmidler, forskellige oxidanter og typiske korrosionsinhibitorer. De testede kemikalier lå på 10mM færdig koncentration, hvilket er ca. 10 gange højere end den sædvanlige dosis, der anvendes ved behandling af kølevandssystemer (100 PPM).

10 Det er således muligt at anvende enzymet ifølge opfindelsen i kombination med kemikalier til behandling af vand, og specielt med de kemikalier, der almindeligvis hidtil er anvendt til at løse problemet med mikrober i kølevandssystemer.

I henhold til et yderligere aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af alginat-lyase, der er kendetegnet ved, at man 15 dyrker stammen Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394 eller mutanter heraf med væsentligt samme egenskaber under submerse betingelser i et kulturmedium indeholdende egnede kulstof- og kvælstofkilder og dernæst udvinder enzymet fra kulturvæsken.

Som allerede nævnt er alginat-lyasen ifølge opfindelsen velegnet til 20 anvendelse til reduktion af forurening med mikroorganismer i systemer med vand, især systemer med recirkulerende vand, såsom koldtvandsbeholdere eller genbrugsvand i papir- og pulpindustrien (f.eks. "white water" eller "back water"). Enzymet kan anvendes ved temperaturer fra stuetemperatur til 70°C, især 40-60°C og ved pH 4-9, især 5-8. Et koncentrat i fast eller flydende form af alginat-lyasen 25 tilsættes det recirkulerende vand i effektive mængder. Der kan gives gode råd med hensyn til den minimale effektive mængde, da hvert system med vand kan være specielt, f.eks. rent eller meget forurenet vand, lavt eller højt mineralindhold i vandet (zink og natriumchlorid viser sig delvist at hæmme enzymet), hyppighed for dosering af enzymet, f.eks. kontinuert, ugentligt, månedligt, evt. indhold af biocid og om β-30 glucanase, f.eks. Ceremix® 2X L også er tilstede i systemet. Det anbefales at udtage en prøve til bestemmelse af den minimale effektive enzymdosis. Normalt vil det være DK Tb/bbZ bl 6 tilstrækkeligt med noget mindre end de koncentrationer, der angives i eksemplerne senere.

En effektiv mængde alginat-lyase ifølge opfindelsen, f.eks. 2500 enheder pr. liter vand og måske mindre, der skal behandles, kan tilsættes til vandet. Større 5 mængder end 2500/1 alginat-lyase kan selvfølgelig også anvendes, hvis det ikke er for dyrt. 2.5 ml til 25 ml Ceremix® 2X L i kombination med de 2500 u/l alginat-lyase skulle være ret effektivt. Almindeligt anvendte biocider kan også anvendes sammen med alginat-lyasen (da enzymet ikke hæmmes af de fleste biocider) ved koncentrationen på 100 PPM, hvilket er den sædvanlige anbefalede mængde (1987 10 Guide to water treatment chemicals).

Mikroorganismerne ifølge opfindelsen er et aerobt Bacillus isolat af atypisk Bacillus stearothermophilus. Den bedste producentstamme W36-7-4 (NRRL B-18394) blev deponeret ved Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, U.S.A., under Budapesttraktatens betingelser.

15 Mutanter af denne stamme, W36-7-4 (NRRL B-18394) med væsentligt samme egenskaber ligger også indenfor opfindelsens omfang. Andre lyasedannende stammer af den atypiske Bacillus stearothermophilus er undersøgt (relativt overfladisk). Alginat-lyasen, der er eksemplificeret i denne beskrivelse, udgør den foretrukne udførelsesform. Alginat-lyasen ifølge opfindelsen kan fremstilles ved 20 hjælp af en transformeret værtsorganisme (celle). Den native alginat-lyase er et induceret enzym, men kan fremstilles konstitutivt i muterede eller transformerede celler.

Væksttemperaturen af stamme W36-7-4 er 50°C til 60°C, ringe vækst ved eller over 60°C. Optimal pH for vækst af stamme W36-7-4 er 7. Nul-vækst foregår 25 ved eller over pH 8.0.

På nærings-agarskrårør er modne kolonier af stamme W36-7-4 gennemsigtige og med glatte overflader.

En rudimentær indikation af alginat-lyaseaktivitet er en forøgelse i viskositet af en 0,5% natriumalginat-opløsning. Kvantitative beregninger af alginat-30 lyase-reaktionen er udført ved hjælp af nedenstående metoder: DK 167882 B1 7 (a) Forøgelse i U.V.-absorbans ved 230 nm (J. Boyd et al., Carbohydr.Res. 1977, 57:163-171). Til en 2 ml natriumalgesyreopløsning (0,1%, 0,25% eller 0,5%), som blev fremstillet i 10mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0 indeholdende 10mM MgCI2, blev 0,1 ml af en tilpas fortyndet enzymvæske tilsat, og 5 reaktionsblandingen blev inkuberet ved 55°C i 2 timer under kraftig omrøring. Ved slutningen af inkubationstiden blev forøgelsen i absorbans ved 230 nm målt ved hjælp af et spektrofotometer. En enhed blev defineret som mængden af alginat-lyase, der gav en forøgelse på 0,001 OD-enhed (230 nm) pr. minut ved en nærmere angivet temperatur, sædvanligvis 55°C.

1 o (b) Reduktionskraft. Substratopløsningen var identisk med ovenstående.

Substratopløsning (2 ml) og enzymopløsning (1 ml) blev inkuberet ved 55°C i 2 timer, og dinitrosalicylatreagens (2 ml) blev derefter tilsat. Reduktionskraften som mannuronsyre blev bestemt som beskrevet af G. Noelting et al., (G. Noelting et al., Helv.Chim.Acta., 1948,31:286-290). En aktivitetsenhed blev defineret som mængden 15 af enzym, der kunne frigøre reduktionskraften svarende til 0,123 mg mannuronsyre under de nævnte nedbrydningsbetingelser.

(c) Thiobarbitursyreforsøg. Substratopløsningen var identisk med ovennævnte. Substratopløsningen (2 ml) og enzymopløsning (1 ml) blev inkuberet ved 55°C i 2 timer. Udbyttet af umættet uronsyre blev bestemt ved periodat/-20 thiobarbitursyre-metoden (TBA-metoden) ved Weissbach og Hurwitz (A. Weissbach et al., J.Biol.Chem. 1959,234:705-709). Enzymaktivitetsenheden blev defineret som mængden af enzym, der kunne frigøre, hvad der svarer til 1 pmol pr. minut af formylpyruvinsyre; 0,01 jumol dannede en OD549 af 0,29 i prøven.

Som det fremgår af figur 1 (a) blev den optimale aktivitet af alginat-lyasen 25 fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 iagttaget ved pH ca. 7. Det er overraskende, at alginat-lyasen ifølge opfindelsen udviser et temperaturoptimum omkring 50°C som vist i figur 1(b), da de mikroorganismer, der fremstiller enzymet, er termofile.

Alginat-lyasen fra stamme W36-7-4 udviste ikke blot et højt temperatur-30 optimum, men udviste tillige god termostabilitet ved 60°C som vist i figur 2. Alginat-lyase fra Bacillus circulans ATCC15518) og Xanthomonas maltophilia (ATCC13637) DK 167882 81 8 tabte henholdsvis 55 og 29% af den oprindelige aktivitet efter en times varmebehandling ved 60°C. Enzymet ifølge opfindelsen bibeholdt 100% af dets enzymaktivitet gennem fire timers varmebehandling.

Bacillus stearotherophilus stamme W36-7-4 (NRRL B-18394) kan dyrkes 5 under aerobe betingelser i en næringsmedium indeholdende assimilerbart kulstof og kvælstof sammen med andre væsentlige næringsmidler. Mediet per se anses ikke for at være en del af opfindelsen, og kan formuleres i henhold til de i teknikken kendte retningslinier til dyrkning af Bacillus stearothermophilus stammer.

Om ønsket kan natriumaiginat anvendes som kulstofkilden og til at 10 inducere enzymet. Alginat-koncentrationen, der er inkorporeret i mediet kan variere meget, hvor f.eks. 0,1 til 1% med 0,5% koncentration i opløsningen af mediet er passende.

Kvælstofkilden i næringsmediet kan være af organisk eller inorganisk art. Blandt mulige organiske kvælstofkilder anvendes et antal regelmæssigt i 15 gæringsprocesser (omfattende dyrkning af bacilli) såsom sojamel, bomuldsfrøkage, peanutmel, majsstøbevand og gærekstrakt. Derudover bør næringsmediet endvidere indeholde de sædvanlige sporstoffer.

Da den atypiske B. stearothermophilus ifølge opfindelsen er termofil, udføres dyrkningen ved relativt høje temperaturer (f.eks. 55°C). Til dyrkning af 20 stamme W36-7-4 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber i gæringstanke anbefales kunstig beluftning. Beluftningshastigheden kan være som den, der anvendes i konventionelle gæringstanke (submers).

Efter gæring kan produktet alginat-lyase (som er dannet ekstracellulært) fremstilles i flydende form ved fjernelse af groft materiale fra gæringsvæsken og 25 derefter ved koncentrering af væsken ved konventionelle metoder, f.eks. inddampning ved lav temperatur eller ved ultrafiltrering. Endelig kan konserveringsmidler tilsættes til koncentratet.

Alginat-lyasen ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved dyrkning af en transformeret mikroorganismecelle indeholdende et gen, der koder for og udtrykker 30 alginat-lyasen, der er dannet ved dyrkning af den atypiske Bacillus stearothermophilus ifølge opfindelsen, efterfulgt af udvinding af enzymet fra DK 167882 B1 9 kulturvæsken. Nævnte transformerede værtsorganisme omfatter en værtscelle, hvori genet for alginat-lyasen ifølge opfindelsen og expressions-DNA er indsat ved rekombinant DNA teknik. Denne teknik er kendt i litteraturen, og omfatter sædvanligvis følgende trin: 5 a) tilvejebringelse af en egnet rekombinant DNA-kloningsvektor omfattende DNA-sekvens, der koder for funktioner, der letter genudtrykkelsen og en DNA-sekvens, der koder for Bacillus alginat-lyasen; b) transformering af en egnet værtsorganisme med kloningsvektoren fra trin a); og derefter 10 c) dyrkning af den transformerede vært i et egnet kulturmedium og udvinding af alginat-lyasen fra kulturmediet.

Foretrukne værtsorganismer er stammer af Bacillus, især Bacillus subtilis.

Enzympræparater i fast form kan om ønsket fremstilles fra den 15 oprensede og/eller koncentrerede gæringsvæske ved udfældning med salt såsom Na2S04 eller med vandblandbare opløsningsmidler såsom ethanol eller acetone. Fjernelse af alt vand i gæringsvæsken ved egnede tørremetoder såsom spraytørring kan også anvendes. Aktiviteten af rå alginat-lyase-præparater, der er fremkommet på den måde ved dyrkning af NRRL B-18394, ligger sædvanligvis omkring 5000 20 enheder/g pulver.

Enzymadditivet ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at det omfatter alginat-lyasen ifølge opfindelsen og at nævnte additiv foreligger i form af et ikke-støvende granulat eller en stabiliseret væske.

Ikke-støvende enzymgranulater er velkendte, og kan f.eks. fremstilles i 25 henhold til hollandsk patentansøgning nr. 167,993 (Novo Nordisk A/S), US patent nr. 4,106,991 (Novo Nordisk A/S) eller US patent nr. 4,661,452 (Novo Nordisk A/S), og granulatet kan om ønsket overtrækkes i henhold til kendte metoder.

DK Ί67882 ΒΊ 10

Et flydende alginat-lyase-præparat kan stabiliseres, f.eks. ved tilsætning af propylenlgycol, andre polyoler, sukkerarter, sukkeralkoholer og borsyre. Andre kendte enzymstabiliseringsmidler kan anvendes.

Følgende eksempler beskriver fremstilling af enzymet, karakterisering 5 deraf og mulige anvendelser deraf.

EKSEMPEL 1

Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 (NRRL B-18394) blev dyrket ved 55°C på et rystebord (250 rpm) i 250 ml Erlenmeyer kolber med tredobbelt baffelanordning indeholdende 50 ml af et medium med nedenstående io sammensætning:

Sammensætning af mediet i gram pr. liter:

Trypton 1,0 (NH4)2S04 2,0 KH2P04 1,3 15 Na!2*"*P04 3’5

MgCII2‘2H2° °·2

CaCI2-2H20 0,2

Natriumalginat 5,0

Det var ikke nødvendigt at indstille pH af mediet. Efter 30 timers 20 inkubation blev alginat-lyase-aktiviteten af gæringsvæsken bestemt under anvendelse af U.V.-absorbans-prøven som tidligere beskrevet. Alginat-lyase-aktiviteten af W36-7-4 væsken var 21 U/ml med 0,1% natriumalginat som substratet.

EKSEMPEL 2 pH-aktivitets- og temperatureaktivitetskurverne for rå alginat-lyase fra Bacillus 25 stearothermophilus stamme W36-7-4 CNRRL B-183941_

Alginat-lyase-aktivitet (forøgelse af OD-værdi ved 230 nm) ved 55°C blev undersøgt med natriumalginat som substratet. Konstante mængder af substrat, DK 167882 B1 11 enzym og MgCI2 (10mM) var tilstede i alle reaktioner. Citrat-phosphat-puffer blev anvendt mellem pH 5,0 og 6,5 og phosphat-puffer blev anvendt mellem pH 6,0 og 8,0. Den maksimale aktivitet blev iagttaget omkring pH 7,0, se figur 1a.

Temperaturaktivitetskurven blev udarbejdet ved undersøgelse af alginat-5 lyase-aktiviteten ved temperaturer mellem 30°C til 70°C i 10mM MgCfø. Maksimumaktiviteten blev iagttaget omkring 50°C, se figur 1 b.

EKSEMPEL 3

En sammenligning af termostabiliteten mellem alginat-lyaser fra Bacillus stearo-thermophilus stamme W36-7-4 (·), Bacillus circulans (ATCC 15518) (□) and 10 Xanthomonas maltoohilia (ATCC 13637) (XI_

Alle 2.0 ml af en rå enzymopløsning blev varmebehandlet ved 60°C under anvendelse af den samme puffer, der blev anvendt i det foregående eksempel. Varmebehandlingen varede i 4 timer. Straks derefter blev opløsningen nedkølet til stuetemperatur i kold vandbad, og restenzymaktiviteterne blev målt under 15 anvendelse af natriumalginat som substratet. Efter 4 timers inkubation bibeholdt alginat-lyase fra stamme W36-7-4 100% af dets oprindelige aktivitet, hvorimod enzymet fra Bacillus circulans og Xanthomonas maltophilia henholdsvis tabte 100% og 88% af deres oprindelige aktivitet, se figur 2.

EKSEMPEL 4 20 Frigørelse af umættet uronsyreenheder fra alginat-komponenten af algecellevægge ved hiælp af alainat-lvase fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4_ 2.0 ml af algesuspensioner opnået fra et kølevandstårn i fabrik, der var bragt til en endelig koncentration ved hjælp af en 10mM fosfatpuffer, pH 7,0, blev behandlet-med forskellige mængder alginat-lyase fra stamme W36-7-4 ved 37°C.

25 Frigørelsen af 4-deoxy-1-erythro-hex-5-ulosuronsyre blev undersøgt ved måling af U.V.-absorptionsevnen ved 230 nm; de fremkomne resultater ses i tabel I.

Tabel I

DK 167882 ΒΊ II Δ OD230nm 12 5 Inkubationstid 0 mg 3 mg 5 mg

Enzym Enzym* Enzym -1- 3,5 timer || 0 0 0,7 15,0 timer || 0,05 0,4 1,30 10 22,5 timer || 0 1,25 3,05 * Enzym blev tilsat som rå enzymlyophiler på ca. 5000 U/g EKSEMPEL 5

Kombinationseffekten af j3-glucanase, dvs. Ceremix® 2X L, og alginat-lyasen fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 ved nedbrydning af alginat-komponent 15 i alaecellevæaae_

Algesuspensionerne svarede til de i eksempel 4 anvendte. Alginat-lyasen blev doseret i mængder af 5 mg af det rå enzymlyophil pr. 2 ml algecellesuspension, og det kommercielle Novo Nordisk produkt Ceremix® 2X L blev tilsat ved 50 /il pr. prøve. Nedbrydning blev undersøgt som beskrevet i eksempel 4.

20 En synergistisk effekt af Ceremix® 2X L og alginat-lyase ved nedbrydning af algecellevægge ses tydeligt, som det fremgår af tabel II.

13 Δ OD230nm DK 167882 Bl

Tabel II

5 5 mg alginat-lyase

Inkuba- 5 mg 50 μΐ +

tions- Intet alginat-lyase Ceremix® 2X L 50 μΐ tid Enzym alene alene Ceremix® 2X L

10 ----- 4 t II 0 I 0,75 I o I 0,81 23 t || 0 I 3,24 I 0,35 | 5,70 74 t || 0 I 5,49 I 0,85 | 7,13 EKSEMPEL 6 15 Nedbrydningsevnen af alginat-lyase fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 for alginat-polymer fremstillet ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 1 ml suspension af friskdyrket Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) med OD ved 660 nm på 0,43 blev blandet med 5 mg og 10 mg alginat-lyase-20 lyophiler og inkuberet ved 37°C i 30 minutter, 1 timer og 2 timer. Frigørelsen af den umættede uronsyreenhed blev undersøgt ved absorbans ved 230 nm som ovenfor beskrevet. Blindprøvetesten blev udført under de samme betingelser uden tilsætning af enzym. Resultaterne fremgår af tabel III.

Δ OD230nm

Tabel XII

DK 167882 B1 14 5 Inkubationstid 0 mg 5 mg 10 mg

Enzym Enzym Enzym -1-=- 1/2 time || 0 0,15 0,245 1 timer || 0 0,27 0,51 10 2 timer || 0 0,65 1/41 EKSEMPEL 7

Effekten af kemikalier, der sædvanligvis anvendes i kølevandssystemer, på aktiviteten af alainat-lvase fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4_ EDTA (ethylendiamintetracetat), NaCI, FeS04, NaAlOa Na2Mo04, Zink, 15 glutaraldehyd, hydrazin og natriumnitrit blev testet ved den endelige koncentrering til 10mM. Alginat-lyase-aktiviteten blev undersøgt som beskrevet i eksempel 2 i løbet af 16 timers inkubation. Resultaterne opsummeres i tabel IV. Alginat-lyase fra Bacillus stearothermophilus stamme W36-7-4 viser sig at være rimelig stabil i tilstedeværelse af forskellige oxidanter, metalchelatorer og salte, der almindeligvis anvendes i 20 kølevandssystemer som forureningsbekæmpelsesmidler, biocider, koagulerings-midler/-flokkuleringsmidler, korrosionshæmmere, osv.

DK 167882 B1 15

Tabel IV

Inhibering (%) af kemikalier Kemikalier på enzvmaktiviteten

EDTA O

5 NaCI 48,7

FeS04 O

NaAI02 O

Na-MoC^ O

Zink 43,7

10 glutaraldehyd O

hydrazin O

NaN02 O

Claims (10)

1. Atypisk stamme af Bacillus stearothermophilus, kendetegnet ved, at den har evnen til at danne aiginat-lyase, har vækst ved pH 5,7 og har optimal temperatur til vækst ved 55-60°C med næsten nul-vækst under 30°C, og er en biologisk ren 5 kultur af stammen Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394 eller en mutant heraf med væsentligt samme egenskaber.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af aiginat-lyase, kendetegnet ved, at man dyrker stammen Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394 eller mutanter heraf med væsentligt samme egenskaber under submerse betingelser i et kulturmedium 10 indeholdende egnede kulstof- og kvælstofkilder og dernæst udvinder enzymet fra kulturvæsken.

3. Aiginat-lyase, kendetegnet ved, at det har evnen til at nedbryde algecellevægge og nedbryde alginat-polymeren fremstillet ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa, og hvor nævnte aiginat-lyase bibeholder 100% aktivitet 15 efter 4 timers varmebehandling ved 60°C, og er identisk med det enzym, der dannes ved dyrkning af Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394.

4. Aiginat-lyase ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er dannet ved dyrkning af Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394.

5. Enzymadditiv til kølevandssystmer, kendetegnet ved, at det omfatter 20 alginat-lyasen ifølge krav 3 eller 4, og at nævnte additiv foreligger i form af et ikke- støvende granulat eller en stabiliseret væske. DK 167882 B1 17

6. Enzymadditiv ifølge krav 5, kendetegnet ved, at alginat-lyasen er dannet ved dyrkning af Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394.

7. Fremgangsmåde til bekæmpelse af forurening af et kølevandsystem med alger og Pseudomonas spp., kendetegnet ved, at man tilsætter en effektiv mængde 5 af alginat-lyasen ifølge krav 3 eller 4.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at alginat-lyasen er dannet ved dyrkning af Bacillus stearothermophilus NRRL B-18394.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at man yderligere tilsætter en effektiv mængde ø-glucanase til vandet. 1 o

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7 - 9, kendetegnet ved, at man yderligere tilsætter en effektiv mængde biocid til vandet.