DK168049B1 - Monoklonalt antistof eller et fragment deraf samt fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af humane ikke-smaacellede lungecarcinomer. - Google Patents
Monoklonalt antistof eller et fragment deraf samt fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af humane ikke-smaacellede lungecarcinomer. Download PDFInfo
- Publication number
- DK168049B1 DK168049B1 DK393886A DK393886A DK168049B1 DK 168049 B1 DK168049 B1 DK 168049B1 DK 393886 A DK393886 A DK 393886A DK 393886 A DK393886 A DK 393886A DK 168049 B1 DK168049 B1 DK 168049B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- antibody
- fragment
- monoclonal antibody
- cells
- binding
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
- C07K16/4258—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
- C07K16/4266—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 168049 B1
Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof eller et Fab-, F(ab')2- eller Fv-fragment deraf samt en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af humane ikke-småcellede lungecarcinomer.
5 Humane lungecarcinomer er ansvarlige for de fleste cancerdødsfald blandt mænd og er ved at overstige brystcarcinomer som den hyppigste årsag til cancerdødsfald blandt kvinder (Cancer Facts and Figures, 1983). Denne sygdom kan inddeles i 4 større histologiske typer, 10 dvs. epidermoid (30%), adenocarcinom (35%), storcellet udifferentieret (15%) og småcellet (20%). De fleste tilfælde af lungecarcinomer kan ikke helbredes ved kemoterapi eller stråleterapi. Små-cellede lungecarcinomer kan reagere på kemoterapi og stråleterapi ved en reduk-15 tion af størrelsen, men ikke ved total helbredelse. En fuldstændig kirurgisk fjernelse af tumoren synes at være den eneste effektive terapi. Uheldigvis er det imidlertid færre end 30% af lungecancerpatienter, der har tumorer, som kan fjernes operativt ved diagnosticering, 20 og heraf overlever færre end en tredjedel i 5 år efter den tilsyneladende fuldstændige operative fjernelse af alle tumorer. Der er således et stort behov for fremgangsmåder, der vil muliggøre en tidligere diagnose af lungecancer, en bedre definering af omfanget af cancerspredning 25 og en mere effektiv terapi.
Monoklonale antistoffer kan anvendes til alle disse formål. En forudsætning er det dog at finde antistoffer til antigener, der udtrykkes kraftigere ved lungecancer end i normalt voksenvæv. I betragtning af tumorcellepopulationers 30 kendte heterogeneitet kan tilstedeværelsen af flere determinanter på det samme antigenmolekyle, de forudsete forskelle mellem antigener med hensyn til deres egnethed som diagnosticeringsmarkører sammenlignet med terapeutiske mål, og de forskellige biologiske karakteristiska hos forskellige anti-35 stoffer til det samme antigen kan et antal forskellige antistoffer være påkrævet.
2 DK 168049 B1
Humane monoklonale antistoffer til lungecancerantigener er beskrevet af Sikora et al., Br. J. Cancer 43, 696-700 (1981). Monoklonale antistoffer, som udviser specificitet for flere typer human lungecancer, er omtalt af Cuttitta et 5 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4591-4595 (1981). Antigener associeret med et humant lungeadenocarcinom defineret af monoklonale antistoffer er beskrevet af Varki et al., Cancer Research 44, 681-687 (1984).
Monoklonale museantistoffer til glycolipid-ganglio-10 -N-triosylceramid (asialo GM2) er beskrevet af Young et al., J. Exp. Med. 150. 1008 (1979). Ekspression af asialo GM2 på celler fra patienter med Hodgkin's sygdom er beskrevet af Kniep et al., J. Immunol. 131, 1591-1594 (1983)., I US patentskrift nr. 4.737.579 er der omtalt visse 15 monoklonale antistoffer for humant ikke-småcellet lungecar-cinom.
Kontinuerlige kulturer af fusionerede celler, der udskiller antistof med forud defineret specificitet, er beskrevet af Kohier et al., Nature 265. 495-497 (1975).
20 Huang et al. beskriver i Arch. Biochem. Biophys.
220. 318-320 (1983) monoklonale antistoffer produceret af hybridomer fremstillet ud fra Balb/c-mus immuniseret med en anerkendt linie af human småcellet lungecarcinom (NCI-69).
De monoklonale antistoffer definerer en determinant betegnet 25 lacto-N-fucopentaose III, der udtrykkes på de fleste humane småcellede lungecarcinomer og i mindre omfang på adenocar-cinom og pladecelle-carcinom fra lungen og slet ikke på storcellet lungecarcinom. I modsætning til de monoklonale antistoffer, der er beskrevet i det ovennævnte litteratur-30 sted, fremstilles det L6-monoklonale antistof ifølge opfindelsen mod ikke-småcellet lungecarcinom og definerer et andet carbonhydrat-antigen.
Den foreliggende opfindelse angår nye monoklonale antistoffer, der definerer et determinantsted på et glyco-35 lipid-antigen associeret med humane ikke-småcellet lungecarcinom-(NSCLC)-celler. Udtrykket "NSCLC-celler" omfatter 3 DK 168049 B1 epidermoide carcinomceller, adenocarcinomceller og storcel-lede udifferentierede carcinomceller. Determinantstedet kan også findes på antigener for nogle andre carcinomer, f.eks. nogle carcinomer i brystet, og antistofferne ifølge opfin-5 delsen vil således også bindes til disse andre carcinomceller. De her omhandlede monoklonale antistoffer bindes i langt mindre omfang til normale voksne celler end til tumorceller. Udtrykket "bindes i langt mindre omfang" betyder, at bindingen ikke vil kunne påvises ved immunhistologiske 10 metoder. De monoklonale antistoffer udskilles af musehybri-domer.
Opfindelsen angår således et monoklonalt antistof eller et Fab-, Ffab1^- eller Fv-fragment deraf, hvis antigen-kombinerende sted bindes til: 15 a) et carbonhydrat-antigen, der er beslægtet, men ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2, der er en celleoverfladedeterminant af humant, ikke-små-cellet lungecarcinom, og b) et protein-antigen med en molekylvægt på ca. 20.000 20 dalton, og som er associeret med humant, ikke-småcellet lungecarcinom, hvorhos antistoffet er i stand til binding til target-anti-genet af monoklonale antistoffer produceret af hybridomet betegnet ATCC HB6877, hvorved man kompetitivt inhiberer 25 (binding af antistoffet inhiberer kompetitivt) bindingen af monoklonale antistoffer produceret af hybridomet betegnet ATCC HB6877 til det nævnte carbonhydrat-antigen, eller et fragment deraf.
Opfindelsen angår også visse diagnostice-30 ringsmetoder, ved hvilke der anvendes monoklonale- antistoffer ifølge opfindelsen. En af disse fremgangsmåder indebærer bestemmelse af tilstedeværelsen af NSCLC--celler i en prøve, der mistænkes for at indeholde sådanne celler. Prøven bringes i berøring med det mono- 35 klonale antistof, som er i stand til at skelne sådanne celler fra andre celletyper, som kan forekomme i prøven.
DK 168049 B1 4
Kontakten udføres under betingelser for, at antistoffet bindes til sådanne celler. Efter kontakt bestemmes tilstedeværelse af. eller mangel på binding mellem antistoffet og cellerne i prøven. Denne binding er relateret til 5 tilstedeværelsen af .eller manglen på NSCLC-celler i prøven. I reglen bringes prøven i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for det monoklonale antistof.
Dette mærkestof er i stand til at producere et påviseligt signal. En anden diagnosticeringsmetode omfatter 10 lokalisering til en tumor af antistoffer eller antistoffragmenter, som er blevet passende mærket (f.eks. med en radioaktiv isotop) og derefter injiceret i patienter. Denne fremgangsmåde udgør en bedre måde til hos cancerpatienter at bestemme stadiet med hensyn til sygdommens 15 omfang og at overvåge ændringer som respons på terapi.
Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand i en vævsprøve, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man 20 a) bringer vævsprøven i kontakt med et monoklonalt antistof eller et fragment deraf ifølge ethvert af kravene 1-7 og b) detekterer hvorvidt det monoklonale antistof eller fragmentet deraf bindes immunspecifikt til vævsprøven, idet 25 immunspecifik binding af det monoklonale antistof eller fragmentet deraf til vævsprøven indikerer tilstedeværeslen af en malign tilstand i vævsprøven.
Antistofferne ifølge opfindelsen finder også terapeutisk anvendelse. Antistofferne kan reagere med det oven-30 nævnte antigen, som udtrykkes i høje koncentrationer på tumorcelleoverfladen. Det kan formidle antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), dvs. det kan dræbe NSCLC--celler (og visse andre humane carcinomceller), når der forekommer humane lymfocytter eller makrofager; det kan aktivere 35 human-komplement, så at det f.eks. dræber NSCLC-celler i nærvær af humant serum. Det kan også anvendes som bærer for 5 DK 168049 B1 forskellige midler, som har en anti-tumor-effekt, herunder, men ikke blot kemoterapeutiske præparater og radioaktive isotoper.
Den foreliggende opfindelse angår som nævnt nye anti-5 stoffer, som bindes til et antigen på humane NSCLC-celler, samt visse diganosticeringsmetoder, ved hvilke disse antistoffer anvendes. De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan fremstilles ifølge de standardmetoder, der er beskrevet af Kohier og Milstein, supra. Eksempelvis anvendes 10 som immunogen humane lungecarcinomceller fra pleurale skylninger eller dyrkede celler fra humant ikke-småcellet lun-gecarcinom eller celler fra en normal fosterlunge. Disse celler injiceres i en mus, og efter en tilstrækkelig tid aflives musen, og miltceller isoleres. De miltcellekromoso-15 mer, der koder for ønskede immunglobuliner, gøres udødelige ved fusion mellem miltcellerne og myelomceller eller lymfom-celler, i reglen i nærvær af polyethylenglycol. De opnåede celler, som omfatter de fusionerede hybridomer, får lov at gro i et selektivt medium, såsom HAT-medium, og de over-20 levende celler dyrkes i et sådant medium under begrænsende fortyndingsbetingelser. Cellerne dyrkes i passende beholdere, f.eks. mikrotiterbrønde, og overfasen screenes for monoklonale antistoffer med den ønskede specificitet.
Der findes forskellige metoder til at forøge udbytter 25 af monoklonale antistoffer, såsom injektion af hybridomcel-lerne i peritonealhulheden hos en pattedyrevært, der accepterer cellerne, og indhøstning af ascitesvæsken. Når der opsamles en utilstrækkelig mængde af det monoklonale antistof i ascitesvæsken, høstes antistoffet fra værtens blod. Der 30 findes forskellige gængse måder til isolering og rensning af de monoklonale antistoffer for at befri de monoklonale antistoffer for andre proteiner og andre forureninger (jfr. Kohier og Milstein, supra).
Et monoklonalt antistof ifølge den foreliggende 35 opfindelse betegnes L6. Det definerer et celleoverfla-de-glycolipid-antigen, der er blevet identificeret som 6 DK 168049 B1 karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane carcinomer. På basis af krydsreaktioner mellem flere kendte glycolipider og L6-antistof og asia-lo GalNAc-GM^'s reaktivitet med L6-antistof har man kon-5 kluderet, at L6-glycolipid-antigenet har følgende ende-stillede sekvens: GalNAcfil—>4Galf31—7>3GalNAc81—^4Gal31—>R, hvor R er et carbonhydrat, der endnu ikke er defineret.
Et særligt nyt træk ved det ovennævnte antigen er, at det ikke indeholder sialsyrerester og hidtil ikke vides 10 at være associeret med humant væv. Sialosylderivater med den ovennævnte endestillede sekvens er blevet beskrevet af Svennerholm et al. , J. Biol. Chem. 248, 740-742 (1973), og af Iwamori et al., J. Biochem. j^4, 1601 (1978). Endvidere anerkendes sialsyrederivater med ovennævnte 15 sekvens også som blodgruppe-Sd-antigener af Donald et al., Biochem. Soc. Trans. 12, 596-599 (1984) og af Blan chard et al., J. Biol. Chem. 258. 7691-7695 (1983).
L6-Antistoffet udfælder også et protein-antigen fra biosyntetisk mærkede NSCLC-celler. Dette antigen er karak-20 teristisk ved et bånd på natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-gel-elektroforeser (SDS-PAGE) med en molekylvægt på ca.
20.000 dalton. Dette antistof er af isotypen IgG2a. Det bindes ikke påviseligt til normale celler, såsom fibroblas-ter, endotelceller eller epitelceller i de større organer.
25 L6-Antistoffet produceres af L6-musehybridomet.
Omfattet af opfindelsens omfang er som nævnt nyttige bindingsfragmenter af det ovennævnte monoklonale antistof, nemlig Fab-, F(ab')2~ og Fv-fragmenter. Antistoffragmenterne opnås ved gængse metoder. Således kan der fremstilles anven-30 delige bindingsfragmenter ved hjælp af peptidasefordøjelse af antistoffet med papain eller pepsin.
Selv om det ovennævnte specifikke eksempel på det nye antistof ifølge opfindelsen angår et antistof, der bindes til specifikke determinantsteder på de respektive antigener 35 og er af underklassen IgG2 fra en musekilde, skal dette ikke fortolkes som en begrænsning. Det ovennævnte antistof 7 DK 168049 B1 og sådanne antistoffer, som er funktionelt ækvivalente med ovennævnte antistof, hvadenten det stammer fra en musekilde, en anden pattedyrekilde, herunder human, eller andre kilder eller kombinationer heraf, er omfattet af opfindelsens om-5 fang, samt andre isotyper. Ved udtrykket "funktionelt ækvivalente med" skal forstås, at antistoffet kan bindes til det ovenfor beskrevne determinantsted og er i stand til at konkurrere med et bestemt antistof ifølge opfindelsen om et sådant sted. Det vil sige, at et sådant antistof, når det 10 kombineres med en prøve, der indeholder en celle eller et cellefragment med et sådant determinantsted, vil bindes til et sådant determinantsted og hindre, at et antistof ifølge opfindelsen bindes til et sådant sted.
Antigenet kan renses ved gængse metoder såsom immun-15 fældning som beskrevet af Young et al., J. Exp. Med. 150. 1008-1010 (1979).
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen indebærer bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand i lungevæv og andet humant væv ved, at vævet undersøges for tilstede-20 værelsen af et glycolipid-antigen med L6-antigenets karakteristika eller af et ganglio-N-triosylceramid. Udtrykket "malign tilstand" refererer til forekomst af dysplastiske, herunder carcinom- in situ, neoplastiske, maligne eller tumorceller og lignende. Udtrykket "karakteristika" betyder, 25 at antigenet er reaktivt med et antistof, som genkender L6-antigenet eller et beslægtet antigen, såsom asialo GalNac-GM2 eller asialo-GM2. Eksempelvis kan prøven bringes i kontakt eller kombineres med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, såsom L6-antistof eller et antistof med lignende 30 karakteristika, såsom beskrevet af Young et al., supra, eller Kniep et al., supra. Kontakten udføres under betingelser for antistoffets binding til de maligne celler. Efter kontakt iagttages forekomst af antistoffets binding til de maligne celler i prøven. Det vil sige, at prøven undersøges 35 for immunkomplekser af antistoffet og det antigene sted.
Denne immunkompleksdannelse har relation til forekomsten af 8 DK 168049 B1 maligne celler i prøven.
Et specifikt illustrerende eksempel på en fremgangsmåde ifølge opfindelsen er en fremgangsmåde til påvisning af tumorceller i bortopereret væv. Tumoren, der er bortopereret, 5 behandles, så at der fås snit, hvilken behandling til at begynde med indebærer frysning af tumoren eller vævet, i reglen frysning umiddelbart efter fjernelse. Det frosne vævslag skæres derpå i snit, f.eks. ved hjælp af en kryostat.
Tumorsnittet, der fås som beskrevet ovenfor, bringes 10 i kontakt med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og derpå med et andet antistof rettet mod det ovennævnte mono-klonale antistof, hvilket andet antistof er mærket med et påviseligt mærkestof.
Den fjernede prøve, f.eks. tumorsnittet, brin-15 ges i kontakt med det første monoklonale natistof under betingelser for antistoffets binding til de maligne celler. Inkubationen sker i reglen i et vandigt medium, såsom phosphatpufret saltvandsopløsning indeholdende en lille mængde natriumazid, i en passende beholder, såsom 20 en petriglasskål, i et tidsrum af ca. 15-30 minutter ved en temperatur fra ca. 20 til 30QC. Den mængde antistof, der anvendes, er i reglen tilstrækkelig til at give påviselig binding, dvs. til at tilvejebringe et påviseligt antal immunkomplekser mellem antistoffet og determinan-25 ten eller det antigene sted, det drejer sig om.
Efter inkubationen vaskes snittet for at reducere eller eliminere ikke-specifikt bundet antistof og undersøges derpå for at iagttage de ovennævnte komplekser, der er fremkaldt af det monoklonale antistofs binding 20 til de celler i prøven, der har det antigene sted. Bindingen er relateret til tilstedeværelsen af maligne celler i snittet. Følgelig bestemmes bindingen ved f.eks. at bringe prøven i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for det monoklonale antistof. Mærkestoffet 35 er i stand til at producere et påviseligt signal og kan være et radioaktivt mærkestof, en chromofor, såsom et 9 DK 168049 B1 fluorescerende middel, et enzym eller lignende.
Et eksempel på en metode, ved hvilken ovennævnte løsning anvendes, er immunfluorescensfarvning. Ved denne teknik fikseres frosne snit af tumoren på et ob-5 jektglas med acetone og inkuberes med det monoklonale antistof, f.eks. i en petriskål. Efter vask med en passende puffer, såsom phosphatpufret saltvandsopløsning, anbringes snittet på en petriskål og bringes i berøring med den mærkede specifikke partner for det monoklonale an-10 tistof, som f.eks. kan være et mærket antistof, der er specifikt for det anvendte monoklonale antistof. Eftersom det monoklonale antistof for størstedelens vedkommende er afledt fra en musekilde, kan der anvendes et mærket anti--museimmunoglobulin, der er specifikt for det monoklonale 15 antistof. Sådanne immunoglobuliner kan produceres ved hjælp af standardmetoder ved at injicere en passende vært med museantistof, vente en passende tid og høste anti-museim-munoglobulinerne fra den injicerede værts blod.
Efter at objektglasset er vasket endnu en gang med 20 f.eks. en vandig puffer, kan snittene dækkes med en fluorescerende antistof-monterende væske og dækslipark og derpå undersøges med et fluorescensmikroskop for at bestemme det monoklonale antistofs binding til snittet. Bindingsbestemmelsen kan også omfatte identificering af en sådan bindings 25 lokalisering i prøven.
Det monoklonale antistofs binding til prøven kan også bestemmes ved anvendelse af et monoklonalt antistof, som er covalent konjugeret til et mærkestof, der kan producere et påviseligt signal, såsom en radioaktiv enhed, en chromofor, 30 der omfatter farvestoffer og fluorescerende midler, eller et enzym. Det antal mærkestoffer, der anvendes pr. antistof, bestemmes i reglen af kravene til den diagnostiske fremgangsmåde, ved hvilken det mærkede antistof anvendes, og de til rådighed stående steder for mærkestoffets binding til anti-35 stoffet.
Fremgangsmåder til konjugering af mærkestoffer til 10 DK 168049 B1 antistoffer og antistoffragmenter er kendt, jfr. US patentskrifterne nr. 4.220.450, 4.235.869, 3.935.074 og 3.006.345.
Et andet eksempel på en metode, ved hvilken det mono-klonale antistof ifølge opfindelsen kan anvendes, er im-5 munoperoxidasemærkning [Sternberger, Immunocytochemistry,
John Wiley & Sons, New York, 104-169 (1979), modificeret af Garrigues et al., Int. J. Cancer 29, 511-515 (1982)]. Det væv, der skal afprøves, fikseres med et passende opløsningsmiddel, såsom acetone, på en understøtning, såsom et ob-10 jektglas. Dernæst inkuberes vævet med det monoklonale antistof og vaskes derpå fri for ubundet antistof. Derpå inkuberes vævet med kanin-anti-muse-IgG, vaskes for at fjerne ubundet antistof, kombineres med muse-perioxidase/anti-per-oxidase-kompleks, vaskes for at fjerne ubundet konjugat og 15 behandles derpå med substrat for enzymet. Efter denne behandling undersøges objektglasset for et påviseligt signal.
Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes ved en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand, f.eks. i en eksfoliativ cel-20 leprøve fra lungen, såsom opspyt eller i et cervikalt ud-strygningspræparat. Ved udtrykket "eksfoliativ" skal forstås, at prøven omfatter isolerede celler eller klumper af celler, der fås ved skrabning eller vask af vævsoverfladen, hvilke celler fjernes individuelt eller i skad.
25 eller lag. Den eksfoliative celleprøve må ikke forveksles ned operativt fjernet væv, som det opnås‘ved biopsi.
Kontakt mellem prøven og antistoffet sker under betingelser for antistoffets binding til det antigene sted.
Efter kontakt bestemmes tilstedeværelse af eller mangel 30 på antistofbinding til det antigene sted og relateres til tilstedeværelsen af en malign tilstand i lungen.
For at bestemme tilstedeværelsen af en malign tilstand i lungen vil en opspytsprøve give den eksfoliative celleprøve, der skal anvendes ved fremgangsmåden.
35 Fremgangsmåden kan finde anvendelse til påvisning af en malign tilstand i eksfoliative celleprøver fra bronki- 11 DK 168049 B1 o erne, mave-tarmkanalen, herunder det orale svælg, munden etc.
Derpå bringes den eksfoliative celleprøve i kontakt med det ovennævnte antistof under betingelser for antistoffets binding til det specifikke antigene 5 sted i prøven, så at der dannes antigen/antistof-kom-plekser. Dette antigene sted kan forekomme på celler eller cellefragmenter i prøven. I reglen anbringes prøven på en passende understøtning, som f.eks. et objekt-1Q glas, helst glas, eller et andet passende materiale.
Den eksfoliative celleprøve udstryges på glasset, så at der fås et tyndt lag af prøven på glassets overflade. Kontakten mellem antistoffet og prøven sker i reglen i et vandigt pufret medium. Pufferne, der kan anvendes, 15 omfatter phosphat, tris, bicarbonat etc. pH justeres efter prøvens art og antistoffet og ligger i reglen i intervallet fra ca. 5 til 8. Det vandige medium kan y-derligere indeholde organiske polære opløsningsmidler i en mængde fra 0 til ca. 40%. De organiske polære op-2o løsningsmidlet er vandopløselige og har i reglen ca.
1 til 10 carbonatomer og fra ca. 1 til 4 oxygenatomer. Antistoffet vil forekomme i det vandige medium ved en koncentration på ca. l-100^,ug/ml, fortrinsvis fra ca.
10 til 20^,ug/ml. Temperaturen under prøvens kontakt 25 med antistoffet er i reglen fra ca. 4 til 40°C, fortrinsvis ca. 10 til 30°C. Kontakttidsrummet er i reglen fra ca. 15 til 120 minutter, fortrinsvis fra ca.
30 til 60 minutter.
Efter kontaktperioden mellem prøven og anti-3Q stoffet behandles understøtningen i reglen for at fjerne uomsat antistof. I reglen sker dette ved at vaske understøtningen med et vandigt; i reglen pufret medium. Almindeligvis er mængden af vaskeopløsning tilstrækkelig til at fjerne det uomsatte antistof.
35 Dernæst iagttages forekomst af antistof bun det til det antigene sted i prøven, hvilken binding 0 12 DK 168049 B1 har relation til en malign tilstand på stedet, dvs. prøven undersøges for at bestemme det dannede antal anti-gen/antistof-(immun)-komplekser. Det skal bemærkes, at i nogle tilfælde kan der findes meget små antal 5 af det pågældende antigene sted i eksfoliative celleprøver. Ved en malign tilstand vil der imidlertid forekomme et stort antal antigene steder, og-den nævnte tilstand kan let ved hjælp af denne fremgangsmåde skelnes fra en ikke-malign tilstand, fordi et stort antal 10 antigen/antistof-komplekser kan måles, når der forekommer en malign tilstand. Når tilstedeværelsen af binding skal bestemmes, inkorporeres midler til at frembringe et påviseligt signal i analysesystemet. Således kan man konjugere det antistof, der anvendes i analysen, til et 15 mærkestof, som kan producere et påviseligt signal. Mærkestoffet kan være en radioaktiv enhed, en chromofor, herunder farvestoffer og fluorescerende midler, et enzym eller lignende. Det antal mærkestoffer, der anvendes til antistoffet, bestemmes i reglen af fremgangsmådens 20 krav og de til rådighed stående steder for binding mellem mærkestoffet og antistoffet.
Alternativt kan man bringe det vaskede objektglas i berøring med en mærket specifik bindingspartner for antistoffet, som f.eks. kan være et mærket antistof, 25 der er specifikt for det anvendte antistof. Når det mo-noklonale antistof er afledt fra en musekilde, kan der anvendes et mærket anti-museimmunoglobulin, der er specifikt for det antistof, der anvendes ved fremgangsmåden. Sådanne immunoglobuliner kan produceres ved hjælp af stan-30 dardmetoder ved i en passende vært at injicere det mono-klonale antistof, vente en passende tid og høste anti-mu-seimmunoglobulinerne fra den injicerede værts blod. Når der anvendes en mærket specifik bindingspartner for antistoffet, skal objektglasset vaskes igen med et vandigt 35 medium, før glasset undersøges for fluorescens.
Når man skal bestemme tilstedeværelsen af bin- 0 13 DK 168049 B1 ding mellem antistoffet og celleprøven, hvor der anvendes et fluorescerende mærkestof, undersøges objektglasset for fluorescens, i reglen ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. Når der anvendes andre mærkestoffer end et fluorescerende middel, kan objektglasset eller 5 prøven undersøges for dannelsen af et bundfald, en farve eller lignende.
Ovenstående beskrivelse er primært rettet på anvendelsen af antistofferne ifølge opfindelsen ved im-munofluorescensmetoder. Imidlertid kan antistofferne i- 10 følge opfindelsen anvendes til de fleste prøver, der indebærer antigen/antistof-reaktioner. Prøverne kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen analysemetode kan prøven være biologisk væske, såsom serum, urin og lignende, eller prøven kan være lyseret og klaret for at 15 fjerne affaldsstoffer. Den immunologiske reaktion indebærer i reglen det specifikke antistof, en mærket ana-lyt og den pågældende prøve. Signalet, der fremkommer fra mærkestoffet, modificeres direkte eller indirekte efter antistoffets binding til den mærkede analyt.
20 Både den immunologiske reaktion og påvisningen af dennes omfang udføres i en homogen opløsning. Immunoke-miske mærkestoffer, som kan anvendes, omfatter f.eks. frie radikaler, fluorescerende farvestoffer, enzymer, bak- teriofager og coenzymer.
25
Ved en heterogen analysemetode er reagenserne i reglen prøven, det specifikke antistof og midler til frembringelse af et påviseligt signal. Prøven anbringes i reglen på en understøtning, såsom en plade eller et objéktglas, og bringes i berøring med anti-30 stoffet i en flydende fase. Understøtningen skilles derpå fra væskefasen, og enten understøtningsfasen eller væskefasen undersøges for et påviseligt signal ved hjælp af midler til frembringelse af et sådant signal. Signalet relateres til tilstedeværelsen af analytten i prøven. Midler til frembringelse af et påviseligt 14 DK 168049 B1 signal omfatter anvendelsen af radioaktive mærkestoffer, fluorescerende midler, enzymer osv. Eksempler på heterogene immunanalyser er radioimmunoanalyse, immuno-fluorescensmetoder, enzymbundne immunanalyser etc.
5 Med hensyn til en mere detaljeret gennemgang af de ovennævnte immunanalysemetoder henvises til "En-zyme-Immunoasisay" af Edward T, Maggio, CRC Press, Inc.,
Boca Raton, Florida, 1980, jfr. f.eks. også US patentskrifter nr. 3.690.834, 3.791.932, 3.817.837, 3.850.578, 10 3.853.987, 3.867.517, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345 og 4.098.876, hvilket dog ikke skal anses for at være udtømmende.
Antistofferne ifølge opfindelsen kan også anvendes til at give et billede af metastaser hos humane patienter 15 med NSCLC på analog måde som beskrevet for malignt melanom i J. Nuel. Med. 24./ 123-129 (1983) og i J. Clin. Invest.
72., 2101-2114 (1983). Antistoffet eller fragmenter deraf mærkes radioaktivt og indgives intravenøst til en patient, som derefter gengives, f.eks. ved hjælp af et gammakamera 20 eller lignende. Undersøgelser udført på "nøgne" mus uden thymus, der er xenotransplanteret med et humant lungecar-cinom, har vist, at med 131I mærkede Fab-fragmenter fremstillet af L6 selektivt lokaliseres i den transplanterede tumor. Dette viser på basis af tidligere undersøgelser af 25 melanomer [J. Nucl. Med. 24./ 123-129 (1983) ; J. Clin. Invest. 72, 2101-2114 (1983)], at selektiv tumorlokalisering med L6 og antistoffragmenter fremstillet af L6 er sandsynlig efter injektion i humane patienter.
Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes tera-30 peutisk. Antistoffer med de rigtige biologiske egenskaber er anvendelige direkte som terapeutiske midler. Antistof L6 har denne egenskab, eftersom det, når det kombineres med humane lymfocytter eller makrofager, formidler antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) in vitro. Det vil 35 sige, at det kan bevirke ødelæggelse af humane NSCLC-celler, hvilket kan påvises f.eks. ved hjælp af en teknik, hvor 15 DK 168049 B1 cancercellerne mærkes med 5-^Cr Qg inkuberes med lymfocytterne og antistof. Analoge undersøgelser er blevet foretaget med anti-melanom-antistoffer og har vist, at antistoffer med høj ADCC kan inhibere udvækst af humant melanom hos nøgne 5 mus. Da L6-antistoffet er af isotypen IgG2a, kan det også være i stand til at aktivere makrofager [Sears et al.,
Contrl. Oncol. Karger, Basel, 19, 180-192 (1984)]. Desuden kan antistoffet bindes til et toksin til dannelse af et immunotoksin eller til et radioaktivt materiale eller præpa-10 rat til dannelse af et radiofarmaceutikum eller farmaceuti-kum. Fremgangsmåder til fremstilling af immunotoksiner og radiofarmaceutika af antistoffer er kendt, [jfr. f.eks.
Cancer Treatment Reports 68, 317-328 (1984)]. Desuden kan L6-antistoffet aktivere humant komplement, så at det f.eks.
15 dræber NSCLC-celler i nærvær af humant serum.
En anden terapeutisk anvendelse af det monoklonale antistof ifølge opfindelsen er immunisering af en patient med et anti-idiotype-antistof produceret ved hjælp af et af de foreliggende monoklonale antistoffer som immunogen. En 20 sådan immunisering kan fremkalde en aktiv anti-tumor-ak-tivitet [jfr. f.eks. Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA .81, 2864-2867 (1984)]. På lignende måde kan patienten immuniseres med L6-antigenet i renset form eller en modificeret form for antigenet.
25 Et interessant aspekt ved den foreliggende opfindelse er, at de foreliggende antistoffer kan kombineres med andre antistoffer mod NSCLC, såsom dem, der omtales i US patentskrift nr. 4.737.579. Kombinationen er effektiv til påvisning i det mindste af de ovennævnte typer lungecarcinomer, dvs.
30 storcellet, udifferentieret lungecarcinom, adenocarcinom og epidermoidt carcinom.
De monoklonale anstistoffer ifølge opfindelsen definerer også determinant-steder på antigener associeret med andre carcinomer, såsom brystcarcinomer. Følgelig kan de 35 omhandlede antistoffer anvendes i diagnosticeringsprodukter og i terapeutiske produkter rettet mod sådanne carcinomer.
16 DK 168049 B1
Eksempler
Opfindelsen vil i det følgende blive belyst ved hjælp af eksempler. Først vil en række af de anvendte metoder blive beskrevet.
5
Iromunhistologisk teknik
Til immunhistologiske undersøgelser på frosne snit anvendes den umærkede antistof-teknik beskrevet af Sternberger i Immunochemistry, John Wiley & Sons, New 10 York, 1979, side 104-169, modificeret af Garrigues et al., Int. J. Cancer 29, 511-515 (1982) . Targetvævene til disse forsøg fås ved kirurgi og fryses inden for 4 timer efter fjernelse i isopentan, som i forvejen er afkølet i flydende nitrogen. Vævsprøver opbevares derpå i flyden-15 de nitrogen eller ved -70°C indtil brug. Kanin-anti-mu-se-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jaretts-ville, MD) anvendes ved en fortynding på 1:50. Muse-per-oxidase/antiperoxidase-kompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) indeholdende 2 mg/ml specifikt 20 renset PAP anvendes ved en fortynding på 1:80. Frosne snit fremstilles, tørres, behandles med acetone og tørres (Garrigues m.fl., 1982). Snit, der skal anvendes til histologisk bedømmelse, farves med hæmatoxylin. For at nedsætte uspecifik baggrund præinkuberes snit med 25 normalt human-serum fortyndet 1:5 (Garrigues m.fl., 1982). Museantistoffer, gede-anti-muse-IgG og muse-PAP fortyndes i en opløsning af 10% normalt human-serum og 3% kaninserum.
Farvningsproceduren omfatter behandling af 30 seriesnit med enten specifikt eller kontrolantistof i 2,5 timer, inkubation i 30 minutter med kanin-antimuse--IgG fortyndet 1:50 og eksposition i 30 minutter i muse-PAP-kompleks fortyndet 1:80. Efter hver behandling med antistof vaskes objektglassene to gange i 35 phospha tpuf ret saltvandsopløsning (PBS) . Den immunhi-stokemiske reaktion fremkaldes med frisk fremstillet 0 17 DK 168049 B1 0,05% S^'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (Sigma,
St. Louis, MO) og 0,01% hydrogenperoxid i 0,05 molær Tris-puffer, pH 7,6, i 8 minutter. Yderligere eksposition i en 1% OsO^-opløsning i destilleret vand i 20 5 minutter forstærker farvningen. Snittene skylles med vand, dehydratiseres i alkohol, klares i xylen og monteres på objektglas.
Glassene aflæses hver under kode, og kodede prøver kontrolleres ved hjælp af en uvildig forsker.
10 Typiske glas fotograferes ved hjælp af differentieret interferenskontrastoptik (Zeiss-Nomarski). Graden af antistof farvning bedømmes som 0 (ingen reaktivitet) , + (nogle få positive celler), ++ (mindst 1/3 af cellerne er positive), +++ (de fleste celler er positive), 15 ++++ (næsten alle celler er stærkt positive). Efter som forskellene mellem +- og 0-farvning er mindre afgrænset end mellem ++- og +-farvning, bedømmes en farvning som positiv med ++ eller derover. Både neoplastiske og stroma-celler iagttages i tumorprøver; den noterede 20 farvning referer til tumorcellernes farvning, eftersom stromacellerne slet ikke farves eller kun farves svagere end tumorcelierne.
Bestemmelse af antigenplacering
Antigeners subcellulære lokalisering bestemmes 25 ved at måle antistofbinding til celler før eller efter permeabilisering med ikke-ionisk detergent. Antistoffer, der bindes til celleoverfladen på intakte dyrkede celler, identificeres ved hjælp af enten direkte bindingsprøver 125 med med I mærket antistof [Brown et al., Proc. Natl.
30 Acad. Sci. USA 78, 539-543 (1981)] eller ved indirekte fluorescens ved hjælp af "(FACS) II" cellesorterer. Antistoffer, der binder til intracellelulærer steder, be- 125 stemmes ved hjælp af med I mærkede antistoffers direkte binding til celler efter fiksering med paraformal-35 dehyd og efterfølgende permeabilisering med ikke-ionisk detergent NP-40.
18 DK 168049 B1 o
Bindingsprøver (a) Til bindingsprøver foretaget ved hjælp af ra- diomærkede antistoffer (Brown m.fl., supra) inkuberes dyrkede celler (10^) ved 4°C i 30 minutter med 10^ cpm 125 5 af med I mærket antistof i lOO^uliter varmeaktiveret (30 minutter ved 56°C) kalvefosterserum i dyrkningsmedium. Efter tilsætning af 5 ml PBS pelleteres cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 250 G. Overfa- 125 sen bortsuges, og pelletten tælles for I. For at 10 måle ikke-specifik binding foretages parallele inkubationer med lO^ug umærket antistof som konkurrent (Brown m.fl., supra). I nogle tilfælde udføres bindingsprøver på analog måde på cellemonolag fastgjort til plastdyrkningsskåle.
15 (b) Når bindingsprøver udføres på "FACS II"-celle- sortereren, fjernes celler fra deres substrater ved hjælp af PBS indeholdende 5 mmolær ethylendiamin-tetraeddike- 5 syre (EDTA). Prøver, der indeholder 1 x 10 celler, inkuberes først med monoklonalt antistof ved en koncentration 20 på 2^,ug/ml efterfulgt af fluorescein-konjugeret gede--antimuse-antistof ved en fortynding på 1:200. Derpå vaskes cellerne og resuspenderes i dyrkningsmediet. Lige før "FACS"-analyse tilsættes propidiumiodid til en s lutkoncentration på l^,ug/ml for at farve ikke-levedyg-25 tige celler. Under "FACS"-analyse udelukkes celler, der udsender rød fluorescens, elektronisk, så at kun levedygtige celler undersøges. Fluorescein-fluorescen-sens gennemsnitlige intensitet bestemmes så for hvert antistof. Negative kontroller består af prøver, hvori 30 monoklonalt antistof er udeladt; positive kontroller består af monoklonale antistoffer mod HLA type 1-histokom-patibilitetsantigener. Farvning anses for positiv, hvis den gennemsnitlige fluorescein-fluorescens er mindst 3 gange så stor som baggrundens.
35 Protein-antigenbestemmelse
For at identificere proteinantigener overfla- 0 19 DK 168049 B1 deradioioderes lungecarcinomceller eller mærkes metabo-lisk med S-methionin. Antigener isoleres fra celle-lysater ved inkubation med monoklonalt antistof, tilsætning af gede-anti-muse-IgG og adsorption på S. aureus.
5 Immunudfældninger vaskes og analyseres ved hjælp af na-triumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) (10-20% acrylamid) som beskrevet (Brown m.fl., supra).
Bestemmelse af antistoffers reaktivitet over for gly-10 colipider
Antistoffer afprøves for reaktivitet over for glycolipidantigener ved inkubation med rensede gly-colipider adsorberet på mikroprøvefordybninger (sammen med cholesterol og lecithin) og med tyndtlagschromato-15 grafiplader, hvorpå der er fraktioneret glycolipider.
Bundet antistof påvises ved inkubation med antiserum mod muse-immunglobulin og radioioderet protein A. Isotypebestemmelse (a) Ouchterlony immundiffusion.
2o En alikvot mængde overfase af bestemte hybri- domceller anbringes i midterfordybningen på en 2% agarplade. Monospecifikke kanin-anti-muse-Ig-isotype -antistoffer (Meloy) anbringes i de ydre fordybninger, og pladen inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur og natten 25 over ved 4°C.
(b) Fleksible polyvinylchloridplader med 96 fordybninger (Costar) dækkes med 0,1 mg/ml gede-antimuse--Ig-antistoffer i 2 timer ved 37°C og moddækkes med en 3% BSA-opløsning i 2 timer ved 37°C. x-iybridomoverfasen 30 inkuberes derpå ved 37°C i 2 timer. Efter vask med PBS-okseserumalbumin-(BSA) inkuberes pladerne ved 37°C i 2 timer med monospecifikke kanin-anti-muse-Ig-isotype-antistoffer koblet til peroxidase (Zymed) . Efter vask inkuberes pladerne med 1 mg/ml orthophenylendiamin og 35 0,03% H202 i 0,1 molær citratpuffer, pH 4,5. Optisk densitet ved 630 nm bestemmes på en "Dynatec" EEISA-pladeaflæser.
0 20 DK 168049 B1
Staphylococ-protein-A-bindingsianalvse
Mikrotiterfordybninger inkuberes med 5% NCS i PBS + 0,02% NaN.,, og overfasen bortsuges. 25,uliter J 7 / af en suspension af epiderme celler (2 x 10 celler/ml) 5 tilsættes til hver fordybning og inkuberes med 25^,uliter af et bestemt antistof i en time ved stuetemperatur.
Pladerne centrifugeres ved 1200 omdr./min. i 7 minutter, 125 vaskes to gange med 50% NCS/PBS/NaN3, og 25^,uliter I--staphylococ-protein A (ca. 50.000 cpm/25 liter) tilsæt-10 tes. Pladerne inkuberes i én time ved 25°C, vaskes to gange med 5% NCS/PBS/NaN^ og tørres. Bunden af fordybningerne skæres fra og tælles i en gammatæller.
Eksempel 1 15 Fremstilling af monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer fremstilles ved at immunisere 3 måneder gamle BALB/c-mus med humant væv fra en af tre forskellige kilder: (1) pleurale udsivninger fra patienter med metastatisk ikke-småcellet lungecarcinom, 20 (2) dyrkede celler fra et ikke-småcellet lungecarcinom og (3) lungevæv fra 3-4 måneder gamle humane embryoer.
Immuniseringerne udføres ved, at mus injiceres intraperi- 7 tonealt 3-4 gange med ca. 10 celler. Tre dage efter den sidste immunisering fjernes miltene, suspenderes i 25 dyrkningsmedium og fusioneres med NSl-musemyelomceller (Kohier og Milstein, supra). Blandingerne podes, så at der dannes kulturer med lav densitet stammende fra enkelte fusionerede celler (kloner); de metoder, der anvendes til hybridisering, er tidligere beskrevet af Yeh 3Q m.fl., Int. J. Cancer 29, 269-275 (1979).
Overfaser fra hybridceller screenes ved hjælp af både en ELISA-prøve og en autoradiografisk indirekte 125 med I-mærket protein A-prøve [Brown m.fl., J. Immunol. Meth. 31, 201-209 (1979)] mod ekstrakter fra de tumorer, 35 der anvendes til immunisering, som bl.a. indeholder cellemembraner. Disse ektrakter fremstilles ved hjælp af 21 DK 168049 B1 en metode, der er modificeret på grundlag af Colcher m.fl., Cancer Res. 42., 1451-1459 (1981), og Yeh m.fl., supra. Hertil vaskes vævene med PBS og suspenderes, hvilket for intakte tumorers vedkommende gøres ved, 5 at vævet presses gennem en rustfri-stålsigte. Herefter tilsættes 1 mmolær NaHCO^ indeholdende 1 mmolær phenyl-methylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), og materialet homogeniseres derpå på is med 50 slag af B-støderen i en "Dounce" homogenisator.
10 Efter centrifugering i 15 minutter ved 27.000 G fjernes overfasen, og pellet'en resuspenderes i PBS, lydbehandles i 1 minut og opbevares ved -70°C.
Hybridomer, der producerer antistoffer, der bindes til cellemembranekstrakterne, klones, ekspande-15 res in vitro og afprøves yderligere for antistof-specificitet. Denne afprøvning udføres ved hjælp af den immunhistologiske teknik, der er beskrevet ovenfor, hvor antistoffernes evne til at bindes til frosne lungecarci-nomsnit, snit fra andre tumorer og normalt humant væv af-20 prøves. De hybridomer, der producerer antistof med tydelig specificitet for human lungecancer, reklones, ekspanderes og injiceres i med "Pristan" præparerede 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de udvikles som ascites-tumorer.
25 Antistoffer, der er udskilt i ascitesvæsken, renses på protein A "Sepharose®" [Ey et al., Immunochemistry 15.
429 (1978)] eller ved hjælp af gelfiltrering i "Sephacryl® S-300". Rensede antistoffer anvendes til yderligere karakterisering, der omfatter yderligere specificitetsprøver ved 30 hjælp af immunhistologiske bindingsprøver på intakte celler til bestemmelse af, hvilke antistoffer der bindes til celleoverfladen, og radioimmunfældningsprøver som beskrevet ovenfor.
Monoklonalt antistof L6 produceres af det tilsvarende 35 hybridom som beskrevet ovenfor. Dette antistof udviser de egenskaber, der er anført ovenfor i beskrivelsen.
22 DK 168049 B1
Cellelinien, der er betegnet L6, er deponeret hos ATCC den 6. december 1984 og har deponeringsnummer HB 8677.
Eksempel 2 5 Visse crlvcolipiders reaktivitet med L6-antistof
Undersøgelser vedrørende L6-antistoffets reaktivitet undersøges ved hjælp af standardmetoder, som beskrevet af Kannagi et al., Cancer Research 43., 4997-5005 (1983), og Nudelman et al., J. Biol. Chem. 257. 12752-12756 (1982).
10 Definerede glycolipider afprøves for reaktivitet med Le-antistoffet. Glycolipider adskilles på TLC og immunfarves ved hjælp af antistoffet, og der udføres fast-fase-radioimmun-analyser på glycolipider, der er blevet strøget på plastfordybninger. Dataene er vist i tabel I.
0 23 DK 168049 B1
Tabel I
Struktur Reaktivitet med L6 5 Asialo GalNAc-GM^
GalNAcei-t-AGalBl^GalNAcSl^AGalBl^AGlcemCer +++ 10 Krydsreaktinnpr:
Gg? (asialo Gf^)
GalNAcBl**-4GalBl+4GlcBl+lCer ♦+ 15 Gg^ (asialo GM^)
Galgl+JGalNAc Bl-*-4Gal Bl+4Glc Bl+lCer ♦ x2 glycolipid
GiilNAcB1^3GalB1^4GlcNAcB1^3GalBl-*-AGlcBl^lCer + 20 ~
Gb3 (>"TH; Pk antigen)
Galol+4GalB1^4GlcBl-*“lCer
Globosid (P antigen) 25 GalNacBl>3Galal+4GalBl+4GlcBl-*-lCer
Paraglobosid
GalBl-*-4GlcNAc Bl-^3GalBl*4Glc Bl^lCer 30 5 andre glycolir>id-strukturer " 35 0 24 DK 168049 B1 L6-Antistoffet reagerer specifikt med asialo-GalNAc-GL^ og asialo Gt^, idet den kraftigste reaktion iagttages med asialo GalNAc-GM^. En svag reaktivitet ses med gangliotetrao.sylceramid (asialo GM^) og X2~gly-5 colipid (struktur defineret i tabel I). Globosid, glo-botriaosylceramid, lactosylceramid, paraglobosid (lacto-tetraosylceramid), glycolipider med Le - og LeJ-struktur og gangliosider med ganglio- og lacto-seriestruktur er alle negative. Det synes derfor, at L6-antistoffet gen-10 kender følgende sekvens:
GalNAc β 1—>4 Ga 1 β 1—^3 GalNAc β 1-^-4 Gal β 1—>R
nvor R er et udefineret carbonhydrat.
15
Eksempel 3
Antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC)
Denne undersøgelse udføres ved hjælp af en metode, der tidligere er beskrevet af Hells trom et al., PNAS 20 8 2, 14 9 9 (19 85) , ved at inkubere blandinger af med ^Cr mærkede targetceller (2981 lungecarcinom), antistoffer (forskellige fortyndinger) og lymfocytter (forskellige forhold mellem lymfocytter og targetceller) i 4 timer og måle de mængder ^Cr, der frigøres i overfasen. Forsøget 25 og resultaterne er anført i tabel II.
30 35 0 25 DK 168049 B1
Tabel II
L6-Antistof _(^uq/ml) % ADCC-cytotoksicitet 10^ug/ml portion 1 84* 5 10^ug/ml portion 2 76 10^ug/ml portion 3 83 10^ug/ml portion 4 66 10^ug/ml portion 5 74 O^ug/ml 18 10 (ingen humane lymfocytter/ portion 1) 0
Derfor formidler L6 ADCC, når det afprøves på targetceller/ der udtrykker L6-antigenet.
15
Eksempel 4
Antistof-formidlet cytotoksicitet i nærvær af humant komplement
For at afprøve, om antistof L6 kan ødelægge 20 tumorceller i nærvær af humant komplement, inkuberes med 5^Cr-mærkede targetceller (2981 lungecarcinom) i 4 timer med antistof og humant komplement ved hjælp af etablerede metoder [Hellstromm.fi., PNAS 82, 1499 (1985)]. Forsøget og resultaterne er anført i tabel III 25
Tabel III
L6-Antii5tof (^ug/ml) Cytotoksicitet 50 3 10 54 30 1 43 50 (intet komplement) 1 10 (intet komplement) 3
Targetceller plus medium 0 35 Antistoffer, der aktiverer humant komplement, har interesse af mindst to grunde: de kan direkte dræbe 0 26 DK 168049 B1 tumorceller, og de kan være i stand til at inducere et inflammatorisk respons i tumorområdet med aktiverede makrofager og andre celler, som fortrinsvis er cytolytiske til neoplastiske i sammenligning med normale celler 5
Eksempel 5
Specificitetsafprøvning med immunhistologi mod forskellige tumorer 10 Væv_Antistof L6
Lungecarcinom adeno 18/19 squamosus 8/10 småcellet 2/6 storcellet 2/2 15 Brystcarcinom 13/16
Coloncarcinom 9/9
Melanom 1/4
Andre tumorer (sarcom etc.) 1/9 20 25 30 35
Claims (11)
1. Monoklonalt antistof eller et Fab-, F(ab')2- eller Fv-fragment deraf, hvis antigen-kombinerende sted bindes til: a) et carbonhydrat-antigen, der er beslægtet, men 5 ikke identisk med ganglio-N-triosylceramid, betegnet asialo GM2/ der er en celleoverfladedeterminant af humant, ikke-små-cellet lungecarcinom, og b) et protein-antigen med en molekylvægt på ca. 20.000 dalton, og som er associeret med humant, ikke-småcellet 10 lungecarcinom, hvorhos antistoffet er i stand til binding til target-anti-genet af monoklonale antistoffer produceret af hybridomet betegnet ATCC HB6877, hvorved man kompetitivt inhiberer (binding af antistoffet inhiberer kompetitivt) bindingen af 15 monoklonale antistoffer produceret af hybridomet betegnet ATCC HB6877 til det nævnte carbonhydrat-antigen, eller et fragment deraf.
2. Monoklonalt antistof eller fragment deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er af IgG-isoty- 20 pen.
3. Monoklonalt antistof eller fragment deraf ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er af IgG2a-iso-typen.
4. Monoklonalt antistof ifølge ethvert af kravene 25 1-3 eller et fragment deraf, der produceres af en murin hybridom-cellelinie med identifikationsbetegnelsen HB8677 som deponeret ved ATCC.
5. Monoklonalt antistof ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det betegnes L6, eller et fragment 30 deraf.
6. Monoklonalt antistof eller et fragment deraf ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det er konjugeret til et mærkningsstof, der kan producere et detekterbart signal.
7. Monoklonalt antistof eller et fragment deraf ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at mærk- DK 168049 B1 ningsstoffet omfatter et fluorescerende middel, en radioaktiv mærkning, en chromofor eller et enzym.
8. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand i en vævsprøve, kendetegnet 5 ved, at man a) · bringer vævsprøven i kontakt med et monoklonalt antistof eller et fragment deraf ifølge ethvert af kravene 1-7 og b) detekterer hvorvidt det monoklonale antistof eller 10 fragmentet deraf bindes immunspecifikt til vævsprøven, idet immunspecifik binding af det monoklonale antistof eller fragmentet deraf til vævsprøven indikerer tilstedeværeslen af en malign tilstand i vævsprøven.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendeteg-15 net ved, at bindingen af det monoklonale antistof eller fragmentet deraf til vævsprøven detekteres i trin b) ved kontakt mellem vævsprøven og et konjugat af et mærkningsstof og en specifik bindingspartner for det monoklonale antistof eller fragmentet deraf, idet mærkningsstoffet kan tilveje-20 bringe et detekterbart signal således, at detektering af signalet bundet til vævsprøven indikerer bindingen af det monoklonale antistof eller fragmentet deraf til vævsprøven.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at bindingspartneren omfatter et antistof, der 25 er specifikt for det monoklonale antistof eller et fragment deraf.
11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 8-10, kendetegnet ved, at vævsprøven omfatter en lunge-, tarm- eller brystvævsprøve.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/684,759 US4935495A (en) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas |
| US68475984 | 1984-12-21 | ||
| US77632185 | 1985-10-18 | ||
| US06/776,321 US4906562A (en) | 1984-12-21 | 1985-10-18 | Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
| US8502441 | 1985-12-13 | ||
| PCT/US1985/002441 WO1986003838A1 (en) | 1984-12-21 | 1985-12-13 | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK393886D0 DK393886D0 (da) | 1986-08-19 |
| DK393886A DK393886A (da) | 1986-08-19 |
| DK168049B1 true DK168049B1 (da) | 1994-01-24 |
Family
ID=27103432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK393886A DK168049B1 (da) | 1984-12-21 | 1986-08-19 | Monoklonalt antistof eller et fragment deraf samt fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af humane ikke-smaacellede lungecarcinomer. |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4906562A (da) |
| EP (1) | EP0207963B1 (da) |
| JP (1) | JPH09191878A (da) |
| KR (1) | KR910000956B1 (da) |
| AT (1) | ATE77701T1 (da) |
| AU (1) | AU601360B2 (da) |
| CA (1) | CA1335796C (da) |
| DE (1) | DE3586262T2 (da) |
| DK (1) | DK168049B1 (da) |
| ES (2) | ES8800602A1 (da) |
| FI (2) | FI88808C (da) |
| GB (1) | GB2180256B (da) |
| GR (1) | GR853054B (da) |
| HU (1) | HUT42637A (da) |
| IE (1) | IE58572B1 (da) |
| IL (1) | IL77291A (da) |
| NO (1) | NO174718C (da) |
| NZ (1) | NZ214542A (da) |
| OA (1) | OA08412A (da) |
| PH (1) | PH25742A (da) |
| PT (1) | PT81744B (da) |
| WO (1) | WO1986003838A1 (da) |
| YU (1) | YU45294B (da) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| EP0173648A3 (en) * | 1984-08-30 | 1988-04-27 | Ciba-Geigy Ag | New monoclonal antibodies to glycoconjugates, processes for their production, and applications |
| IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
| US5614610A (en) * | 1984-12-21 | 1997-03-25 | Oncogen | Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies |
| AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
| EP0234122A3 (en) * | 1986-02-21 | 1989-03-22 | Oncogen Limited Partnership | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
| IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
| NZ225599A (en) | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
| AU632469B2 (en) * | 1988-04-04 | 1993-01-07 | Johns Hopkins University, The | A method for early detection of lung cancer |
| US5173292A (en) * | 1988-06-14 | 1992-12-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies which specifically recognize galactosyl-globoside, compositions containing same and methods of using same |
| US5171665A (en) * | 1989-04-17 | 1992-12-15 | Oncogen | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors |
| US5192551A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-09 | Johns Hopkins University | Neutral glycolipid as an adsorbent for enteric viral pathogens |
| CA2015862A1 (en) * | 1989-05-04 | 1990-11-04 | Gajanan Nilaver | Cell surface antigen that binds with l6 monoclonal antibody |
| CA2040513A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Robert C. Bast, Jr. | Method of diagnosing cancer |
| US5165922A (en) * | 1990-05-22 | 1992-11-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Synergistic tumor therapy with combinations of biologically active anti-tumor antibodies and chemotherapy |
| DK0610179T3 (da) * | 1990-07-20 | 1997-03-24 | Pharmacia & Upjohn Ab | Målspecifikke antistof-superantigenkonjugater og fremstilling deraf |
| US5597707A (en) * | 1993-04-15 | 1997-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use |
| US7745159B2 (en) * | 1999-02-26 | 2010-06-29 | Nathalie B Scholler | Methods and compositions for diagnosing carcinomas |
| US6117981A (en) * | 1999-06-03 | 2000-09-12 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof |
| EP1320551A4 (en) * | 2000-09-01 | 2006-12-20 | Internat Bioimmune Systems Inc | IDENTIFICATION AND DEVELOPMENT OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SQUAFTEPITHELIC CARCINOMA |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| HRP20140338T1 (hr) * | 2005-07-25 | 2014-06-20 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Smanjenje broja b-stanica upotrebom molekula koje se specifiäśno vežu na cd37 i cd20 |
| WO2007146968A2 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Single-chain multivalent binding proteins with effector function |
| EP2365003A1 (en) | 2008-04-11 | 2011-09-14 | Emergent Product Development Seattle, LLC | CD37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| RU2526156C2 (ru) * | 2008-11-13 | 2014-08-20 | ЭМЕРДЖЕНТ ПРОДАКТ ДИВЕЛОПМЕНТ СИЭТЛ, ЭлЭлСи | Cd37-иммунотерапевтическая комбинированная терапия и ее применения |
| TR201810152T4 (tr) | 2011-10-14 | 2018-08-27 | The Board Of Regents Of The Universty Of Texas System | Bileşikler ve anti-tümör nqo1 substratları. |
| WO2014089177A2 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines |
| CA2909091C (en) * | 2013-04-09 | 2021-11-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Tumor-selective combination therapy |
| EP3352760B1 (en) | 2015-09-21 | 2026-03-11 | Aptevo Research and Development LLC | Cd3 binding polypeptides |
| US10918627B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-02-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs |
| WO2018209239A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
| US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
| US11535634B2 (en) | 2019-06-05 | 2022-12-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof |
| WO2022182415A1 (en) | 2021-02-24 | 2022-09-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507391A (en) * | 1982-04-02 | 1985-03-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for detecting the presence of GD3 ganglioside |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| US4569788A (en) * | 1983-05-18 | 1986-02-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer |
| JPS6057254A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Dainabotsuto Kk | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 |
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
| JPS61258173A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-15 | Akira Taniuchi | モノクロ−ナル抗体およびその製法ならびに用途 |
| AU601680B2 (en) * | 1985-05-28 | 1990-09-20 | Joseph P. Brown | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
-
1985
- 1985-10-18 US US06/776,321 patent/US4906562A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-10 CA CA000497251A patent/CA1335796C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-11 IL IL77291A patent/IL77291A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 AT AT86900473T patent/ATE77701T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 NZ NZ214542A patent/NZ214542A/en unknown
- 1985-12-13 DE DE8686900473T patent/DE3586262T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 GB GB8619900A patent/GB2180256B/en not_active Expired
- 1985-12-13 EP EP86900473A patent/EP0207963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 HU HU86569A patent/HUT42637A/hu unknown
- 1985-12-13 WO PCT/US1985/002441 patent/WO1986003838A1/en not_active Ceased
- 1985-12-13 AU AU53124/86A patent/AU601360B2/en not_active Ceased
- 1985-12-17 PH PH33200A patent/PH25742A/en unknown
- 1985-12-18 IE IE322085A patent/IE58572B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-18 GR GR853054A patent/GR853054B/el unknown
- 1985-12-19 YU YU1996/85A patent/YU45294B/xx unknown
- 1985-12-20 PT PT81744A patent/PT81744B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-20 ES ES550251A patent/ES8800602A1/es not_active Expired
- 1985-12-31 KR KR1019860700504A patent/KR910000956B1/ko not_active Expired
-
1986
- 1986-07-29 NO NO863071A patent/NO174718C/no unknown
- 1986-08-19 DK DK393886A patent/DK168049B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-20 FI FI863375D patent/FI88808C/fi active
- 1986-08-20 FI FI863375A patent/FI98736C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-09-18 OA OA58956A patent/OA08412A/xx unknown
- 1986-10-16 ES ES557140A patent/ES8707797A1/es not_active Expired
-
1995
- 1995-10-27 JP JP7280811A patent/JPH09191878A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK168049B1 (da) | Monoklonalt antistof eller et fragment deraf samt fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af humane ikke-smaacellede lungecarcinomer. | |
| US5091177A (en) | Monoclonal antibodies for treatment of human non-small cell lung carcinomas | |
| US4737579A (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carinomas | |
| US5185432A (en) | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas | |
| DK170619B1 (da) | Monoklonale antistoffer og fragmenter deraf med antigener knyttet til humane ikke-småcellede lungecarcinomer | |
| DK166682B1 (da) | Monoklonale antistoffer og fremgangsmaade til diagnose af en ondartet lungecancer i ikke-smaacellede lungeceller, cellelinier, som producerer disse antistoffer, samt diagnosticeringssaet indeholdende dem | |
| CA1320689C (en) | Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen | |
| AU601680B2 (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas | |
| CA1337049C (en) | Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody | |
| FI94291C (fi) | Monoklonaalinen vasta-aine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |