DK170118B1 - Promotor til anvendelse i aspergillus - Google Patents

Description

5 i DK 170118 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt promotor til anvendelse i Aspergillus.

Indtil nu har der været udviklet et stort antal fremgangsmåder til fremstilling af polypeptider eller protei-10 ner ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi. Hovedinteressen har været koncentreret om bakterier og gær, f.eks. E. coli, Bacillus subtilis og Saccharomyces cerevisiae, der er velkarakteriserede arter hvad angår f.eks. ekspression og selekteringssystemer.

15 Foruden de ovennævnte mikroorganismer er filamen tøse svampe, såsom Aspergillus niger, attraktive kandidater som værtsorganismer for rekombinant DNA-vektorer, idet de er velkarakteriserede mikroorganismer, der i vid udstrækning er blevet anvendt til kommerciel produktion af enzymer. Bestræ-20 belserne har især været koncentreret om udviklingen af transformeringssystemer, ved hvilke der anvendes en selektionsmarkør, der tillader selektering af transformanter fra ikke-transformerede værtsorganismer.

I de seneste år er der blevet beskrevet selekte-25 ringsmarkører til transformering af Aspergillus nidulans, og der er for nylig blevet udviklet procedurer til integrativ transformering af den filamentøse svamp Aspergillus nidulans med det formål at undersøge de genetiske og molekylære processer, der kontrollerer svampecelledifferentiering.

30 Transformering af A. nidulans er blevet demonstre ret ved anvendelse af plasmider indeholdende Neurospora crassa pyr-4 genet (Ballance, D.J. et al.,

Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983) 284-289), A. nidulans amdS genet (Tilburn, J.G. et al., Gene 2J5 (1983) 205-221), A.

35 nidulans trpC genet (Yelton, M.M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.

U.S.A., 81^ (1984) 1470-1474) og A. nidulans argB genet (John, M.A. og Peberdy J., Microb.Technol. 6 (1984) 386-389). Det 2 DK 170118 B1 transformerede DNA fandtes at være integreret i værtsgenomet med temmelig lave frekvenser (typisk ^1000 transformanter^g DNA). *

For nylig er transformering af Aspergillus niger 5 med amdS genet fra A. nidulans blevet beskrevet (Kelly, J.M. og Hynes, M.J., EMBO Journal 4 (1985), 475-479), og amdS blev vist at være en potentiel selektionsmarkør til anvendelse ved transformering af Aspergillus niger, der ikke kan gro stærkt på acetamid som den eneste nitrogenkilde. Transformering af 10 Aspergillus niger under anvendelse af argB genet fra Aspergillus nidulans er også blevet beskrevet for nylig (Buxton, F.P. et al., Gene 32 (1985), 207-214).

Der er indtil nu ikke blevet udviklet nogle systemer til ekspression af fremmede proteiner i den filamen-15 tøse svamp Aspergillus oryzae hovedsageligt på grund af utilstrækkeligt kendskab til, hvordan genekspressionen i denne svamp skal kontrolleres, og på grund af mangel på egnede selekterbare genetiske markører på kloningsvektorer.

Ifølge den foreliggende opfindelse er det nu blevet 20 vist, at den ovenfor beskrevne transformeringsteknik kan anvendes til opnåelse af et højt niveau af ekspression af heterologe proteiner eller til at forøge produktionen af homologe proteiner i Aspergillus oryzae.

Som anvendt her betyder udtrykket "heterologe 25 proteiner" proteiner, der ikke produceres af A. oryzae, hvorimod "homologe proteiner" betyder proteiner, der produceres af A. oryzae selv.

Der er nu isoleret en hidtil ukendt promotor, der giver overraskende høje ekspressionsniveauer i såvel Asoercril-30 lus oryzae som andre Asperoillus-arter.

*

Den foreliggende opfindelse angår således en promoter egnet til udtrykkelse af et proteinprodukt i Aspergillus. hvilken promoter er Aspergillus orvzae TAKA-amylase promotoren eller en funktionel del deraf, eventuelt forudgået af til promotoren naturligt sammenhørende upstream aktiveringssekvenser.

3 DK 170118 B1 TAKA-amylasen er en velkendt a-amylase (Toda et al., Proc.Japan Acad. 58_ Ser. B (1982) 208-212). DNA, der koder for promotor-5 regionen blev isoleret fra TAKA-amylasegenomklonen. Sekvensen for promotoren og regioner oven for promotoren sammen med præregionen og 5'-enden af det strukturelle gen for TAKA-amylase er illustreret i fig. 1.

Som beskrevet i yderligere detaljer i eksempel 2 10 blev en DNA-sekvens, der koder for TAKA-amylasen omfattende præregionen og promotor- og upstreamaktiveringssekvenser, isoleret fra A. oryzae mycelium og indsat i BamHI-fordøjet pBR322 til dannelse af pTAKA 17, DSM4012 (se fig. 2). I pTAKA 17 er DNA fra A. oryzae vist som en 5,5 kb BamHI/Sau3AI -15 BamHI/Sau3AI fragment, idet promotor- og upstreamsaktive-ringssekvenserne repræsenterer et 2,1 kb fragment, der starter ved position 0. Den fastlagte DNA-sekvens af promotor- og upstreamaktiveringssekvenserne op til Bglll spaltningsstedet er vist i fig. 1. Promotoren ender ved 20 nucleotid(-l), der går forud for Met(l) kodonen for TAKA-amylasepræsekvensen. Nucleotidsekvensen, der koder for præsekvensen, udgøres af 63 nucleotider, og den modne TAKA-amylase starter ved en position, der svarer til nucleotid 64.

Fra pTAKA 17 kan hele promotorsekvensen omfattende 25 sekvenser ovenfor promotoren eller funktionelle dele deraf isoleres på måder, der er indlysende for en fagmand. Promotorsekvensen kan forsynes med linkere med det formål at indføre et specifikt restriktionsspaltningssted, der gør det nemmere at ligere promotorsekvensen med yderligere DNA, 30 f.eks. genet, der koder for det ønskede proteinprodukt, eller forskellige præregioner (signalpeptider).

Ifølge den foreliggende opfindelse er sekvensen fra nucleotid -1144 (se fig. 1) (der repræsenterer starten af en Sall spaltningssted) til 35 nucleotid -10 blevet anvendt som et eksempel på en velfungerende del af promotorregionen. I en yderligere udførelsesform for den foreliggende opfindelse var nucleotidsekvensen fra 4 DK 170118 B1 nucleotid -1176 til -1 forudgået af en endnu ikke sekventeret 1,05 kb fragment fra pTAKA 17. Det er indlysende for en fagmand, at der kan anvendes forskellige fragmenter. i

Ifølge en udførelsesform for den foreliggende 5 opfindelse har promotor- og upstreamaktiveringssekvenserne c følgende sekvens eller en funktionel del deraf:

GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 10 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT

ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA

AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC

TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT

TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA

15 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG

CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA

GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG

TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT

AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT

20 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT

CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA

TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA

GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT

CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC

25 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG

CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA

TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA

GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT

CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA

30 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC

ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG

der repræsenterer sekvensen fra nucleotid -1144 til -10 i ^ fig. 1.

35 5 DK 170118 B1

Ifølge en yderligere udførelsesform for den foreliggende opfindelse har promotoren og upstreamaktiveringsse-kvenserne følgende sekvens eller en funktionel del deraf: 5 AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG 10 ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA 15 ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA 20 ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA 25 AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT 30 der repræsenterer sekvensen fra nucleotid -1176 til -1 i fig.

1.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse kan den endnu ikke sekventerede upstream-region på 35 1,05 kb fra pTAKA 17 (position 0 til 1,05 i fig. 2) gå forud for den sidstnævnte sekvens.

6 DK 170118 B1

Promotoren ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes ved en fremgangsmåde til ekspression af et proteinprodukt i Aspergillus, og denne fremgangsmåde omfatter 5 følgende trin: 4 (a) tilvejebringelse af et rekombinant DNA-klonings-vektorsystem, der er i stand til at integreres i genomet i en Aspergillus vært i en eller flere kopier og omfattende: A. orvzae TAKA-amylasepromotoren; en egnet markør til selektering 10 af transformanter; og en DNA-sekvens, der koder for det ønskede proteinprodukt; (b) transformering af Aspergillus værten, der ikke indeholder et funktionelt gen for den valgte selekteringsmarkør, med det rekombinante DNA kloningsvektorsystem fra trin 15 a; og (c) dyrkning af den transformerede Aspergillus oryzae vært i et egnet næringsmedium.

Det udtrykte produkt kan derefter udvindes fra næringsmediet.

20 Den anvendte transformeringsteknik var en metode tilpasset fra metoderne til transformering af A. nidulans (Ballance et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289; Tilburn et al., Gene 26 (1983), 205-221, Yelton et al. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81 (1984), 1470-1474) og 25 lignende metoden beskrevet af Buxton et al., (Gene 2]_ (1985), 207-214) til transformering af A. niger. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse transformeres Aspergillus oryzae med et vektorsystem, der indeholder en selekteringsmarkør, der er i stand til at inkorporeres i værtsstammens 3Q genom, men som ikke indeholdes i værtsstammen før transformering. Der kan derpå selekteres for transformanter, og disse kan isoleres fra ikke-transformanter på basis af den inkorporerede selekteringsmarkør.

Foretrukne selekteringsmarkører er argB-(A.

* 35 nidulans eller A. niger), trpC-(A. nidulans),.amdS-(A.

nidulans), eller pyr4-(Neurospora crassa) gener,' eller DHFR-(dihydrofolatreduktase eller mutanter deraf) genet. Mere foretrukne selekteringsmarkører er argB- eller amdS-genet.

7 DK 170118 Bl

Vildtype A. oryzae stammer er normalt argB+ (d.vs. argB genet er funktionelt i A. oryzae). Hvis argB vælges som selekteringsmarkøren, må der som værtsorganisme anvendes en argB mutantstamme af A. oryzae, der er defekt i genet for denne g markør. A. oryzae argB mutanter kan fremstilles som beskrevet af F.P. Buxton et al., (Gene 37 (1985), 207-214). En argB mutant er defineret som en mutant, der har en defekt i ornithintranscarbamylasegenet. På den anden side kan amdS genet anvendes som selekteringsmarkør for transformering af vildtype A. oryzae, da viIdtypestammerne ikke indeholder dette gen.

DNA-kloningsvektoren, der indeholder TAKA-amylase promotoren kan desuden indeholde terminator- og polyadenyleringssekvenser, der kan fås 15 fra gener, der koder for både ekstracellulære og intracellulære proteiner, såsom amylaser, glucoamylaser, proteaser, lipaser, cellulaser og glycolytiske enzymer.

Egnede promotorer kan fås fra gener for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei aspartat proteinase, A. niger 20 glucoamylase, A. niger neutral a-amylase, A. niger syrestabil a-amylase og Rhizomucor miehei lipase. Eksempler på promotorer fra gener for glycolytiske enzymer er TPI, ADH og PGK. Enhancersekvenser kan også indsættes i konstruktionen.

25 Det udtrykte produkt kan akkumuleres inden for cellerne, hvilket kræver en sprængning' af cellerne for at isolere produktet. For at undgå dette yderligere trin og også for at minimere mængden af eventuel nedbrydning af det udtrykte produkt i cellerne, foretrækkes det, at produktet 30 secerneres fra cellerne. Til dette formål udstyres genet for det ønskede produkt med en præregion, der sikrer effektiv ledelse af det udtrykte produkt ind i cellens sekretionsvej. Denne præregion, som kan være et naturligt forekommende signal- eller lederpeptid eller funktionelle dele deraf eller 3g syntetiske sekvenser, der tilvejebringer sekretion, fraspaltes sædvanligvis fra det ønskede produkt under sekretionen, hvorved det modne produkt er klar til isolering fra næringsvæsken.

Præregionen kan fås fra gener for secernerede proteiner fra vilkårlige organismer.

8 DK 170118 B1

Ifølge den foreliggende opfindelse kan præregionen fås fra et glucoamylase- eller amylasegen fra en Aspergillus-art, et amylasegen fra en Bacillusart, et lipase- eller proteinasegen fra Rhizomucor miehei, genet for α-faktoren fra 5 S. cerevisiae eller kalveprochymosingenet. Mere foretrukket ^ fås præregionen fra genet for A. oryzae TAKA-amylase, A. niger neutral a-amylase, A. niger syrestabil α-amylase, B. licheniformis α-amylase, den maltogene amylase fra Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α-amylase eller B. licheni-formis subtilisin. Effektive signalsekvenser er A. oryzae TAKA-amylasesignalet, Rhizomucor miehei aspartat proteinase-signal og Rhizomucor miehei lipasesignalet.

TAKA-amylasesignalet har følgende sekvens ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCT

MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaPro

GCTTTGGCT

AlaLeuAla

Genet for det ønskede produkt, der funktionelt er forbundet med promotor- og terminatorsekvenser, kan inkorpo- 20 reres i en vektor, der indeholder en selekteringsmarkør, eller kan anbringes på en separat vektor eller et separat plasmid, der er i stand til at integreres i værtsstammens genom. Som anvendt her betyder udtrykket "vektorsystem" en enkelt vektor eller et enkelt plasmid eller to eller flere 25 vektorer eller plasmider, der sammen indeholder den totale DNA-information, der skal integereres i værtsgenomet.

Vektorer eller plasmider kan være lineære eller lukkede cirkulære molekyler.

Eksempler på produkter, der kan udtrykkes ved hjælp af promotoren ifølge opfindelsen, er chymosin eller prochymosin og andre mælkekoaguleringsenzymer, proteases, amylogluco-sidaser, syrestabile amylaser fra Aspergillus, svampelipaser eller prokaryote lipaser samt thermostabile bakterie- og svampeamylaser.

35 .

DK 170118 B1 9

Den foreliggende opfindelse skal illustreres yderligere med reference til tegningen på hvilken, fig. 1 viser DNA-sekvensen af TAKA-amylasepromo- 5 toren og upstream-promotorregioner, præregionen og 5'-delen af det strukturelle gen for TAKA-amylasen, fig. 2 viser et endonucleaserestriktionskort for plasmid pTAKAl7, fig. 3 viser konstruktionen af plasmid p285'proC, fig. 4a og b viser DNA-sekvensen af præpro Rhizomu-cor miehei aspartat proteinase cDNA sammen med den afledte aminosyresekvens karakteriseret ved trebogstavsforkortelser, 15 fig. 5 viser konstruktionen af plasmid pRMP, fig. 6 viser endonucleaserestriktionskortet for plasmid pCAMG91, fig. 7a viser konstruktionen af plasmid pICAMG/Term, 20 fig. 7b viser konstruktionen af plasmid p686, fig. 8 viser konstruktionen af plasmid pRMPAMGTerm, fig. 9a viser konstruktionen af plasmid pB408.3, fig. 9b viser konstruktionen af plasmid p778, fig. 10 viser konstruktionen af plasmid p719, __ fig. 11 viser konstruktionen af plasmid p777, 25 fig. 12 viser sekvensen af præpro Rhizomucor miehei lipase cDNA sammen med den afledte aminosyresekvens angivet ved trebogstavsforkortelser, fig. 13a viser konstruktionen af plasmid pB544, ^ fig. 13b viser konstruktionen af plasmid p787, fig. 14 viser DNA-sekvensen af et syntetisk fragment RML51, fig. 15a viser konstruktionen af plasmid pTOC51 og fig. 15b viser konstruktionen af plasmid pTOC56.

35 DK 170118 B1 10

Den foreliggende opfindelse illustreres ved hjælp af produktionen af prochymosin, Rhizomucor miehei aspartat 5 proteinase, TAKA-amylase og en lipase fra Rhizomucor miehei.

Generne for disse enzymer blev isoleret fra cDNA biblioteker eller genome biblioteker som beskrevet i yderli- * gere detaljer i det følgende.

De som udgangsmaterialer anvendte plasmider i de følgende eksempler er som følger: p285: (ATCC nr. 20681) pCAMG91: Boel et al. EMBO Jornal 3 (1984), 1581-1585 15 PICI9R: Marsh et al. Gene 32 (1984), 481-485 pSal43: Berse et al. Gene 25 (1983), 109-117

John & Peberdy, Enzyme Microb.

Technol. 6 (1984), 386-389 p3SR2: J.M. Kelly and M.J. Hynes, EMBO

20 Journal 4 (1985), 475-479 pBR322: Bolivar F. et.al., Gene 2 (1977), 95-113 pBR327: Covarrubias L. et al., Gene 13 (1981), 25-35 25 pUC9, pUCl3, Vieira et al., Gene _19 (1982), 259- and pUC19: 268 og Messing, Meth. in Enzymology 101 (1983), 20-27.

Der anvendtes følgende stammer: 3q A. niger: ATCC 1015, ATCC 10582 A. oryzae: ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCC 11601 og ATCC 12892.

E. coli: MC1000 (Casabacan, M.J. and Cohen, 1 35 l 11 DK 170118 B1 S.N., J.Mol.Biol. 138, 179-207) (NCIB 11956)

Rhizomucor miehei: CBS 370.65 5

Eksempel 1

Fremstilling af plasmid 285'proC indeholdende 10 prochymosingenet

Præprochymosingenet fra kalvemave cDNA-bibliotek og indsat i Pstl-spaltningsstedet i pBR322 ved G-C-tailing (Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294 og Truelsen et al., Nucleic Acids Res. (5 (1979), 3061) til opnåelse af pR26.

15 pUC9 blev skåret med Sall og udfyldt med Klenow polymerase og lieret med T4 ligase. Det fremkomne plasmid blev skåret med BamHI-EcoRI, og det 2,7 kb store fragment blev ligeret med et 0,47 kb BamHI-EcoRI-fragment fra pR26, der indeholder den N-terminale ende af prochymosingenet, til dannelse af pUC9'.

20 pUC9' indeholder et Hindlll-spaltningssted i den N-terminale ende af prochymosingenet. pUC13 blev skåret med BamHI-Narl og Narl-Xmal, og det store henholdsvis lille fragment blev ligeret med et 0,64 kb Xmal-BclI-fragment fra pR26, der indeholder den C-terminale ende af prochymosingenet, til 25 opnåelse af plasmid pUC13'. pUC13' -indeholder et Xbal- spaltningssted ved den C-terminale ende af prochymosingenet.

Et 0,65 kb Xmal-Xbal-fragment af pUCl31 blev ligeret med et 0,46 kb Hindlll-Xmal-fragment fra pUC9' og et 11 kb Xbal-. HindIII-fragment fra p285 til dannelse af plasmid p285' proC, 30 der indeholder prochymosingenet som vist i fig. 3.

12 DK 170118 B1

Eksempel 2

Kloning af A. oryzae TAKA-amylase genet %

Isolering af en partiel cDNA klon 5 Fra A. oryzae Hw 325, der blev dyrket på kartoffel- « stivelse, blev mRNA fremstillet ifølge Kaplan et al.,

Biochem.J. 183, (1979) 181-84. En partiel cDNA klon, der indeholdt 1050 bp fra TAKA-amylasegenet blev opnået ved specifik priming af mRNA med en 14-mer 10 oligonucleotidblanding:

A A A A

5'GG TT TC TG TT 3*(NOR-168),

G G G G

15 der er komplementær til den kodende sekvens for aminosyrer 295-299 i TAKA-amylasen (Toda et al., Proc.Japan Acad. 58,

Ser. B, (1982) 208-212). Der blev anvendt en kloningsprocedure som beskrevet af Gubier & Hoffmann, Gene 2^5, (1983) 20 263-269. Sekventering ved enderne og i midten af cDNA klonen viste tilstedeværelsen af sekvenser, der svarer til aminosyre sekvensen af TAKA-amylasen.

Isolering af en genomklon 25 Mycelium fra A. oryzae Hw 325 blev høstet og videreforarbejdet til fremstilling af DNA ifølge metoden anvendt for A. niger beskrevet af Boel et al., supra. Restriktionsfragmenter på 3 - 10 kb, der var dannet ved delvis fordøjelse med Sau3A, blev ligeret med BamHI-fordøjet, 30 dephosphoryleret pBR322 (New England Biolabs). 50.000 rekom-binanter blev screenet med den ovenfor beskrevne oligonu-cleotidprobe NOR-168, og der blev fundet 7, der indeholdt DNA kodende for TAKA-amylasen. En klon blev udvalgt til yderligere anvendelse af promotorregionen med 2,1 kb ovenfor mRNA-35 starten. Restriktionskortet for plasmid pTAKA 17 er vist i fig. 2. pTAKA 17 transformeret i en E. colistamme er blevet deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), 13 DK 170118 B1

Griesebachstrasse 8, D-3400/ Gottingen, d. 23. februar 1987 og fik deponeringsnummeret DSM 4012. DSM, der er et internationalt deponeringsinstitut autoriseret under Budapesttrakta-ten fra 1977, sikrer permanent deponering og offentlighedens 5 adgang dertil ifølge regel 9 og 11 i ovennævnte traktat.

Eksempel 3

Konstruktion af et Rhizomucor miehei cDNA bibliotek 10 Fycomyceten Rhizomucor miehei (med hensyn til en morfologisk og taxonomisk beskrivelse af denne art henvises til: Schipper, M.A.A. On the genera Rhizomucor and Parasitella. I: Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Sciences and Letters. No. 17 (1978), 15 53-71) udskiller en sur proteinase (Rhizomucor miehei proteinase, i det følgende forkortes til RMP), der i vid udstrækning anvendes til koagulering af mælk i osteproduktion. For at opnå cDNA rekombinantkloner af dette protein i E. coli blev total RNA ekstraheret fra homogeniseret R. miehei 20 mycelium som beskrevet af Boel et al. (EMBO J., 2: 1097-1102, 1984) og Chirgwin et al., (Biochemistry (Wash.), 3J), 5294-5299, 1979). Poly(A)-indeholdende RNA blev opnået ved to gange affinitetskromatografi på oligo(dT)-cellulose, som beskrevet af Aviv og Leder (PNAS, USA, 69_, 1408-1412, 1972).

25 Oligo(dT)-initieret komplementært DNA blév syntetiseret og gjort dobbeltstrenget ifølge Gubier og Hoffman (Gene, 25, 263-269, 1983). Dobbeltstrenget cDNA blev forsynet med hale med dCTP og terminal deoxynucleotidyltransferase som beskrevet af (Roychoudhury et al. (Nucleic Acids Res., 3_, 30 101-106, 1976). Plasmid pBR327 blev lineariseret'med PstI og forsynet med hale med dGTP. Oligo(dC) dscDNA forsynet med hale blev baseparret til denne med oligo(dG)-hale forsynede vektor som beskrevet af Peacock et al., Biochem.Biophys.

Acta, 655, 243-250, 1981) og anvendt til at transformere et 35 hsdR~, M derivat af E. coli MC1000 (Casadaban and Cohen, J.Mol.Biol., 138, 179-207, 1980) til dannelse af rekombinantkloner.

14 DK 170118 B1

Identificering af RMP specifikke cDNA rekombinanter En blanding af 16 heptadecamer oligodeoxyribonucleotider »

5 A A A A

d(GC TCCA AA ΤΑ TA),

G G G G

af hvilken en er komplementær til RMP mRNA i regionen kodende 10 for Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Ale (Bech og Foltmann, Neth-milk Dairy J. 3_5: 275-280/ 1981) blev syntetiseret på en Applied Biosystems, Inc. DNA syntesemaskine og oprenset ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese. Omtrent 10.000 E. coli rekombinanter fra Rhizomucor miehei cDNA-biblioteket blev overført 15 til Whatman 540 papirfiltre. Kolonierne blev lyseret og immobiliseret som beskrevet af Gergen et al. (Nucleic Acids

Res. 7, 2115-2135, 1979). Filtrene blev hybridiseret med 32 ~~ P-mærket RMP-specifik heptadecamerblanding som beskrevet af Boel et al., (EMBO J. 3^, 1097-1102, 1984). Hybridisering og 20 vask af filtrene blev udført ved 40°C efterfulgt af autoradiografi i 24 timer med en forstærkningsskærm. Miniprep plasmid DNA blev isoleret fra en hybridiserende koloni pRMPl016 ved standardprocedure (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res., 1_, 1513-1523, 1979), og DNA^sekvensen af det 25 indsatte cDNA fragment blev bestemt ved Maxam og Gilbert proceduren (Methods Enzymol 6j>, 499-560, 1980). pRMP1016 blev påvist at indeholde en del af den 5' ikke translaterede ende af mRNA og udstrækker sig derpå gennem regionerne, der koder for en 69 aminosyre lang præproregion og 300 aminosyrer i den 30 modne del af RMP proteinet. Da pRMP1016 ikke indeholdt noget

indsat fragment svarende til den fuldstændige 3' ende af RMP

32 mRNA, blev cDNA biblioteket screenet igen med et P nick-translateret 3' specifikt restriktionsfragment fra klon pRMP1016, hvorved klonen pRMP2931 blev isoleret. Denne klon 35 indeholder en del af den 3' ikketranslaterede region og en åben læseramme med 270 tripletter, der koder for den carboxy-terminale ende a:: RMP-proteinet. pRMPl016 og pRMP2931 har 15 DK 170118 B1 derfor en væsentlig overlapning, og den kombinerede sekvens af de to kloner giver sekvensen for R. miehei præproRMP-cDNA. Der blev sekventeret et totalt antal på 1416 nucleotider mellem G:C enderne resulterende fra cDNA kloningsproceduren.

5 Den fastlagte DNA-sekvens er vist i fig. 4a og b sammen med den heraf udledte aminosyresekvens af en precursor for RMP. I fig. 4a og 4b angiver de vandrette linier positionen af en syntetisk oligoblanding anvendt til screening af cDNA bibliotek. En pil viser den position, hvor der sker spaltning i 10 modning af naturligt RMP. Nucleotiderne er nummereret fra den første base i start-Met-kodonen, og aminosyrerne er nummereret fra den første aminosyrerest i det modne RMP. Fra denne cDNA sekvens kan det konkluderes, at RMP syntetiseres som en 430 aminosyre lang precursor med et propeptid på 69 amino-15 syrer. Et formodet signalpeptidasespaltningssted (von Heijne, Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) i denne precursor kunne være mellem Ala(-48) og Arg(-47), og det modne RMP ville blive dannet ved autoproteolytisk spaltning mellem Glu(-l) og Ala(+1). Den fra cDNA afledte aminosyresekvens af RMP er i 20 god overensstemmelse med den tidligere publicerede delvise aminosyresekvens (Bech og Foltmann, Neth-Milk Dairy J. 35: 275-280, 1981).

For at gøre det yderligere konstruktionsarbejde med RMP-cDNA lettere, blev-der indsat en Hindlll-linker i et 25 Banl-spaltningssted netop efter 3'-enden af TAA- termineringskodonen identificeret i klon pRMP2931 som følger: 25 pg pRMP2931 blev fordøjet med PstI to opnåelse af RMPcDNA-fragmentet. Dette fragment blev oprenset ved 1% agarosegelelektroforese, elektroelueret fra gelen, renset med 30 phenol- og kloroformekstraktioner, og udfældet med NaCl og ethanol. Dette fragment, der koder for 3'-halvdelen af RMP, blev .fordøjet med BanI, og de kohesive Banl-restriktionsspaltningssteder blev udfyldt med en blanding af 4 dNTP'er og Klenowfragmentet af E. coli DNA-polymerase. Til 35 disse udfyldte ender blev der tilføjet Hindlll-linkere i en T4-DNA ligasereaktion. Ligeringsblandingen blev ekstraheret med phenol og kloroform, og DNA blev udfældet med 4M NH4+ 16 DK 170118 B1 acetat/ethanol. Det oprensede DNA blev fordøjet med et overskud af Hindu I enzym, og et 380 bp fragment blev oprenset på en 6% polyacrylamidgel. Dette fragment, der « indeholder 3'-enden af den åbne læseramme for RMP plus TAA-5 termineringskodonen, blev ligeret til pIC19R,‘ der var fordøjet med Hindlll og behandlet med alkalisk phosphatase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og transformanter blev udvalgt på ampicillinholdige agarplader. Plasmid DNA blev oprenset fra 10 transformanterne, og korrekte rekombinanter blev identificeret ved restriktionsendonucleasefordøjelse og agarosegelelek-troforese. Fra en sådan korrekt rekombinant pRMP3' blev der isoleret et 210 bp Bglll/Hindlll-fragment ved 6% polyacryl-amidgelelektroforese. Dette fragment indeholder 3'-enden af 15 RMP-cDNA fra BglIl-spaltningsstedet ved aminosyrerne 297-299 og strækker sig gennem TAA-termineringskodonen til den indsatte Hindlll-linker.

5'-delen af RMP-cDNA blev isoleret fra pRMP 1016 som et 997 bp Hindlll/BgIII-fragment ved 1% agarose gelelek-20 troforese. Hindlll-spaltningsstedet er i RMP-DNA lokaliseret ved en position svarende til resterne -36/-35 i prosegmentet.

Dette 997 bp 5'-fragment blev ligeret til 210 bp 3'-fragmentet i pIC19R fordøjet med Hindlll og behandlet med phosphatase. Med denne ligeringsblanding blev der opnået rekombinanter 25 fra E. coli, og et korrekt plasmid,- pRMP, med 5'-delen af RMP forbundet med 3*-delen blev identificeret ved restriktionsenzymanalyse. Konstruktionen af pRMP er illustreret i fig. 5. pRMP koder ikke for RMP-præregionen og 5' halvdelen af prosegmentet.

30

Eksempel 4

Konstruktion af en Aspergillus ekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af aktivt RMP 35 I dette eksempel blev der konstrueret et plasmid til ekspression af RMP under kontrol af glucoamylasepromo-toren, glucoamylasesignalet og glucoamylaseterminatorse- 17 DK 170118 B1 kvenser. Glucoamylasepromotoren og terminatorsekvenserne blev opnået fra det genome glucoamylasegen klonet i vektor pCAMG91. Konstruktionen af pCAMG91 er beskrevet af Boel et al. (EMBO Journal 3^ (1984), 1581-1585), og et endonucleasere-5 striktionskort for plasmid pCAMG91 er vist i fig. 6.

pCAMG91 blev fordøjet med Sall og PstI restrik-tionsendonucleaser. Fra en sådan fordøjet blanding blev der isoleret et 698 bp fragment på en agarosegel. Dette Sall-Pstl-fragment indeholder den region, der koder for den 140 bp 10 3' ikketranslaterede del af glucoamylase-mRNA plus 540 bp 3' i forhold til poly(A)-additionsstedet. Dette 3'-fragment blev behandlet med T4-DNA polymerase for at forsyne restriktionsspaltningsstedet med lige afskårne ender før påsætningen af Xbal-linkere og fordøjelse med Xbal restriktionsenzym. Denne 15 3'-ende af glucoamylasegenet blev ligeret til pUCl3, der var lineariseret med Xbal, til dannelse af plasmid pAMG/Term, der indeholder poly(A)-additionsregionen af glucoamylasegenet. Konstruktionen af pAMG/Term er illustreret i fig. 7a.

3'-enden af A. niger glucoamylasegenet blev opnået 20 som et 700 bp Xbal-fragment fra pAMG/Term. Dette terminator-fragment blev ligeret til pICl9R, der var fordøjet med Xbal og behandlet med phosphatase. Med denne ligeringsblanding blev der opnået rekombinanter fra E. coli, og et korrekt plasmid, pICAMG/Term, med 5'-enden af terminatorfragmentet 25 stødende op til Hindlll spaltningsstedet i det multiple kloningssted i pICl9R-vektoren, blev identificeret ved restriktionsenzymanalyse. Konstruktionen af pICAMG/Term er illustreret i fig. 7a. Fra pICAMG/Term blev glucoamylaseter-minatoren (AMG terminator) regionen isoleret som et 750 bp 30 Hindlll/Clal -spaltningsfragment ved 1% agarosegelelektro-forese. Fra pCAMG91 blev glucoamylasepromotoren (AMG promotoren) "isoleret sammen med de regioner, der koder for glucoamy-lasesignalpeptidet, hexapeptid-prosegmentet og ampicillin-resistensgenet (Amp) fra pBR322 som et 3,5 kb Clal/BssHII-35 fragment ved 1% agarosegelelektroforese. Der blev fremstillet en syntetisk BssHII/Hindlll-linker fra to syntetiske 31'-mer 18 DK 170118 B1 oligonucleotider, fremstillet på en Applied Biosystems Inc.

DNA-syntesemaskine. Den syntetiske linker har følgende struktur: 5

5 RVSKQSESKD

CGCGTAAGTAAGCAGAGCGAGAGCAAGGATA

ATTCATTCGTCTCGCTCTCGTTCCTATTCGA

Denne linker blev anvendt i en ligeringsreaktion 10 med 3,5 kb fragmentet indeholdende glucoamylasepromotoren og 750 bp fragmentet indeholdende glucoamylaseterminatoren. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli, og der blev identificeret en korrekt rekombinant, p673 ved restriktionsendonucleasespaltning. Den isolerede p673 er en 15 HindiIl-kloningsvektor, i hvilken der kan indsættes et passende Hindlll-cDNA-fragment mellem glucoamylasehexapeptid-prosegmentet og glucoamylasetransscriptionsterminator-regionen. Det indsatte cDNA vil være under transscriptionel kontrol af glucoamylasepromotoren, og sekretionen af det 20 translaterede fusionsprodukt vil være dirigeret af glucoamy-lasesignalpeptidet plus glucoamylasehexapeptidprosegmentet. p673 blev fordøjet med Hindlll, behandlet med alkalisk phosphatase og ligeret til et 1,2 kb HindIII-fragment oprenset fra en fordøjet blanding af pR-MP.

25 Ligeringsblandingen blev 'anvendt til at transforme re E. coli og en rekombinant p686 med RMP-cDNA indsat i korrekt orientering til opnåelse af RMP-ekspression blev isoleret og karakteriseret ved restriktionsendonucleasespalt-ninger. p686 koder for en RMP-precursor med følgende 30 struktur: glucoamylasesignalpeptid, glucoamylasehexapropep-tid, aminosyrer -45 til -1 af propeptidet fra RMP, 361 aminosyrer af moden RMP. Konstruktionen af p686 er illustreret i fig. 7b.

35 19 DK 170118 B1

Eksempel 5 I en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse skal den åbne læseramme af præproRMP indsættes i et ekspressionsplasmid under kontrol af promotoren fra 5 glucoamylasegenet fra A. niger eller TAKA-amylasegenet fra A. oryzae. Til opnåelse af dette blev der indsat et BaraHI-restriktionsendonucleasespaltningssted lige foran 5'-enden af startmethioninkodonen for signalpeptidet for præproRMP på følgende måde: pRMPl016 blev fordøjet med Ddel, som spalter i 10 cDNA-et ved en position svarende til aminosyreresterne Ser(-66) og Gin(-65), og med Hindlll, der spalter i cDNA-et ved en position svarende til aminosyreresterne Lys(-36) og Leu(-35). Det fremkomne 89 bp Ddel/Hindlll-fragment blev oprenset på en 8% polyacrylamidgel, elektroelueret og ethanolfældet efter 15 phenol og CHC13 ekstraktioner. Et syntetisk DNA-fragment med følgende sekvens blev syntetiseret som to oligonucleotider på en Applied Biosystems Inc. DNA syntesemaskine:

M L F S

20 GATCCACCATGCTGTTCTC oligo 697/698

GTGGTACGACAAGGAAGT

Dette fragment har en BamHI-kohesiv ende i 5'-enden af startMet-kodonen og ..en Ddel-kohesiv ende i 3' enden. De to 25 oligonucleotider blev kineret med ATP og T4 polynucleotidkinase, baseparret til hinanden og derpå ligeret til 89 bp Ddel/Hindlll RMP-fragmentet oprenset fra pRMP 1016 i en BamHI/HindIII-fordøjet pUCl3 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og korrekte 30 rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepoprensede plasmider. Korrekte rekombinant-plasmider blev sekventeret til verificering af sekvensen af de anvendte oligonucleotider. Et sådant korrekt plasmid pRMP5' blev fordøjet med BamHI og Hindlll, og et 110 bp 35 BamHI/HindIII-fragment med startMet-kodonen, RMP-signalpep-tidet og en del af RMP-prosegmentet blev oprenset ved 10% polyacrylamidgelelektroforese. Fragmentet blev elektroelue-

«I

20 DK 170118 B1 ret, phenol- og CHCl.,-ekstraheret og fældet med ethanol. Den resterende del af den åbne RMP læseramme og AMG-terminatorse- kvenserne blev opnået fra plasmid p686 efter fordøjelse med

EcoRI og delvis Hindlll fordøjelse. Herved blev der frigjort 5 et 1,9 kb fragment, og dette fragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese, elektroeluering, phenol- og CHC13 ekstraktion før ethanoludfældning. Dette 1,9 kb fragment blev ligeret til 110' bp BamHI/Hindlll-fragmentet fra pRMP5' i en pUC13 vektor, der var blevet fordøjet med BamHI og EcoRI.

10 Li geringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler og korrekte rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepoprensede plasmider.

En sådan korrekt rekombinant var pRMPAMGTerm. Konstruktionen af pRMPAMGTerm er illustreret i fig. 8.

15

Eksempel 6

Konstruktion af en Aspergillusekspressionsvektor designet til at opnå sekretion af aktiv RMP i A. oryzae ved hjælp af 20 Aspergillus niger glucoamylasepromotor

Glucoamylasepromotoren blev isoleret som følger: 25 μg af pCAMG91 blev fordøjet med EcoRI og BssHII restriktions-endonucleaser. Efter denne dobbelte fordøjelse kunne der isoleres et 270 bp DNA fragment ved agarosegelelektrophorese.

25 Dette fragment indeholder en del af· promotorregionen, den 5' ikketranslaterede region og signalpeptidet af glucoamylase-genet (AMG-gen). Efter elektroeluering af DNA fra agarose-gelen blev fragmentet oprenset ved phenol- og CHCl^-ekstraktioner før ethanolfældning. Det 270 bp lange fragment blev 30 derpå fordøjet med SfaNI. Dette enzym har et spaltningssted netop før 5'-enden af start-ATG-methioninkodonen af glucoamy-lasegenet..Efter fuldstændig fordøjelse blev DNA behandlet med det store fragment (Klenow) af DNA polymerase I og alle fire dNTP‘er til dannelse af lige afskårne ender på DNA.

35 Dette DNA blev forsynet med Bglll-linkere med DNA-ligase, og DNA blev fordøjet med overskud af Bglll-restriktionsenzym.

Efter adskillelse af DNA-fragmenter på en 10% 21 DK 170118 B1 polyacrylamidgel kunne der isoleres et 175 bp Bglll-fragment ved elektroeluering. Dette fragment har en Bglll-linker indsat i en position svarende til SfaNI-restriktionsspaltningsstedet netop foran 5'-enden af 5 startmethioninkodonen. Dette stykke DNA blev ligeret til en pIC19R-vektor, der var fordøjet med Bglll og behandlet med alkalisk phosphatase, og ligeringsblandingen blev anvendt til transformering af E. coli celler. Blandt de fremkomne transformanter blev korrekte plasmider identificeret ved 10 restriktionsenzymspaltninger på miniprepplasmider. Et sådant korrekt plasmid pB404.1 blev fordøjet med Nsil og Bglll til frigørelse af et 0,16 kb fragment, der indeholder den 5'-ikketranslaterede region af glucoamylasegenet sammen med ca.

100 bp af 3'-enden af promotorregionen. Dette fragment blev 15 oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese, elektrolueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og ethanolfældet. For at knytte dette fragment til den resterende del af gluco-amylasepromotorregionen fra pCAMG91 blev følgende trin udført: 25 μg pCAMG91 blev fordøjet med BssHII og derpå yder-20 ligere delvist fordøjet med Ndel. Efter udfyldning af fragmentets ender med alle fire dNTP og Klenow fragmentet af DNA-polymerase, blev der isoleret et 1,4 kb DNA-fragment på en 1% agarosegel. Dette fragment indeholder hele promotorregionen sammen med den 51-ikketranslaterede region 25 og regionen kodende for signalpeptidetJ Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl3-ekstraheret og fældet med ethanol til koncentrering af DNA. Efter fordøjelse med Nsil, blev DNA kørt på en 1% agarosegel, og der blev isoleret et 1,2 kb Ndel - Nsil-fragment ved elektroeluering. Dette DNA 30 var blevet forsynet med lige afskårne ender ved Ndel- spaltningsstedet i en tidligere reaktion og blev nu ligeret til 0,16 kb Nsil - Bglll-fragxnentet fra pB401.1 i en pIC19R-vektor fordøjet med Nrul - Bglll. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler og blandt de 35 fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant pB408.3 blev 22 DK 170118 B1 fordøjet med Hindlll og Bglll, og glucoamylase-(AMG) promotoren blev isoleret som et 1,4 kb fragment på en 1% agarosegel. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^ ^ ekstraheret og ethanolfældet. Dette glucoamylasepromotor-5 fragment blev derpå ligeret til et 2,0 kb BamHI-EcoRI-fragment fra pRMPAMGTerm (se eksempel 5) i en pUC19 vektor fordøjet med Hindlll-EcoRI. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved 10 restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant p778 blev dyrket i stor skåle til isolering af rekombinantplasmid, og plasmidpræparationen blev oprenset ved CSCl/ethidiumbromid-centrifugering. Dette plasmid dirigerer syntesen af RMP under kontrol af 15 glucoamylasepromotor- og glucoamylaseterminatorsekvenser. Konstruktioner af p408.3 er illustreret i fig. 9a, og konstruktionen af p778 er illustreret i fig. 9b.

20 Eksempel 7

Konstruktion af en Aspergillus ekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af aktiv RMP ved hjælp af Aspergillus oryzae TAKA-amylasepromotoren 50 μg af plasmid pTAKA17 (se .eksempel 2), der 25 indeholder det genome Aspergillus oryzae TAKA-amylasegen, blev fordøjet med Sall. Dette enzym har et restriktionsspaltningssted i det genome DNA ved en position svarende til aminosyreresten 26 i den modne TAKA-amylase. Et andet Sall restriktionsspaltningssted er anbragt ca. 1300 nucleotider 30 oven for denne position, d.v.s. i 5'-enden af upstream-promo-torregionen. Efter Sall-fordøjelse blev dette 1300 bp fragment, der indeholder promotoren, oprenset ved agarosegelelektroforese, og DNA blev oprenset ved phenol- og CHCl^-ekstraktioner og ethanolfældet. DNA blev derpå opløst i 35 exonuclease III puffer og fordøjet med exonuclease III ifølge Henikoff, S. (Gene, 2£: 351-359, 1984). Reaktionen blev standset til opnåelse af ca. 130 bp deletioner i hver ende af 23 DK 170118 B1 DNA'et. Deletionen af ca. 130 bp fra Sall-spaltningsstedet i den kodende del af TAKA-amylasegenet giver på denne måde muligheden for at indføre et multipelt kloningslinkerfragment netop ovenfor startmethioninkodonen. Det exonuclease III-5 behandlede DNA blev fordøjet med SI nuclease ifølge Henikoff, S. (Gene, 2§.: 351-359, 1984) og fældet med ethanol efter phenol- og CHCl^-ekstraktioner. Reparering af Sl-nucleasebe-handlet DNA til opnåelse af ligerbare lige afskårne ender blev udført med alle fire dNTP'er og Klenowfragmentet af DNA 10 polymerase I ifølge Henikoff, S., (Gene, 28: 351-359, 1984). DNA blev fordøjet med EcoRI, som spalter ét sted i 1300 bp Sall-fragmentet til dannelse af to grupper af fragmenter. Den ene gruppe var ca. 380 bp lang og repræsenterede upstreamregioner, medens den anden gruppe var ca. 620 bp lang 15 og indeholdt promotorregionen. Disse grupper af EcoRI- fordøjede produkter blev adskilt på en agarosegel, og de ca.

620 bp lange DNA-fragmenter blev elektroelueret og ligeret til en EcoRI/Smal-fordøjet pUC19 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, 20 og miniprepplasmid DNA blev isoleret fra rekombinanterne.

Disse deletionsmutanter blev karakteriseret ved restriktionsenzymspaltninger til identificering af plasmider med deletionsendepunkter netop ved 5' for startmethioninkodonen. Nogle få kandidater med de ønskede 25 karakteristika blev sekventeret, og en mutant (p9) , der havde 9 bp deleteret ved 5’ for af A i ATG-methioninkodonen, blev udvalgt til yderligere konstruktioner. p9 blev fordøjet med EcoRI og Hindlll, og et 645 bp TAKA-amylasepro-motorindeholdende fragment blev isoleret ved agarosegelelek-30 troforese, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. pTAKA17 blev fordøjet med Sall og EcoRI, og et 510 bp fragment indeholdende TAKA-amylasepromotorupstreamregio-nerne blev isoleret ved agarosegelelektroforese, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. Disse promotorre-35 gioner blev ligeret til hinanden og til en pICl9R vektor, der var blevet fordøjet med Sall og Hindlll. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og korrekte 24 DK 170118 B1 rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspalt-ninger af plasmider ekstraheret som minipreppreparater. I en sådan rekombinant p719 blev TAKA-amylasepromotorregionen fra Aspergillus oryzae fundet som et 1/1 kb fragment, der kan 5 udskæres ved hjælp af et antal forskellige restriktionsenzymer. Konstruktionen af p719 er illustreret i fig. 10.

Fra pRMPAMGTerm blev den åbne læseramme af præproRMP og glucoamylaseterminatorregionen (AMGTerm) isoleret som et 2 kb fragment efter fordøjelse med BamHI og 10 EcoRI. Dette fragment blev oprenset ved agarosegelelektro-forese, phenol- og CHCl^-ekstraktioner og derpå koncentreret ved ethanolfældning. Promotoren fra TAKA-amylasen fra A. oryzae blev nu isoleret som et 1,1 kb fragment opnået efter fordøjelse af p719 med Sall og BamHI. Dette fragment blev 15 oprenset ved agarosegelelektroforese, phenol- og CHCl^-ekstraktioner og derpå fældet med ethanol. 1,1 kb promotorfragmentet blev ligeret til 2 kb BamHI/EcoRI-fragmentet fra pRMPAMGTerm i en pUC19 vektor, der var blevet fordøjet med Sall og EcoRI. Ligeringsblandingen blev anvendt til at trans-20 formere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant p777 blev dyrket i stor skala til isolering af rekombinant plasmid, og plasmidpræparationen blev oprenset 25 ved CsCl/ethidiumbromidcentrifugering. Konstruktionen af p777 er illustreret i fig. 11.

Eksempel 8 30 Konstruktion af en Aspergillusekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af Rhizomucor miehei lipase under kontrol af Aspergillus oryzae TAKA-amylase promotoren

Konstruktion og identificering af en lipase cDNA-klon i E.

35 coli 25 DK 170118 B1

For at opnå informationer, der tillader konstruktionen af en specifik oligonucleotidprobe, blev der udført en delvis sekvensbestemmelse på oprenset Rhizomucor miehei lipase (Moskowitz, G.J. et al., J.Agric. Food Chem., 25 5 (1977), 1146-1150). I den følgende tekst anvendes forkortelsen RML for Rhizomucor miehei lipasen. Supernatanten fra en kulturvæske af Rhizomucor miehei, fra hvilken myceliet og stoffer med lav molekylvægt var blevet fjernet, blev underkastet en anionbytningschromatografi. Den største lipolytiske 10 fraktion fra kolonnen blev afsaltet og ultrafiltreret før lyophilisering. Det lyophiliserede pulver blev derpå underkastet affinitetskromatografi. De samlede lipasefraktioner fra kolonnen blev afsaltet og koncentreret ved ultrafiltrering. Dette koncentrat blev derpå underkastet en hydrofobisk 15 interaktionskromatografi (HIC), og lipasen fra HlC-oprensnin-gen blev anvendt til aminosyresekvensbestemmelse. Sekvensbestemmelsen blev udført både på det native enzym (N-terminal sekvens) og på udvalgte fragmentet opnået efter proteolytisk spaltning af lipasen med Armillaria mellea protease. Sekvens-20 bestemmelsen blev udført på en gasfasesekvenator (Applied Biosystems Model 470A) som beskrevet af Thim, L. et al. (FEBS Lett., 212 (1987), 307-312).

RML blev fordøjet med Armillaria mellea protease som beskrevet af Moody, et al. (FEBS Lett. 172 (1984), 142-25 148) med den ene undtagelse, at forhold mellem enzym og substrat var 1:40 (mol:mol). De opnåede fragmenter blev separeret ved HPLC, og UV-absorptionen blev monitoreret ved 280 nm og 214 nm. For at identificere egnede fragmenter til konstruktion af oligonucleotidprober, blev der kun sekvente-30 ret peptider med et højt forhold mellem 280 nm og 214 nm, da disse fragmenter indeholder Trp og/eller Tyr.

Følgende N-terminale sekvens blev fundet ved anvendelse af nativt RML: 35 26 DK 170118 B1 5 10 15

Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Thr-Ser-Gln-glu-Ile-Asn- 20 25

Glu-Leu-Thr-Tyr-Tyr-Thr-X-Leu-(Ser)-(Ala)-.

5

Et af de isolerede fragmenter fra den proteolytiske spaltning havde sekvensen: Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Trp-Asp-X-Ile-His, og dette fragment blev anvendt til syntese af en specifik oligonucleotidprobe.

10 Rhizomucor miehei cDNA biblioteket fra eksempel 3 konstrueret til isoleringen af aspartatprotease-(RMP) rekombinanter fra denne organisme blev også anvendt til identificeringen af lipasespecifikke rekombinanter. En blanding af oligonucleotider blev syntetiseret på en Applied 15 Biosystems Inc. DNA-syntesemaskine. Blandingen med følgende struktur:

A

5' TCCCANGTNGCNCC 3' 430/431

20 G

er komplementær til RML mRNA i en region, der koder for aminosyrerne Gly-Ala-Thr-Trp-Asp. Dette pentapeptid blev identificeret som et segment fra en aminosyresekvens opnået 25 fra proteolytiske fragmenter af oprenset RML protein (se ovenfor).

Rhizomucor miehei cDNA-biblioteket blev screenet 32 med blandingen af P-kineret lipaseoligonucleotider som beskrevet i forbindelse med screeningen af den RMP-specifikke 30 blanding. Hybridisering og den første vask af filtrene blev udført ved 43°C. Efter autoradiografi blev filtrene vasket ved 47°C. Kolonier, der viste en stærk hybridisering, blev isoleret, og det indsatte cDNA i de tilsvarende plasmider blev sekventeret til identificering af RML-specifikke 35 rekombinanter. To sådanne rekombinanter p353.7 og p353.16 havde indsatte fragmenter på ca. 1,2 kb. DNA-sekvensen opnået fra disse to rekombinanter startede i midten af 27 DK 170118 B1 signalpeptidet (se fig. 12) og strækker sig gennem poly-A-enden. I denne region kunne der identificeres én lang åben læseramme. Da de to rekombinanter ikke indeholder sekvensen for 5'-delen af signalpeptidet med dets startmethioninkodon, 5 blev der syntetiseret et syntetisk oligonucleotid (584) 5' CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3' 584.

Dette oligonucleotid 584 er komplementær til RML-mRNA i den region, der koder for en aminosyresekvens Pro-Pro-Leu-Ile-10 Pro-Ser-Arg fundet i propeptidregionen (se fig. 12). Efter at oligo 584 var blevet kineret til høj specifik aktivitet med

^ O

T4 polynucleotidkinase og P-^-ATP, blev den anvendt i en primer-ekstensionsreaktion på Rhizomucor miehei mRNA med AMV revers transcriptase ifølge publicerede procedurer (Boel, E.

15 et al., PNAS, USA, £0, 2866-2869, 1983). Produkterne fra primer-ekstensionsreaktionen blev elektroforeret på en 10% polyacrylamid/urinstofgel, og to cDNA-produkter blev isoleret. Disse to cDNA', den ene 150 nucelotider lang og den anden 160 nucleotider lang, blev begge elektroelueret og 20 sekventeret ved hjælp af den kemiske nedbrydningsprocedure for DNA-sekventering. Begge cDNA-fragmenterne gav læselige sekvenser, der strækker sig fra primer-regionen og op til en position 9 nucleotider 5' for startmethioninkodonen.

Sekvensen bekræftede den sekvens, der blev opnået fra lipase-25 rekombinant cDNA-plasmider. Længden af de to cDNA-produkter fra primer-ekstensionen viser, at 5'-enden (CAP-stedet) af lipase-mRNA er lokaliseret ca. 5 eller 15 nucleotider oven for 5'-enden af det første A nucleotid vist i fig. 12. En mikroheterogenicitet ved 5'-enden i mRNA fra svampe er meget 30 almindelig. Ved kombination af den sekvens, der blev opnået fra de to klonede cDNA-fragmenter p353.7 og p353.16 med sekvensen fra primerekstensionsanalysen, kan aminosyresekven-sen af RML-precursoren fastlægges. DNA-sekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens af RML-precursoren er vist i 35 fig. 12. I fig. 12 angiver de vandrette linier positionen af syntetiske oligonucleotider anvendt til cDNA syntese og til screening af cDNA-bibliotek. En pil viser den position, hvor 28 DK 170118 B1 spaltning sker under modningen af det native RML. Nucleoti-derne er nummereret fra den første base i startMet-kodonen, og aminosyrerne er nummereret fra den første aminosyrerest i det modne native RML. Dette RML kodes af en åben læseramme, 5 der strækker sig fra startMetkodonen og gennem 363 kodoner, før der nås en stopkodon. I denne precursor udgør de første 24 aminosyrerester et typisk hydrofobt signalpeptid. Ifølge von Heijnes regler (Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) vil signalpeptidet spaltes fra det følgende propeptid ved hjælp 10 af signalpeptidasespaltning mellem Ala- og Val-resterne henholdsvis i position -71 og -70.

Da den N-terminale aminosyresekvensanalyse af oprenset RML opnået fra kultursupernatenten fra Rhizomucor miehei identificerede Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg som den N-15 terminale ende af det aktive RML-enzym, består propeptidet af RML-precursoren af de næste 70 aminosyrerester i precursoren. Begyndende med denne N-terminale Ser-rest udstrækker det modne RML sig gennem 269 rester, før det når termineringskodonen. I dette modne 29500 dalton enzym er et 20 lipasesubstratbindingssted lokaliseret omkring aminosyrerest Ser(144), som er bevaret i et antal lipaser. I 3'enden af RML-mRNA blev 104 nucleotider lokaliseret som en ikke-translateret region mellem TAA-stopkodonen og poly(A)-enden.

23 nucleotider oven for 5'-enden af denne poly(A)-ende blev 25 der fundet en repetitiv struktur bestående af 7 AT-basepar, medens der ikke kunne identificeres noget typisk eukaryotisk polyadenyleringssignal.

I en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse blev der udført en række ændringer på RML cDNA.

30 Disse ændriner involverer fjernelse af G:C-haler sat til cDNA under kloningen og indførelse af restriktionsendonuclease-spaltningssteder ved 5'-enden og 3'-enden af den åbne læseramme. Et antal passende restriktionsspaltninssteder blev også indført i signalpeptid- og i propeptidregionerne i cDNA.

29 DK 170118 B1 p353.16 blev fordøjet med FnuDII, og et 880 bp DNA-fragment (fra 3'-enden af RML-cDNA) blev isoleret ved agarosegelelektroforese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl3-ekstraheret og fældet med ethanol.

5 Denne 3'-ende af RML cDNA blev derpå ligeret til en pUC19 vektor, der var blevet spaltet med Smal og behandlet med alkalisk phosphatase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identi-10 ficeret ved restriktionsenzymspaltning af miniprepplasmider.

En sådan passende rekombinant p435.2 blev fordøjet med Banll og Hindlll, og et 0,69 kb fragment blev isoleret ved agarosegelelektroforese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl3-ekstraheret og fældet med ethanol. Dette fragment af 15 RML cDNA indeholdt nu en væsentlig del af det multiple pUC19 kloningssted knyttet til dets 3'-ikketranslaterede region.

5'-enden af RML-cDNA blev gendannet ved anvendelse af syntetiske oligonucleotider for at indføre passende restriktionsspaltningssteder. DNA-sekvensen af det syntetiske 20 fragment (RML 5') er vist i fig. 14. Positionen af introducerede restriktionsspaltningssteder og de forenede fragmenter af de individuelt syntetiserede oligonucleotider er angivet ved hjælp af vandrette henholdsvis lodrette/vandrette linier. Det fremkomne fragment -(RML 5') blev oprenset som et 150 bp 25 fragment på en 2% agarosegel, elektroelueret, phenol- og CHCl3-ekstraheret og fældet med ethanol før yderligere ligeringsreaktioner.

p353.7 blev fordøjet med BanI og Banll, og et 387 bp RML-fragment blev oprenset ved hjælp af 10% 30 polyacrylamid-gelelektroforese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl3-ekstraheret før ethanolfældning og derpå ligeret til det syntetiske RML 5*-fragment og 0,69 kb Banll/Hindlll-fragmentet fra p435.2 i en BamHI/HindIII-fordøjet pUC13 vektor. Ligeringsblandingen blev 35 anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger 30 DK 170118 B1 på miniprepplasmider. I en sådan korrekt rekombinant pB544, blev den syntetiske del sekventeret til bekræftelse af den forventede struktur. Konstruktionen af pB544 er illustreret i fig. 13a. Fra pB544 blev præpro-RML-cDNA isoleret som et 1,2 5 kb BamHI-fragment ved agarosegelelektroforese. Der blev fremstillet en ekspressionsvektor baseret på promotoren fra Aspergillus oryzae TAKA-amylasegenet og terminatoren fra Aspergillus niger glucoamylasegenet som følger: p719 (se eksempel 7) blev fordøjet med Sall og BamHI. Det fremkomne 10 1,1 kb TAKA amylase promotorfragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese. pICAMG/Term (se eksempel 4) blev fordøjet med BamHI og EcoRI. Det fremkomne 0,75 kb glucoamylaseterminatorfragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese. Efter phenol- og CHCl^-ekstraktioner 15 blev disse to fragmenter fældet med ethanol og ligeret til en Sall/EcoRI-fordøjet pUC19 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltning af miniprepplasmider.

20 En sådan korrekt rekombinant p775 blev fordøjet med BamHI og behandlet med alkalisk phosphatase. 1,2 kb BamHI RML-præpro-cDNA-fragmentet fra pB544 blev ligeret til denne p775 vektor og transformeret i E. coli. En rekombinant p787 med RML-præpro-cDNA indsat i korrekt orientering mellem promotoren og 25 terminatoren blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepplasmider ekstraheret fra E. coli transformanter. p787 plasmid DNA blev dyrket i stor skala, og plasmidpræparationen blev oprenset ved CsCl/ethidiumbromid-centrifugering. Konstruktionen af p787 er illustreret i fig.

30 13b.

Eksempel 9

Transformering af Aspergillus oryzae (generel, procedure) 35 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast

Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, 1981) blev podet med sporer af A. oryzae, IFO 4177 eller argB mutanter heraf, 31 DK 170118 B1 og inkuberedes under omrystning ved 37°C i to ca. dage.

Myceliet blev høstet ved filtrering gennem miraklæde og vasket med 200 ml 0,6 M MgSO^. Myceliet blev suspenderet i 15 ml 1,2 M MgSO^, 10 mM NaHjPO^, pH = 5,8. Suspensionen blev 5 afkølet på is, og der blev tilsat 1 ml puffer indeholdende 120 mg Novozym® 234, batch 1687. Efter 5 minutters forløb blev der tilsat 1 ml af 12 mg/ml BSA (Sigma type H25), og inkuberingen blev fortsat under mild omrøring i 1,5 - 2,5 timer ved 37°C, indtil et stort antal protoplaster var 10 synlige i en prøve undersøgt under mikroskop.

Suspensionen blev filtreret gennem miraklæde, filtratet blev overført til sterile rør og belagt med 5 ml 0,6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0. Der blev centrifugeret i 15 minutter ved 1000 g, og protoplaster blev samlet 15 fra toppen af MgS04-puden. Der blev tilsat 2 rumfang STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM CaCl2) til proto-plastsuspensionen, og blandingen blev centrifugeret i 5 minutter ved 1000 g. Protoplastpillen blev resuspenderet i 3 ml STC og repelleteret. Dette blev gentaget. Til slut blev 20 protoplasterne resuspenderet i 0,2 - 1 ml STC.

100 μΐ af protoplastsuspensionen blev blandet med 5-25 pg af det pågældende DNA i 10 μΐ STC. Protoplasterne fra argB-stammerne blev blandet med pSal43 DNA (et plasmid .bærende et A. nidulans argB-gen), og protoplaster fra argB+ 25 stammerne blev blandet med p3SR2 (ét plasmid bærende et A. nidulans amdS-gen). Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, og der blev tilsat 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, og der blev blandet omhyggeligt (to gange), hvorpå der til slut blev 30 tilsat 0,85 ml af den samme opløsning og blandet omhyggeligt. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, centrifugeret i 15 minutter ved 2500 g, og pillen blev resuspenderet i 2 ml 1,2 M sorbitol. Efter en yderligere sedimentering blev protoplasterne spredt ud på passende 35 plader. Protoplaster fra argB-stammerne transformeret med pSal43 blev spredt ud på minimalplader (Cove, Biochem,Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) med glucose og 32 DK 170118 B1 urinstof som henholdsvis carbon- og nitrogenkilde og indholdende 1,2 M sorbitol til osmotisk stabilisering. Protoplaster fra argB -stammerne transformeret med p3SR2 blev udspredt på minimalplader (Cove, Biochem.Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) 5 indeholdende 1,0 M sucrose, pH = 7,0, 10 mM acetamid som nitrogenkilde og 20 mM CsCl til inhibering af baggrundsvæksten. Efter inkubering i 4-7 dage ved 37°C blev sporerne taget op, suspenderet i sterilt vand og spredt ud til enkeltkolonier. Denne procedure blev gentaget, og sporerne fra en 10 enkelt koloni efter den anden reisolering blev opbevaret som en specifik transformant.

Eksempel 10 15 Ekspression af TAKA-amylase i en vildtype A. oryzae stamme pTAKA 17 blev transformeret i A. oryzae IFO 4177 ved kotransformering med p3SR2 indeholdende amdS-genet fra A. nidulans som beskrevet eksempel 9. Protoplaster fremstillet som beskrevet blev inkuberet med en blanding af lige store 20 mængder pTAKA 17 og p3SR2, idet der anvendtes ca. 5 μg af hver. 9 transformanter, som kunne anvende acetamid som eneste nitrogenkilde, blev reisoleret to gange. Efter vækst på YPD (Sherman et al., 1981) i tre dage blev kultursupernatanterne analyseret ved SDS-PAGE. Gelerne blev farvet med coomassie 25 brilliant blue R. De bedste transformariter producerede 10 -20 gange mere amylase end ikke-transformeret IFO 4177. En transformant blev udvalgt til yderligere studier og dyrket i en 2 liter Kieler-fermenteringsbeholder på 4% sojabønnemel, idet der tilførtes glucose under væksten. Kulturen blev 30 omrørt kraftigt under gæringen. Under disse betingelser gav IFO 4177 ca. 1 g/1, og transformanten ca. 12 g/1 amylase bestemt ved hjælp af enzymaktivitet. Enzymaktiviteten blev målt som evnen til at nedbryde stivelse (Cereal Chemistry lj> (1939), 712-723). Den anvendte stivelse var Merck Amylum 35 solubile erg B.6, og prøven blev udført ved pH 4,7 og ved 37°C. Der blev ikke tilsat 8-amylase.

33 DK 170118 B1

Eksempel 11

Ekspression af RMP i A. oryzae p777 fra eksempel 7 eller p778 fra eksempel 6 blev transformeret i IFO-4177 ved kotransformeringen med p3SR2 på 5 den i eksempel 9 beskrevne måde. Transformanter blev selekteret og reisoleret som beskrevet i eksempel 9.

Transformanter blev dyrket i tre dage i YPD, og supernatanterne blev analyseret ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af Western'blotting og ELISA. Supernatanterne fra 10 transformanter af både p777 og p778 indeholdt fra 50 - 150 mg/1 protein# der reagerer med RMP-antistof. Proteinasen var overglycosyleret i sammenligning med R. miehei-produceret proteinase. Der blev set to former, af hvilke den ene blev antaget at være proformen og den anden at være fraspaltet 15 moden proteinase. To transformanter af p778 og tre transformanter af p777 blev dyrket i en fermenteringsbeholder som beskrevet ovenfor for TAKA-amylasetransformanterne. De to transformanter af p778 gav ca. 0,2 g/1 og 0,4 g/1, og de tre transformanter af p777 gav ca. 0,5 g/1, 2,4 g/1 og 3,3 g/1 af 20 RMP bestemt som mælkekoaguleringsaktivitet ved hjælp af

Kunitz-metoden (Kunitz M., Jour .Gen.Physiol. 1_8 (1935), 459-466), idet det antoges, at den specifikke aktivitet af rekom-binant RMP er den samme som aktiviteten af Rhizomucor miehei enzymet. (Dette er senere blevet bekræftet). SDS-PAGE og 25 SDS-PAGE efterfulgt af Western-blotting og ELISA viste, at der kun fandtes en form for RMP, når der blev dyrket i stor skala. Denne RMP var også overglycosyleret under disse vækstbetingelser. Proteinmængden set på geler svarer godt til mængden bestemt ud fra enzymaktivitet.

30 RMP blev oprenset fra kulturvæskesupernatanten ved affinitetskromatografi og størrelseseksklusionskromatografi.

Den N-terminale sekvens af det oprensede rekombi-nante RMP blev bestemt ved anvendelse af en gasfasesekvenator som beskrevet af Thim et al. (FEBS Lett, 1987 under 35 trykning).

34 DK 170118 B1

Der blev fundet to former for rekombinant RMP, hvilket viser, at spaltningen ved den N-terminale ende er heterogen. Den ene form har følgende N-terminale sekvens: Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-, og den anden form 5 har følgende N-terminale sekvens: Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-. En sådan heterogen spaltning ved den N-terminale ende er også beskrevet for nativt RMP fra Mucor miehei (Paquet, D. et al., Neth.Milk.Dairy J., (1981), 358-360). Da den heterogene spaltning af det rekombinante RMP 10 svarer godt overens med spaltningen af nativt RMP, er det i følge den foreliggende opfindelse blevet demonstreret, at A. oryzae er i stand til at spalte rekombinant RMP i den korrekte region.

15

Eksempel 12

Konstruktion af et ekspressionsplasmid til produktion af prochymosin i A. oryzae

Konstruktionen indeholder prochymosingenet umiddel-20 bart forudgået af signalpeptidsekvensen fra A. oryzae TAKA-amylasegenet under kontrol af A. oryzae TAKA-amylasepromoto-ren. Konstruktionen indeholder yderligere terminatoren fra A. niger glucoamylasegenet plus en E. coli replicon.

Et ca. 430 bp BamHI/Xmal-fragment fra p285' proC 25 (se eksempel 1) og en syntetisk oligomer med følgende sekvens

AATTCCAGCTGCCGCGGCCGAGATCACCAG

GGTCGACGGCGCCGGCTCTAGTGGTCCTAG

30 blev indsat i EcoRI-Xmal-skåret pUC19 plasmid til dannelse af plasmid pToC50a.

pToCSOa blev skåret med EcoRI-SacII, og det store fragment indeholdende pUC19 og 5'-enden af prochymosingenet (prochymosin') blev isoleret. Dette fragment blev ligeret til 35 et 0,6 kb EcoRI-Banl-fragment fra pTAKA 17 og den følgende syntetiske oligomer 35 DK 170118 B1

GCACCTGCTTTGGC

GACGAAAC (KFN 280/281) 5 Efter transformering blev der isoleret et plasmid pToC51 indeholdende 5'-delen af prochymosingenet (prochymosin') forbundet med signalsekvensen fra A. oryzae TAKA-amylasegenet (preTAKA) og forudgået af ca. 500 bp upstream TAKA-amylasesekvenser. Konstruktionen af pToC51 er 10 illustreret i fig. 15a.

pR26 blev spaltet med HinfI, behandlet med det store fragment (Klenow) af DNA polymerase I og de fire dNTP'er og skåret med Xmal. Et 750 bp fragment indeholdende 3'-enden af prochymosingenet blev isoleret. Med det formål at 15 indsætte et Hindlll-spaltningssted ved 3'-enden af dette fragment blev pUC9 spaltet med Xmal/HincII, og det store fragment blev ligeret til 750 bp fragmentet indeholdende 3'-enden af prochymosingenet.

Et 5,6 kb EcoRI-Clal-fragment fra pTAKA 17 blev 20 isoleret og ligeret til et 2,6 kb ClaI-HindIII-fragment fra det samme plasmid plus et 0,7 kb EcoRI-Hindlll-fragment fra pICAMG/Term (se eksempel 4) indeholdende A. niger glucoamyla-segenterminatoren og polyA-stedet. Det fremkomne plasmid er vist i fig. 15b som pT-oC52.

25 pToC52 blev skåret med Hindlil og delvis med EcoRI, og der blev isoleret et 6,4 kb fragment. Dette blev ligeret til et 0,9 kb EcoRI-Xmal-fragment fra pToC51 og et 0,7 kb Xmal-HindlIl-fragment fra pUC9'PC indeholdende 3'-delen af prochymosingenet ('prochymosin). Det fremkomne plasmid er 30 benævnt pToC56 og er vist i fig. 15b.

36 DK 170118 B1

Eksempel 13

Ekspression af prochymosin i A. oryzae pToC56 blev transformeret i A. oryzae IFO 4177 eller en argB-mutant deraf ved kotransformation med enten 5 p3SR2 (amdS-gen) eller pSal43 (argB-gen). Transformanter, der voksede på selektive medier, blev reisoleret to gange som beskrevet i eksempel 9.

Transformanterne blev dyrket i tre dage på YPD, og prochymosinindholdet i supernatanterne blev analyseret ved 10 hjælp af ELISA på en Western blot efter SDS-PAGE. Transformanterne producerede 1-10 mg/1 af et immunoreaktivt protein af prochymosinstørrelse i supernatanterne. Der kunne ikke påvises andre immunoreaktive proteiner i supernatanterne.

15

Eksempel 14

Ekspression i RML i A. oryzae p787 fra eksempel 8 blev transformeret i IFO-4177 ved kotransformation med p3SR2 på den i eksempel 9 beskrevne 20 måde. Transformanterne blev selekteret og reisoleret som beskrevet i eksempel 9.

Supernatanter fra YPD-kulturer af transformanterne dyrket i tre dage blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting og ELISA. Den bedste transformant producere-25 de 2 mg/1 af et protein af samme størrelse som moden RML.

Lipaseaktiviteterne i supernatanterne blev målt som evnen til at spalte tributyrin (NOVO metode AF 95.1/3-GB).

Målingen bekræftede, at der var 2 mg/1 aktiv lipase til stede i supernatanterne.

Claims (8)

1. 5 PATENTKRAV
2. 1. Promotor egnet til udtrykkelse af et proteinpro-10 dukt i Aspergillus, kendetegnet ved, at den er Aspergillus orvzae TAKA-amylase promotoren eller en funktionel del deraf, eventuelt forudgået af til promotoren naturligt sammenhørende upstream aktiveringssekvenser.
3. 2. Promotor- og upstreamsaktiveringssekvenser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende sekvens AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC
4. 20 CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA
5. 25 CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TAGCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG
6. 30 GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC
7. 35 GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC r DK 170118 B1 TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT eller en funktionel 5 del deraf, der kan forudgås af den 1,05 kb ikke-sekventerede upstreamregion fra position 0 til 1,05 i plasmid pTAKA 17 (DSM 4012), eller
8. 10 GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT 15 TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT 20 AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT 25 CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GGAGCÅAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT 30 CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG eller en funktionel del deraf. * 35