DK170741B1 - Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel - Google Patents
Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel Download PDFInfo
- Publication number
- DK170741B1 DK170741B1 DK209188A DK209188A DK170741B1 DK 170741 B1 DK170741 B1 DK 170741B1 DK 209188 A DK209188 A DK 209188A DK 209188 A DK209188 A DK 209188A DK 170741 B1 DK170741 B1 DK 170741B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- asp
- thr
- protein
- drug
- protein according
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 40
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 2
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N Thr-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- -1 isopropyl - Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
DK 170741 B1
Den foreliggende opfindelse angår bifunktionelle proteiner, en fremgangsmåde til deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelsen deraf til fremstilling af et lægemiddel.
5 Interleukin-2, i det følgende benævnt som IL-2, virker som T-cellevækstfaktor. IL-2 forstærker aktiviteten af "dræ-ber"-celler, såsom NK (Natural Killer)-celler, cytotoksiske T-celler og LAK ("Lymphokine Activated Killer")-celler.
Granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor, i 10 det følgende benævnt som GM-CSF, stimulerer derimod granu-locyt- og makrofagdannelsen ud fra hæmatopoietiske forløberceller. Kombinationen af de to biologiske aktiviter er interessant for tumorbehandling med og uden indgift af cytos-tatika. IL-2 og GM-CSF har imidlertid forskellig stabilitet, 15 hvilket kan føre til problemer med den direkte indgift af de to komponenter og følgelig til et mindre godt terapeutisk resultat.
Problemet med den forskellige stabilitet kan ifølge opfindelsen løses ved, at man forbinder disse to proteiner 20 til dannelsen af et bifunktionelt protein.
Man har allerede foreslået fusionsproteiner med de almene formler
Met-X-Y-Z eller Met-Z-Y-X
25 (la) (Ib) til genteknisk fremstilling af eventuelt modificeret GM-CSF, idet X i det væsentlige er aminosyrerækkefølgen af de første ca. 100 aminosyrer af fortrinsvis menneskeligt IL-2, Y er 30 en direkte binding, såfremt den til det ønskede protein nabostillede aminosyre eller aminosyrerækkefølge muliggør en fraspaltning af det ønskede protein. Ellers muliggør et broelement af en eller flere aminosyrer, der kan kodes genetisk, fraspaltningen, og Z er en sekvens af aminosyrer, som 35 kan kodes genetisk, hvilken sekvens udgør det ønskede CM--CSF-protein. Det er ligeledes blevet foreslået at anvende 2 DK 170741 B1 den for IL-2 kodende DNA-sekvens - mere eller mindre - til ende og således danne - eventuelt modificeret - biologisk aktivt IL-2 som M biprodukt ·', men forslaget er ikke gennemført i praksis (ikke offentliggjort europæisk patentansøgning 5 med offentliggørelsesnummeret EP-A-228.018 og sydafrikansk patentskrift nr. 86/9557).
Den foreliggende opfindelse angår bifunktionelle proteiner, bestående af en biologisk aktiv interleukin-2 (IL-2) - og en granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor 10 (GM-CSF)-del.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af de bifunktionelle proteiner ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man konstruerer et gen, der koder for disse proteiner, og eksprimerer det i 15 en værtscelle.
Opfindelsen angår endvidere et lægemiddel bestående af et protein ifølge opfindelsen, eventuelt i kombination med en farmakologisk egnet bærer.
Opfindelsen angår endelig også anvendelsen af et 20 protein ifølge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til behandling af maligne nydannelser.
Det ifølge opfindelsen anvendte fusionsprotein består altså af to biologisk aktive komponenter, nemlig på den ene side af en IL-2-del, som kan være modificeret på i og 25 for sig kendt måde, og på den anden side en GM-CSF-del, som eventuelt kan være modificeret, og eventuelt et broelement, svarende til definitionen af Y i de ovenfor angivne formler. Fortrinsvis er de komponenter arrangeret som i formlen la. Det her omhandlede princip kan ligelede tjene til fremstil-30 ling af hidtil ukendte bifunktionelle proteiner.
På tegningen i figuren er vist konstruktionen af plasmidet pB30, som koder for et bifunktionelt protein ifølge opfindelsen.
Modifikationer af IL-2-molekylet er kendt, idet der 35 her som eksempler kun skal henvises til europapatentansøgning nr. EP-A-091.593, -109.748, -118.617, -136.489 og -163.249.
DK 170741 B1 3
Endvidere er der i den ikke offentliggjorte europapatent-ansøgning EP-A219.839 foreslået et IL-2-derivat, i hvilken N-terminal de første syv aminosyrer er fjernet.
Modifikationer af GM-CSF-molekylet er foreslået i 5 europapatentansøgning nr. EP-A-228.018.
Yderligere ændringer af de to aktive molekyldele kan foretages på i og for sig kendt måde, idet man her som eksempel kun skal nævne den specifikke mutagenese.
Broelementet Y har fordelagtigt formlen 10 -ASp-(AS)x-Pro- (II) hvori x er et helt tal op til ca. 20, og As er en vilkårlig aminosyre, der kan kodes, med undtagelse af cystein.
Fordelagtigt er IL-2-delen anbragt i den venstre 15 ende, og følgelig er GM-CSF-delen anbragt i den højre ende i formlen II.
Især foretruknes udførelsesformer af Y viser amino-syrerækken -Asp-Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Pro- eller 20 -Asp-Pr o-Met-1 le-Thr-Thr-Tyr-Leu-G lu-Glu-Leu-Thr- -Ile-Asp-Asp-Pro- hvori tillige fortrinsvis IL-2-delen er anbragt i venstre ende og GM-CSF-delen er anbragt i højre ende.
Ekspressionen af de bifunktionelle proteiner ifølge 25 opfindelsen kan ske på i og for sig kendt måde. I bakterielle ekspressionssystemer kan den direkte ekspressions-vej lykkes. Hertil egner sig alle kendte værts-vektor sy stemer med værter, såsom bakterier af arterne Streptomyces, B-subtilis, Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, især E.
30 coli.
Den DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein, indbygges på kendt måde i en vektor, som i det udvalgte ekspresionssystem sikrer en god ekspression.
Herved vælger man hensigtsmæssigt promotoren og ope-35 ratoren fra gruppen trp, lac, tac, PL og PR fra fagen λ, hsp, omp eller en syntetisk promotor, såsom de eksempelvis 4 DK 170741 B1 er beskrevet i tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 eller i europapatentansøgning nr. EP-A-173.149. Fordelagtig er tac-promotor-operator-sekvensen, som i mellemtiden er tilgængelig i handelen (eksempelvis ekspressionsvektor 5 pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and
Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).
Ved ekspressionen af det her omhandlede protein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter af de første aminosyrer efter ATG-start-kodon for 10 at hindre en eventuelt basepardannelse på mRNA-planet. Sådanne ændringer som fjernelser eller additioner af enkelte aminosyrer er velkendte for fagfolk og ligeledes omfattet af opfindelsen.
Til ekspressionen i gær - fortrinsvis S. cerevisiae-15 anvender man hensigtsmæssigt et sekretionssystem, eksempelvis den heterologe ekspression via α-faktor-systemet, som er beskrevet flere gange.
Til ekspressionen af det bifunktionelle molekyle i gær er det fordelagtigt, når dibasiske peptidsekvenser samt 20 glycosyleringssteder i det bifunktionelle protein ødelægges ved tilsvarende ombytning af enkelte aminosyrer. Herved fås mange kombinationsmuligheder, som ligeledes kan påvirke den biologiske virkning.
Ekspressionen af IL-2 i gær er kendt fra europapa-25 tentansøgning nr. EP-A-142.268, af GM-CSF fra europapatent-ansøgning nr. EP-A-188-350.
Indgiften af de her omhandlede bifunktionelle proteiner svarer til indgiften af de to komponenter. På grund af den større stabilitet er det dog i mange tilfælde muligt 3 0 med en mindre dosering, som holder sig i det nedre område af de hidtil foreslåede doseringer.
I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere. Procentangivelser og forhold er beregnet på vægten, såfrem intet andet er angivet.
35 DK 170741 B1 5
Eksempel 1
Plasmidet pl59/6 (europapatentansøgning nr. EP-A-163.249, fig. 5, (1) på tegningen, i den foreliggende figur) indeholder mellem et EcoRI- og et Sall-spaltested et syn-5 tetisk, for 11-2 kodende gen. DNA-sekvensen for dette gen er gengivet i det nævnte EP-A2 som "DNA-sekvens I". I triplet 127- og 128-området befinder der sig et Taql-spaltested. Fra dette plasmid udskæres ved spaltning med EcoRI og Taql IL-2-delsekvensen (2), og den isoleres.
10 Plasmidet pHG23 (3) , som koden for GM-CSF, er kendt fra europatentansøgning nr. EP-A2-183.350. GM-CSF-cDNA er gengivet i fig. 2 i denne EP-A2. Plasmidet pHG23 fås ved, at man indbygger cDNA-sekvensen i PstI-spaltestedet i pBR322, idet der på den ene side bliver gjort brug af Pstl-spalte-15 stedet ved 5'-enden og på den anden side af et ved hjælp af GC-"tailing" indført Pstl-sted ved 3'-enden. Fra dette plasmid isoleres ved spaltning med SfaNI og PstI DNA-sekvensen (4), som indeholder den største del af GM-CSF-genet.
Ved phosphitroetoden syntetiseres det følgende oligo-20 nukleotid (5): 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile
CG AT C ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATG
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG
25 (Taql) (5) 1 2
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
ACC ACC TAT GCG GAC GAT CCG GC
TGG TGG ATA CGC CTG CTA GGC CGT GGG
30 (SfaNI)
Oligonukleotidet (5) fuldstændiggør ved 5'-enden DNA-sekvensen af IL-2, idet der dog i 133-stillingen i stedet for Thr står Asp. Ved 3'-enden af dette oligonukleotid be-35 finder de nukleotider sig, som ved spaltning med SfaNI er faldet bort fra cDNA.
6 DK 170741 B1
Fremstilling af ekspressionsplasmidet pEWlOOO (6) er foreslået i den (ikke offentliggjorte) europapatentansøgning nr. EP-A-227.938 (fig. l). Dette plasmid er et derivat af plasmidet ptac 11 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167-178), i 5 hvilket der i genkendelsesstedet fra EcoRI er indbygget en syntetiske sekvens, som indeholder et Sall-spaltested. Man får således ekspressionsplasmidet pKK 177.3. Ved indsættelse af lac-repressoren (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765-769) får man plasmidet pJF118. Dette åbnes ved det singulære 10 restriktionsspaltested for Aval, og på kendt måde forkortes det ved exonuklease-behandling med ca. 1000 bp og ligeres. Man får plasmidet pEWlOO (6). Ved åbning af dette plasmid i polylinkeren med enzymerne EcoRI og PstI får man det linea-riserede ekspressionspladmid (7).
15 Dette lineariserede plasmid-SNA (7) ligeres derpå med DNA-fragmentet (2), som koder for IL-2-sekvensen, med det syntetiske oligonukleotid (5) og med cDNA-fragmentet (4). Der dannes plasmidet pB30 (8), som transformeres i E. coli-stammen Mcl061. Plasmid-DNA fra enkelte kloner isoleres 20 og karakteriseres ved hjælp af restriktionsanalyse.
Eksempel 2
Anvender man i eksempel 2 i stedet for oligonukleo-tidet (5) det følgende syntetiske oligonukleotid 25 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr
CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC ACC ACC TAT
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG TGG TGG ATA
30 (Taql) 1 2
Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
CTA GAA GAG CTC ACG ATC GAC GAT CCG GC
GAT CTT CTC GAG TGC TAG CTG CTA GGC GCT GGG 35 (SfaNI), DK 170741 B1 7 får man således plasmidet pB31.
Kfcggmpel 3
Kompetente celler fra E. coli-stammen W3110 trans-5 formeres med plasmidet pB30 eller pB31. En kultur af stammen, der har stået natten over, fortyndes med LB-medium (J.H. Miller, Experiments in Molec. Gen., Cold Spring Harbor Lab. , 1972), som indeholder 50 μg ampicillin pr. ml, i et forhold på ca. 1:100, og væksten følges via OD-måling. Ved OD = 0,5 10 indstilles kulturen til en koncentration på 2mM isopropyl--/3-D-thiogalactopyranosid (IPTG) , og bakterierne centrifugeres fra efter 150-180 minutters forløb. Bakterierne behandles i ca. 5 minutter i en pufferblanding (7M urinstof, 0,1% SDS, 0,1M natriumphosphat, pH-værdi =7,0), og prøver 15 påføres på en SDS-gelelektroforeseplade. Ekspressionen af det bifunktionelle protein bekræftes således.
De angivne betingelser gælder for rystekulturer. Ved større fermentationer er tilsvarende ændrede OD-værdier, næringssubstrater og varierede IPTG-koncentrationer hen-20 sigtsmæssige.
Eksempel 4
Efter induktion centrifugeres E. coli W3ll0-celler, som indeholder plasmidet pB30 eller pB31, fra, suspenderes 25 igen i natriumphosphatpuffer (pH-værdi = 7) og centrifugeres atter fra. Bakterierne tages op i den samme puffer og åbnes derpå (French Press, ^Dyno-Mvihle) . Celleåbningsmaterialet centrifugeres fra. Den ovenstående væske og det sedimenterede materiale analyseres ved hjælp af SDS-polyacrylamidelektro-30 forese som beskrevet i eksempel 3. Efter farvning af proteinbåndene viser det sig, at man finder det bifunktionelle protein i sedimentet fra det åbnede materiale. Sedimentet vaskes flere gange med chaotrope puffer-opløsninger og til sidst med vand, hvorved det ønskede protein koncentreres 35 yderligere. I den vandige proteinsuspension bestemmes proteinkoncentrationen derpå. Suspensionen indstilles derefter 8 DK 170741 B1 til en koncentration på 5M guanidiniumhydrochlorid og 2 mM dithiothreitol (DTT). Blandingen omrøres i ca. 30 minutter under nitrogen og fortyndes derpå med 50 nM tris-puffer (pH-værdi = 8,5) således, at man får en proteinkoncentration 5 på 100 jug/ml. Derefter dialyseres der mod denne tris-puffer og efter to ganges pufferudskiftning mod vand. Det således behandlede protein filtreres sterilt og efterprøves med hensyn til sin biologiske aktivitet. Det viser både i den interleukin-2-afhængige CTLL 2-celleproliferationstest og i 10 den humane knoglemarvstest fuld biologisk virkning. Man iagttager derved blandede kolonier af granulocyter og makrofager .
Det bifunktionelle protein kan yderligere renses via interleukin-2-specifik affinitetschromatografi. Proteinet 15 er også derefter aktivt ved begge prøver. Et E. coli-ekstrakt af den utransformerede stamme W3110, der behandles som beskrevet, viser derimod ikke nogen aktivitet.
Til den tekniske fremstilling af produktet er andre betingelser hensigtsmæssige, eksempelvis til foldning af 20 proteinet og rensningen deraf. Som - i og for sig kendte-fremgangsmåder til rensning kommer ionbytning, adsorption, gelfiltrering og præparativ HPLC-chromatografi i betragtning.
25
Claims (9)
1. Bifunktionelle proteiner, bestående af en biologisk aktiv interleukin-2 (IL-2)- og en granulocyt-makrofag-"Colony
5 Stimulating"-faktor (GM-CSF)-del.
2. Bifunktionelle proteiner med en biologisk aktiv IL-2- og GM-CSF-del, kendetegnet ved, at de to biologisk aktive proteindele er forbundet via en bro af fra 10 ca. 1 til ca. 20 aminosyrer, der kan kodes genetisk.
3. Protein ifølge krav 2, kendetegnet ved, at broen har formlen
15 -Asp-(As)x-Pro- (II) idet x er et helt tal fra 1 til 18, og As er en aminosyre, der kan kodes genetisk, med undtagelse af Cys.
4. Protein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at broelementet (As)x er aminosyrefølgen -Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp- eller
25 -Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu-Thr-Ile-Asp-Asp- . 1 2 Protein ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at IL-2-delen er anbragt N-terminalt og GM-CSF-delen er anbragt C-terminalt. 30 2 Fremgangsmåde til fremstilling af bifunktionelle proteiner ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man konstruerer et gen, der koder for disse proteiner, og eksprimerer det i en værtscelle. 35 DK 170741 B1
7. Lægemiddel, bestående af et protein ifølge krav 1-5, eventuelt i kombination med en farmakologisk egnet bærer.
8. Anvendelse af et protein ifølge krav 1-5 til frem stilling af et lægemiddel til behandling af maligne nydannelser .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3712985 | 1987-04-16 | ||
| DE19873712985 DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Bifunktionelle proteine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK209188D0 DK209188D0 (da) | 1988-04-15 |
| DK209188A DK209188A (da) | 1988-10-17 |
| DK170741B1 true DK170741B1 (da) | 1996-01-08 |
Family
ID=6325799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK209188A DK170741B1 (da) | 1987-04-16 | 1988-04-15 | Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0288809B1 (da) |
| JP (1) | JP2667193B2 (da) |
| KR (1) | KR970000187B1 (da) |
| AR (1) | AR242991A1 (da) |
| AT (1) | ATE79135T1 (da) |
| AU (1) | AU613022B2 (da) |
| CA (1) | CA1322157C (da) |
| DE (2) | DE3712985A1 (da) |
| DK (1) | DK170741B1 (da) |
| ES (1) | ES2033981T3 (da) |
| FI (1) | FI98830C (da) |
| GR (1) | GR3006141T3 (da) |
| HU (1) | HU204303B (da) |
| IE (1) | IE61574B1 (da) |
| IL (1) | IL86086A (da) |
| NO (1) | NO176922C (da) |
| NZ (1) | NZ224247A (da) |
| PH (1) | PH25327A (da) |
| PT (1) | PT87237B (da) |
| ZA (1) | ZA882659B (da) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5662896A (en) * | 1988-03-21 | 1997-09-02 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| US5108910A (en) * | 1989-08-22 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| JP3115318B2 (ja) * | 1989-08-22 | 2000-12-04 | イミュネックス・コーポレーション | Ｇｍ―ｃｓｆ及びｉｌ―３を含む融合タンパク質 |
| US5376367A (en) * | 1991-11-22 | 1994-12-27 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising MGF and IL-3 |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| PT1037927E (pt) | 1997-12-08 | 2004-10-29 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Proteinas de fusao heterodimericas uteis para imunoterapia de abordagem selectiva e estimulacao imunologica geral |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| BR0013231A (pt) | 1999-08-09 | 2002-07-23 | Lexigen Pharm Corp | Complexos citocina-anticorpo múltiplos |
| EP1228214A2 (en) | 1999-11-12 | 2002-08-07 | MERCK PATENT GmbH | Erythropoietin forms with improved properties |
| WO2001040311A1 (fr) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Proteine fusionnee de chimiokine slc-il2 |
| JP5179689B2 (ja) | 2000-02-11 | 2013-04-10 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強 |
| JP5390055B2 (ja) | 2000-06-29 | 2014-01-15 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 免疫サイトカインの取り込み増強剤との併用治療による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介免疫応答の増強 |
| HUP0303428A2 (hu) | 2001-03-07 | 2004-01-28 | Merck Patent Gmbh. | Expressziós eljárás hibrid izotípusú antitestcsoportot tartalmazó fehérjékhez |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| KR100900166B1 (ko) | 2001-05-03 | 2009-06-02 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 재조합 종양 특이적 항체 및 이들의 용도 |
| EP2042196B1 (en) | 2001-10-10 | 2016-07-13 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) |
| ATE542137T1 (de) | 2001-12-04 | 2012-02-15 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokine mit modulierter selektivität |
| CN100432105C (zh) | 2002-12-17 | 2008-11-12 | 默克专利有限公司 | 与gd2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体(h14.18)以及其与il-2的融合 |
| DE602004031681D1 (de) | 2003-07-21 | 2011-04-14 | Transgene Sa | Multifunktionelle Cytokine |
| DE602004031341D1 (de) | 2003-07-21 | 2011-03-24 | Transgene Sa | Multifunktionelle cytokine |
| WO2010001414A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Lupin Limited | Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| WO1985004673A1 (fr) * | 1984-04-10 | 1985-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouvel adn et son utilisation |
| DE3419995A1 (de) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| JPS61128889A (ja) * | 1984-11-27 | 1986-06-16 | Green Cross Corp:The | 組換えｄｎａ及び該ｄｎａによる形質転換体 |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| EP0238655A4 (en) * | 1985-10-03 | 1989-09-11 | Biogen Nv | POLYPEPTIDES LIKE THE GRANULOCYTE-MACROPHOUS COLONY STIMULATION FACTORS (GM-CSF) AND THEIR METHODS OF PRODUCING LARGE QUANTITIES IN MICROBIAL CELLS. |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
-
1987
- 1987-04-16 DE DE19873712985 patent/DE3712985A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-09 EP EP88105693A patent/EP0288809B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-09 ES ES198888105693T patent/ES2033981T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-09 DE DE8888105693T patent/DE3873397D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-09 AT AT88105693T patent/ATE79135T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 NZ NZ224247A patent/NZ224247A/en unknown
- 1988-04-14 FI FI881743A patent/FI98830C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 PT PT87237A patent/PT87237B/pt active IP Right Grant
- 1988-04-15 HU HU881966A patent/HU204303B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 NO NO881658A patent/NO176922C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 IE IE114688A patent/IE61574B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 AR AR88310585A patent/AR242991A1/es active
- 1988-04-15 JP JP63093321A patent/JP2667193B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 IL IL8608688A patent/IL86086A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 DK DK209188A patent/DK170741B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 CA CA000564322A patent/CA1322157C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 ZA ZA882659A patent/ZA882659B/xx unknown
- 1988-04-15 AU AU14661/88A patent/AU613022B2/en not_active Ceased
- 1988-04-16 KR KR1019880004345A patent/KR970000187B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-04-14 PH PH36799A patent/PH25327A/en unknown
-
1992
- 1992-11-04 GR GR920402185T patent/GR3006141T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3006141T3 (da) | 1993-06-21 |
| ATE79135T1 (de) | 1992-08-15 |
| AU1466188A (en) | 1988-10-20 |
| NZ224247A (en) | 1990-04-26 |
| HU204303B (en) | 1991-12-30 |
| NO881658D0 (no) | 1988-04-15 |
| DE3712985A1 (de) | 1988-11-03 |
| KR880012760A (ko) | 1988-11-29 |
| ZA882659B (en) | 1988-10-14 |
| DK209188D0 (da) | 1988-04-15 |
| AU613022B2 (en) | 1991-07-25 |
| AR242991A1 (es) | 1993-06-30 |
| FI98830C (fi) | 1997-08-25 |
| IL86086A (en) | 1995-01-24 |
| FI881743A0 (fi) | 1988-04-14 |
| NO176922C (no) | 1995-06-21 |
| HUT47319A (en) | 1989-02-28 |
| KR970000187B1 (ko) | 1997-01-06 |
| FI881743L (fi) | 1988-10-17 |
| DE3873397D1 (de) | 1992-09-10 |
| PT87237A (pt) | 1988-05-01 |
| IE881146L (en) | 1988-10-16 |
| NO176922B (no) | 1995-03-13 |
| PH25327A (en) | 1991-04-30 |
| NO881658L (no) | 1988-10-17 |
| DK209188A (da) | 1988-10-17 |
| EP0288809B1 (de) | 1992-08-05 |
| PT87237B (pt) | 1992-07-31 |
| IL86086A0 (en) | 1988-09-30 |
| EP0288809A1 (de) | 1988-11-02 |
| JPS63301898A (ja) | 1988-12-08 |
| IE61574B1 (en) | 1994-11-16 |
| ES2033981T3 (es) | 1993-04-01 |
| CA1322157C (en) | 1993-09-14 |
| JP2667193B2 (ja) | 1997-10-27 |
| FI98830B (fi) | 1997-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5359035A (en) | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) | |
| KR970000187B1 (ko) | 이작용성 단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제 | |
| ES2067486T5 (es) | Proteina inhibidora de factor de necrosis tumoral (tnf) y su purificacion. | |
| SU1604164A3 (ru) | Способ получени гибридного интерферона типа @ 1/ @ 2 | |
| DE3750056T2 (de) | Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS. | |
| HUT64582A (en) | Method for producing recombinant human interleukin-1 inhibitor | |
| JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| KR20050090393A (ko) | 원핵생물 숙주 내 ｉｌ-21 생산 | |
| US5180811A (en) | Proteins having a tnf action comprising tnf-fibromectin fusion protein | |
| CA2041439A1 (en) | Muteins of the granulocyte colony stimulating factor (g-csf) | |
| KR100356140B1 (ko) | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 | |
| Goth et al. | Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential for receptor binding and cytotoxic activity of tumour necrosis factor beta (lymphotoxin) | |
| AU622125B2 (en) | Neutrophil-activating factor | |
| WO1993003152A1 (en) | Igf-ii analogues | |
| AU617999B2 (en) | A genetic engineering process for the preparation of angiogenins | |
| EP0437544A1 (en) | Recombinant pdgf and methods for production | |
| GB2188933A (en) | Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby | |
| JP2602628B2 (ja) | Ｓｍｃ様ポリペプチド及びその産生方法 | |
| Nishizawa et al. | Biologically active human and mouse nerve growth factors secreted by the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| RU2708556C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида | |
| WO1990002178A1 (en) | A method of preparing an active human neutrophil chemotactic factor polypeptide | |
| CN100487118C (zh) | 一种重组人角质细胞生长因子-2的生产方法 | |
| JPS63226297A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド | |
| JPH0330693A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド | |
| JPH0361495A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |