DK171680B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et heptadecapeptid - Google Patents

Description

DK 171680 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt heptadeca-peptid med analgetisk virkning, og nærmere angivet et heptadecapeptid med opioid virkning, som er indeholdt i 5 en vasoaktiv intestinal peptidfraktion (i det følgende betegnet som VIP-fraktion) opnået fra svineduodenum.

Opfinderne af den foreliggende opfindelse har længe foretaget undersøgelser vedrørende ekstraktion af gastrointestinale hormoner, såsom secretin, cholecysto-10 kinin, pancreozymin og vasoaktive intestinale peptider fra et kildemateriale fra svineduodena, og vedrørende deres anvendelse, og det har uventet vist sig, at et stof med opioid virkning er indeholdt i VIP-fraktionen. Man har derfor foretaget yderligere ekstraktion, rensning og 15 analyse af nævnte stof og fundet, at nævnte stof er et peptid med en hidtil ukendt primær struktur og med en opioid virkning, der er flere hundrede gange kraftigere end morfins. Man er dermed nået til den foreliggende opfindelse.

20 Enkephalin og endorphin som endogene opioide stof fer optræder i hjernen, og disse stoffer antages at kontrollere forskellige legemssanser, herunder smertesansen, og mentale aktiviteter. Enkephalin omfatter to typer pen-tapeptider, nemlig methionin-enkephalin og leucin-enke-25 phalin, og disse to peptider antages at have forskellige fysiologiske virkninger. Det er også kendt, at endorphin har molekylær heterogenitet, idet det forekommer som a-, β-, γ- eller δ-endorphin, og at β-endorphin, der består af 31 aminosyrer, har den kraftigste analgetiske virk-20 ning. Den følgende litteratur er anført som henvisninger og indeholder den almene viden om endorphiner: A. Beaumont, J. Hughes: Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 19^, 245 (1979) ; Chikara Oyama: Shindan to Chiryo (Diagnosis and Therapy) 68, 825 (1980); Tampakushitsu, Kakusan, Koso 25 (Proteins, Nucleic acids, and Enzymes) Vol. 26, No. 2 (1981), specielt bind om opioide peptider.

Der er for nylig blevet fremsat formodning om, at endogene opioide stoffer ikke blot er indeholdt i DK 171680 B1 2 hjernen, men også i andre legemsdele, og der er faktisk fra adrenal medulla blevet fraskilt nogle få peptider, som kan tænkes at være enkephalin-precursorer. Tilstedeværelsen af opioide stoffer i tarmsystemet er også tid-5 ligere blevet indiceret ved immunologiske metoder, såsom immunohistokemi og radioimmunoassay og in-vitro-bioassay.

Imidlertid kendes der overhovedet ikke enkeltheder vedrørende fremgangsmåder til deres ekstraktion eller rensning, eller vedrørende deres strukturer, deres 10 farmakologiske virkninger og lignende.

Det ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede stof er en ekstrakt fra tarmsystemet, hvilken ekstrakt ikke er kendt i enkeltheder. Det er blevet klart, at stoffet er forskelligt fra de ovennævnte kend-15 te endogene opioide stoffer, såsom enkephalin og endorphin, og at det har en kraftigere opioid virkning, end det kunne forventes fra den hidtidige viden. Den foreliggende opfindelse må følgelig anerkendes som ny og som indebærende et teknisk fremskridt.

20 Den foreliggende opfindelse beskrives nærmere ne denfor.

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et heptadecapeptid med følgende primære struktur: 25 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-

Lys-Trp-Asp-Asn-Gln, hvori Asp betegner asparaginsyre, Asn betegner asparagin, og Gin betegner glutamin.

Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav l’s 30 kendetegnende del anførte.

Denne primære struktur er bestemt ved analyser som angivet i nedenstående eksempel, dvs. analyse af a-minosyresammensætning og identifikation ved hjælp af dansylering af N-terminal aminosyren i det omhandlede 35 stof; analyse af aminosyresammensætningen og identifikation af N-terminal aminosyren og aminosyresekvensen ved Edman-nedbrydning omkring de fragmenter, der opnås ved trypsin-hydrolyse af det omhandlede stof; og bestem- DK 171680 B1 3 melse af ændringer i mængderne af aminosyrer,som frigøres ved carboxypeptidase-hydrolyse af det omhandlede stof, med tiden.

Det omhandlede stof kan ekstraheres fra en svine-5 duodenum. Ekstraktionen deraf kan udføres efter en konventionel fremgangsmåde, og rensningen foretages ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Den følgende summariske fremgangsmåde er anført som et eksempel. I det første trin fremstilles der VIP-fraktioner ud fra svine-10 duodena f.eks. efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i Yakugaku-Zasshi vol. 99, p. 172 (1979) af Suzuki, Ara-ki og Tachibana. Derefter koncentreres VIP-fraktionerne ved rensningsmetoder, som indbefatter CM-cellulose-ko-lonnechromatografi, Sephade3^-G-25-gelfiltrering og CM-15 Sephadej^kolonnechromatografi. Her udføres bestemmelsen af en aktiv fraktion ved en bioassay under anvendelse af langsgående muskelpræparater fra marsvineileum (teknik anført i afsnittet (2) Metode i nedenstående prøveeksempel) . Derefter opsamles den aktive fraktion og underka-20 stes udsaltning, og materialet underkastes igen gelfiltrering under anvendelse af Bio Gel P 6. Denne gelfiltrering udføres fortrinvis først vinder svagt alkaliske betingelser og derefter under svagt sure betingelser, hvorved den relative aktivitet forøges i udpræget grad. Derefter 25 frysetørres den aktive fraktion og underkastes revers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af Nu-cleosil C 18. Der anvendes en vandig acetonitrilopløs-ning indeholdende trifluoreddikesyre som udviklingsmiddel, og der foretrækkes en acetonitrilkoncentrationsgra-30 dient fra 10 til 40%. Det enkelte peptid ifølge den foreliggende opfindelse opnås ved gentagen frysetørring og revers-fase-højtryksvæskechromatografi og ved til sidst at underkaste fraktionen revers-fase-højtryksvæskechroma-tografi under anvendelse af et "Nucleosil Phenyl".

35 Det omhandlede stofs anvendelighed som analgetisk stof eftervises ved hjælp af det efterfølgende prøveeksempel .

DK 171680 B1 4

Prøveeksempel (1) Prøvestof.

Det omhandlede stof, fremstillet efter den i eksempel 1 anførte fremgangsmåde, anvendtes som prøvestof.

5 Morfin anvendtes som kontrolprøvestof.

(2) Metode.

Der anvendtes de følgende, nedenfor anførte to metoder (A) og (B).

(A) Prøvemetode under anvendelse af et langsgående mu-10 skelpræparat af marsvineileum.

Der anvendtes den teknik, der er angivet af H.W. Kosterlitz et al. Et fuldt udvokset marsvin udtømtes for blod ved overskæring af halsvenen, og umiddelbart efter laparotomi blev ileum udskåret i et 40 til 50 cm langt 15 stykke fra et punkt i en afstand af 15 til 20 cm fra det ileocekale område, blev straks anbragt i en Ringer's opløsning og blev skåret i 10 cm segmenter, og de langsgående muskler blev skrællet af segmenterne med en operationskniv og en applikator. Disse muskler blev sammen-20 bundet med tråde til dannelse af en ring og anbragtes i en 6 cm^ glascelle med konstant temperatur og ophængtes lodret deri. Fra platinelektroder anbragt i bunden og i toppen påførtes der en elektrisk stimulus på 0,1 Hz, 0,5 ms og 80-90 volt, og den fremkaldte kontraktion registre· 25 redes via en transducer. Når prøvestoffet anbragtes i cellen, reguleredes kontraktionsgraden som reaktion på den anvendte mængde prøvestof. Denne regulering af kontraktionen anvendtes til bestemmelse af opioide virkninger.

30 Denne metode er beskrevet i følgende litteratur sted: H.W.Kosterlitz, A.A. Waterfield: Annu. Rev. Pharmacol. 15, 29 (1975).

(B) Metode under anvendelse af musesædstreng.

Der anvendtes den metode, der er angivet af Hughes 35 et al. En fuldt udvokset hanmus udtømtes for blod ved dekapitering, og umiddelbart efter laparotomi fjernedes sædstrengene. Den i sædstrengene værende sædvæske udpressedes med en pincet, og begge ender af den venstre og DK 171680 B1 5 højre sædstreng blev bundet sammen med tråde til dannelse af en ring. Denne ring anbragtes i et lignende elektro-stimulerende apparat som det i (A) anvendte og stimule-redes elektrisk under betingelserne 0,1 Hz, 1 ms og 90 5 volt. Som det var tilfældet med den langsgående muskel fra marsvineileum, reguleredes den af en elektrisk stimulus fremkaldte kontraktion i en grad svarende til den anvendte mængde af prøvestof. Denne regulering af kontraktionen anvendtes til bestemmelse af den opioide virk-10 ning.

Denne metode er beskrevet i følgende litteratursted: H;W.Hughes, H.W.Kosterlitz, F.M.Leslie, Br. J. Pharmacol. 53, 371 (1975).

Styrken af opioid virkning kan udtrykkes ved IC^q 15 (nmol), som er den koncentration, der er nødvendig til at formindske den ved hjælp af en elektrisk stimulus fremkaldte kontraktion til 50%-niveauet, og IC^q bestemtes derfor også ved metoderne (A) og (B).

(3) Resultater.

20 Resultaterne er anført i tabel 1.

Tabel 1

Metode (A) (B)

Prøvestof

Morphin | 105-25 (15) .220-40 (9) 25 opIfndSsS; 0,55-0,15 (¢) 6,6-2,4 (6) I tabel 1 repræsenterer talværdierne IC^q (nmol), og tallene i parenteser repræsenterer antallet af prøver.

Tabel 1 viser, at det omhandlede stof hæmmer den af en elektrisk stimulus fremkaldte kontraktion af den 30 langsgående muskel i marsvineileum, idet dets styrke er ca. 150 gange så stort som morphins, og at det omhandlede stof hæmmer den af en elektrisk stimulus fremkaldte kontraktion af musesædstreng, idet dets styrke er ca. 30 gange så stor som morphins.

35 Opfindelsen beskrives nærmere ved hjælp af det ef terfølgende eksempel.

DK 171680 B1 6

Eksempel 1 VIP-fraktion (1 kg) opnået fra svineduodena (fra 20.000 svin) passeredes gennem en CM-cellulose-kolonne (30 cm i diameter, 70 cm lang), vaskedes i tilstrækkelig 5 grad (4 1/time) med en 20 mM phosphatpufferopløsning og elueredes med en natriumphosphatpufferopløsning med en lineær koncentrationsgradient for 20 mM, pH 10 (140 liter) til 100 mM, pH 12 (140 liter). Den aktive fraktion opsamledes, idet man fortsatte analysen ved hjælp af en 10 bioassay som anført under metode (A) i det ovenstående prøveeksempel.

Fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser den chroma tografiske profil, og hvori udfyldte trekanter repræsenterer morphinækvivalens, og udfyldte cirkler re-15 præsenterer proteinindhold bestemt ved OD280 nm* Dere^~ ter udsaltedes den aktive fraktion ved mætning med salt, og efter opdeling i to portioner afsaltedes den ved passage gennem en Sephadej^-G-25-kolonne (21,5 cm x 81 cm) og frysetørredes (78 g).

20 Derefter passeredes den aktive fraktion gennem en CM-Sephades^-kolonne (3,5 cm x 90 cm), der på forhånd var blevet pufret i tilstrækkelig grad med en 20 mM, pH 10, phosphatpufferopløsning, vaskedes med den samme pufferopløsning og elueredes (107 ml/time, 15 g/fraktion) 25 med en natriumphosphatpufferopløsning med en lineær koncentrationsgradient fra 20 mM , pH 10 (3 liter) til 100 mM, pH 12 (3 liter). Idet man fulgte aktivitetsændringen ved hjælp af den ovennævnte bioassay, opsamledes den aktive fraktion og udsaltedes med salt (20 g). Den udsalte-30 de fraktion opdeltes i 4 portioner, og hver portion passeredes gennem en Bio Gel 6 kolonne (3 cm x 100 cm).

Først elueredes fraktionen med en 100 mM ammoniumhydro-gencarbonatopløsning, og den aktive fraktion frysetørredes og passeredes derefter på tilsvarende måde gennem en 35 Bio Gel P 6 kolonne (2,4 cm x 87 cm) med en 100 mM eddikesyreopløsning. Med 100 mM ammoniumcarbonatopløsningen elueredes den aktive fraktion med dens top overlappet af toppen for salt, medens den aktive fraktion med 100 mM

7 DK 171680 B1 eddikesyreopløsningen elueredes særskilt efter toppen for salt. Fig. 2 er er grafisk afbildning, der viser den opnåede elueringsprofil ved fraktionering under anvendelse af en Bio Gel P 6 kolonne og en 100 mM ammoni-5 umhydrogencarbonatopløsning, idet den punkterede linie repræsenterer aktiviteter udtrykt som morphinækvivalens, og den fuldt optrukne linie repræsenterer proteinindhold udtrykt som C^qq nm. Fig. 3 er en grafisk afbildning, der viser den opnåede elueringsprofil ved fraktionering 10 under anvendelse af en Bio Gel P 6 kolonne og en 100 mM eddikesyreopløsning, idet den punkterede linie repræsenterer peptidindholdet udtrykt som OD225 nm, og den fuldt optrukne linie repræsenterer peptidindholdet udtrykt som ODjqq nm. Det skraverede område viser den ak-15 tive del.

Den fraskilte aktive fraktion frysetørredes og opløstes i 1 ml af en opløsning, der var fremstillet ved sammenblanding af en acetonitril/vand-blanding (1:9) med 0,065 vol/vol-% trifluoreddikesyre, og underkastedes re-20 vers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af Nucleosil C 18 kolonne (4,6 mm x 500 mm). Opløsningsmiddelsystemet var her en opløsning, der var fremstillet ved sammenblanding af en acetonitril/vand-blanding med 0,065 vol/vol-% trifluoreddikesyre. Denne opløsning hav-25 de en acetonitrilkoncentrationsgradient fr 20% til 40% og passeredes igennem med en hastighed på 2 ml/min.

Fig. 4 er en grafisk afbildning, der viser resultatet af denne chromatografering, idet den punkterede linie repræsenterer koncentrationsændringen for aceto-30 nitril, og det skraverede område repræsenterer en aktiv del. Som vist i fig. 4 koncentreredes og udvaskedes den aktive fraktion nær ved den fraktion, der svarer til en acetonitrilkoncentration på 30%. Fraktionen frysetørredes, underkastedes højtryksvæskechromatografi under an-35 vendelse af de samme betingelser og underkastedes til sidst revers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af en Nucleosil-Phenyl-kolonne (4,6 mm x 250 mm). Her var udviklingsmidlet en opløsning, der var frem- 8 DK 171680 B1 stillet ved at blande en 30% vandig acetonitrilopløs-ning med 0,065 vol/vol-% trifluoreddikesyre, og denne opløsning passeredes igennem med en hastighed på 1 ml/ min. Den aktive del svarende til optiske absorptions-5 toppe ved 280 nm og 225 nm elueredes symmetrisk.

Fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser resultatet af denne chromatografering. Det fremstillede stof omdannedes til det tilsvarende dansylerede derivat ved en sædvanlig fremgangsmåde til bekræftelse af 10 dets renhed. Udbyttet var 15 nmol. Strukturen af det opnåede stof bestemtes ved de nedenfor under (1) til (4) anførte analyser.

(1) Aminosyresammensætning.

Peptidet (2 nmol) hydrolyseredes ved 110°C i 15 24 timer i 20 yl af en 3 N mercaptoethansulfonsyre- opløsning og analyseredes for dets indgående aminosyrer ved hjælp af en Hitachi Model-835 aminosyreanalysa-tor. Som resultat heraf viste det sig, at peptidet bestod af 17 aminosyrer, nemlig 2 Asp, 1 Glu, 2 Gly, 20 1 Pro, 1 lieu, 2 Leu, 1 Phe, 1 Tyr, 2 Lys, 3 Arg og 1

Trp.

(2) Identifikation af N-terminale aminosyrer.

Peptidet (1 nmol) opløstes i 50 yl af en 0,5 N natriumhydrogencarbonatopløsning, blandedes med 50 yl 25 af en acetoneopløsning indeholdende 1 mg/ml af dansy1-chlorid og henstilledes natten over. Det dansylerede peptid udvikledes ved silicagel-tyndtlagschromatografi (TLC), n-BuOHiAcOHi^O = 4:1:5. Pletten af dansyleret peptid (R^ 0,3-0,4) blev skrabet af og elueredes med 30 en blanding af MeOH, AcOH, pyridin og vand (1:1:1:1).

Efter koncentrering og inddampning til tørhed i et hydrolyserørglas hydrolyseredes peptidet med 100 yl 6 N saltsyre ved 105°C i 16 timer. Efter afdestillation af saltsyren ekstraheredes hydrolysatet med 100 yl 35 vandmættet ethylacetat. Det uopløselige stof fracentrifugeredes, og den overliggende væske analyseredes ved hjælp af en HPLC (Waters) Nucleosil C 18 kolonne (4,6 mm x 250 mm). Som resultat identificeredes e-DNS- DK 171680 B1 9 lysin og 0,N-diDNS-tyrosin. Følgelig skønnedes N-terminalen at være tyrosin.

(3) Bekræftelse af strukturen af trypsinhydrolysat.

Peptidet (5 nmol) opløstes i 100 yl af destille-5 ret vand. Til opløsningen sattes 10 yg/ml af trypsin (Sigma Co.) og 15 yl af en 0,1 M phosphatpufferopløsning, pH 7,6, og den opnåede opløsning underkastedes enzymatisk hydrolyse ved 37°C i 1,5 timer. Hydroly-satet som sådant underkastedes en adskillelsesbehandling 10 under anvendelse af et HPLC (Waters) apparat, og under betingelser indbefattende en Nucleosil C 18 kolonne (4,6 mm x 250 mm) og en 0,065% vandig TFA-opløsning med en acetonitrilkoncentrationsgradient, der stiger lineært fra 10 til 60%, til opnåelse af fem fragmenter.

15 Hvert fragment underkastedes aminosyreanalyser, identifikation af N-terminale aminosyrer og bestemmelse af aminosyresekvensen ved Edman-nedbrydning. Som resultat heraf skønnedes fragmenterne at have følgende aminosyresekvenser: 20 Frag. I : Ile-Arg-Pro-Lys

Frag. II : Arg-Ile-Arg-Pro-Lys

Frag. III : Leu-Lys-Trp-Asp (Asx Glx)

Frag. IV : Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg

Frag. V : Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg.

25 Strukturerne af fragmenterne I, II, IV og V

bekræftedes ved at sammenligne dem med syntetiske standardprøver. Der skal her anføres følgende litteratur vedrørende Edman-nedbrydningen: Methods in Enzymo-logy Vol, XLVII, del E, p. 335, udgivet af C.H.W. Hrsog 30 S.N. Timasheff, 1977, Academic Press, New York.

(4) Bestemmelse af sekvensen af C-terminale aminosyrer.

Peptidet (1 nmol) sammen med 1 yg carboxypepti-dase A (sigma Co.) inkuberedes i 150 yl af en 0,1 M ammoniumacetatpufferopløsning, pH 8,0, ved 33°C, til 35 nedbrydning af peptidet. Efter 2 timers og 16 timers forløb blev der udtaget 50 yl prøver, og de analyseredes for frigjorte aminosyrer ved hjælp af en Hitachi Model-835 aminosyreanalysator under anvendelse af en biologisk DK 171680 B1 10 væskekolonne. Til den tilbageblevne (50 yl) opløsning sattes 1 yg carboxypeptidase til fuldstændig nedbrydning, og der hydrolyseredes yderligere i 24 timer.

Efter 24 timers forløb injiceredes hele opløsningen 5 i en aminosyreanalysator, og de frie aminosyrer bestemtes kvantitativt. Som resultat skønnedes det, at C-ter-minalen var Gin, og at den næstsidste aminosyre var Asp eller Asn, det vil sige,at C-terminaldelen skønnedes at være -Asp-Asn-Gln eller -Asn-Asp-Gln. På den 10 anden side, udfra resultaterne af Edman-nedbrydningen af det trypsinhydrolyserede fragment III skønnedes den tredie aminosyre fra C-terminalen at være Asp. Følgelig bestemtes aminosyresekvensen i C-terminaldelen til at være -Asp-Asn-Gln.

15 Ud fra resultaterne af analyserne (1) til (4) bekræftedes det, at peptidets aminosyresekvens var som følger:

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln.

20 Kort beskrivelse af tegningen.

Fig. 1 refererer til eksempel 1 og er en grafisk afbildning, der viser en elueringsprofil opnået ved anvendelse af en CM-cellulose-kolonne, fig. 2 refererer til eksempel 1 og er en gra-25 fisk afbildning, der viser en elueringsprofil opnået ved anvendelse af en Bio Gel P 6 kolonne og en ammonium-carbonatopløsning, fig. 3 refererer til eksempel 1 og er en grafisk afbildning, der viser en elueringsprofil opnået ved 30 anvendelse af en Bio Gel P 6 kolonne og en eddikesyreopløsning, fig. 4 refererer til eksempel 1 og er en grafisk afbildning, der viser resultatet af revers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af en 35 Nucleosil C 18 kolonne, og fig. 5 refererer til eksempel 1 og viser resultatet af revers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af en Nucleosil-Phenyl-kolonne.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et hepta-decapeptid med den primære struktur: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys- Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln 5 kendetegnet ved, at (1) ud fra svineduodenum fremstillede VIP-fraktioner koncentreres ved metoder, som indbefatter CM-cellulose-kolonnechromatografi og gelfiltrering og kolonnechroma-tografi på tværbundet dextran, fortrinsvis Sephadex®-

10 G-25-gelfiltrering og CM-Sephadex ®-kolonnechromatografi, eventuelt med mellemliggende udsaltning og frysetørring, (2) den eller de i trin (1) opnåede aktive fraktioner, der udviser opioide virkninger, underkastes udsaltning, og materialet igen underkastes gelfiltrering under 15 anvendelse af Bio Gel, fortrinsvis Bio Gel 6 og Bio Gel P 6, (3) den eller de i trin (2) opnåede aktive fraktioner, der udviser opioide virkninger, frysetørres og underkastes revers-fase-højtryksvæskechromatografi under anvendelse af Nucleosil C 18, og efter gentagen sådan fryse- 20 tørring og revers-fase-højtryksvæskechromatografi underkastes den aktive fraktion til sidst revers-fase-høj-tryksvæskechromatografi under anvendelse af et "Nucleosil Phenyl".

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 25 net ved, at der som elueringsmiddel i trin (1) anvendes en natriumphosphatpufferopløsning.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gelfiltreringen i trin (2) udføres først under svagt alkaliske betingelser og derefter under svagt 30 sure betingelser.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der ved revers-fase-højtryksvæskechromatograf ien i trin (3) anvendes en vandig acetonitrilop-løsning indeholdende trifluoreddikesyre som udviklings- 35 middel.