DK171685B1 - Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af humant væksthormon - Google Patents
Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af humant væksthormon Download PDFInfo
- Publication number
- DK171685B1 DK171685B1 DK059492A DK59492A DK171685B1 DK 171685 B1 DK171685 B1 DK 171685B1 DK 059492 A DK059492 A DK 059492A DK 59492 A DK59492 A DK 59492A DK 171685 B1 DK171685 B1 DK 171685B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- hgh
- amino acid
- ala
- met
- Prior art date
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims abstract description 86
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 title abstract description 15
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 title description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 title description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 title 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 3
- 101000733770 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Aminopeptidase 1 Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 13
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010013127 Met-human growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101710091872 Putative fusion protein Proteins 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
i DK 171685 B1
Den foreliggende opfindelse angår en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af autentisk humant væksthormon (hGH) ud fra aminoterminalekstenderet hGH ved anvendelse af Dipeptidyl Aminopeptidase I (DAP I) (E.C.
5 3.4.14.1).
Fra USA patentskrift nr. 4 342 832 er det kendt at producere biosyntetisk hGH ved fermentering af en rekombinant værtscelle, specielt Escherichia coli, som koder for hGH 10 med tilhørende methionin. Ved den derfra kendte fremgangsmåde fås imidlertid hGH, som til den N-terminale ende har knyttet aminosyren methionin, der ikke findes i autentisk hGH.
15 På grund af risikoen for antigene reaktioner og andre bivirkninger ved anvendelsen af et væksthormon, som ikke er helt identisk med hGH, er der derfor et stort behov for at kunne fremstille biosyntetisk hGH med korrekt aminosy-resekvens. Dette problem har været søgt løst ved EP-A-20 127305 (DK patentansøgning, nr. 2046/84), som omhandler en fremgangsmåde til fremstilling af hGH ud fra præ-hGH i en rekombinant prokaryot mikroorganisme, såsom Pseudomonas aeruginosa eller E. coli.
25 Anvendelsen af Pseudomonas aeruginosa til fremstilling af hGH uden methionin til terapeutisk brug er imidlertid behæftet med den risiko, at denne bakterie og mange andre Pseudomonas bakterier, der er potentielt patogene, syntetiserer giftige toxiner, som vanskeligt kan fjernes ved 30 oprensning af hGH.
Udtrykkeisen af præ-hGH efterfulgt at proteolytisk spaltning til opnåelse af det autentiske hGH i en E. coli (som ikke er patogen) er antydet i DK patentansøgning nr.
35 2046/84, men i denne beskrivelse er det ikke dokumenteret, at den proteolytiske spaltning entydigt fører til DK 171685 B1 2 dannelsen af autentisk hGH, dvs. med korrekt aminosyrese-kvens.
Som ovenfor nævnt, kan det være risikabelt at anvende 5 Met-hGH. Selv om der er foreslået metoder til enzymatisk fraspaltning af methioningruppen ved hjælp af aminopepti-daser, ville problemet ikke derved blive løst, fordi de kendte enzymatiske processer af denne type ikke fører til 100% omdannelse. Der ville opstå en blanding af hGH og 10 Met-hGH, som ikke ved konventionelle præparative oprensningsprocesser kunne adskilles fuldstændigt.
I EP-A-89626 er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af specifikke polypeptider, hvori der udtrykkes et 15 fusionsprodukt bestående af polypeptidet og en polymer af ladede aminosyrer. Efter separation af fusionsproduktet fra kontaminanter baseret på egenskaberne ved den nævnte polymer, fjernes denne ved hjælp af en exopeptidase. Der er ikke anført nogle specifikke retningslinier for dan-20 nelsen af hGH.
I EP-A-35384 foreslås anvendelse af specielle linkere med et specifikt spaltningssted for endopeptidaser for at lette oprensningen af proteiner. Oprensnings-linkeren kan 25 indeholde ladede aminosyrer. Der er ikke givet nogle specifikke retningslinier for dannelsen af hGH.
I WO 84/02351 og DK-ans. 3448/84 foreslås en fremgangsmåde til fremstilling af bl.a. autentisk hGH, hvori et bio-30 syntetisk fremstillet N-terminalekstenderet hGH nedspises med en aminopeptidase, fortrinsvis leucinaminopeptidase (LAP) for at fraspalte ekstenderingen. Denne bestod af vilkårligt udvalgte aminosyrerestere, der fjernedes ved trinvis fraspaltning. Det har imidlertid vist sig, at 35 denne fremgangsmåde ikke fungerede i praksis ved anvendelse af ren LAP.
DK 171685 B1 3 I DK-ans. 556/85 (PL. §2.2.2 teknik) er beskrevet en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af autentisk væksthormon, hvorved biosyntetisk aminoterminalt eksten-5 deret hGH nedspises med et enzym, der er påvist værende Dipeptidyl Aminopeptidase I (E.C.3.4.14.1), hvilket også-kan udledes af de angivne karakteristika for enzymet.
Ekstenderingen er defineret som X-Z-hGH, hvor X er en 10 vilkårlig aminosyre eller aminosyresekvens, hvori kun den N-terminale aminosyre kan være Pro, og Z er en aminosyre med ladet sidekæde.
De eneste specifikke ekstenderinger, der er nævnt er 15 (Ala-Glu),,, hvor n er 1-12, eksemplificeret med Ala-Glu og Ala-Glu-Ala-Glu, samt Ala-Glu-Glu og Met-Ala-Glu. Disse ekstenderinger kan opnås ved, i et egnet substrat at fermentere en mikroorganisme, som er transformeret med et plasmid, der koder for hGH med disse tilknyttede amino-20 terminalekstenderinger plus aminoterminalt Met. Efter udtrykkeisen bliver Met eventuelt fraspaltet enzymatisk af mikroorganismen.
Det har vist sig, at et specifikt udvalg af forsekvenser 25 af den i DK ans. 556/85 generelt karakteriserede art, der ikke er beskrevet i DK ans. 556/85, nemlig sekvenser med den almene formel X, hvori X er en lineær aminosyresekvens med et lige antal aminosyrerester, der ikke ladningsmæssigt ophæver hinanden, og hvori den første amino-30 syre regnet fra N-terminus af hGH er forskellig fra Lys og Arg, alle andre ulige aminosyrer er forskellige fra Pro, Lys og Arg, og alle lige aminosyrer er forskellige fra Pro, idet mindst én af aminosyrerne i den dipeptid-komponent, som er knyttet direkte til N-terminus af hGH, 35 er Asp eller Glu, og den anden aminosyre ikke er positivt ladet, idet X dog ikke kan være (Ala-Glu) r, hvor r er et DK 171685 B1 4 helt talt fra 1-12 eller Met-Ala-Glu-Glu, ved hjælp af enzymet DAP I lader sig fraspalte i højt udbytte til produkter, der ved kendte oprensningsmetoder, såsom chroma-tografi, kan adskilles på tilfredsstillende måde. Derved 5 er det muligt at opnå homogent autentisk hGH i kommercielle mængder og egnet til terapeutisk behandling.
DAP I er et kendt enzym. Således er det fra CA Vol 77, 1972, page 223, nr. 2289q kendt, at dipeptidylaminopepti-10 dase I (DAP I) kan fraspalte N-terminale dipeptider fra oligopeptider, men enzymet er ikke i stand til at fjerne dipeptider med en N-terminal arginin eller lysin eller at spalte bindingen på hver side af prolin.
15 Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, der er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte, benyttes enzymet Dipeptidyl Aminopeptida-se (DAP I) (E.C. 3.4.14.1) til fraspaltning af en specifik aminoterminalekstendering på hGH, der som nævnt inde-20 holder mindst én aminosyre valgt blandt Asp og Glu. Dette enzym er specielt derved, at det kan afspalte dipeptider fra den N-terminale ende af peptider og proteiner, bl.a. under forudsætning af følgende: 25 a) at den N-terminale aminosyre i protei- net/peptidet ikke er Lys eller Arg, b) at den anden eller tredie aminosyre fra den N- terminale ende i proteinet/peptidet ikke er Pro.
30 N-terminalsekvensen af hGH er
Phe 1 Pro 1 Thr - Ile 35 og det vil sige, at DAP I ikke er i stand til at spalte bindingerne i hGH angivet med 1 og 2.
DK 171685 B1 5
Det er klart, at da DAP I afspalter dipeptider, må ekstenderingen bestå af et lige antal aminosyrer, for at det aminoterminalekstenderede hGH kan omdannes til hGH 5 uden ekstra aminosyre.
Da enzymet har ovennævnte specificitet, er det ligeledes klart, at ekstenderingen ikke må indeholde Lys eller Arg på de ulige pladser, og hvis Pro forekommer, må den kun 10 være placeret som N-terminal aminosyre, da afspaltningen af dipeptider ellers vil standse, før hele ekstenderingen er afspaltet.
Da ingen enzymreaktioner kan forventes at føre til 100¾ 15 omdannelse, indføres der ifølge opfindelsen aminosyrer i ekstenderingen, som gør det muligt analytisk og præparativt at adskille autentisk hGH fra aminoterminalekstende-ret hGH. I princippet kan dette gøres ved at vælge aminosyrer med ladede sidekæder, dvs. Glu eller Asp (negativt 20 ladede sidekæder) eller Arg, Lys eller His (positivt ladede sidekæder). Det vil så ved henholdsvis anionbytning og kationbytning (analytisk eller præparativt) eller ved anionisk og kationisk elektroforese være muligt at adskille aminoterminalekstenderet hGH fra (autentisk) hGH -25 forudsat, at der ikke er valgt en kombination af positivt og negativt ladede aminosyrerester i ekstenderingen, som ladningsmæssigt ophæver hinanden.
Ifølge opfindelsen er mindst en af aminosyrerne indeholdt 30 i dipeptidkomponenten, som er knyttet direkte til den N-terminale ende af hGH, valgt blandt Asp og Glu, idet man så kan erkende, om hele aminoterminalekstenderingen er afspaltet. Imidlertid er det mest hensigtsmæssigt, at den sidste aminosyrerest i ekstenderingen er Asp eller Glu.
35 Dette har især betydning i tilfælde af, at mikroorganis- DK 171685 B1 6 men in vivo kun delvis fraspalter den N-terminale methio-ninrest.
Det er mest hensigtsmæssigt, at aminosyrer med ladede si-5 dekæder i aminoterminalekstenderingen til hGH udeluk kende er negativt ladede. Dette forhindrer, at aminoter-minalekstenderet hGH, delvis enzymatisk omdannet amino-terminalekstenderet hGH og autentisk hGH på noget tidspunkt får samme nettoladning.
10 I hGH sker der let en deamidering af visse Gin- og Asn-rester, dvs. Gin og Asn omdannes til henholdsvis Glu og Asp - altså aminosyrer med negativt ladede sidekæder. Den specifikke sammensætning af dipeptid-komponenten, som er 15 knyttet direkte til N-terminus af hGH, bevirker, at man undgår den situation, at én eller flere deamideringer i hGH ophæver den/de positive ladninger, der er i ekstende-ringen. En sådan ophævelse af ladninger ville nemlig føre til, at eventuelt uomsat deamideret aminoterminaleksten-20 deret hGH ikke kan adskilles ved ionbytning fra det enzymatisk dannede autentiske hGH.
Eksempler på særligt egnede aminoterminalekstenderinger, der kan fraspaltes med DAP I er 25 1. Met-Glu-Ala-Glu 2. Met-Phe-Glu-Glu 3. Thr-Glu-Ala-Glu 4. Met-Asp-Ala-Asp 30 5. Met-Glu-Ala-Asp
Disse og andre egnede aminoterminalekstenderinger kan opnås ved, i et egnet substrat, at fermentere en mikroorganisme, som er transformeret med et plasmid, der koder for 35 humant væksthormon med disse tilknyttede aminoterminalekstenderinger.
DK 171685 B1 7
Ved nogle specifikke forsekvenser bliver methionin, som er den N-terminale aminosyre i alle proteiner dannet i E. coli, afspaltet enzymatisk i mikroorganismen efter ud-5 trykkelse af proteinet. Herved fremkommer blandt andet de ovenfor nævnte aminoterminalekstenderede hGH proteiner.
Disse proteiner oprenses ved konventionelle oprensningsmetoder. Aminoterminalekstenderingen afspaltes selektivt 10 og i høj udbytte, og det dannede hGH kan derefter let adskilles fra eventuelle rester af delvis omdannet amino-terminalekstenderet hGH, samt deamideret hGH ved anion-bytning.
15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler.
EKSEMPEL 1 20 Fremstilling af aktivt enzym eller enzymkompleks
Som udgangsmateriale til fremstilling af det aktive enzym (DAP I) eller enzymkompleks indeholdende dette kan der, som beskrevet i DK ans. 556/85 anvendes en leucina-25 minopeptidasepræparation fra Sigma, idet DAP I er blevet fraktioneret sammen med leucinaminopeptidase (LAP). DAP I kan fraktioneres fra LAP ved IE-HPLC (ionexchance-HPLC), på en højt opløselig MonoQ søjle fra Pharmacia.
30 Fraktionering
Kolonne: 0,196 cnt x 5 cm pakket med MonoQ (Pharmacia), 10 pm + 0,2 pm.
35 Puffer A: 20 mM Tris-Cl, 5 mM MgCl: pH = 8,5.
DK 171685 B1 8
Puffer B: 10 mM Tris-Cl, 5 mM MgCl;, 500 mM NaCl pH = 8.5.
Strømningshastighed : 1 ml/min.
5
Injektionsvol: 500 μΐ.
Detektion : 280 nm, 0,5 AUFS.
10 Temperatur 20 °C.
Gradienttabel:
Tid %A %B Gradientform 15 0 100 0 2 100 0 lineær 18 0 100 lineær 20 Fraktioner: 1 min'1.
Et leucinaminopeptidasepræparat fra Sigma, L-1503, lot. nr. 14F-8155 indeholdende 10 mg LAP/ml og 120 μ/mg, fortyndes til 2,6 mg/ml med puffer A. 500 μΐ blev påført ko-25 lonnen. UV-profilen af fraktioneringen fremgår af tegningen, som viser at præparationen er inhomogen. Der opsamles 17 fraktioner, som undersøges for leucinaminopeptida-seaktivitet og den specifikke aktivitet for omdannelse af AE-hGH (Ala-Glu-hGH) til hGH.
30
Leucinaminopeptidaseaktiviteten måles spektrofotometrisk ved omsætning af L-leucin og ammoniak ved 238 nm, pH = 8.5, som beskrevet i (ref. 1) E. Merck: Analytisches Zen-trallab. Priifungsvorschrift code nr. AZL 0526675. 300 μΐ 35 af hver fraktion præinkuberes ved 40 °C i 2 timer, før DK 171685 B1 9 aktivitetsmålingen. Resultatet af aktivitetsmålingen fremgår af tegningen.
Den specifikke aktivitet for omdannelsen af AE-hGH til 5 hGH blev målt på følgende måde: 100 μΐ af de enkelte fraktioner tilsættes 100 μΐ AE-hGH (1 mg/ml i 5 mM MgCl.; 10 mM Tris pH = 8,5), fremstillet som beskrevet i eksempel 2, pH justeres til 4,2. Reaktionsblandingen analyseres efter 2 timer ved polyacrylamidgelelektroforese på en 10 10% gel. Omsætningsgraden bestemmes ved Laser-scanning af gelerne. Resultatet fremgår af tegningen.
Leucinaminopeptidaseaktiviteten i de enkelte fraktioner er angivet i tegningen. Der er kun LAP-aktivitet i frak-15 tion 13 og 14. En balanceberegning på LAP-aktivitet viser at al påsat LAP-aktivitet elueres i disse to fraktioner.
Aktivitet for omdannelsen af AE-hGH til hGH findes i fraktionerne 9-15 med maksimum i fraktion 12, hvorefter 20 aktiviteten hurtigt aftager. Det ses således klart, at der er to enzymaktiviteter til stede, og at det ved den givne fraktioneringsmetode er muligt at adskille disse.
Det er påvist, at den specifikke aktivitet for omdannel-25 sen af Ala-Glu-hGH skyldes tilstedeværelsen af enzymet DAP I.
Fremstilling af Ala-Glu-hGH ved biosyntese som beskrevet i DK ans. 556/85 30
Til en klonet DNA-sekvens, som koder for et protein med aminosyresekvens som humant væksthormon, hGH (191 amino syrerester, hvoraf de fire første aminosyrer er Phe-Pro-Thr-Ile), tilkobles følgende syntetisk fremstillede, dob-35 beltstrengede DNA-sekvens således, at +strengens 3' ende tilkobles ovennævnte gens +5' ende, og den syntetiske DK 171685 B1 10 DNA-sekvens-streng 5' ende tilkobles ovennævnte gens 3' ende ved sturapendeligering:
+5' CGATG GCT GAA
5 -3' TAC CGA CTT
hvor de 2 første nucleotider i +strengen er et Clal-restriktionsstedoverhæng, og de efterfølgende nucleotid-sekvenser koder for aminosyrerne Met-Ala-Glu-.
10
Ved normalt anvendt genkloningsteknik indsattes ovennævnte gen i et ekspressionsplasmid indeholdende en fusioneret Trp-Lac-promotor samt SD-sekvensen AGGA. Denne konstruktion skulle udtrykke Met-Ala-Glu-hGH.
15
Denne plasmidkonstruktion indføres herefter ved kendt teknik i en E. coli celle. En velegnet klon, som indeholder ovennævnte konstruktion, isoleres og opdyrkes i 5 1 skala. Cellerne blev høstet ved centrifugering og opslæm-20 mes i et lille volumen og lyseres ved anvendelse af en såkaldt "fransk presse".
Ved immunologiske metoder under anvendelse af hGH-antistoffer kunne det formodede fusionsprotein påvises i 25 ovennævnte bakterieekstrakt, svarende til, at der i dyrkningsmediet var en koncentration af 200 mg/1. Fusionsproteinet oprenses konventionelt ved anionbytning, amonium-sulfatfældning og hydrofob chromatografi.
30 Det oprensede (formodede) Met-Ala-Glu-hGH blev ved SDS-elektroforese bedømt til at være mere end 99¾ rent.
En aminoterminalsekvensbestemmelse viste, at det oprensede hGH-materiale havde sekvensen Ala-Glu-hGH, hvilket vil 35 sige, at Met var blevet afspaltet af et i E. coli forekommende enzym.
11 DK 171685 B1
Enzymatisk spaltning af Ala-Glu-hGH til hGH, jfr. DK ans. 556/85 5 100 mg Ala-Glu-hGH i 20 mM Tris-Cl, pH 4,2 (1,5 mg/ml) tilsattes 7 mg enzymfraktion med DAP I aktivitet, isoleret fra svinenyrer som angivet ovenfor.
Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C.
10 Efter 4 1/2 time afkøledes blandingen til 4 °C. Den afkølede reaktionsblanding blev derefter fraktioneret ved anionbytning, hvorefter hovedtoppen (hGH-produkt) blev isoleret. Udbyttet var 90%.
15 hGH-produktet blev vist at være mere end 99% rent, bedømt ved SDS-elektroforese. En aminoterminalbestemmelse (Edman-degradation) viste, at aminoterminalsekvensen af hGH-produktet var Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-, dvs. som for autentisk hGH.
20
Den biologiske aktivitet af hGH-produktet blev bestemt ved en tibia-test, og blev fundet til at være 2,5 IU/ml, hvilket også fås for autentisk hGH.
25 EKSEMPEL 2 (ifølge opfindelsen)
Fremstilling af hGH ud fra Met-Glu-Ala-Glu-hGH meddipep-tidylaminopeptidase I
30 Met-Glu-Ala-Glu-hGH blev fremstillet ved genteknologi i princippet som beskrevet for Ala-Glu-hGH i eksempel 1. Met-Glu-Ala-Glu-hGH blev oprenset fra fermenteringsproduktet ved anionbytning og hydrofob interaktionschromato-grafi.
35 DK 171685 B1 12
Det oprensede Met-Glu-Ala-Glu-hGH blev ved IE-HPLC og SDS-elektroforese bedømt til at være mere end 99¾ rent.
En aminoterminalsekvensbestemmelse viste, at det oprense-5 de hGH indeholdt sekvensen Met-Glu-Ala-Glu-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu, hvor de seks sidste aminosyrer svarer til N-terminalen i hGH. 200 ml Met-Glu-Ala-Glu-hGH (2,0 mg/ml) i 20 mM Tris, 10 mM citronsyre, 25 mM NaCl, pH 4,2, blev tilsat 10.000 mU (svarende til 3,3 mg) Dipeptidyl 10 Aminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1) fra Boehringer Mannheim. Andre fabrikater kan dog også anvendes. pH justeres eventuelt til 4,2.
Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C i 15 60 minutter, hvorved opnås mere end 98¾ omdannelse af
Met-Glu-Ala-Glu-hGH til hGH. Reaktionsblandingen afkøles til 4 °C efter endt reaktion. Den videre oprensning består af en isofældning, gelfiltrering og en anionbytning.
20 hGH produktet viste sig at være mere end 99¾ rent, bedømt ved IE-HPLC og SDS-elektroforese. En aminoterminal sekvensbestemmelse ved Edman-degradation viste, at amino-terminalsekvensen af hGH produktet var Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu, dvs. som for autentisk hGH.
25
Den biologiske aktivitet af hGH-produktet blev bestemt ved en tibia-test og blev målt ækvipotent med pituitært hGH.
DK 171685 B1 13 EKSEMPEL 3 (ifølge opfindelsen)
Fremstilling af hGH fra Met-Phe-Glu-Glu-hGH med dipep-tidylaminopeptidase I
5
Met-Phe-Glu-Glu-hGH blev fremstillet ved genteknologi i princippet som beskrevet i eksempel 1. Met-Phe-Glu-Glu-hGH blev oprenset fra fermenteringsproduktet ved anion bytning, og hydrofob interaktionschromatografi.
10
Det oprensede Met-Phe-Glu-Glu-hGH blev ved IE-HPLC og SDS-elektroforese bedømt til at være mere end 99¾ rent.
En aminoterminalsekvensbestemmelse viste, at det oprense-15 de hGH havde sekvensen Met-Phe-Glu-Glu-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu, hvor de seks sidste aminosyrer svarer til N-terminalen i hGH.
100 ml Met-Phe-Glu-Glu-hGH (1,5 mg/ml) i 20 mM Tris, 10 20 mM citronsyre, 25 mM NaCl, 1 mM L-Cystein pH 4,2 blev tilsat 15.000 mU (~5,0 mg) Dipeptidyl Aminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1) fra Boehringer Mannheim. Andre fabrikater kan dog også anvendes. pH rejusteres eventuelt til 4,2.
25 Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C i 60 minutter, hvorved opnås mere end 98¾ omdannelse af Met-Phe-Glu-Glu-hGH til hGH. Reaktionsblandingen afkøles til 4 °C efter endt reaktion. Den videre oprensning består af en isofældning, gelfiltrering og en anionbytning.
30 hGH produktet viste sig at være mere end 99¾ rent, bedømt ved IE-HPLC og SDS-elektroforese. En aminoterminalse-kvensbestemmelse var Edman-degration viste, at aminoter-minalsekvensen af hGH produktet var Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-35 Leu, dvs. som for autentisk hGH.
DK 171685 B1 14
Den biologiske aktivitet af hGH-produktet blev bestemt ved en tibia-test og blev målt ækvipotent med pituitært hGH.
Claims (6)
1. Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af autentisk humant væksthormon, (hGH), hvorved biosyntetisk aminoter-5 minalt ekstenderet hGH indeholdende mindst en ladet aminosyre i ekstenderingen nedspises med Dipeptidyl Aminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1), kendetegnet ved, at det aminoterminalt eksten-derede hGH har formlen: 10 X-hGH hvori X er en lineær aminosyresekvens med et lige antal aminosyrerester, der ikke ladningsmæssigt ophæver hinan-15 den, og hvori den første aminosyre regnet fra N-terminus, er forskellig fra Lys og Arg, alle andre ulige aminosyrer er forskellige fra Pro, Lys og Arg, og alle lige aminosyrer er forskellige fra Pro, idet mindst én af aminosyrer-ne i den dipeptid-komponent, som er knyttet direkte til 2 0 N-terminus af hGH, er Asp eller Glu, og den anden amino syre ikke er positivt ladet, idet X dog ikke kan være (Ala-Glu) r, hvor r er et helt tal fra 1-12, eller Met-Ala-Glu-Glu.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Asp eller Glu er den sidste aminosyre i aminosy-resekvensen X.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 30 ved, at Asp eller Glu er den næstsidste aminosyre i ami- nosyresekvensen X.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at både den sidste og den næstsidste aminosyre i 35 aminosyresekvensen X er Asp eller Glu. DK 171685 B1
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen X er Met-Glu-Ala-Glu.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 4, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen X er Met-Phe-Glu-Glu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK059492A DK171685B1 (da) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af humant væksthormon |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK059492A DK171685B1 (da) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af humant væksthormon |
| DK59492 | 1992-05-06 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK59492A DK59492A (da) | 1992-05-06 |
| DK59492D0 DK59492D0 (da) | 1992-05-06 |
| DK171685B1 true DK171685B1 (da) | 1997-03-10 |
Family
ID=8095336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK059492A DK171685B1 (da) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af humant væksthormon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK171685B1 (da) |
-
1992
- 1992-05-06 DK DK059492A patent/DK171685B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK59492A (da) | 1992-05-06 |
| DK59492D0 (da) | 1992-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takagi et al. | Control of folding of proteins secreted by a high expression secretion vector, pIN-III-ompA: 16-fold increase in production of active subtilisin E in Escherichia coli | |
| US5679552A (en) | Process for preparing a desired protein | |
| CN101186940B (zh) | 获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法 | |
| EP0327377B1 (en) | KEX2 endoprotease and process for production thereof | |
| US5234830A (en) | DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region | |
| Nagasawa et al. | Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli | |
| WO1992006211A1 (en) | Process for producing peptide or protein | |
| CA2438886A1 (en) | Fusion protein for the secretion of a protein of interest into the supernatant of the bacterial culture | |
| EP0217814B2 (en) | A process for producing human growth hormone | |
| KR20010083900A (ko) | 활성 β-ＮＧＦ의 제조방법 | |
| JPS6410999A (en) | Production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
| Anselme et al. | Asparaginyl-tRNA synthetase from Escherichia coli has significant sequence homologies with yeast aspartyl-tRNA synthetase | |
| MOLLAY et al. | Isolation of a dipeptidyl aminopeptidase, a putative processing enzyme, from skin secretion of Xenopus laevis | |
| US5218093A (en) | EGF variants and pharmaceutical use thereof | |
| EP0528686B8 (en) | Process for producing peptides | |
| EP0329693A1 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same | |
| Lepage et al. | Recombinant technology as an alternative to chemical peptide synthesis: Expression and characterization of HIV-1 Rev recombinant peptides | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| CA2369973C (en) | Preparation of pancreatic procarboxypeptidase b, isoforms and muteins thereof and their use | |
| US6428997B1 (en) | Aminopeptidase derived from Bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins | |
| Moguilevsky et al. | Production of authentic human proapolipoprotein AI in Escherichia coli: strategies for the removal of the amino-terminal methionine | |
| US20050272125A1 (en) | Method for making acylated polypeptides | |
| KR102064810B1 (ko) | 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법 | |
| AU650150B2 (en) | Novel endopeptidase | |
| CA1339495C (en) | A process for producing human growth hormone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |