DK171992B1 - Peptider, farmaceutiske præparater indeholdende dise peptider, anvendelse af peptiderne til fremstilling af et farmaceutisk præparat til anvendelse ved stimulering af myelopoieesesystemet hos mennesker eller dyr, fremgansmåde til fremstilling af peptiderne og forbindelser med anvendelse som mellemprodukter herved - Google Patents

Description

DK 171992 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptider med stimulerende virkning på hæmopoiesen, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, forbindelser med anvendelse som mellemprodukter herved, farmaceutiske 5 præparater indeholdende peptiderne, samt peptidernes anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat til anvendelse ved stimulering af myelopoiesesystemet hos mennesker eller dyr.

10 Knoglemarvens celler stammer fra mangesidigt poten te stamceller (stem cells) som modnes til dannelse af en kompleks population af morfologisk distinkte celler, nemlig megakaryocytter, erytrocytter, granulocytter og lymfocytter. Kun ca. 10% af stamcellerne befinder sig i celle-15 delingsfase på et givet tidspunkt. I en indledende fase af modningen bliver enhver under opformering værende stamcelle "sporet ind" til en bestemt, morfologisk distinkt form som til sidst fører til en af de ovennævnte fire modne celletyper. Efterhånden som cellerne formerer 2o sig, mister de evne til yderligere opformering og de modne celler, fx erytrocytter eller granulocytter, kan ikke længer dele sig. Eftersom der stadig dør modne celler, er det afgørende at formeringsevnen hos de mindre modne celler opretholdes, navnlig hos de stamceller som er "beregnet" 25 til myelopoiese.

Det er nu lykkedes at finde frem til en gruppe hidtil ukendte peptider som har evne til at stimulere formeringen af myelopoietiske stamceller.

Ifølge opfindelsen er der således tilvejebragt for-3Q bindeiser med den almene formel A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO). -(NH-CH-CO)-B I a i b i

(CH ) (CH,) CH0 I

I ^ n i 2 m I 2 COR COR' S-- 2 35 2 DK 171992 B1 hvor alle aminosyreenhederne er i L-konfiguration, A betegner NH-CH-CO-, NH-CH-CO-, NH^-CH-CO- 5 XJ U <{H2»2 0 CONH2 eller et hydrogenatom, B betegner -NH-CH-COR" , -NH-CH-CO-R" (CH2)4 (ch2)3

NH0 NH

2 I

HN NH2 15 eller en hydroxygruppe, n og m uafhængigt af hinanden hver betegner tallet 1 eller 2; a og b uafhængigt af hinanden hver betegner tallet 0 eller 1; R, R' og R" uafhængigt af hinanden hver betegner en hydroxygruppe eller en aminogruppe, 2Q samt fysiologisk acceptable salte deraf, dog således at hvis A og B henholdsvis er et hydrogenatom og en hydroxygruppe, så kan b ikke være tallet 0.

Forbindelserne med formlen I er således symmetriske dimerer.

__ Når A betegner en glutaminrest eller en prolinrest, 25 foretrækkes det at a=b=1, n=2, m=1, R og R' betegner hy-droxygrupper og B betegner en lysinrest.

Når B er en argininrest, foretrækkes det at A er en pyroglutamatrest, a=b=1, n=2 og m=1, og at R og R' be-tegner hydroxygrupper.

En foretrukken gruppe forbindelser er dem i hvilke b=1, m=1 og R, R' og R" er hydroxygrupper.

Særlig foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er som følger (idet der bruges den konventionelle biokemi-ske notation for aminosyrerne og der læses fra N-terminalen) : 3 DK 171992 B1 (Cys - Lys)2 f (Asp - Cys - Lys)2» (Glu - Asp - Cys - Lys)2, 5 (pGlu - Glu - Asp - Cys)2, (pGlu - Asp - Cys - Lys)2, (pGlu - Asp - Asp - Cys - Lys>2, (pGlu - Glu - Asp - Cys - Arg>2, (Gin - Glu - Asp - Cys - Lys)2 og 10 (Pro - Glu - Asp - Cys - Lys)2

En yderligere særlig foretrukken forbindelse er (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2» dvs. den forbindelse hvor a=b=1, m=1, n=2, R og R1 er hydroxygrupper, A er en pyroglutamat-15 rest og B er en lysinrest.

Fysiologisk acceptable salte af peptiderne ifølge opfindelsen indbefatter syreadditionssalte som fx hydro-klorider, hydrobromider, sulfater, såvel som salte med baser såsom alkalimetalsalte, fx natrium- eller kaliumsal-20 te, jordalkalimetalsalte som fx kalciumsalte og aminsalte.

Nogle af forbindelserne med formel I er dimerer af forbindelser som er beskrevet i EP 0 112 656 A2. Denne ansøgning angår en lille gruppe hæmoregulerende peptider med inhiberende virkning på granulopoiesen.

25 På grund af de meget små mængder naturlig granulopoie- se-faktor som er til rådighed, er strukturen af det naturlige stof aldrig blevet bestemt. Det er aldrig blevet vundet i krystallinsk eller fuldstændig ren form, og det vides ikke om dette ville kunne lade sig gøre under anven-30 delse af materiale fra kun naturlige kilder. Det er blevet postuleret at stoffet har strukturen pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, men som det er anført i ovennævnte europæiske patentansøgning viste den syntetiske forbindelse med denne struktur sig at være inaktiv. Det 35 er blevet konstateret at der er produceret en forbindelse med stimulatorisk virkning når den naturlige granulopoie- 4 DK 171992 B1 se-inhiberingsfaktor underkastes oxiderende betingelser. Dette produkt er imidlertid heller aldrig blevet isoleret eller identificeret. I modsætning hertil kan peptiderne ifølge opfindelsen vindes i ren form som egner sig til far-5 maceutisk anvendelse og kan vindes i forholdsvis store mængder.

Det er også blevet rapporteret (Exp. Hematol. J_2 7 (1984)) at når man underkaster et af de peptider der er angivet i ovennævnte europæiske patentansøgning, nemlig 10 pyroGlu-Glu-Asp-Cys-LysOH, frysning og optøning, udviser den stimulatorisk aktivitet som kan reverseres ved behandling med merkaptoætanol. Det stimulatoriske produkt blev imidlertid aldrig vundet i ren form, og dets struktur blev aldrig bestemt.

15 De her omhandlede, hidtil ukendte forbindelser i kemisk ren form er blevet afprøvet for hæmoregulatorisk virkning in vitro og in vivo. Undersøgelser in vitro både af humane og muse-myelopoietiske stamceller har udvist forøgelser med hensyn til agarkolonidannelse på op til 20 1500%. Den stimulatoriske virkning optræder i koncentra- tionsområdet 10 til 10 M. Ved undersøgelser in vivo på mus har det vist sig at en enkelt injektion kan forøge antallet af myelopoietiske stamceller med 50% i løbet af 49 timer, og ved kontinuerlig infusion blev antallet af 25 stamceller fordoblet i løbet af 13 dage.

Opfindelsen er i særlig grad egnet til anvendelse til stimulering af myelopoiese hos patienter der lider af nedsat myelopoietisk aktivitet, herunder knoglemarvsbeskadigelser, agranulocytose og aplastisk anæmi. Dette indbe-30 fatter behandling af patienter med nedsat knoglemarvsfunktion på grund af immunosuppressiv behandling for at undertrykke vævsreaktioner, fx ved kirurgisk knoglemarvstransplantation .

Forbindelserne kan også bruges til at fremme en 35 hurtigere regeneration af knoglemarven efter cytostatisk kemoterapi og strålingsbehandling mod neoplastiske og vi- 5 DK 171992 B1 rusfremkaldte sygdomme.

Desuden kan disse nye forbindelser være af særlig værdi i tilfælde hvor patienter har alvorlige infektioner på grund af mangel på immunreaktion som følge af knogle-5 marvssvigt.

En anden klinisk anvendelse vil være i kombination med de tilsvarende monomerer eller beslægtede myelopoiese-inhibitorer som angivet i ovennævnte europæiske patentskrift for at fremkalde alternerende toppe af høj og lav 10 aktivitet i knoglemarvsceller og dermed forøgelse af hæmo-poiesens naturlige døgnrytme. På denne måde kan man give cyto-statisk behandling i perioder med lav knoglemarvsaktivitet og dermed nedsætte risikoen for beskadigelser af knoglemarven, mens regenerationen vil blive fremmet ved den efter-15 følgende aktivitetstop.

Det skal bemærkes at der ikke er nogen stimulatorisk virkning på cellerne i andre væv og specielt på svulstceller som har relation til ikke-myelopoietisk væv. De foreliggende nye forbindelser stimulerer således det myelopoieti-2Q ske system selektivt.

Opfindelsen angår således ligeledes anvendelsen af en forbindelse ifølge opfindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat til anvendelse ved stimulering af myelopoiesesystemet hos mennesker eller dyr.

25 Peptiderne har ikke nogen signifikant toxicitet.

Desuden er alle iagttagne hæmatologiske virkninger reversible og der blev ikke iagttaget nogen makroskopiske ændringer i andre organer hos de dyr hvori peptiderne blev injiceret.

30 I almindelighed kan peptiderne ifølge opfindelsen med henblik på at udøve stimulatorisk Virkning indgives i mennesker ved injektion i dosisområdet 0,1-10 mg, fx 1-5 mg pr. 70 kg legemsvægt om dagen. Hvis de indgives ved infusion eller ved lignende teknik kan dosis være i områ-35 det 30-300 mg pr. 70 kg legemsvægt, fx ca. 100 mg, i løbet af 6 dage. Det er i princippet ønskeligt at fremkalde en 6 DK 171992 B1 _ i 3 _c koncentration af peptidet på ca. 10 M til 10 Mi patientens extracellulære væsker.

Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater der son virksom bestanddel indeholder en eller flere forbindelser 5 med den almene formel I som defineret foran eller fysiologisk kompatible salte deraf, sammen med en farmaceutisk bærer eller excipient. Præparaterne ifølge opfindelsen kan fx oparbejdes til en form som egner sig til oral, nasal, parenteral eller rektal indgift.

10 Med betegnelsen "farmaceutisk" sigtes der i nærvæ rende beskrivelse også til veterinærmedicinske anvendelser.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan foreligge i konventionelle farmakologiske indgiftformer såsom tabletter, overtrukne tabletter, næsesprøjtepræparater, opløs-15 ninger, emulsioner, pulvere, kapsler eller former med langvarig frigivelse af det virksomme stof. Der kan bruges konventionelle farmaceutiske excipienter såvel som de sædvanlige produktionsmetoder til fremstilling af disse former. Tabletter kan fx fremstilles ved at man blander den 20 eller de virksomme bestanddele med kendte excipienter som fx med fortyndingsmidler såsom kalciumkarbonat, kalciumfosfat eller laktose, desintegreringsmidler såsom majsstivelse eller alginsyre, bindemidler såsom stivelse eller gelatine, smøremidler såsom magnesiumstearat eller talkum 25 og/eller midler til sikring af forsinket frigivelse såsom karboxypolymetylen, karboxymetylcellulose, celluloseacetat-ftalat eller polyvinylacetat.

Om ønsket kan tabletterne bestå af flere lag. Overtrukne tabletter kan fremstilles ved at man overtrækker 30 tabletkerner, fremstillet på lignende måde som tabletter, med midler der anvendes sædvanligt til tabletovertræk, fx polyvinylpyrrolidon eller shellak, gummiarabicum, talkum, titandioxid eller sukker. For at opnå forsinket frigivelse eller for at undgå uforenelighedsproblemer kan kernen også 35 bestå af flere lag. Tabletovertrækket kan også bestå af flere lag for at opnå forsinket frigivelse, i hvilket til- 7 DK 171992 B1 fælde man kan bruge de excipienter som er nævnt ovenfor til tabletter.

Der kan også bruges organspecifikke bæresystemer.

5 Injektionsopløsninger kan fx fremstilles på konven tionel måde som fx ved tilsætning af konserveringsmidler såsom p-hydroxybenzoat, eller stabilisatorer såsom EDTA. Opløsningerne fyldes derefter i injektionsglas eller ampuller .

20 Næsesprøjtepræparater kan formuleres på lignende måde i vandig opløsning og pakkes i sprøjtebeholdere enten med et aerosol-drivmiddel eller forsynet med midler til manuel kompression. Kapsler indeholdende et eller flere virksomme stoffer kan fx fremstilles ved at man blander 25 de virksomme bestanddele med inerte bærestoffer såsom lak-tose eller sorbitol og fylder blandingen i gelatinekapsler.

Egnede suppositorier kan fx fremstilles ved blanding af det virksomme stof eller aktive stofkombinationer med konventionelle bærestoffer egnet til dette formål, så-20 som naturlige fedtstoffer eller polyætylenglykol eller derivater deraf.

Dosisenheder indeholdende forbindelserne ifølge opfindelsen indeholder fortrinsvis 0,1-10 mg, fx 1-5 mg af et peptid med formlen I eller et salt deraf.

25 Den foreliggende opfindelse muliggør en fremgangs måde til stimulering af myelopoiese, der består i at man indgiver en effektiv mængde af et farmaceutisk præparat som defineret foran til et individ.

En anden hovedanvendelse af de nye peptider består 30 imidlertid af produktion af materiale til immunologiske prøveteknikker. Peptidet kan herved bindes covalent til et passende højmolekylært bærestof såsom albumin, polyly-sin eller polyprolin med henblik på at blive injiceret i antistofproducerende dyr (fx kaniner, marsvin eller geder). 3^ Der kan også bruges in vitro-immuniseringsteknikker. An- 8 DK 171992 B1 tisera med høj specificitet opnås ved anvendelse af velkendte absorptionsteknikker under anvendelse af det højmoleky-

Λ A

lære bærestof. Ved at indføre radioaktivitet ( "h, 4C, 35 S) i peptidmolekylet kan der let udformes en radioim-5 munprøve og den kan bruges til bestemmelse i forskellige biologiske væsker såsom serum (plasma), urin og cerebrospi-nalvæsken.

Peptiderne ifølge opfindelsen kan syntetiseres på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde. I almindelighed lo vil de tilstedeværende reaktive sidekædegrupper (amino, tiol og/eller karboxyl) være beskyttet under de koblingsreaktioner som indgår i totalsyntesen, og sluttrinnet vil så bestå i fjernelse af beskyttelsesgrupper på et beskyttet derivat med formel I. Normalt vil alle COOH-grupper, 15 Nl^-grupper og NH-gruppen i en pyroglutamylrest eller pro-linrest være beskyttet.

Et yderligere træk ved opfindelsen udgøres således af en fremgangsmåde til fremstilling af et peptid ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejen-20 dommelig ved, at man fjerner beskyttelsesgrupper fra en forbindelse med den almene formel

A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO). -(NH-CH-CO)-B I a I o I

(CH-) (CH^) CH0

25 i 2 η I 2 m | 2 II

COR1 COR2 S--2 hvor A betegner R3N-CH-C0-, R4N-CH-CO- , R5NH-CH-CO- 30 JJ U <Ίν2

O CONHR

et hydrogenatom eller en aminbeskyttelsesgruppe; B betegner 35 DK 171992 Bl 9 -NH-CH-COR8 , -NH-CH-COR10 (ch2)4 <{h2)3 NHR7

5 C

r\ 9

HN NHR

en hydroxygruppe eller en karboxy1blokerende gruppe; n og m uafhængigt af hinanden betegner et af talle-10 ne 1 og 2; a og b uafhængigt af hinanden betegner et af tallene 0 og 1; 12 8 10 R , R , R og R er aminogrupper, hydroxygrupper, beskyttede aminogrupper eller karboxylbeskyttelsesgrup-15 per; R^, R^, R8, R8, R7 og R^ er hydrogenatomer eller aminbeskyttende grupper; dog således at når A er et hydrogenatom eller en aminbeskyttende gruppe og B en hydroxygruppe eller en karbo-20 xylbeskyttelsesgruppe, så kan b ikke være tallet 0.

Generelt kan de beskyttede derivater med formel II fremstilles ved teknikker der egner sig til peptidsyntese.

En mulig vej udnytter cystin og kobler denne til de resterende aminosyrerester således at der samles to iden-25 tiske kæder af dimeren, som derpå samles og bindes til hinanden via den disulfidbinding der allerede er til stede i cystin. En anden fremgangsmåde består i at syntetisere den tilsvarende monomere forbindelse i S-beskyttet form under anvendelse af S-beskyttet cystein, at fjerne S-be-30 skyttelsesgruppen og udføre dimerisering. Det er muligt at bruge S-beskyttende grupper som kan fjernes ved hjælp af oxidationsmidler der tilvejebringer en disulfidbinding direkte i et beskyttelsesfjernelsestrin; således kan fx tritylgrupper fjernes selektivt ved hjælp af jod, for-35 trinsvis i et passende opløsningsmiddel såsom dimetylform- DK 171992 Bl 10 amid; en sådan dimerisering kan gennemføres på den C- og N-beskyttede monomer, efterfulgt af fjernelse af C- og N-beskyttelsesgrupperne, eller kan ifølge opfindelsen gennemføres på en monomer med formel III 5 A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO), -(NH-CH-CO)-B I a i b i

(CH~) (CH0) (CH0) III

I 2 n T 2 m I 2 COR COR' SR" 10 hvor A, B, n, m, a, b, R og R' har de ovenfor angivne betydninger og R" er et hydrogenatom eller en tiolbeskyttel-sesgruppe som kan fjernes under oxiderende betingelser.

Ved opbygning af peptidkæderne kan man i principis pet begynde enten med C-terminalen eller med N-terminalen, men fremgangsmåden med at begynde med C-terminalen er i almindelig brug.

Man kan således begynde ved C-enden ved reaktion med et passende beskyttet derivat af fx lysin med et pas-20 sende beskyttet derivat af cystein eller cystin. Lysinde-rivatet vil indeholdende en fri α-aminogruppe, mens den anden reaktant vil have enten en fri eller en aktiveret karboxylgruppe og en beskyttet aminogruppe. Efter koblingen kan mellemproduktet renses, fx ved kromatografering, og 25 derefter kan N-beskyttelsesgruppen fjernes selektivt for at muliggøre tilføjelse af en yderligere aminosyrerest. Denne fremgangsmåde fortsættes indtil den ønskede amino-syresekvens er fuldstændig.

Karboxylsyreaktiverende substituenter som fx kan 30 anvendes, indbefatter symmetriske og blandede anhydrider og aktiverede estere som fx p-nitrofenylesteren, 2,4,5-triklorfenylesteren, N-hydroxybenzotriazolesteren (OBt) eller N-hydroxysuccinimidylesteren (OSu).

Sammenkoblingen af frie amino- og karboxylgrupper 35 kan fx gennemføres ved hjælp af dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Et andet koblingsmiddel som fx kan anvendes er N- 11 DK 171992 B1 ætoxykarbonyl-2-ætoxy-1,2-dihydroquinolin.

I almindelighed er det hensigtsmæssigt at gennemføre koblingsreaktionen ved lave temperaturer, fx fra -20°C op til omgivelsernes temperatur, hensigtsmæssigt i 5 et passende opløsningsmiddelsystem som fx tetrahydrofuran, dioxan, dimetylformamid, metylenklorid eller en blanding af disse opløsningsmidler.

Det kan være mere hensigtsmæssigt at gennemføre syntesen på en fastfaseharpiks-bærer. En nyttig type bærer er klormetyleret polystyren (tværbundet med 1% divinylben-zen); i dette tilfælde vil syntesen begynde med C-termina-len, fx ved kobling af N-beskyttet lysin til bæreren.

Et antal egnede fastfaseteknikker er beskrevet af Eric Atherton, Christopher J. Logah og Robert C. Sheppard, J. Chem.Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S.

15

Tjoeng og R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102 6117-6127 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi og R.B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Res. Jj>, 412-425 (1980); Manfred Mutter og Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta, 67, 2009-2016 (1984).

20

Der kendes mange forskellige beskyttelsesgrupper for aminosyrer og de er eksemplificeret i E. Schroder og K. Lvibke, The Peptides, bind 1 og 2, Academic Press, New York og London,, 1965 og 1966; G.R. Pettit, Synthetic Peptides, bind 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 25 1971, 1975 og 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen

Chemie, Synthese von Peptiden, bind 15, Georg Thieme Ver- lag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, bind 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 og 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang 30

Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlage Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology 1-7, red; Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Fransisco, London; Solid phase peptide synthesis, 2. udgave, John M. Stewart, Janis D. Young,

Pierce Chemical Company.

35 12 DK 171992 B1 Således indbefatter fx aminbeskyttende grupper som kan bruges sådanne beskyttelsesgrupper som karbobenzoxy (i det følgende også betegnet Z) t-butoxykarbonyl (i det følgende også betegnet Boc), 4-metoxy-2,3,6-trimetylbenzen-5 sulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoxykarbonyl (i det følgende også betegnet Fmoc). Det vil forstås at når peptidet er opbygget fra C-terminalenden, vil der være en amin- beskyttelsesgruppe til stede på α-aminogruppen i enhver nytilføjet rest, og det vil være nødvendigt fjerne den se-10 lektivt forud for det næste koblingstrin. En særlig nyttig gruppe til en sådan midlertidig aminbeskyttelse er Fmoc-gruppen, der kan fjernes selektivt ved behandling med pipe-ridin i et organisk opløsningsmiddel.

Karboxylbeskyttelsesgrupper der fx kan anvendes 15 indbefatter let fraspaltelige estergrupper såsom benzyl (Bzl), p-nitrobenzyl (ONb), pentaklorfenyl (OPC1P), penta-fluorfenyl (OPFP) eller t-butyl (OtBu) såvel som koblingsgrupperne på faste bærere, fx metylgrupper bundet til polystyren.

20 Tiolbeskyttelsesgrupper er bl.a. p-metoxybenzyl (Mob), trityl (Trt) og acetamidometyl (Acm).

Det vil forstås at der eksisterer en lang række andre sådanne grupper som fx detaljeret omtalt i ovennævnte litteraturreferencer, og anvendelse af alle sådanne 25 grupper i de foran beskrevne processer ligger inden for opfindelsens rammer.

Der eksisterer en lang række forskellige fremgangsmåder til fjernelse af amin- og karboxylbeskyttelsesgrupper. De anvendte metoder må stemme med den anvendte synte-30 sestrategi. Beskyttelsesgrupperne for sidekæder må være stabile under de betingelser der bruges til at fjerne de midlertidige α-aminobeskyttelsesgrupper før det næste koblingstrin.

35 13 DK 171992 B1 Sådanne aminbeskyttelsesgrupper som Boc og karboxyl-beskyttende grupper såsom tBu kan fjernes samtidig ved syrebehandling, fx med trifluoreddikesyre. Tiolbeskyttelses-grupperne såsom Trt kan fjernes selektivt ved hjælp af et 5 oxidationsmiddel såsom jod.

Opfindelsen angår også de beskyttede former af peptiderne med den almene formel II' som er defineret i krav 8.

De følgende eksempler tjener blot til belysning.

10 Opløsningsmidler var redestillerede ud fra kommer cielt materiale og opbevaret på følgende måde: dimetylformamid (DMF) over molekylsigtemateriale 4A, diklormetan (DCM) over CaC^r triætylamin (TEA) over en Na/Pb-lege-ring (Baker) og trifluoreddikesyre (TFA) over molekylsig-15 temateriale 4A.

TLC-systemer var som følger: S,: Silika/CHC13: MeOH (98:2) S2: Silika/CHC13*. MeOH (95:5) S3: Silika RP 8/0,1% TFA i 5% EtOH (vandig).

20 De rensede slutprodukter blev analyseret ved revers- fase-højtydende væskekromatografering (HPLC). HPLC-syste-met bestod af en HP 1090M kromatograf med indbygget selvvirkende prøvetager og en HP 1040 diode-opstilling (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG), og en supelcosil LC-18 kolonne 25 (250 x 4,6 mm, 5μ store partikler).

Prøverne blev opløst i 0,1 rumfangs% vandig TFA og elueret med en lineær gradient fra 0 til 30% acetonitril i 0,1%s TFA (vandig). Strømningshastigheden var 2 ml/min. Eluenten blev overvåget ved 214 nm med en båndbredde på 30 4nm. Opløsningsmiddel-kromatogrammet blev elektronisk fratrukket og resultaterne fremkom udtrykt som arealprocent.

Aminosyreanalyse:

De cystinholdige peptider blev oxideret med permyre-35 syre for at omdanne den syrelabile cystinrest til den syre- 14 DK 171992 B1 stabile cysteinsyre før syrehydrolyse i 6M HC1 ved 110°C i 16 timer. De tørre hydrolysater blev derefter derivati-seret ved hjælp af fenylisotiocyanat og analyseret som beskrevet af Heinrikson (Anal. Bioch. 136, 65-74, 1984).

5

Eksempel 1 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)^ 1) (Fmoc-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2 10 2 g (2,275 mM) (Fmoc-Cys-OSu)^> 2,18 g (5,0 mM)

Lys(Νε-Boc)-OtBu.HCl og 0,58 g (5 mM) N-ætylmorfolin opløstes i 7,5 ml DMF og omrørtes ved stuetemperatur i 3 timer. Reaktionsblandingen inddampedes til tørhed under ned-.j 2 sat tryk. Remanensen opløstes i 50 ml CHCl^ og vaskedes med 3 x 12 ml 0,1N HC1 og 3 x 12 ml 1M NaCl. Det organiske lag filtreredes gennem et faseadskillelsesfiltrerpapir (Whatman) og inddampedes til tørhed under nedsat tryk.

Råproduktet, 3,32 g, omkrystalliseredes fra 5 ml 2q varm metanol (15 timer), filtreredes, vaskedes med metanol og æter og lufttørredes. Udbytte 1,75 g (61%). Det hvide faste stof udviste én hovedplet ^UV254+' C^/dikarboxi-din+, ninhydrin*) på TLC (S^: Rf = 0,667, S2: Rf = 0,829).

25 2) (Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2 1,5 g (1,19 mM) af forbindelse (1) opløstes i 10 ml 20%s piperidin i DMF og omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter. TLC (S2) viste at alt udgangsmaterialet var forbrugt og at der kun var dannet ét nyt produkt (UV9t.. + , 30 C^/dikarboxidint, ninhydrint). Opløsningsmidlet afdampe- des under nedsat tryk. Remanensen opløstes i 20 ml æter og vaskedes med 2 x 3 ml 0,1N HC1 og 3 ml 1M NaHCO^. Det organiske lag filtreredes gennem et faseadskillelses-fil- trerpapir og inddampedes til tørhed. Udbytte 1,2 g. TLC 35 viste kun en ninhydrin-positiv komponent (s Rf=0,216).

15 DK 171992 B1 3) (Fmoc-Asp(0-OtBu)-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2

Ca. 1,19 mM af forbindelse (2) og 1,32 g (2,6 mM) Fmoc-Asp(0-OtBu)-OSu opløstes i 6 ml CH2C12 og omrystedes j. ved stuetemperatur i 2 timer. TLC (S^) viste at alt nin-hydrin-positivt materiale var forbrugt og at der var blevet dannet ét nyt UV^^-positivt hovedprodukt. Remanensen efter inddampning opløstes i 30 ml ætylacetat, vaskedes med 4 x 10 ml 1M NaCl, filtreredes og inddampedes som be-1 g skrevet for (1). Råprodukt opløstes i 2,5 ml æter og udfældedes som et halvkrystallinsk fast stof ved tilsætning af 4 ml n-hexan (køleskab i 16 timer). Opløsningsmidlet dekanteredes og produktet vaskedes med 5 ml n-hexan og tørredes under nedsat tryk. Udbytte 1,272 g (67%). TLC viste én ho-1 g vedplet (UV254+' Clj/dikarboxidint, ninhydrin*; : Rf= 0,333, S2: Rf=0,658).

4) (Asp(0-OtBu)-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2 1,0 g (0,62 mM) af forbindelsen (3) opløstes i 5 20 ml 20%s piperidin i CH2C12 og behandledes som beskrevet for (2). Udbytte 0,469 g (65%). TLC udviste kun én ninhy-drin-positiv plet (S2: Rf=0,22).

5) (Fmoc-Glu(γ-OtBu)-Asp(0-OtBu)-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)0 25 ---------------------------------------------------é.

0,469 g (0,407 mM) af forbindelsen (4) og 0,47 g (0,90 mM)

Fmoc-Glu(γ-OtBu)-0Su opløstes i 5 ml CH2C12 og omrørtes ved stuetemperatur i 15 timer. Oparbejdningsprocessen var som for (3). Udbytte 0,62 g (77%). TLC udviste kun en ho- 30 vedplet (UV254+' cl2//<^:'-karboxidin+, ninhydrin*, : Rf= 0,312, S2: Rf=0,536).

6) (Glu (γ-OtBu)-Asp(0-OtBu)-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2 35 0,50 g (0,25 mM) af forbindelsen (5) opløstes i 2,5 ml 20%s piperidin i CH2C12 og behandledes som beskrevet for (2).

16 DK 171992 B1 TLC udviste kun én ninhydrin-positiv plet (S2:

Rf=0,154).

7) (pGlu-Glu(y-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Νε-Boc)-OtBu)2 5

Ca. 0,25 mM af forbindelsen (6) og 0,206 g (0,546 mM) pGlu-OPCIP opløstes i 2,5 ml DMF og omrørtes ved stuetemperatur i 15 timer. Oparbejdningen skete som beskrevet under (3). Udbytte: 0,259 g (59%). TLC udviste kun én 1q plet, UV254+' ninhydrin* og Cl2/dikarboxidin+ (S2: Rf= 0,117) og kun spor af urenheder.

8) (p-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys)2 0,110 g (0,063 mM) af forbindelsen (7) opløstes i 5 ml 80%s TFA (CH2C12) og omrørtes ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningsmidlet afdampedes og remanensen opløstes i 4 ml H20 + 2 ml CHCl^· Den vandige fase vaskedes med 2 x 3 ml CHCl^ og inddampedes til tørhed under nedsat ^ (g) tryk. Råproduktet, 0,050 g, rensedes på en "Lobar(A) 20

Rp 8 kolonne (Merck) og elueredes med 0,1% TFA i 7,5%s vandig ætanol. Efter frysetørring af produktet blev det gen-kromatograferet på samme kolonne og elueret med 0,1% TFA i 5%s vandig ætanol. Produktet frysetørredes. Udbytte 0,016 g. Produktet, der havde ninhydrint, Cl-/dikarboxi-25 ^ din+ og UV254*' var homogent bedømt ved TLC, S^: Rf=0,436, og der opdagedes kun spor af urenheder ved HPLC.

Aminosyreanalyse: Asp 1,02, Glu 1,91, Cys 1,08,

Lys 0,93.

30

Eksempel 2 9) (Cys-Lys)2

Forbindelsen (2) fra eksempel 1 opløstes i TFA og omrørtes ved stuetemperatur i 40 minutter. Opløsningsmid-35 ,0 let afdampedes under nedsat tryk (30 C) og den vandoplø- (S) selige del af remanensen kromatograferedes på en "Lobar,wy 17 DK 171992 B1 (B) RP8 kolonne (Merck) under anvendelse af 0,1% TFA (vandig) i 5%s vandig ætanol som mobil fase. Kolonnen overvågedes ved UV22Q· Fraktioner som indeholdt det rene produkt (bedømt ved TLC) blev forenet og frysetørret. Produktet 5 var homogent ifølge TLC (S^: RF=0,57) og udviste positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254. HPLC-analyse: 93,5% rent ifølge arealbestemmelse. Aminosyreana-lyse: Cys 1,01, Lys 0,99.

10 Eksempel 3 10) (Asp-Cys-Lys)2

Forbindelsen (4) behandlet som beskrevet i eksempel 2 (2% ætanol i mobil fase) førte til forbindelsen (10). 15 Produktet var homogent bedømt ved TLC (S^: Rf = 0,64) og udviste positiv reaktion ved ninhydrin og ingen absorption ved UV254* HPLC-analyse: 97,9% ren ifølge arealet. Amino-syreanalyse: Asp 0,99, Cys 1,03, Lys 0,98.

20 Eksempel 4 11) (Glu-Asp-Cys-Lys)2

Forbindelsen (6) behandlet som beskrevet i eksempel 2 førte til forbindelse (11). Produktet var homogent ifølge 25 TLC (S^: Rf = 0,83) og udviste positiv reaktion med ninhydrin og ikke nogen absorption ved UV254* HPLC-analyse: 100% ren ifølge arealet. Aminosyreanalyse: Asp 1,08, Cys 0,97, Glu 0,98, Lys 0,98.

30 eksempel 5 12) (pGlu-Glu-Asp-Cys)2

Forbindelse (12) syntetiseredes som monomer ved peptidsyntese i fastfase med kontinuerlig strømning under 35 anvendelse af et "Biolynx" 4170 automatiseret peptid-synte-seapparat (LKB) og DMF som opløsningsmiddel.

18 DK 171992 B1

Reagenser: FMOC-Cys(Trt)-SASRIN-harpiks (Bachem); Fmoc-Asp(0-OtBu)-OPFP; FMOC-Glu(y-OtBu)-OPFP; pGlu-OPCLP; HOBT som katalysator. FMOC fjernedes efter hvert koblingstrin ved hjælp af 20% piperidin i DMF. Disulfidbroen og 5 dermed dimeren blev etableret ved behandling af det fuldt beskyttede peptid på den faste bærer med 0,1M jod (2-3 ækvivalenter) i DMF i 15 minutter. Efter vask med DMF blev peptidet skilt fra den faste bærer og tilbageværende beskyttelsesgrupper fjernet i ét trin ved behandling med 50% TFA i CHC13 10 i 40 minutter. Harpiksen frafiltreredes og filtratet inddampedes til tørhed under nedsat tryk (30°C). Remanensen opløstes i 0,1%s vandig TFA og kromatograferedes på en "Lobar"® (B) RP8-kolonne under anvendelse af 0,1%s vandig TFA i 4%s propan-2-ol som mobil fase. Kolonnen overvågedes 15 ved UV22Q· Fraktioner indeholdende det rene produkt (bestemt ved HPLC) forenedes og frysetørredes. Produktet udviste ikke nogen reaktion ved ninhydrid og ingen absorption ved UV254' HPLC-analyse: 96,9% rent ifølge arealet. Amino-syreanalyse: 1,15, Cys 0,99, Glu 1,85.

20

Eksempel 6 13) (pGlu-Glu-Cys-Lys)2

Forbindelse (13) syntetiseredes og rensedes som be-25 skrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederi-vater. Reagenser der ikke er beskrevet tidligere: FMOC-Lys(Ne-BOC)-SASRIN-harpiks; FMOC-Cys(S-Trt)-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,49) og udviste positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254* 30 HPLC-analyse: 100% rent ifølge arealet. Aminosyreana- lyse: Cys 1,01, Glu 1,98, Lys 1,01.

Eksempel 7 5 14) (pGlu-Asp-Cys-Lys)2

Forbindelse 14 blev syntetiseret og renset som beskrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederi- 19 DK 171992 B1 vater. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,55) og gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254.

HPLC-analyse: 97,5% rent ifølge arealet. Aminosyre-analyse: Asp 1,04, Cys 0,96, Glu 0,97, Lys 1,02.

Eksempel 8 15) (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 10 Forbindelsen (15) syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrede-rivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,42) og gav positiv reaktion med ninhydrid og ingen absorption ved UV254.

1b HPLC-analyse: 99,3% rent, ifølge arealet. Amino- syreanalyse: Asp 1,03, Cys 0,96, Glu 2,09, Lys 0,94.

Eksempel 9 20 16) (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2

Forbindelse (16) syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederiva-ter. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,38) og udviste positiv reaktion ved ninhydrin og ingen absorption 25 ved UV254' HPLC-analyse: 100% rent ifølge arealet. Amino-syreanalyse: Asp 2,06, Cys 0,98, Glu 0,98, Lys 0,98.

Eksempel 10 30 17) (pGlu-Glu-Cys-Lys)2

Forbindelse 17 syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederi-vater. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,39) og gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved 35 nv uv254 * HPLC-analyse: 99,9% rent ifølge arealet. Aminosyre-analyse: Cys 0,95, Glu 2,90, Lys 1,15.

20 DK 171992 B1

Eksempel 11 18) (pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)2

Forbindelse (18) syntetiseredes og rensedes som be-5 skrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederi-vater. Reagenser som ikke er beskrevet tidligere: FMOC-Asn-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,42) og gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254.

10 HPLC-analyse: 98,2% ifølge arealet. Aminosyreana- lyse: Asx 1,1, Cys 1,03, Glu 1,9, Lys 0,96.

Eksempel 12 ._ 19) (pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)0 1 5 _£

Forbindelse (19) syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 ud fra de tilsvarende aminosyrederi-vater. Reagenser som ikke er beskrevet tidligere: FMOC-Gln-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,45) 20 og gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254.

HPLC-analyse: 98,3% rent ifølge arealet. Aminosyre-analyse: Asp 1,09, Cys 1,06, Glx 1,89, Lys 0,96.

25 Eksempel 13 20) (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2

Forbindelse (20) syntetiseredes og rensedes (5% propan-2-ol i mobil fase) som beskrevet i eksempel 5 ud 30 fra de relevante aminosyrederivater. Den sluttelige fjernelse af beskyttelsesgrupper udførtes i 10% tioanisol i TFA.

Reagenser som ikke er beskrevet tidligere: FMOC-Arg(Mtr)-SASRIN-harpiks.

35 Produktet gav ingen reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254* DK 171992 B1 21 HPLC-analyse: 99,4% rent ved arealbestemmelse. Amino-syreanalyse: Arg 0,92, Asp 1,12, Cys 1,00, Glu 1,96.

Eksempel 14 5 21) (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2

Forbindelse (21) syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 ud fra de relevante aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S^: Rf=0,57) og 10 gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254* HPLC-analyse: 94,7% rent ved arealbestemmelse. Ami-nosyreanalyse: Asp 1,00, Cys 1,01, Glx 2,02, Lys 0,96.

15 Eksempel 15 22) (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2

Forbindelse (22) syntetiseredes og rensedes som beskrevet i eksempel 5 under anvendelse af de relevante ami-20 nosyrederivater. Produktet var rent ifølge TLC (S^: Rf= 0,57) og gav positiv reaktion med ninhydrin og ingen absorption ved UV254* HPLC-analyse: 98,2% rent ifølge arealbestemmelse. Aminosyreanalyse: Asp 1,06, Cys 1,01, Glu 0,99, Lys 0,99, 25 Pro 0,96.

30 35 22 DK 171992 B1

Bestemmelse af stimulatorisk virkning In vitro test

Nedennævnte peptider ifølge opfindelsen opløstes fra

5 krystallinsk materiale i 0/9% saltvand og sattes til C3H

museknoglemarvsoeller suspenderet i Eagle-Dulbecco's medium med 10% serum fra nyfødte kalve. Efter præinkubation i 1 time udpladedes cellerne i agar, og kolonierne taltes efter 7 dage i overensstemmelse med tidligere standardisering af 10 metoden. Rekombinant GM-CSF (Immunex) anvendtes til at give en kolonitælling af størrelsesordenen 30 til 100 kolonier pr. 35 mm plade. Som standard var koncentrationerne af -5 -15 peptid ved præinkubation 10 til 10 M, 5 plader pr. punkt.

15 GM-CFS - granulocyt-monocyt kolonistimulerende faktor

Resultater

Resultaterne er anført som "maks. effekt" og "kone.", der betyder, at det testede peptid havde sin maksimale 20 virkning (i %) ved den anførte koncentration (i molære enheder, M).

Peptid: Maks. effekt: Kone.: (p-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys)2 165% 10 ^ 25 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 118% 10”^ (p-Glu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 124% 10-^ (Asp-Cys-Lys)2 140% 10 ^ (Cys-Lys)2 145% 10 ^

Resultaterne viser, at dipeptid-, tripeptid- og pentapeptiddimererne har stimulatorisk virkning i in vitro test systemet.

Claims (16)

1. Peptider, kendetegnet ved, at de har den almene formel 5 p A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO).-(NH-CH-CO)-B I a I b j (CH,) (CH-) CH, I I 2 n i 2 m I 2 COR COR’ S-- _ J 2 10 hvor alle aminosyreenheder er i L-konfiguration, hvor A betegner 15 NH-CH-CO-, NH-CH-CO-, NH,-CH-CO- QXJ U <?H2>2

0 CONH2 20 eller et hydrogenatom; B betegner -NH-CH-COR" , -NH-CH-CO-R" 25 (fH2}4 (^H2J3 nh9 NH HN NH2 30 eller en hydroxygruppe; n og m uafhængigt af hinanden betegner tallet 1 eller 2; 35. og b uafhængigt af hinanden betegner tallet 0 eller 1; R, R' og R" uafhængigt af hinanden betegner en hydroxygruppe eller en aminogruppe; eller udgøres af fysiologisk acceptable salte deraf, DK 171992 B1 dog således at hvis A og B betegner henholdsvis et hydrogenatom og en hydroxygruppe, så kan b ikke være tallet 0.

2. Peptider ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at b betegner tallet 1, m betegner tallet 1, og R, R' og R" betegner hydroxygrupper.

3. Peptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er 10 (Cys - Lys)2, (Asp - Cys - Lys)2» (Glu - Asp - Cys - Lys)2, (pGlu - Glu - Asp - Cys)2, (pGlu - Asp - Cys - Lys)2, 15 (pGlu - Asp - Asp - Cys - Lys)2, (pGlu - Glu - Asp - Cys - Arg)2, (Gin - Glu - Asp - Cys - Lys>2 eller (Pro - Glu - Asp - Cys - kys)2 20

4. Peptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fjerner 25 beskyttelsesgrupper fra en forbindelse med den almene formel II A-(NH-CH-CO).-(NH-CH-CO). -(NH-CH-CO)-B I a 1 b 1 (CH-) (CH,) CH, —_

30 I 2 n I 2 m j 2 11 COR1 COR2 S--2 hvor A betegner 35 r3n-ch-co-, rVch-co- , r5rh-ch-co- , I J IJ <iV2, CONHR6 O DK 171992 B1 et hydrogenatom eller en aminbeskyttelsesgruppe; B betegner -NH-<j:H-COR8 , -NH-CH-COR10 5 (?H2.*4 NHR^ |b 9 HN NHRy 10 en hydroxygruppe eller en karboxylblokerende gruppe; n og m uafhængigt af hinanden betegner tallet 1 eller 2; a og b uafhængigt af hinanden betegner tallet 0 eller 1; i 2 8 10

15 R , R , R og R er aminogrupper, hydroxygrupper, beskyttede aminogrupper eller karboxylbeskyttelsesgrupper;

3. S 6 7 9 R , R , R , R , R og R er hydrogenatomer eller ami nbe s ky11e1sesgrupper; dog således, at såfremt A er et hydrogenatom eller en 20 aminbeskyttelsesgruppe og B er en hydroxygruppe eller en karboxylbeskyttelsesgruppe, så kan b ikke være tallet 0.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at fjernelse af beskyttelsesgrupper udføres ved syrehydrolyse, hydrogenolyse, ammonolyse eller en- 25 zymatisk hydrolyse.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dimeriserer en forbindelse med den almene formel III 30 A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO)(NH-CH-CO)-B (<fH2>n «rB2>m «K* 111 COR COR1 SR" 35 DK 171992 B1 hvor A, B, n, m, a, b, R og R' har de i krav l angivne betydninger, og R" er et hydrogenatom eller en tiolbe-skyttelsesgruppe, som kan fjernes under oxiderende betingelser.

8. Forbindelser med den almene formel II> A-(NH-CH-CO)(NH-CH-CO)< NH-CH-CO) -B ‘f2’" <CH2)n 4¾ ,

10 COR1 COR2 S__ L- J 2 hvor A betegner R3N-CH-CO-, R4N-CH-CO- , R5NH-CH-CO- , jo u C) CONHR® et hydrogenatom eller en aminbeskyttelsesgruppe 20 udvalgt blandt karbobenzoxy (Z), t-butoxykarbonyl (Boc), 4-metoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoxykarbonyl (Fmoc); B betegner

25 -NH-CH-COR8 , -NH-CH-COR10 (Ch2)4 (<fH2>3 NHR7 /\ g HH NHR* 30 en hydroxygruppe eller en karboxylblokerende gruppe udvalgt blandt benzyl (Bzl), p-nitrobenzyl (ONb), pentaklorfenyl (OPClP), pentafluorfenyl (OPFP) og t-butyl (OtBu) 35 DK 171992 B1 n og m uafhængigt af hinanden betegner tallet 1 eller 2; a og b uafhængigt af hinanden betegner tallet 0 eller 1; c 12 8 10

3 R , R , R og R er aminogrupper, hydroxygrupper, beskyttede aminogrupper » hvor beskyttelsesgruppen er udvalgt blandt karbobenzoxy (Z) , t-butoxykarbonyl (Boc), 4-metoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoxykarbonyl (Fmoc) , eller karboscylbeskyttelses-10 grupper udvalgt blandt benzyl (Bzl) , p-nitrobenzyl (ONb), pentaklorfenyl (0PC1P) , pentafluorfenyl (OPFP) og t-butyl (OtBu) R3, R4, R5, R6, R7 og R9 er hydrogenatomer eller aminbeskyttelsesgrupper udvalgt blandt karbobenzoxy 15 (Z), t-butoxykarbonyl (Boc), 4-metoxy-2,3,6-trimethyl-benzensulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoxykarbonyl (Fmoc) dog således, at såfremt A er et hydrogenatom eller en aminbeskyttelsesgruppe og B er en hydroxygruppe eller en 20 karboxylbeskyttelsesgruppe, så kan b ikke være tallet 0. 9. · Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som virksom bestanddel indeholder en eller flere forbindelser med den almene formel I som angivet i krav 1 eller et fysiologisk kompatibelt salt deraf, sammen 25 med en farmaceutisk bærer eller excipient.

10. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav l til fremstilling af et farmaceutisk præparat til anvendelse ved stimulering af myelopoiesesystemet hos mennesker eller dyr. 30 35