DK172382B1 - Rekombinante lymphotoxinderivater - Google Patents

Description

i DK 172382 B1

Opfindelsen angår rekombinante lymphotoxinderivater og antistoffer for disse samt nucleinsyrer, der koder for lymphotoxinderivaterne, vektorer omfattende nucleinsyrer-ne, celler transformeret med vektorerne og en fremgangs-5 måde omfattende dyrkning af cellerne til dannelse af lym-photoxinderivatet.

Lymphotoxin blev først identificeret som en biologisk faktor med anticellulær aktivitet på neoplastiske cellelinier. En aktivitet identificeret som lymphotoxin og op-10 nået ud fra ni togen-stimulerede lymphocytter er forbundet med et spektrum af cytotoxiske aktiviteter varierende fra cytostase af visse tumorcellelinier til udpræget cytolyse af andre transformerede celler. Imidlertid er lymphotoxin- aktivitet karakteriseret ved ringe eller ingen an-15 ticellulær aktivitet på afprøvede primære cellekulturer og normale cellelinier. Denne formodede skelnende anti-cellulære egenskab hos lymphotoxin førte til in vivo undersøgelser, som tyder på, at lymphotoxin kan have kraftig antitumor-aktivitet.

20 Lymphotoxin er den betegnelse, der anvendes om, hvad der er blevet beskrevet som en familie af molekyler. Lympho-toxin-molekyler er blevet identificeret som glycoprotei-ner delt i 5 molekylvægtklasser, som hver på sin side er heterogen med hensyn til ladning. De humane a-(molekyl-25 vægt 70000 - 90000) og β-(molekylvægt 25000 - 50000) klasser viser sig at have overvægt i de fleste lymphocyt-supernatanter. α-molekylvægt-klassen kan adskilles efter ladning i mindst 7 underklasser, medens β-molekylvægt-klassen er blevet adskilt i 2 forskellige underklasser 30 (G. Granger et al., i Mozes et al., Ed., 1981, Cellular

Responses to Molecular Modulators, side 287 - 310). Der er også blevet identificeret komplekse (molekylvægt >200000) og γ-(molekylvægt 10000 - 20000) lymphotoxin- former. De forskellige lymphotoxin-former og -klasser ad- DK 172382 B1 2 skiller sig fra hverandre med hensyn til deres stabilitet og kinetik af forekomst i kultur. Endvidere kan forskellige former og klasser af lymphotoxinmolekyler også have tendens til at aggregere eller danne multimere med den 5 komplekse klasse under betingelser med lav ionstyrke.

Lymphotoxinklasserne med lavere molekylvægt er blevet angivet at være relativt ustabile og svagt cellelytiske sammenlignet med klasserne med højere molekylvægt (Hirserodt et al.. Ed., 1980 Biochemical Characterization 10 of Lymphokines, side 279 - 283). γ-klassens aktivitet er ikke blevet undersøgt i udstrakt grad på grund af dens ustabilitet (G. Granger et al., 1978 "Cellular Immunology" 38: 388-402). β-klassen er også blevet rapporteret at være ustabil (Walker et al., "J. of Immun." 116[3]: 807 -15 815) [March 1976].

Det bør forstås, at lymphokin-terminologien ikke er ensartet. For tiden er de navne, som gives til cellekulturprodukter, stort set en funktion af de celler, som antages at udarbejde produktet, og produkternes opførsel ved 20 biologiske prøvninger. Imidlertid forbliver disse produkter i vid udstrækning dårligt karakteriseret, fordi mange undersøgelser er blevet gennemført med delvis rene præparater, og fordi prøvningerne, der er anvendt til at karakterisere produkterne, ikke er molekylspecifikke og i 25 hvert tilfælde er underkastet betydelig variation. Den sande identitet af de forskellige cytotoxiske faktorer vil forblive ukendt i fravær af en standardterminologi baseret på klart prøvelige skelnende egenskaber, såsom aminosyresekvenser eller immunepitoper. Som eksempler på 30 andre navne, der er givet til cytotoxiske cellekulturprodukter, kan nævnes tumornecrosefaktor, cytotoxisk NK-celle-faktor, hæmoragisk necrose-faktor og macrophagcyto-toxin eller cytotoxisk macrophag-faktor.

DK 172382 B1 3 I US patentansøgning nr. 608 316, indleveret den 7. maj 1984, og EP offentliggørelsesskrift nr. 100 641 A er beskrevet aminosyresekvenser for et humant lymphotoxin isoleret fra den humane lymphoblastoid-cellelinie RPMI-1788.

5 I EP offentliggørelsesskrift nr. 132 125 A er beskrevet udvinding af et protein fra en kanin efter stimulering af dens reticuloendotheliale system. Proteinet blev rapporteret at have antitumor-aktivitet og den N-terminale ami-nosyresekvens Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-10 Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Seu-Gln-Trp-Leu.

I US patentansøgning nr. 628 059, indleveret den 5. juli 1984, er angivet rensning og rekombinant syntese af et cytotoxisk humant polypeptid identificeret som tumorne-15 crosefaktor og med den N-terminale aminosyresekvens Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro.

I US patentskrift nr. 4 481 137 er angivet udvinding af et stof med molekylvægt 7000 - 9000 benævnt CBX3 fra 20 BALL-1 cellekultur, hvilket stof undertrykker væksten af tumorceller og har en Ala-Ala-N-terminus.

Ifølge Toth and Granger, "Mol. Immun." U.: 671 - 679 (1979) havde hverken fjernelsen af sialsyre fra lympho-toxinholdige lymphocyt-supernatanter ved neuraminodasebe-25 handling eller tilsætningen af N-acetylglycosamin, galactose, lactose, mannose, α-methylmannosid eller fucose til supernatanterne nogen virkning på in vitro lytisk aktivitet. Toth et al. konkluderede således, at simple sukkerstoffer ikke viser sig at spille en rolle i aktiviteten 30 af deres lymphotoxin. Imidlertid iagttager Toth et al. også, af saccharider spiller en vigtig rolle i virkningen af andre lymphokiner, og konkluderede, at de ikke kunne DK 172382 B1 4 udelukke deltagelsen af roere komplicerede former af oligosaccharider i lymphotoxins cytotoxiske aktivitet.

Senere har Proctor, Klostergaard and Granger ("Clinical Research", 1982, 20.(1): 55A) rapporteret, at humane lym-5 phocytter, når de aktiveres af PHA i nærvær af tunicmycin (for at inhibere tilføjelsen af N-forbundne carbonhydrat-dele til lymphotoxinmolekyler), frigjorde biologisk inert lymphotoxin. Ifølge disse forfattere afslørede immunoke-miske undersøgelser, at medens carbonhydratdelen af lym-10 photoxin ikke var nødvendig for dens transport og frigivelse af den aktiverede lyrophocyt til supernatanten, var carbonhydratet nødvendigt for at få effektiv målcelledestruktion, fordi carbonhydratet var ansvarligt for lyro-photoxinmolekylets passende konformation.

15 Anden litteratur, som giver generel baggrundsinformation for denne opfindelse, inkluderer Evans, "Cancer Immunol. Immunother. " 12.: 181 - 190 ( 1982); Lee et al., "Cell. Immun." 42.: 166 - 181 ( 1979); De Week et al., Ed., (1980) Biochemical Characterization of Lymphokines, s. 279 - 20 312; Khan et al. Ed. (30. juni, 1982) Human Lymphokines, s. 459 - 477; Aggarwal et al., Presentation at the 3rd International Lymphokine Workshop in Haverford, PA., August 1 - 5, 1982; Ransom et al., "Cancer Research" 43: 5222 - 5227 (Nov. 1983); Kuli et al., "J. Immun." 126(4)ϊ 25 1279 - 1283 (April 1981); J. Sawada et al., "Jpn. J. Exp.

Med." 42* 263 - 267 (1976); G. Granger et al., "Cell. Immunol." 22: 388 - 402 (1978); J. Rundelle et al., "Immunopharmacology" 2: 9 - 18 (1981); G. Granger et al.

"J. Lymphokine Res." i: 45 - 49 (1982); N. Ruddle et al., 30 "Lymphokine Res." 2: 23 - 31 ( 1983); M. Mitsuhashi et al., GB offentliggørelsesskrift nr. 2 106 117; H. Enomo-to, EP offentliggørelsesskrift nr. 87 A; B. Williamson et al., "P.N.A.S. USA" M: 5397 - 5401 (1983) og S. Wright et al., ”J. Immunol." 126: 1516 - 1521 (1981).

DK 172382 B1 5

Lymphotoxi.net (eller stoffer identificeret som lympho-toxin), som tidligere er opnået ud fra lymphocytkultur, er til stede i lave koncentrationer af størrelsesordenen (0,05 - 2) X 106 enh./l i supernatanter af RPMI-1788 cel-5 ler eller primære lymphocytter. De høstede mængder varierer ofte betydeligt, og primære lymphocytter er dyre. Der er behov for en økonomisk fremgangsmåde til fremstilling af lymphotoxin (Yamamoto et al., "J. of Biological Response Modifiers" jj.: [1] 76 - 87 [ 1984).

10 Tidligere fremgangsmåder har heller ikke kunnet producere lymphotoxin, som er homogent med hensyn til aminosyrese-kvens, et vigtigt træk for lægemiddelanvendelser. Lymphotoxin udvundet fra celleliniekultur udviser aminoterminal heterogenitet, sandsynligvis på grund af proteolytisk 15 forarbejdning (se den ovennævnte US patentansøgning nr.

608 316). Kulturer af primære lymphocytter, f.eks. fra adenoider eller perifert blod, må nødvendigvis indeholde cellerne fra mange donorer af økonomiske grunde. Imidlertid vil produkterne af disse celler afspejle genetisk va-20 riation blandt donorerne, således at det resulterende "lymphotoxin" faktisk kan være en blanding af alleliske arter. Det er klart, at mængderne og identiteterne af sådanne alleler vil være ukendte fra portion til portion.

Der er behov for en fremgangsmåde til fremstilling af 25 lymphotoxin, som er ensartet med hensyn til dets aminosy-resekvens.

De tidligere fremgangsmåder er også begrænset til fremstillingen af lymphotoxin med primære aminosyresekvenser svarende til dem, der findes i naturen. Udskiftning, de-30 letering eller indsætning af forskellige aminosyrer i disse sekvenser ville kræve omfattende og dyre kemiske modifikationer, hvis sådanne i det hele taget kunne gennemføres. Der er behov for fremgangsmåder til let indførelse af variationer i aminosyresekvenser af lymphotoxin.

DK 172382 B1 6

Selv om antitumor-virkningerne og den tilsyneladende terapeutiske værdi af lymphotoxin-aktivitet er blevet rapporteret i litteraturen siden 1968, er lymphotoxin ikke blevet undersøgt ved udstrakte kliniske afprøvninger el-5 ler kommercialiseret på grund af de små mængder og den heterogene natur af det lymphotoxin, som var tilgængeligt via de hidtil kendte fremgangsmåder. Der er behov for fremgangsmåder til økonomisk at fremstille mængder af lymphotoxin, som er tilstrækkelige til kliniske undersø-10 gelser.

I litteraturen er blevet beskrevet kanin-antisera, som er i stand til at neutralisere den cytolytiske aktivitet af forskellige cytotoxiner, herunder stoffer identificeret som lymphotoxin (Yamamoto et al. "Cell. Immun." iS.: 403 -15 416 (1978); Gately et al., "Cell. Immun." 27.: 82 - 93 (1976) ; Hirserodt et al., "J of Immun." 119(2): 374 - 380 (1977) ; Zacharchuk et al., "P.N.A.S. USA" M* 6341 - 6345 (oktober 1983); Ruddle et al., "Lymphokine Research" 2.(1) 23 - 31 (1983); Mannet et al., "Infection and Immunity" 20 ϋ(1)! 156 - 164 (1981); Wallach et al., i E. De Maeyer et al. Ed.: The Biology of the Interferon System, s. 293 - 302 (udg. september 1983) og Stone-Wolff et al., "J. Exp. Med." 159: 828 - 843 (marts 1984). Da dette antiserum er polyklonalt, indeholder det en mangfoldighed af 25 antistoffer rettet mod immunogenet lymphotoxin. Ethvert eller flere sammen af disse antistoffer virker for at neutralisere "lymphotoxin"-aktiviteten. Endvidere er litteraturrapporterne almindeligvis uklare, hvad angår den molekylære identitet af det for lymphotoxinaktivitet an-30 svarlige stof, der blev anvendt som immunogenet. Hvad der behøves til diagnose og immunoaffinitetsrensningsprocedu-rer, er et monospecifikt antistof rettet mod et klart og utvetydigt identificeret lymphotoxinmolekyle.

DK 172382 B1 7

Det er et af formålene for denne opfindelse at tilvejebringe et sådant antistof.

Det er et yderligere formål for opfindelsen at angive fremgangsmåder til økonomisk at syntetisere en lympho-5 toxinform i en sammensætning, hvori den primære aminosy-resekvens af i det væsentlige alle lymphotoxinmolekylerne er den samme.

Det er et andet formål for opfindelsen at frembringe forud fastlagte variationer i aminosyresekvensen af en lym-10 photoxinform, mere specifikt aminosyredeletioner, -indsætninger, -udskiftninger eller kombinationer deraf, til opnåelse af lymphotoxinderivater med cytotoxisk aktivitet .

Sammenfatning af opfindelsen 15 Disse formål opnås gennem den heldige rekombinante ud-trykkelse af protein med lymphotoxin-aktivitet. Denne lymphotoxinart, som er beskrevet i denne beskrivelse ved dens aktivitet og naturlige eller variante aminosyrese-kvens, betegnes i det følgende som lymphotoxin. Overras-20 kende er DNA'en, som koder for lymphotoxin, blevet identificeret uanset de små mængder af lymphotoxin, der udtrykkes i homologe celler, og usikkerheden med hensyn til det tidspunkt, hvorved mRNA, som koder for lymphotoxin, viser sig i homologe celler. Ligeledes overraskende er 25 biologisk aktivt lymphotoxin blevet udtrykt i rekombinante celler, der ikke glycosylerer lymphotoxinet (eller der ikke ville forventes at gøre det på samme måde som homologe celler), og det således udtrykte lymphotoxin er udvundet med en i det væsentlige ensartet aminosyresekvens, 30 uden N-terminal enzymatisk hydrolyse. DNA, som koder for lymphotoxin, udtrykkes i cellekulturer i rigelige mængder, der overskrider (0,1 - 1) x 1011 enheder pr. liter kulturlysat.

DK 172382 B1 8

Det lymphotoxin, der udtrykkes af en rekombinant værtscelle, vil afhænge af den DNA, der anvendes til at kode for lymphotoxinet eller dets forstadier, såvel som af den valgte værtscelle. De nucleinsyresekvenser, der anvendes 5 heri til lymphotoxinsyntese, er hidtil ukendte. De er karakteriseret ved nucleotidsekvenser, som adskiller sig fra den native eller naturlige sekvens på en eller flere af de følgende måder: DNA'en er fri for introns, i tilfælde af humant lymphotoxin den intron, som befinder sig 10 mellem nucleotiderne 284 og 285 (fig. 2A); DNA'en er fri for nucleinsyre, som koder for andre proteiner i den organisme, hvorfra DNA'en stammede; nucleinsyren, som koder for lymphotoxin, ligeres ind i en vektor; og/eller nucleinsyren er i stand til at hybridisere til nucleinsyre, 15 som koder for lymphotoxin, dog forudsat at en sådan hy-bridiserende nucleinsyre ikke har nucleotidsekvensen af naturlig DNA eller RNA, som koder for lymphotoxin.

Mutantnucleinsyrer, som koder for lymphotoxin, er produktet af rekombinante manipulationer. Tavse mutationer i 20 5'-utranslateret eller -translateret nucleinsyre for lym photoxin tilvejebringes for at forhøje ekspressionsniveauerne i udvalgte værter, f.eks. ved at reducere sandsynligheden for stamme-og-løkke mRNA-strukturer i nucelinsy-rens 5'-områder, eller ved at indføre værts-foretrukne 25 kodoner i stedet for dem, der findes i naturlige nuclein-syreisolater.

Mutationer i nucleinsyrerne, som udtrykkes i stedet for at være tavse, muliggør fremstillingen af lymphotoxinde-rivater med aminosyresekvensen af nativt lymphotoxin el-30 ler primærsekvens-derivater deraf med aminosyresekvenser, der adskiller sig fra det native lymphotoxin. Lymphotoxinet eller lymphotoxinderivatet udvindes som sådant eller forarbejdes yderligere af værtscellen til opnåelse af det ønskede lymphotoxinderivat.

DK 172382 B1 9

Disse nucleinsyrer eller nucleinsyrer, som hybridiserer dermed, eller fragmenter deraf kan også mærkes og anvendes ved hybridiseringsprøvninger til identifikation eller bestemmelse af genetisk materiale, som koder for lympho-5 toxin.

Ved fremgangsmåder til syntese af lymphotoxin ligeres DNA, som koder for lymphotoxin, ind i en vektor, vektoren anvendes til at transformere værtsceller, værtscellerne dyrkes, og lymphotoxin udvindes fra kulturen. Denne alme-10 ne fremgangsmåde anvendes til at syntetisere lymphotoxin med aminosyresekvensen af nativt lymphotoxin eller til at konstruere hidtil ukendte lymphotoxinderivater, afhængigt af vektorkonstruktionen og den værtscelle, der vælges til transformation. Lymphotoxinarterne, som kan syntetiseres 15 ifølge denne beskrivelse, inkluderer leucyl-aminotermi- nalt lymphotoxin, histidyl-aminoterminalt lymphotoxin, prælymphotoxin og lymphotoxinderivater, inklusive (a) fusionsproteiner, hvori et heterologt protein eller poly-peptid er forbundet via en peptidbinding med de amino-20 og/eller carboxylterminale aminosyrer i lymphotoxin, (b) lymphotoxinfragmenter, især fragmenter af prælymphotoxin, hvori enhver aminosyre mellem -34 og +23 er fragmentets aminoterminale aminosyre, (c) lymphotoxinderivater, hvori en eller flere aminosyrerester er udskiftet, indsat eller 25 deleteret, (d) methionyl- eller modificeret -methionyl- (såsom formylmethionyl eller andre blokerede methionylar-ter) aminoterminale derivater og/eller (e) uglycosylerede eller på forskellig måde glycosylerede arter af alle de førnævnte.

30 Hvis en pattedyrcelle transformeres med nucleinsyre, som koder for lymphotoxin, operabelt ligeret til en eukaryo-tisk sekretorisk leder (inklusive den native sekretoriske leder for lymphotoxin, eller hvis nucleinsyre, som koder for lymphotoxin, ligeres operabelt i en vektor til en se- DK 172382 B1 10 kretorisk leder fra en prokaryotisk organisme eller gær, som genkendes af værtscellen, der skal transformeres (sædvanligvis den organisme, hvorfra ledersekvensen blev opnået), og værten transformeres med vektoren og dyrkes, 5 så udvindes almindeligvis det ikke aminoterminalt methio-nylerede lymphotoxinderivat fra kulturen.

Hvis DNA, som koder for lymphotoxin, ligeres operabelt ind i en vektor uden en sekretorisk ledersekvens og derpå anvendes til at transformere en værtscelle, er de lympho-10 toxinderivater, som syntetiseres, almindeligvis substitu eret med en aminoterminal methionyl- eller modificeret methionyl-rest, såsom formylmethionyl.

Der tilvejebringes fremgangsmåder, hvorved in vitro muta-genese af nucleinsyren, som koder for lymphotoxin, fører 15 til udtrykkelse af lymphotoxinderivater, som ikke hidtil har været til rådighed.

For det første udtrykkes N-terminalt methionyl- eller modificeret methionyl-lymphotoxin af værtsceller transformeret med lymphotoxinkodende nucleinsyre, som udtrykkes 20 direkte, dvs. som ikke er operabelt forbundet med en sekretorisk ledersekvens.

For det andet anvendes in vitro, steds-specifik, forudbestemt eller tilfældig mutagenese til at indføre deletioner, udskiftninger og/eller indsætninger i nucleinsyren, 25 som koder for lymphotoxin. Lymphotoxinfusioner produceres på denne måde. De lymphotoxinderivater, som opnås ved ekspression af mutantnucleinsyre, udviser modificerede egenskaber.

Endelig tilvejebringes uglycosylerede eller på varierende 30 måde glycosylerede lymphotoxiner som hidtil ukendte lymphotoxinderivater. Uglycosyleret lymphotoxin produceres ved prokaryotisk ekspression af DNA, som koder for lym- DK 172382 B1 11 photoxin. På varierende måde glycosylerede lymphotoxinde-rivater er produktet af rekombinantkultur i transformerede højere eukaryotiske, almindeligvis pattedyr-, celler.

Det her producerede lymphotoxin renses fra kultursuperna-5 tanter eller lysater ved immunoaffinitetsadsorption under anvendelse af insolubiliseret lymphotoxin-neutraliserende antistof. Dette antistof, som produceres mest effektivt i monoklonal cellekultur, frembringes hos mus ved immunisering med alun-adsorberet lymphotoxin.

10 Lymphotoxinderivatet ifølge opfindelsen kombineres til terapeutisk brug med fysiologisk uskadelige stabilisatorer og excipienter og præpareres i steril doseringsform, f.eks. ved lyophilisering i doseringsampuller eller opbevaring i stabiliserede vandige præparater. Alternativt 15 inkorporeres lymphotoxinderivatet i en polymermatrix til implantation i tumorer eller kirurgiske steder, hvorfra tumorer er blevet udskåret, hvorved der frembringes en tidsbestemt afgivelse af lymphotoxinderivatet i en lokaliseret høj-gradient-koncentration.

20 De her omhandlede terapeutiske præparater indgives i terapeutisk effektive doser ved implantation, injektion eller infusion til dyr, herunder mennesker, som bærer maligne tumorer.

Kort forklaring af tegningerne 25 Fig. 1A afbilder en DNA-sekvens og dens tilhørende amino-syresekvens, hvor DNA-sekvensen koder for et lymphotoxin-fragment.

Fig. IB viser konstruktionen af syntetisk DNA, som koder for fragmentet i fig. 1A.

DK 172382 B1 12

Fig. 2A viser den komplette aminosyresekvens for prælym-photoxin, dens kode-DNA plus 5'- og 3'-flankerende utranslaterede områder.

Fig. 2B belyser en fremgangsmåde til konstruktion af en 5 ekspressionsvektor for methionyl-leucyl-arainoterminalt lymphotoxin og dets aminoterminale methionylderivater.

Fig. 3 viser en fremgangsmåde til konstruktion af en ekspressionsvektor for methionyl-histidyl-aminoterminalt lymphotoxin.

10 Fig. 4 afbilder aminosyresekvenserne for humant, muse- og okse-lymphotoxin og pattedyr-lymphotoxin-consensus-res-terne.

Fig. 5A og 5B afbilder konstruktionen af et plasmid, som koder for en fusion af lymphotoxin og en bakteriel sig-15 nalsekvens.

Detailbeskrivelse

Lymphotoxin defineres til denne opfindelsens formål som et biologisk aktivt polypeptid med et område, som viser væsentlig strukturel aminosyrehomologi med mindst en por-20 tion af den i fig. 2A viste lymphotoxin-aminosyresekvens. Biologisk aktivitet defineres som fortrinsvis cytotoxisk aktivitet som defineret nedenfor, immunologisk krydsreaktivitet med et cytotoxisk lymphotoxin eller evnen til at konkurrere med cytotoxisk lymphotoxin om lymphotoxin-25 celleoverflade-receptorer. I de sidstnævnte to tilfælde behøver lymphotoxinet ikke at være cytotoxisk i sig selv. Immunologisk krydsreaktive mutanter er nyttige som immu-nogener til frembringelse af antilymphotoxin i dyr, f.eks. til fremstilling af immunoprøvningsreagenser, me-30 dens ikke-cytotoxiske konkurrerende mutanter finder an- DK 172382 B1 13 vendelse som mærkede reagenser ved immunoprøvninger af konkurrence-type for biologisk aktivt lyrophotoxin.

Fortrinsvis cytotoxisk aktivitet defineres som den fortrinsvise ødelæggelse eller vækstinhibering af tumorcel-5 ler in vivo eller in vitro sammenlignet med normale celler under de samme betingelser. Ødelæggelse af tumorceller ved lyse in vitro eller necrosis in vivo er det foretrukne prøvningsendepunkt, selv om cytostase eller anti-proliferativ aktivitet også anvendes tilfredsstillende.

10 Egnede prøvninger til detektering af lymphotoxins anti-cellulære aktiviteter er beskrevet i B. Aggarwal et al., 1984, MJ. Biol. Chem." 259 ( 1), 686-691, og E. Carswell et al., 1975, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 72., 3666-3670.

Lymphotoxin-specifik aktivitet defineres i denne beskri-15 velse med krav ved målcellelyse frem for ved cytostase.

En enhed af lymphotoxin defineres som den mængde, der kræves til 50% lyse af målceller udsået pladet i hvert hul som yderligere beskrevet i eksempel 1. Imidlertid er andre metoder til bestemmelse af cytotoxisk aktivitet ac-20 ceptable.

Væsentlig strukturel homologi betyder almindeligvis, at mere end ca. 60%, og sædvanligvis mere end ca. 70% af aminosyreresterne i polypeptidet er de samme eller konservative udskiftninger for de tilsvarende rester i se-25 kvensen i fig. 2A.

Ikke hele sekvensen af et lymphotoxin-polypeptid behøver at være homolog med sekvensen i fig. 2A. Kun en portion deraf behøver at være homolog med nogen portion af sekvensen i fig. 2A, sålænge kandidaten udviser den krævede 30 biologiske aktivitet. Almindeligvis bør homologi være påviselig for områder på fra omkring 20 til omkring 100 DK 172382 B1 14 aminosyrerester, idet det anerkendes, at der af og til kan være mellemrum for at maksimere homologien.

Der kræves mindre homologi, for at polypeptider falder indenfor definitionen, hvis området af homologi med se-5 kvensen i fig. 2A ikke er i et af lymphotoxin-nøgleområderne, dvs. områder, der er vigtige for cytoto-xisk aktivitet. Nøgleområderne i sekvensen i fig. 2A antages at være omkring 162 - 171, 52 - 83 og 127 - 148.

Lymphotoxin defineres til specifikt at udelukke human tu-10 mornecrosefaktor eller dens naturlige animalske analoge (D. Pennica et al., "Nature" 312;20/27 December, 1984, s. 724-729 og B. Aggarwal et al., "J. Biol. Chem." 260(4): 2345-2354 [1985]).

"Strukturelt lignende" henfører til dominante egenskaber 15 hos aminosyresidekæderne, såsom basisk, neutral eller sur, hydrofil eller hydrofob, eller nærvær eller fravær af sterisk opfyldning. Udskiftning af én aminosyre med en strukturelt lignende betegnes indenfor teknikken almindeligvis som en konservativ substition.

20 En signifikant faktor ved etablering af et polypeptids identitet som lymphotoxin er evnen hos antisera, som er i stand til i det væsentlige at neutralisere den cytolyti-ske aktivitet af i det væsentlige homogent, lymphoblasto-id-(eller naturligt)lymphotoxin, til også i det væsentli-25 ge at neutralisere den cytolytiske aktivitet af det pågældende polypeptid. Imidlertid vil det indses, at immunologisk identitet og cytotoxisk identitet ikke nødvendigvis har samme udstrækning. Hvis et neutraliserende antistof for lymphotoxinet i fig. 2A eventuelt er rettet 30 mod et sted på lymphotoxinet, som blot er nabo til et område, der er kritisk for lymphotoxinets cytotoxiske aktivitet, således at det virker som neutraliserende antistof ved sterisk hindring af det lymphotoxin-aktive sted, be- DK 172382 B1 15 høver det ikke at binde et kandidatprotein. Et kandidatprotein muteret i dette uskadelige område vil eventuelt ikke længere binde det neutraliserende antistof, men det ville ikke desto mindre være lymphotoxin med hensyn til 5 væsentlig homologi og biologisk aktivitet.

Lymphotoxin opnået ved virkning af lymphoblastoidcelleli-nier er blevet bestemt at have de følgende egenskaber: en molekylvægt på 20 000 eller 25 000 afhængigt af graden af glycosylering og N-terminal heterogenitet; glycosylering 10 ved Asn+62 (fig. 2A); en tendens til at aggregere, især til at organiseres til multimere; et isoelektrisk punkt på omkring 5,8; pH-labilitet (tab af >50% cytolytisk aktivitet, når det opbevares i 24 timer i ammoniumhydrogen-carbonatpuffer ved 10 ng/ml koncentration med pH-niveauer 15 på mindre end ca. 5 eller større end ca. 10); og væsentlige tab i aktivitet efter inkubering i vandig opløsning i 5 minutter ved 80 °C. To molekylvægtarter af lymphobla-stoid-lymphotoxin er blevet identificeret. 25 000 Da arten af lymphoblastoid-lymphotoxin har en aminoterminal 20 leucinrest. Polypeptider med 25 000 Da artens primære aminosyresekvens kaldes leucil-aminoterminalt lymphotoxin. 20 000 Da arten af lymphoblastoid-lymphotoxin er karakteriseret ved en aminoterminal histidinrest, og tilsvarende sekvenser betegnes histidyl-aminoterminalt lym-25 photoxin. Det er vigtigt at iagttage, at disse egenskaber beskriver det native eller vild-type humane lymphotoxin opnået fra lymphoblastoidcellekulturer. Selv om lymphotoxin som defineret i denne beskrivelse med krav ikke omfatter nativt, glycosyleret lymphotoxin, kan andre be-30 slægtede cytotoxiske polypeptider falde indenfor definitionens omfang. F.eks. kan den glycosylering, som almindeligvis er forbundet med et animalsk lymphotoxin, modificeres ved ekspression i en heterolog rekombinant euka-ryotisk værtscelle, hvorved det modificerede lymphotoxin 35 bringes udenfor de molekylvægte eller det isoelektriske DK 172382 B1 16 punkt, som er fastslået for humant lymphoblastoid-lympho-toxin. Lymphotoxin, som er helt uglycosyleret, produceres i rekombinant bakterielkultur med dets molekylvægt, iso-elektriske punkt og andre egenskaber modificeret tilsva-5 rende. Desuden kan efter-translations-forarbejdning af prælymphotoxin fra en første dyreart i en cellelinie afledt fra en anden dyreart resultere i en anden aminoter-minal rest end det almindeligvis er tilfældet for den første dyreart. På lignende måde kan de i denne beskri-10 velse med krav tilvejebragte mutageneseprocedurer f.eks. gøre det muligt for én at variere aminosyresekvensen og N-terminus af lymphotoxin og derved modificere pH-stabiliteten, det isoelektriske punkt og lignende.

Den translaterede aminosyresekvens for humant lymphotoxin 15 er beskrevet i fig. 2A. Bemærk at denne sekvens inkluderer en præsekvens på 34 rester, som antages at blive fjernet under normal forarbejdning af det translaterede transskript i humane celler (i denne beskrivelse med krav sammen med derivater deraf betegnet "prælymphotoxin"), 20 hvilket resulterer i den leucyl-aminoterminale art. Den histidyl-aminoterminale art er homolog med den leucyl-aminoterminale art, undtagen af de første 23 aminosyrer fra den leucyl-aminoterminale art mangler. Alle tre arter, dvs. prælymphotoxin, leucyl-aminoterminalt lympho-25 toxin og histidyl-aminoterminalt lymphotoxin, såvel som deres methionyl-, modificeret-methionyl-, mutant- og uglycosylerede former er inkluderet i omfanget af lymphotoxin. De uglycosylerede leucyl- og histidyl-aminoterminale arter vil have lavere molekylvægte end beskrevet 30 ovenfor for de homologe arter fra lymphoblastoidceller.

Prælymphotoxin er en art af lymphotoxin, som er inkluderet i den ovenstående definition. Den er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et signal- (eller leder-Jpolypep-tid ved molekylets aminoterminus. Almindeligvis fraspal- DK 172382 B1 17 tes lymphotoxins native signalpolypeptid proteolytisk fra lymphotoxin som en del af den sekretoriske proces, hvorved proteinet secerneres fra cellen. Signalpeptidet kan være mikrobielt eller fra pattedyr (inklusive den native 5 præsekvens på 34 rester), men den er fortrinsvis et signal, som er homologt for værtscellen. Nogle signal-lymphotoxin-fusioner genkendes eller "forarbejdes" ikke af værtscellen til N-terminalt Met-frit lymphotoxin. Sådanne fusioner indeholdende mikrobielle signaler har an-10 vendelighed f.eks. som lymphotoxin-immunogener.

Bemærk at sprogbrugen "i stand til at udøve" cytotoxisk aktivitet betyder, at lymphotoxin inkluderer polypepti-der, som kan omdannes, f.eks. ved enzymatisk hydrolyse, fra en inaktiv tilstand analogt med et zymogen til et po-15 lypeptidfragment, som udøver den ønskede biologiske akti vitet. Sprogbrugen "i stand til at udøve" in vitro eller in vivo cytotoxisk aktivitet skal forstås at omfatte ik-ke-cytotoxiske polypeptider, som kan omdannes, f.eks. ved enzymatisk hydrolyse, fra en inaktiv tilstand analog med 20 et zymogen til et polypeptidfragment, som udøver den definitionsmæssige biologiske aktivitet. Typisk vil inaktive forstadier være fusionsproteiner, hvori lymphotoxin er forbundet ved hjælp af en peptidbinding ved dets carboxyl terminus til et andet protein eller polypeptid. Sekven-25 sen ved denne peptidbinding eller nær ved vælges således, at den er modtagelig for proteolytisk hydrolyse til frigivelse af lymphotoxin, enten in vivo eller, som en del af en fremstillingsforskrift, in vitro. Typiske forbindelsessekvenser er Lys-Lys eller Arg-Lys. Ikke-lympho-30 toxin-komponenten af et sådant prolymphotoxin er fortrinsvis et homologt protein med henblik på at minimere fusionens immunogenicitet. Det homologe protein bør være uskadeligt og ikke bindes til celleoverflader. Lympho-toxinet, der er dannet således, vil derpå udøve den defi-35 nitionsmæssigt krævede cytotoxiske aktivitet.

DK 172382 B1 18

Selv om lymphotoxin almindeligvis betyder humant lympho-toxin, er lymphotoxin fra kilder såsom mus, svin, heste eller okser inkluderet i definitionen af lymphotoxin, sålænge det iøvrigt opfylder de ovenfor beskrevne standar-5 der for homologe områder og biologisk aktivitet. For eksempel har okse- og muse-lymphotoxiner vist sig at være stærkt (omkring 80%) homologe med humant lymphotoxin. Lymphotoxin er ikke artsspecifikt, f.eks. er humant lymphotoxin aktivt på musetumorer og neoplastiske cellelini-10 er. Derfor kan lymphotoxin fra én art anvendes til terapi af en anden.

Lymphotoxin inkluderer også multimere former. Lymphotoxin aggregerer spontant til multimere, sædvanligvis dimere eller højere multimere. Multimere er cytotoxiske og i 15 overensstemmelse dermed egnede til anvendelse ved in vivo terapi. Lymphotoxin udtrykkes i rekombinante værter som monomer. Imidlertid har lymphotoxin derefter tendens til spontant at danne multimere. Homogene multimere eller en blanding af forskellige multimere er terapeutisk nyttige.

20 Lymphotoxinderivater inkluderer forud fastsatte eller målbestemte, dvs. stedsspecifikke, mutationer af molekylet i fig. 2A eller dets fragmenter. Lymphotoxinderivater defineres som polypeptider, der iøvrigt opfylder de definerede krav til lymphotoxinegenskaber, men er karakteri-25 seret ved en aminosyresekvens, der adskiller sig fra den i fig. 2A, hvad enten det drejer sig om udeladelse, udskiftning eller indsætning af rester. De her beskrevne ikke-humane lymphotoxiner og alleler af humant lymphotoxin skal betragtes som lymphotoxinderivater ligesom 30 steds-dirigerede mutanter uden noget naturligt modstykke. Formålet med mutagenese er at konstruere DNA, som koder for lymphotoxin som defineret ovenfor, men som udviser egenskaber der modificerer den biologiske aktivitet af naturligt lymphotoxin eller letter fremstillingen af lym- DK 172382 B1 19 photoxin. F.eks. muteres lysinkodonen +89 for at udtrykke en histidinrest i stedet for lysenresten. Histidinresten +89 hydrolyseres ikke længere af trypsin (der almindeligvis spalter proteiner ved en Arg-X eller Lys-X binding).

5 Proteaseresistents forventes at tilføre større biologisk halveringslevetid til mutanten, end det er tilfældet for lymphotoxin med sekvensen i fig. 2A (eller et fragment deraf). Andre lymphotoxin-lysin- eller -arginin-rester kan muteres til histidin, f.eks. lysin +28, lysin +19 el-10 ler arginin +15.

Som omtalt ovenfor udviser visse områder af lymphotoxin-molekylet væsentlig homologi med et på lignende måde aktivt protein betegnet tumornecrosefaktor. Aminosyrerester i og umiddelbart flankerende disse homologe områder fore-15 trækkes til mutagenese rettet mod at identificere lympho-toxinderivater, der udviser variant biologisk eller cyto-toxisk aktivitet. Sådanne derivater frembringes ved metoder, der er kendte i sig selv, og screenes derpå for den ønskede biologiske aktivitet, f.eks. forøget cytotoxici-20 tet overfor den bestemte neoplasme, som behandles, eller i tilfælde af lymphotoxinderivater beregnet til immunisering af dyr evnen til at udløse en kraftigere immunreaktion. Eksempler på sådanne lymphotoxinderivater er som følger: Ala +168 muteres til en forgrenet aminosyre (Val, 25 Ile eller Leu); en hydrofob aminosyre (f.eks. Phe, Val,

Ile eller Leu) indsættes mellem Thr +163 og Val +164; tyrosin indføres i stedet for Thr +163; lysin indføres i stedet for Ser +82; isoleucin, leucin, phenylalanin, va-lin eller histidin indføres i stedet for Ser +42; gluta-30 min, tryptophan, serin eller histidin indføres i stedet for Lys +84; Ser +82 deleteres; et hydrofobt di- eller tripeptid knyttes til Leu +171; asparaginsyre eller lysin indføres i stedet for Thr +163; Ala-Lys indsættes mellem Glu +127 og Pro +128; lysin eller glycin indføres i ste-35 det for Ser +70; tyrosin indføres i stedet for Thr +69; DK 172382 B1 20 arginin eller histidin indføres i stedet for Lys +28; ar-ginin eller lysin indføres i stedet for His +32; prolin, serin, threonin, tyrosin eller glutaminsyre indføres i stedet for Asp +36; tyrosin, methionin eller glutaminsyre 5 indføres i stedet for Ser +38; threonin, tyrosin, histidin eller lysin indføres i stedet for Ser +61; asparagin-syre, serin eller tyrosin indføres i stedet for Gly +124; arginin, lysin, tyrosin, thryptophan eller prolin indføres i stedet for His +135; asparaginsyre indføres i ste- 10 det for Thr +142; og lysin eller threonin indføres i ste det for Gin +146.

En særlig ønskelig gruppe af derivater er dem, hvori met-hioninresterne +20, +120 og +133 i humant lymphotoxin er deleteret eller, fortrinsvis, erstattet med de tilsvaren-15 de rester fundet i lymphotoxinerne af andre arter, såsom det er beskrevet andetsteds i denne beskrivelse med krav.

P.eks. udskiftes Met +20, +120 og +133 med henholdsvis threonin, serin og valin. Disse er de tilsvarende rester i okse-lymphotoxin. Udskiftningen frembringes på den må-20 de, der er beskrevet i eksempel 9, undtagen at Met +133 muteres til Val ved et yderligere mutagenesetrin under anvendelse af M13 Mp8 fag i overensstemmelse med i sig selv kendte metoder. Denne mutante dyreart-hybride lym-photoxin-DNA anvendes i stedet for den leucyl-amino-2 5 terminale DNA fra eksempel 7 og udtrykkes som en fusion. Ifølge kendte procedurer anvendes cyanbromid til at spalte STII-signalet fra hybridlymphotoxinet, og det modne leucyl-aminoterminale lymphotoxinderivat udvindes.

Andre nyttige lymphotoxinderivater er de, hvori rester 30 fra tumornecrose-faktor er indført i stedet for tilsvarende lymphotoxinrester til dannelse af hybride tumorne-crosefaktor-lymphotoxinderivater. Et repræsentativt eksempel er indførelsen af de første 8, 9 eller 10 rester af moden tumornecrosefaktor (f.eks. Val-Arg-Ser-Ser-Ser- DK 172382 B1 21

Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-) i stedet for de første 27 rester af leucyl-aminoterminalt lymphotoxin. Dette derivat vil mere sandsynligt blive N-terminal-demethionyleret efter direkte ekspression i E. coli.

5 Selv om mutationsstedet er forudbestemt, er det unødvendigt, at mutationen i sig selv er forudbestemt. F.eks. gennemføres for at optimere histidin +89 lymphotoxinmu-tantens optræden tilfældig mutagenese ved kodonen for ly-sin +89, og de udtrykte lymphotoxinmutanter screenes for 10 den optimale kombination af cytotoxisk aktivitet og pro-teaseresistens.

Lymphotoxin kan også indeholde indsætninger, sædvanligvis af størrelsesordenen fra 1 til omkring 10 aminosyrere-ster, eller deletioner på fra 1 til omkring 30 rester.

15 Udskiftninger, deletioner, indsætninger eller enhver underkombination kan kombineres for at nå til en endelig konstruktion. Indsætninger inkluderer amino- eller carboxyl terminale fusioner, f.eks. en hydrofob forlængelse føjet til carboxylterminus. Fortrinsvis gennemføres imid-20 lertid kun udskiftningsmutagenese. Det er klart, at mutationerne i den kodende DNA ikke må bringe sekvensen ud af læseramme og fortrinsvis ikke vil skabe komplementære områder, som kunne frembringe sekundær mRNA-struktur. Ekstrakter af E. coli transformeret med vektorer indeholden-25 de DNA, som koder for lymphotoxinderivater med en deletion af de sidste 16 carboxylterminale aminosyrer eller deletion af de første ca. 33 aminoterminale rester i leucyl-aminoterminalt lymphotoxin, udviste ingen cytotoxisk aktivitet. Imidlertid er grundene til mangel på aktivitet 30 ikke kendt og kunne have været enhver af dem, der er anført i eksempel 1 nedenfor.

Ikke alle mutationer i DNA'en, som koder for lymphotoxi-net, vil blive udtrykt i det endelige produkt af rekombi- DK 172382 B1 22 nant cellekultur. F.eks. er en overvejende klasse af DNA-substitutionsmutationer de DNA'er, hvori en anden sekre-torisk leder er blevet indført i stedet for den sekreto-riske leder i fig. 2A, enten ved deletioner i lederens 34 5 rester eller ved udskiftninger, som ombytter det meste af eller hele den native leder med en leder, som mere sandsynligt vil blive genkendt af den påtænkte vært. F.eks. ved konstruktion af en prokaryotisk ekspressionsvektor delekteres den sekretoriske leder i fig. 2A til fordel 10 for lederen for bakteriel alkalisk phosphatase eller var-mestabilt enterotoxin II, og til gær udskiftes lederen i fig. 2A til fordel for lederen for gærinvertase, α-faktor eller sur phosphatase. Dette indebærer imidlertid ikke, at den humane sekretoriske leder ikke genkendes af andre 15 værter end humane cellelinier. Når den sekretoriske leder "genkendes" af værten, spaltes fusionsproteinet bestående af lymphotoxin og lederen almindeligvis ved lederpeptid-bindingen i den samme hændelse, som fører til sekretion af lymphotoxinet. Selv om en mutant-DNA anvendes til at 20 transformere værten, kan det resulterende produkt således være enten et sammenknyttet eller nativt lymphotoxin, afhængigt at værtscellens effektivitet ved forarbejdning af fusionen.

En anden overvejende klasse af DNA-mutanter, der ikke ud-25 trykkes som lymphotoxinderivater, er nucleotidudskiftnin-ger foretaget for at forhøje ekspressionen, først og fremmest ved at undgå stamme-løkke-strukturer i den transskriberede mRNA (se den sideløbende US patentansøgning nr. 303 687, der betragtes som inkorporeret ved den-30 ne henvisning) eller for at tilvejebringe kodoner, som lettere transskriberes af den valgte vært, f.eks. de velkendte E. coli præferencekodoner for E. coli udtrykkelse.

Mutantnucleinsyren fremstilles ved i sig selv kendte fremgangsmåder (A. Hui et al., 1984, "The EMBO Journal" DK 172382 B1 23 2(3): 623-629; J. Adelman et al. 1983, "DNA" 2(3): 183- 193; GB offentliggørelsesskrift nr. 2 130 119 A; G. Winter et al., 1982, "Nature" 299: 756-758; og R. Wallace et al., 1981 "Nucleic Acids Research" 9.( 15): 3647-3656).

5 Disse fremgangsmåder inkluderer M13-fag-mutagenese, syntese af mutant-lymphotoxin-genet som beskrevet i eksempel 1 og videre eller andre fremgangsmåder som er eller vil blive kendte inden for teknikken.

Nucleinsyre, som koder for lymphotoxin, er enhver DNA-10 eller RNA-sekvens, som koder for et polypeptid, der falder ind under definitionen af lymphotoxin i denne beskrivelse med krav, hvad enten nucleotiderne deraf svarer til de sekvenser, som findes i naturen, eller ej. Desuden inkluderes i det her beskrevne omfang nucleinsyre, som er i 15 stand til at hybridisere under i det mindste lav-stringens-betingelser til nucleinsyre, som koder for lymphotoxin, selv hvis den hybridiserende nucleinsyre ikke koder for et protein, som iøvrigt opfylder definitionskravene for lymphotoxin. Et eksempel på det sidstnævnte 20 ville være en sonde, som på grund af den korte længde af polypeptid, som den koder for, er ude af stand til at udtrykke et biologisk aktivt lymphotoxin. Nucleinsyren, som koder for lymphotoxin eller er i stand til at hybridisere dermed, fremstilles ved organisk syntese, i det væsentli-25 ge som vist i eksempel 1, eller opnås fra naturlige kilder ved sondering af genomiske eller cDNA-biblioteker som vist i eksemplerne.

Lymphotoxinderivatet ifølge opfindelsen fremstilles ved en fremgangsmåde, som i almindelighed indebærer transfor-30 mation af en vært med en vektor bærende den nucleinsyre, som koder for det ønskede lymphotoxinderivat. En vektor er en replikerbar DNA-konstruktion. Vektorer anvendes i denne beskrivelse med krav til at opformere DNA eller til at udtrykke DNA, som koder for lymphotoxin. En ekspressi- DK 172382 B1 24 onsvektor er en DNA-konstruktion, hvori en DNA-sekvens, som koder for lymphotoxin, er operabelt forbundet med en egnet styresekvens, som er i stand til at frembringe ekspression af lymphotoxin i en egnet vært. Sådanne styrese-5 kvenser inkluderer en transskriptionspromotor, en eventuel operatorsekvens til at styre transskriptionen, en sekvens, som koder for egnede mRNA-ribosomale bindingssteder, og sekvenser, som styrer afslutning af transskription og translation.

10 Vektoren kan være et plasmid, et virus, (inklusive fag) eller et integrerbart DNA-fragment (dvs. integrerbart i værtsgenomet ved rekombination) . Når først den er transformeret ind i en egnet vært, replikerer vektoren og fungerer uafhængigt af værtsgenomet eller kan i nogle til-15 fælde integreres i genomet selv. I den foreliggende beskrivelse med krav anvendes "plasmid" og "vektor" sommetider valgfrit, da plasmidet for tiden er den mest almindeligt anvendte form for vektor. Imidlertid er alle andre former af vektorer, der tjener en ækvivalent funktion, og 20 som er eller bliver kendte inden for teknikken, egnede til anvendelse her.

Egnede vektorer vil indeholde replicon og styresekvenser, som er afledt fra arter, der er kompatible med den påtænkte ekspressionsvært. Transformerede værtsceller er 25 celler, som er blevet transformeret eller transficeret med lymphotoxinvektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik. Transformerede værtsceller udtrykker almindeligvis lymphotoxin. Det udtrykte lymphotoxin vil blive deponeret intracellulært eller secerneret 30 til enten det periplasmiske rum eller kultursupernatan-ten, afhængigt af den valgte værtscelle.

DNA-områder er operabelt forbundet, når de er funktionelt afhængige af hinanden. F.eks. er DNA for en præsekvens DK 172382 B1 25 eller sekretorisk leder operabelt forbundet med DNA for et polypeptid, hvis den udtrykkes som et præprotein, der deltager i sekretionen af polypeptidet; en promotor er operabelt forbundet med en kodesekvens, hvis den styrer 5 transskriptionen af sekvensen; eller et ribosombindingssted er operabelt forbundet med en kodesekvens, hvis det er anbragt således, at det muliggør translation. Almindeligvis betyder operabelt forbundet sammenhængende ud i ét og i tilfælde af sekretoriske ledere sammenhængende ud i 10 ét i aflæsningsfase.

Egnede værtsceller er prokaryoter, gær eller højere euka-ryotiske celler. Prokaryoter inkluderer Gram-negative eller Gram-positive organismer, f.eks. E. coli eller Bacil li. Højere eukaryotiske celler inkluderer etablerede cel-15 lelinier af pattedyroprindelse som beskrevet nedenfor. En foretrukken værtscelle er den fagresistente E. coli W3110 (ATCC 27 325) stamme, som er beskrevet i eksemplerne, selv om andre prokaryoter, såsom E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. coli 294 (ATCC 31 446), Pseudomonas ar-20 ter eller Serratia marcescens er egnede.

Prokaryotiske værts-vektor-systemer foretrækkes til ekspressionen af lymphotoxin. En overflod af egnede mikrobielle vektorer er til rådighed. Almindeligvis vil en mikrobiel vektor indeholde et replikationsorigin, som gen-25 kendes af den påtænkte vært, en promotor, som vil fungere i værten, og et fænotypisk selektionsgen, f.eks. et gen, som koder for proteiner, der overfører antibiotisk resistens eller tilfører et auxotroft krav. Lignende konstruktioner vil blive fremstillet for andre værter. E.

30 coli transformeres typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli art (Bolivar et al., 1977, "Gene" 2: 95). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og tilvejebringer således lette midler til identificering af transformerede celler.

DK 172382 B1 26

Ekspressionsvektorer må indeholde en promotor, som genkendes af værtsorganismen, men kloningsvektorer behøver ikke dette. Promotoren er almindeligvis homolog for den påtænkte vært. Promotorer, som mest almindeligt anvendes 5 ved rekombinant-DNA-konstruktion, inkluderer β-lactamase-(penicillininase-) og lactose-promotorsysternerne (Chang et al., 197 8, "Nature", 275: 615; og Goeddel et al., 1979, "Nature" 281:544). et tryptophan-(trp) promotorsystem (Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8.: 4057 10 og EP offentliggørelsesskrift nr. 36 776) og tac-promotoren [H. De Boer et al., "Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A." 80: 21-25 ( 1983)]. Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er andre kendte mikrobielle promotorer egnede. Detaljer vedrørende deres nucelotidsekvenser 15 er blevet publiceret, hvilket gør det muligt for en fagmand operabelt at ligere dem til DNA, som koder for lym-photoxin i plasmidvektorer (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 2Q. 269 ) og DNA'en, som koder for lymphotoxin. For tiden er den foretrukne vektor et BR322-derivat indehol-20 dende alkalisk-phosphatase-promotoren med trp-Shine-Dalgarno-sekvensen fra E. coli. Promotoren og Shine-Dalgarno-sekvensen er operabelt forbundet med DNA'en, som koder for lymphotoxinet, dvs. de er anbragt således, at de promoterer transskription af lymphotoxin-mRNA fra 2 5 DNA'en.

Foruden prokaryoter transformeres eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer, med lymphotoxin-kodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae eller almindelig bagegær er den mest almindeligt anvendte blandt lavere eukaryotiske 30 værtsmikroorganismer, selv om et antal stammer er almindeligt tilgængelige. Gærvektorer vil almindeligvis indeholde et replikationsorigin fra 2 pm gærplasmidet eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), en promotor, DNA, som koder for lymphotoxin (inklusive især humant prælym-35 photoxin), sekvenser til polyadenylering og transskripti- DK 172382 B1 27 onsafslutning og et selektionsgen. Et egnet plasmid til lymphotoxinekspression i gær er YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, "Nature", 282 : 39; Kingsman et al., 1979, "Gene", 2;141; Tschemper et al., 1980, "Gene", 2£: 157). Dette 5 plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, som mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC No. 44075 eller PEP4-1 (Jones, 1977 , "Genetics", £5.: 12).

Tilstedeværelsen af trpl-læsionen i gærværtscellegenomet 10 tilvejebringer derpå et effektivt miljø til detektering af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

Egnede promoteringssekvenser i gærvektorer inkluderer promotorerne for metallothionein, 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, "J. Biol. Chem", 255: 2073) eller 15 andre glycolytiske enzymer (Hess et al., 1978, "Biochemistry", 12, 4900), såsom enolase, glyceraldehyd- 3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxyla-se, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatiso-20 merase, phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Egnede vektorer og promotorer til anvendelse ved gærekspression er yderligere beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr.

73 657.

Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at 25 transskriptionen styres af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen og de førnævnte metallothionein og glyceral-dehyd-3-phosphat-dehydrogenase såvel som enzymer, der er 30 ansvarlige for maltose- og galactose-udnyttelse. Ved konstruktion af egnede ekspressionsplasmider ligeres afslutningssekvenserne forbundet med disse gener også ind i ekspressionsvektoren 3' for de lymphotoxinkodende sekven- DK 172382 B1 28 ser for at tilvejebringe polyadenylering af mRNA'en og afslutning.

Foruden mikroorganismer kan kulturer af celler afledt fra flercellede organismer også anvendes som værter. Dette 5 foretrækkes imidlertid ikke, fordi der indtil nu er opnået udmærkede resultater med lymphotoxinudtrykkende mikroorganismer. I princippet er enhver højere eukaryotisk cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Imidlertid har interessen været 10 størst for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de seneste år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på nyttige værtscellelinier er VERO- og HeLa-celler, kinesisk ham-15 ster-ovarie-(CHO)-cellelinier og WI38-, BHK-, COS-7- og MDCK-cellelinier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et replikati-onsorigin, en promotor lokaliseret ovenfor genet, som skal udtrykkes, sammen med et ribosombindingssted, RNA-20 splejsningssted (hvis der anvendes intron-holdig genomisk DNA), et polyadenyleringssted og en transskriptionsafslutningssekvens .

Transskriptions- og translations-styresekvenserne i ekspressionsvektorer, som skal anvendes ved transformation 25 af hvirveldyrceller, tilvejebringes ofte af virale kilder. F.eks. er almindeligt anvendte promotorer afledt fra polyoma, Adenovirus 2 og, mest foretrukket, abevirus 40 (SV40). Den tidlige og den sene promotor er særlig nyttig, fordi begge opnås let fra viruset som et fragment, 30 der også indeholder det SV40-virale replikationsorigin (Fiers et al., 1978, "Nature", 273: 113). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forudsat at sekvensen på omkring 250 bp, som strækker sig fra Hindlll-stedet hen imod Bgll-stedet lokaliseret i det virale re- DK 172382 B1 29 plikationsorigin, er inkluderet. Endvidere er det også muligt, og ofte ønskeligt, at anvende de humane genomiske promotor-, styre- og/eller signalsekvenser, der normalt er forbundet med lymphotoxin, forudsat sådanne styrese-5 kvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

Et replikationsorigin kan tilvejebringes enten ved konstruktion af vektoren til at inkludere et exogent origin, som det f.eks. kan afledes fra SV40 eller anden viral (f.eks. polyoma, Adenovirus, VSV eller BPV) kilde, eller 10 kan tilvejebringes af den værtscelle-chromosomale repli-kationsmekanisme. Hvis vektoren integreres i værtscelle-chromosomet, er det sidstnævnte ofte tilstrækkeligt. Lymphotoxin fremstilles uden en aminoterminal methionylrest ved transformation af højere eukaryotiske celler med den 15 humane prælymphotoxin-DNA.

Ved udvælgelse af en foretrukken værtspattedyrcelle til transfektion med vektorer, som omfatter DNA-sekvenser, der koder for både lymphotoxin og dihydrofolatreductase (DHFR), er det passende at vælge værten ifølge den an-20 vendte type DHFR-protein. Hvis der anvendes vild-type DHFR-protein, foretrækkes det at vælge en værtscelle, som er deficient med hensyn til DHFR, hvilket gør det muligt at anvende DHFR-kodesekvensen som markør for heldig transfektion i selektivt medium, som mangler hypoxanthin, 25 glycin og thymidin. En passende værtscelle i dette tilfælde er den DHFR-deficiente kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-cellelinie, der fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci." (USA) 77.: 4216.

30 Hvis der på den anden side anvendes DNA, som koder for DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for methotrexat (MTX), som den styrende sekvens, er det ikke nødvendigt at anvende DHFR-resistente celler. Eftersom den mutante DK 172382 B1 30 DHFR er resistent over for MTX, kan der anvendes MTX-holdige medier som middel til selektion, forudsat at værtscellerne i sig selv er MTX-sensitive. De fleste eukaryotiske celler, som er i stand til at absorbere MTX, 5 viser sig at være methotrexat-sensitive. En sådan nyttig cellelinie er en CHO-linie, CHO-KI (ATCC nr. CCL 61).

Transformerede værtsceller er celler, som er blevet transformeret eller transficeret med lymphotoxinvektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik.

10 Transformerede værtsceller udtrykker almindeligvis lym-photoxin. Det udtrykte lymphotoxin deponeres almindeligvis intracellulært.

Lymphotoxin udvindes fra rekombinant kultur i ikke-secernerende celler ved lyse af cellerne og fjernelse af 15 partikel formet materiale ved centrifugering eller lignen de. Lymphotoxinsecernerende celler adskilles fra kultur-supernatanten ved centrifugering. Den forurenede lympho-toxinopløsning renses derpå ved de ovenfor omtalte fremgangsmåder eller ved immunoaffinitet som beskrevet i ek-20 sempel 4 nedenfor. Lymphotoxinet renses til niveauer, som er egnede til farmakologisk anvendelse og anbringes i konventionelle doseringsformer, f.eks. ampuller, eller kanyler. Blandinger af lymphotoxinderivater anvendes, f.eks. en bank af cytotoxiske mutant-lymphotoxinderiva-25 ter. Lymphotoxin lyofiliseres bedst til langvarig opbevaring, eller det kan anbringes i vandig opløsning med stabilisatorer og excipienter, f.eks. isotonisk saltopløsning, og indgives til patienter som angivet af B. Aggarwal et al., EP patentansøgning nr. 100 641.

30 Lymphotoxinpræparater indgives til tumorbærende dyr. Indgivelsesvejen er i overensstemmelse med kendte metoder, f.eks. intravenøs, intraperitoneal, subcutan, intramusku-lær, intralæsional infusion eller injektion af sterile DK 172382 B1 31 lymphotoxinopløsninger eller ved hjælp af tidsindstillede afgivelsessys teiner som beskrevet nedenfor. Lymphotoxin indgives intralæsionalt, dvs. ved direkte injektion i faste tumorer. I tilfælde af disseminerede tumorer, såsom 5 leukæmi, sker indgivelsen fortrinsvis intravenøst eller i det lymphatiske system. Tumorer i de abdominale organer, såsom ovariecancer, behandles med fordel ved intraperito-neal infusion under anvendelse af udstyr til peritoneal dialyse og peritoneum-kompatible opløsninger. Almindelig-10 vis indgives lymphotoxin imidlertid kontinuert ved infusion, selv om bolusinjektion er acceptabel.

Lymphotoxin indgives ønskeligt fra en implanterbar genstand til tidsindstillet afgivelse. Eksempler på egnede systemer for proteiner med lymphotoxin-dimeres eller 15 -trimeres molekylvægt inkluderer copolymere af L-glutaminsyre og γ-ethyl-L-glutamin (U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22 (1)* 547-556), poly-(2-hydroxy- ethylmethacrylat) R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15.: 167-277 og R. Langer, 1982, "Chem. Tech." 20 12' 98-105) eller ethylenvinylacetat (R. Langer et al..

Id). Lymphotoxinholdige genstande implanteres ved kirurgiske steder, hvorfra tumorer er blevet udskåret. Alternativt indkapsles lymphotoxin i semipermeable mikrokaps-ler eller liposomer til injektion i tumoren. Denne indgi-25 velsesmåde er særlig nyttig til tumorer, som ikke kan udskæres kirurgisk, f.eks. hjernetumorer.

Mængden af lymphotoxin, som indgives, vil f.eks. afhænge af indgivelsesvejen, den pågældende tumor og patientens tilstand. Det vil være nødvendigt for behandleren at ind-30 stille doseringen og modificere indgivelsesvejen efter behov til opnåelse af optimal cytotoxisk aktivitet over for måltumoren, som det kan bestemmes, f.eks. ved biopsi af tumoren eller diagnostiske prøvninger for formodede cancermarkører, såsom carcinoembryonisk antigen, under DK 172382 B1 32 hensyntagen til enhver rekombinant-toxicitet, som mødes ved forhøjet dosering. Almindeligvis har doseringer af rekombinant lymphotoxin hos mus på fra omkring 50 til omkring 200 pg/kg legemsvægt/dag ved intravenøs indgivelse 5 vist sig at være i det væsentlige ikke-toxiske og effektive in vivo. Det er klart, at doseringsprogrammet vil variere for forskellige dyr.

I denne beskrivelse med krav er angivet en fremgangsmåde til opnåelse af lymphotoxin-neutraliserende antistof.

10 Neutraliserende antistof defineres som antistof, der er i stand til at binde lymphotoxin immunologisk som defineret heri på en sådan måde, at dets aktivitet ved prøvninger af cytostatisk eller cytolytisk lymphotoxinaktivitet, såsom den nedenfor beskrevne muse-L929-prøvning, reduceres 15 væsentligt. Den kendsgerning, at antistoffet er i stand til at neutralisere lymphotoxinaktivitet, betyder ikke, at antistoffet må bindes direkte til det lymphotoxinakti-ve sted eller receptorbindingsstedet. Antistoffet kan stadig neutralisere lymphotoxinaktivitet væsentligt, hvis 20 det bindes sterisk til et område, som er nabo til det kritiske sted, dvs. nabo i konformationsforstand og ikke nødvendigvis nabo med hensyn til aminosyresekvens.

Ved forsøg på at fremstille et neutraliserende monoklo-nalt antistof over for lymphotoxin, viste det sig vanske-25 ligt at immunisere mus på en sådan måde, at der frembringes lymphotoxin-neutraliserende antistof i dyrene. Hverken immunisering med lymphoblastoid-lymphotoxin eller med glutaraldehyd-tværbundet lymphotoxin resulterede i noget detekterbart neutraliserende antistof i serumet hos immu-30 niserede mus, selv om musene faktisk dannede ikke-neutraliserende anti-lymphotoxin-antistof, som var detekterbart ved enzymimmunoprøvning. Imidlertid vil immunisering med et lymphotoxin-alun- (aluminiumhydroxid eller aluminiumoxid, AI2O3.3H2O) adsorptionskompleks frembringe DK 172382 B1 33 neutraliserende antistof, selv i dyr, som ikke havde frembragt aktiviteten før immunisering med alunkomplekset. Fremstillingen af alun og dets anvendelse ved produktionen af antiserum er angivet i C. Williams et al., 5 eds. 1967, Methods in Immunology and Immunochemistry I, s. 197-229.

Der er foretaget fusioner af miltceller fra dyr, som producerer neutraliserende antistof, med muse-myelomaceller.

I gennemsnit må der screenes fra omkring 50 til omkring 10 100 kloner for at identificere en, som syntetiserer neu traliserende antistof. Fremgangsmåden til screening af klonerne for den ønskede aktivitet er rutine og inden for almindelig fagmandskunnen og kan reproduceres med minimal eksperimentel indsats.

15 Serumet, plasmaet eller IgG-frektionerne fra det immuniserede dyr såvel som immunoglobuliner secerneret af hy-bridomer frembragt ud fra milt- eller lymfecellen af immuniserede dyr er alle tilfredsstillende til den omhandlede anvendelse. I en foretrukken udførelsesform opnås 20 det neutraliserende antistof i hovedsagen frit for andet anti-lymphotoxin-antistof i hybridomakultur.

Det neutraliserende antistof immobiliseres ved adsorption på overflader, f.eks. termoplastiske formstoffer, såsom polystyren, eller bindes kovalent til matricer, såsom 25 cyanbromid-aktiveret "Sepharose" * ^et anvendes derpå ved immunoprøvninger eller ved immunoaffinitetsrensning. Da antistoffet er et neutraliserende antistof, vil det mest sandsynligt kun adsorbere eller detektere biologisk aktivt lymphotoxin eller fragmenter deraf. Antistoffet er 30 særlig nyttigt ved immunoradiometriske ("Sandwich") immunoprøvninger i samvirken med et ikke-neutraliserende mo-noklonalt anti-lymphotoxin-antistof eller et polyklonalt antiserum, som indeholder ikke-neutraliserende anti-lym- i DK 172382 B1 34 photoxin. Immunoprøvningen gennemføres under anvendelse af enten det neutraliserende eller det ikke-neutralise-rende antistof som den mærkede komponent, hvilken mærkning er effektiv med et detekterbart stof, såsom et fluo-5 rescerende, kemiluminescerende eller radioisotopisk mærke i overensstemmelse med fremgangsmåder, der kendes inden for teknikken. Til lymphotoxin-immunoprøvninger af kompe-titiv type mærkes lymphotoxin på samme måde. Chloramin-T-radioiodering er egnet til både lymphotoxin- og lympho-10 toxin-antistof-tracerpræparation, eller der anvendes fremgangsmåden beskrevet i J. Klostergaard et al., "Mol. Immun." !£: 455 (1980).

For at simplificere eksemplerne vil visse hyppigt forekommende fremgangsmåder blive betegnet ved korte udtryk.

15 Plasmider betegnes ved lille p med store bogstaver og/eller tal foran eller bagefter. Udgangsplasmiderne i denne beskrivelse med krav er kommercielt tilgængelige, er offentligt tilgængelige på ubegrænset basis eller kan konstrueres ud fra sådanne tilgængelige plasmider i over-20 ensstemmelse med publicerede procedurer. Desuden kendes andre ækvivalente plasmider inden for teknikken og vil være nærliggende for fagmanden.

"Nedbrydning” af DNA henfører til katalytisk spaltning af DNA'en med et enzym, der kun virker på visse steder i 25 DNA'en. Sådanne enzymer kaldes restriktionsenzymer, og de steder, for hvilke hvert af dem er specifikt, kaldes et restriktionssted. "Delvis" nedbrydning henfører til ufuldstændig nedbrydning med et restriktionsenzym, dvs.

1 der vælges betingelser, som resulterer i spaltning af 30 nogle, men ikke alle stederne for en given restriktions-endonucleasee i et DNA-substrat. De forskellige her anvendte restriktionsenzymer er kommercielt tilgængelige, og deres reaktionsbetingelser, cofaktorer og andre krav » DK 172382 B1 35 som fastslået af enzymleverandørerne blev anvendt. Restriktionsenzymer betegnes almindeligvis ved forkortelser sammensat af et stort bogstav efterfulgt af andre bogstaver og derpå almindeligvis et tal repræsenterende den mi-5 kroorganisme, hvorfra hvert restriktionsenzym oprindeligt blev opnået. I almindelighed anvendes omkring 1 pg plasmid eller DNA-fragment med omkring 1 enhed enzym i omkring 20 μΐ pufferopløsning. Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specifi-10 ceret af producenten. Der anvendes almindeligvis inkubationstider på omkring 1 time ved 37 °C, men de kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Efter inkubation fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og den nedbrudte nucleinsyre udvindes 15 fra den vandige fraktion ved udfældning med ethanol. Nedbrydning med et restriktionsenzym følges i sjældne tilfælde op med hydrolyse af de terminale 5'-phosphater med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre to restriktionsspaltede ender af et DNA-fragment i at 20 "cirkularisere" eller danne en lukket løkke, som ville forhindre indsætning af et andet DNA-fragment i restriktionsstedet. Med mindre andet er anført, efterfølges nedbrydning af plasmider ikke af 5'-terminal dephosphoryle-ring. Procedurer og reagenser til dephosphorylering er 25 konventionelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning s . 133-134).

"Udvinding” eller "isolation" af et givet fragment af DNA fra en restriktionsnedbrydning betyder adskillelse af nedbrydningsblandingen ved polyacrylamidgel-elektrofore-30 se, identifikation af fragmentet af interesse ved sammenligning af dets mobilitet i forhold til mobiliteten af markør-DNA-fragmenter med kendt molekylvægt, fjernelse af gelsektionen indeholdende det ønskede fragment og adskillelse af gelen fra DNA. Denne procedure er almindeligt 35 kendt; se f.eks. R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids DK 172382 B1 36

Res." j): 6103-6114; and D. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8.: 4057.

"Southern-analyse" er en fremgangsmåde, hvorved tilstedeværelsen af DNA-sekvenser i en nedbrydningsblanding eller 5 DNA-holdig sammensætning bekræftes ved hybridisering til et kendt, mærket oligonucleotid- eller DNA-fragment. Til de her omhandlede formål skal Southern-analyse, med mindre andet er anført, betyde adskillelse af nedbrydningsblandinger på 1% agarose, denaturering og overførsel til 10 nitrocellulose ved den fremgangsmåde, som er beskrevet af E. Southern, 1975, "J. Mol. Biol." ϋ.: 503-517, og hybridisering som beskrevet af T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15.: 687-701.

"Transformation" betyder indførelse af DNA i en organis-15 me, således at DNA'en er replikerbar, enten som et eks-trachromosomalt element eller en chromosomal integrant.

Med mindre andet er anført, er den fremgangsmåde, der anvendes i denne beskrivelse med krav til transformation af E. coli, CaCl2-metoden ifølge Mandel et al., 1970, "J.

20 Mol. Biol." 51:154.

"Ligering" henfører til den fremgangsmåde at danne phos-phodiesterbindinger mellem to dobbeltstrengede nucleinsy-refragmenter (T. Maniatis et al., Id,, s. 146). Med mindre andet er anført, kan ligering gennemføres under an-25 vendelse af kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 pg tilnærmelsesvis ækvi-molære mængder af de DNA-fragmenter, som skal ligeres.

• "Præparation" af DNA fra transformenter betyder isolering af plasmid-DNA fra mikrobiel kultur. Med mindre andet er 30 anført, kan alkali/SDS-metoden beskrevet af Maniatis et al., Id. s. 90, anvendes.

DK 172382 B1 37 "Oligonucleotider" er korte enkelt- eller dobbeltstrengede polydeoxynucleotider, som syntetiseres kemisk ved den fremgangsmåde, som er inkorporeret ved henvisning i eksempel 1, og derpå renses på polyacrylamidgeler.

5 Alle litteraturhenvisninger er udtrykkeligt inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisningerne.

EKSEMPEL 1

Rensning oa sekvensbestemmelse af lymphotoxin

Den humane lymphoblastoidcellelinie RPMT-1788 (ATCC nr.

10 CCl-156) blev dyrkes i 15 liters omrøringskolber til en celletæthed på 4 x 105 celler pr. ml under anvendelse af et serumfrit dyrkningsmedium (RPMI-1640). Lymphotoxin blev induceret 10 - 20 gange (til 500 - 1000 lymphotoxin-enheder/ml, bestemt som beskrevet nedenfor) over grundni-15 veauer ved inklusion af 20 ng/ml phorbolmyristatacetat i det serumfrie RPMI-1649-medium. Efter 65 timers dyrkning blev cellerne høstet ved filtrering, og lymphotoxin-aktiviteten i filtratet blev absorberet til kontrollerede poreglaskugler (Electronucleonics) i en søjle (5 cm x 20 20 cm), ækvilibreret med 5 mM phosphatpuffer (pH 7,4) og elueret med 50% ethylenglycol i 5 mM phosphatpuffer (pH 7,4). Der blev inkluderet 0,1 mM phenylmethylsulfonylflu-orid (PMSF), en proteaseinhibitor, og 1 mM natriumazid, til inhibering af mikrobiel vækst, i alle puffere under 25 hele rensningen. Eluatet fra glaskuglerne indeholdt 84000 enheder lymphotoxin/mg protein. Dette blev efterfulgt af chromatografi på DEAE-cellulose, chromatografi på Lentil-Lectin-"Sepharose"R og præparativ nativ PAGE som beskrevet i B. Aggarwal et al., 1984, "J. Biol. Chem." 259 (1): 30 686-691. Homogeniteten af proteinet, som var ansvarligt for cytotoxisk aktivitet, blev bestemt ved SDS-PAGE, revers-fase HPLC på en Lichrosorb RP-18 søjle og ved amino-terminal sekvensbestemmelse.

• DK 172382 B1 38

Dette lymphotoxinpræparat indeholdt mere end 95 vægt-% af det leucyl-aminoterminale lymphotoxin med en tilnærmet molekylvægt på 25000 ved SDS-PAGE. Den teoretiske molekylvægt af proteinkomponenten af den N-terminale leucy-5 lart er 18664 dalton; de resterende omkring 6500 dalton blev tilskrevet en glycosylsidekæde ved Asn+62 og måske andre O-forbundne sukkerrester. Vævskultursupernatanten indeholdt formodede multimere af denne art (60000 Da ved TSK-HPLC eller 64000 Da ved "Sephadex* G-100"-chromato-10 grafi).

De resterende 5% af lymphotoxinblandingen var den N-terminale histidylart med en molekylvægt på omkring 20000. Begge arter udviste i det væsentlige samme cytoly-tiske aktivitet, i det mindste inden for grænserne af den 15 variation, som er indeholdt i den nedenfor beskrevne musef ibroblastcellelyse-prøvning.

Tryptisk nedbrydning af de intakte lymphotoxin-molekyler gav kun nogle få fragmenter. Histidyl-aminoterminalt lymphotoxin blev nedbrudt i to fragmenter mellem aminosyre-20 positionerne 89 og 90, medens den leucyl-aminoterminale tryptiske nedbrydning gav fire fragmenter spaltet mellem positionerne 15 og 16, 19 og 20 og 89 og 90.

Mikro-sekvensbestemmelse ved Edman-nedbrydningsteknikken gav sekvensinformation om det intakte molekyle og også om 25 fragmenterne dannet ved tryptisk spaltning.

Yderligere sekvensinformation blev leveret af fragmenter af lymphotoxin produceret ved nedbrydning med carboxypep-tidase P og chymotrypsin, eddikesyrenedbrydning og cyan-bromidspaltning. Næsten hele sekvensen af det humane lym-30 photoxin blev bestemt ved denne metode. 156 på hinanden følgende rester blev bestemt fra aminoterminus. Det var klart ud fra denne sekvensinformation, at forskellene mellem de to lymphotoxinarter var tilstedeværelsen af 23 DK 172382 B1 39 aminoterminale rester i den leucyl-aminoterminale art, som ikke fandtes i den histidyl-aminoterminale art. Den carboxylterminale sekvens ud over de første tre rester viste sig at være vanskelig at bestemme på grund af visse 5 peptidbindinger i dette område og resternes hydrophobe natur.

Der blev udformet et syntetisk gen, som ville kode for proteinsekvensen i den udstrækning, som var bestemt ved mikro-sekvensbestemmelse. Genudformningen inkorporerede 10 en almen E. coli kodontilpasning, dvs. sjældent anvendte E. coli kodoner blev ikke anvendt i denne sekvens. Humane referencekodoner blev anvendt, hvor ingen E. coli kodontilpasning var indlysende. Tilpasningen blev valgt for at hjælpe med til ekspressionen i E. coli og også således, 15 at det syntetiske gen ville være nyttigt som sonde til at identificere den naturlige DNA-sekvens fra humane cDNA-eller genomiske biblioteker. De unikke restriktionssteder Xbal, BamHI, Hindlll og Bglll blev udformet i sekvensen for at hjælpe med ved konstruktionen af fragmenterne og 20 muliggøre yderligere manipulation af genet.

De 58 oprindelige oligomere udformet til det syntetiske lymphotoxingen blev syntetiseret ved fast-fase-phosphit-metoden ifølge M. Matteucci et al., 1981, "J. Amer. Chem. Soc.” 10313185-3190 og S. Beaucage et al., 1981, "Tet.

25 Letters" 22=1859-1862. Størrelsen af disse oligomere lå i området fra 16 baser til 20 baser og er vist i fig. 1A. Overlapninger mellem oligomere var 6 baser lange og udformet til at være unikke. Hele genet blev samlet som vist i fig. IB.

30 Genet blev konstrueret i tre adskilte stykker. Det første, segment A, var 117 basepar langt og repræsenterede 5'-kodeområdet for den aminoterminale ende af leucyl-aminoterminal-arten. Segment B repræsenterede DNA'en, som DK 172382 B1 40 koder for midten af lymphotoxin-molekylet, og var 145 basepar langt. Segment C, 217 basepar langt, blev antaget at kode for alle undtagen 16 aminosyrerester ved den car-boxylterminale ende af lymphotoxin. De oligomere, som 5 krævedes til at syntetisere hvert af segmenterne, blev renset ved elektroforese og derpå hældt sammen. Den relativt lille størrelse af hver oligomer (dvs. 15-20 baser) blev valgt for at reducere fejl ved syntesen.

Hver gruppe af oligomere blev phosphoryleret i en reakti-10 onsblanding indeholdende 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 15 enheder af T4-polynucleotidkinase i et volumen på 50 μΐ; omkring 50 pmol af hver oligomer var indeholdt i reaktionsblandingen. Efter 30 minutter ved 37 °C blev reaktionsblandingen 15 opvarmet til 65 °C for at ødelægge kinaseaktivitet og fik derpå lov at afkøles langsomt til 20 °C i løbet af 1 time. De phosphorylerede oligomere blev derpå ligeret ved tilsætning af 10 enheder T4-DNA-ligase, og reaktionen fik lov at foregå i 2 timer ved 20 °C. DNA-ligasen blev var-20 meinaktiveret, og derpå blev de ligerede oligomere nedbrudt i 3 timer ved 37 °C med restriktionsendonucleaser, som genkendte de beregnede terminalsteder (f.eks. Xbal og BamHI for segment A) . Fragmenter til hvert segment blev isoleret ved elektroforese på en 7% polyacrylamidgel.

25 Fragmenter med den korrekte mobilitet blev identificeret for hvert segment ved ethidiumbromidfarvning og elektro-elueret fra gelen. pFIFtrp69 (D. Goeddel et al., 1980, "Nature" 287: 411-416 eller Crea et al., EP patentansøgning nr. 0048970) blev nedbrudt med Xbal og BamHI, og det 30 store vektorfragment isoleret ved 6% polyacrylamidgel-elektroforese. Omkring 50 ng af segment A blev ligeret til pFIFtrp69-fragmentet. På lignende måde blev segment B ligeret ind i BamHI- og HindiII-nedbrudt pBR322, og segment C blev ligeret ind i Hindlll- og BglII-nedbrudt 35 pLeIFA-125-1 (D. Goeddel et al., 1980, "Nuc. Acids Res." DK 172382 B1 41 4057-4073). Ligeringsreaktionsblandingerne blev transformeret ind i E. coli ATCC 31446, og de resulterende re-kombinante plasmider blev karakteriseret ved restrikti-onsendonuclease-analyse og DNA-sekvensbestemmelse ved Ma-5 xam and Gilbert's kemiske nedbrydningsmetode. Fem af seks segment-A-kloner indeholdt den ønskede sekvens. Fire seg-ment-B- og fire segment-C-plasmider blev isoleret, og alle disse indsætninger havde de korrekte sekvenser. Hvert segment blev isoleret ved nedbrydning med restriktionsen-10 donucleaser, som genkendte de terminale steder, og derpå ligeret til plasmidvektoren pFIFtrp69 nedbrudt med Xbal og Bglll. Det resulterende rekombinante pismid, pLTXBl, blev karakteriseret ved sekvensbestemmelse af det indsatte Xbal-BglIl-fragment, som indeholdt den i Fig. 1A viste 15 sekvens.

For at bestemme om det syntetiske gen virkelig ville producere biologisk aktivt lymphotoxin, blev E. coli pLTXBl-transformanterne dyrket i minimalmedier under betingelser, som skulle derepressere trp-promotoren og tillade 20 ekspression af det syntetiske lymphotoxingen. Kulturer blev dyrket til en optisk tæthed på 1,0 ved 550 nm og høstet ved centrifugering. Cellepillen blev suspenderet i 1/10 volumen og derpå lyseret ved ultralydbehandling.

Lymphotoxin-aktivitet blev bestemt ved den modificerede 25 cellelyse-prøvning ifølge B. Spofford, 1974, "J. Immu nol." 112 r 2111. Kort fortalt blev muse-L-929-fibroblast-celler dyrket i mikrotiterplader i nærvær af actinomycin D. Efter 12-18 timer blev 0,125 ml rækkevis fortyndet prøve, som skulle prøves for lymphotoxin, tilsat til 30 hvert hul. Efter 18 timer blev pladerne vasket, og den af lymphotoxin inducerede lyse af cellerne blev detekteret som hæftende til pladerne ved farvning af pladerne med en 1% opløsning af krystalviolet i methanol/vand (volumenforhold 1:4). Intensiteten af farvningen blev iagttaget DK 172382 B1 42 både visuelt og spektrofotometrisk ved absorbans af 450 ran og 570 ran transmission under anvendelse af et Dyna-tech-spektrofotometer. Cellerne udsået i et mikrotiterhul med dyrkningsmedium alene blev sat til 0% lyse, medens 5 dem med 3 M guanidinhydrochloridopløsning udgjorde et endepunkt for 100% lyse. En enhed af lymphotoxin defineres som den mængde, der kræves til 50% cellelyse ud af 12000 celler udsået i hvert hul. Bemærk at andre prøvninger af cytotoxisk aktivitet også kan anvendes. Se f.eks. B. Agio garwal et al. i "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington Univ. Medical Center (den A549-cellelinie, som der henvises til i dette materiale, er tilgængelig fra ATCC som CCL 185) . Kulturlysater viste 15 udetekterbar cytolytisk aktivitet ved den ovenfor beskrevne musecelleprøvning. Kontrollysater fra γ-interfe-ron-udtrykkende kulturer indeholdt faktisk γ-interferon-aktivitet. Dette resultat tydede på, at det syntetiske gen ikke kodede for et aktivt lymphotoxin. Der var flere 20 mulige forklaringer på dette. F.eks.: (1) E. coli organismen nedbrød lymphotoxinet, (2) lymphotoxingenet blev ikke transcriberet i E. coli, (3) lymphotoxinbudskabet blev ikke translateret i E. coli, (4) proteinet havde ikke den rette sekvens på grund af en proteinsekvensbestem-25 melsesfejl eller (5) den carboxylterminale sekvens på 16 rester eller en portion deraf var faktisk nødvendig for aktivitet eller for den rette konfiguration af lympho-toxinmolekylet.

EKSEMPEL 2 30 Procedure til opnåelse af cDNA. som koder for lymphotoxin RNA blev isoleret fra en kultur af en ikke-hæftende cellefraktion af humane perifere blodlymphocytter 48 timer efter induktion med phorbolmyristatacetat (10 ng/ml), DK 172382 B1 43 staphylococ-enterotoxin B (1 pg/ml) og thymosin α-l (S. Berger et al., 1979, "Biochemistry", U.: 5143-5149). Denne kultur producerede 400 enheder lymphotoxinaktivitet/ml supernatant. mRNA'en blev koncentreret ved adsorption til 5 immobiliseret obligo-dT, elueret, og cDNA præpareret ved revers transcription (P. Gray et al., 1982, "Nature" 295: 503-508). Revers transcriptase blev anvendt til at fremstille en cDNA-kopi af mRNA'en ved standardmetoder, en anden streng blev fremstillet (også ved standardmetoder)

10 ved Klenow-behandling, og cDNA'en blev behandlet med S-l nuclease for at fjerne hårnålsløkken. For at indsætte denne cDNA i en vektor blev enderne ligeret til en adaptor eller linker til skabelse af 5'- og 3'-restriktionsenzymsteder eller, fortrinsvis, kohæsive ender til et 15 forudbestemt restriktionsenzymsted. Oligonucleotidet 5'-HO-AATTCATGCGTTCTTACAG

GTAC GCAAGAATGTC-P 5'

blev anvendt til dette formål. Oligonucleotidet blev ligeret til cDNA'en, og cDNA'en isoleret igen ved polyacry-20 lamidgel-elektroforese. XgtlO, en offentligt tilgængelig fag (eller dens væsentlige ækvivalent, \gtll, som er tilgængelig fra ATCC) blev nedbrudt med EcoRI, og det lineære fragment udvundet (M. Wickens et al., 1978, "J. Biol. Chem." 253; 2483-2495). Den med linker forsynede reverse 25 transcript og XgtlO-nedbrydningsblandingen blev ligeret, og ligeringsblandingen anvendt til at transficere E. coli C-600 eller en anden kendt vært, som er modtagelig for λ-fag-infektion. Omkring 10000 rekombinante fager blev ud-sået på en 15 cm plade og screenet ved en lav-stringens 30 plak-hybridiserings-metode (T. Maniatis et al., 1978, "Cell" li: 687-701 og P. Gray et al., "PNAS" ££: 5842-5846) under anvendelse af en P-mærket sonde fremstillet ud fra segment A i Fig. 1A ved fremgangsmåden ifølge J. Taylor et al., 1976, "Biochem, Biophys. Acta" 442: 324-35 330, hvorved der anvendtes kalvethymus-DNA-primere (PL

i DK 172382 B1 44

Biochemicals). Dobbeltsæt af nitrocellulosefiltre blev hybridiseret ved lav-stringens-metoden med 5 x 107 tæl-linger/min af sonden i 20% formamid. Filtrene blev vasket to gange i 0,3 M natriumchlorid, 0,03 M natriumcitrat og 5 0,1% natriumdodecylsulfonat (SDS) ved 37 °C.

To fager hybridiserede med sonden og blev plakrenset. De rensede fager hybridiserede med både segment-A-sonden og en sonde fremstillet ud fra segment B. cDNA-indsætnin-gerne i de to hybridiserende fager, XLTl og λΙ/Γ2, blev 10 subklonet ind i M13mp8 og sekvensbestemt ved dideoxykæde-afslutningsmetoden (A. Smith, 1980, "Methods in Enzymolo-gy" £5.: 560-580). Indsætningen i λΙ/Γ2 var kun på omkring 600 bp og indeholdt ikke hele 3'- kodeområdet for lympho-toxin. Indsætningen i λΙ/ΓΙ indeholdt hele kodeområdet for 15 leucyl-aminoterminalt lymphotoxin plus et 650 bp 3'-utranslateret område (indeholdende et consensus- polyadenyleringssignal) og kodoner for 18 aminosyrer ami-noterminalt for leucyl-terminus. Da dette ikke udgjorde hele lymphotoxin-kodeområdet, blev der fremstillet en 20 yderligere P-mærket sonde ud fra cDNA-indsætningen i λΙιΤΙ, som blev anvendt til at screene yderligere 25000 rekombinante XgtlO-fager ved høj stringens (se T. Huynh et al., 1984, i Practical Approaches in Biochemistry IRL Press, Oxford). 12 yderligere hybridiserende fager blev 25 isoleret, og sekvensen af den længste indsætning, fra XLTll, er vist i fig. 2A. Den længste åbne læseramme blev translateret startende ved den første iagttagne ATG-kodon. Tallene over hver linie angiver aminosyreposition, og tallene under hver linie angiver nucleotidposition.

30 Leucylresten mærket "1" repræsenterer den første sekvensbestemte rest af leucyl-aminoterminalt lymphotoxin (fig.

1A) og er antageligvis den første aminoterminale rest i den modne art af lymphotoxin. De første 34 rester repræsenterer en signalsekvens. Resterne 156 - 171 havde ikke DK 172382 B1 45 kunnet bestemmes ved proteinsekvensbestemmelse af lymphotoxin, men blev i stedet tilskrevet ud fra nucleotidse-kvensen.

EKSEMPEL 3 5 Konstruktion af en hybrid syntetisk-gen/naturlia-cDNA-ekspressionvektor for leucyl-aminoterminalt lymphotoxin

Denne konstruktion er vist i fig. 2B. pLTXBl (indeholdende det inaktive syntetiske gen) blev delvis nedbrudt med EcoRI og PstI, og et 685 bp fragment inde-10 holdende DNA, som koder for 125 N-terminale rester af lymphotoxin, blev udvundet. En delvis PstI-nedbrydning blev gennemført på grund af tilstedeværelsen af et yderligere Pstl-sted ved resten 10 (fig. 1A). Et 301 bp fragment indeholdende DNA, som koder for de C-terminale 51 15 aminosyrer i lymphotoxin, blev isoleret ved nedbrydning af den subklonede c DNA fra XLTl med EcoRI og PstI (disse steder er vist ovenover i fig. 2A ved nucleo tidpos it ionerne 554 og 855). Disse fragmenter blev isoleret ved elektroforese på 5% polyacrylamid og elektroeluering.

20 Fragmenterne blev ligeret ind i pBR322, som var blevet nedbrudt med EcoRI og dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase for at reducere baggrundstransforman-ter. Det resulterende ekspressionsplasmid, pLTtrpl, blev karakteriseret med hensyn til rigtig orientering og se-25 kvens ved restriktionsendonuclease-nedbrydning og DNA-sekvensbestemmelse. Leucyl-aminoterminalt lymphotoxin blev udtrykt ved transformation af E. coli 31446 med pLTtrpl og dyrkning af trans formanterne i medium indeholdende tetracyclin ved 37 °C i 4 - 6 timer, indtil der var 30 opnået en optisk tæthed på 1,0. Cellelysaterne indeholdt cytotoxisk aktivitet. Den leucyl-aminoterminale ende af den udtrykte lymphotoxinart fandtes at være substitueret DK 172382 B1 46 med en blokeret methionylrest. Det antages, at produktet af denne syntese er formylmethionyl- frem for methionyl-arten.

EKSEMPEL,! 5 Immunoaffinitetsrensnina af lymphotoxin

En monoklonal musecellelinie, som secernerede anti-lymphotoxin (eksempel 8) blev dyrket i mus og renset fra ascitesvæske ved ionbytterchromatografi. Anionbytterelua-

O

tet blev koblet til cyanbromid-aktiveret "Sepharose" i 10 en koncentration på 2 mg/ml harpiks. En 20 ml søjle blev ækvilibreret i rækkefølge med IBS (indeholdende 0,05 M "Tris"-HCl, pH 7,0, 0,15 M natriumchlorid og 2 mM EDTA); derpå med elueringspuffer (indeholdende 0,1 M eddikesyre, pH 4,5, 150 mM natriumchlorid); og endelig med TBS. Et 15 bundfald opnået ved fældning af et ultralydbehandlet lysat af pLTtrpl-transformeret E. coli (som først var klaret ved centrifugering) med 40% mættet ammoniumsulfat blev suspenderet i 0,1 M "Tris"-HCl, pH 7,4 og 5 mM EDTA og påført søjlen med en hastighed på 1 søjlevolumen pr.

20 time. Efter omfattende vaskning med TBS indeholdende 0,05% "Tween-20,,R blev specifikt bundet materiale elure-ret roed elueringspufferen, pH-værdien øjeblikkeligt indstillet til 7,8 med 0,1 volumen 1 M ”Tris"-HCl, pH 8,5, og opbevaret ved 4 °C. Den specifikke aktivitet af dette 25 rensede lymphotoxin var (2 - 10) x 107 enh./mg målt ved den ovennævnte muse-L-929-prøvning.

Eluatet indeholdt det meste af den aktivitet, som blev påført søjlen. Hovedparten af det totale eluatprotein vandrede som et enkelt bånd under både reducerende og ik-30 ke-reducerende betingelser ved SDS-polyacrylamidgelelek- DK 172382 B1 47 troforese. Mobiliteten af dette bånd svarer til en molekylvægt på omkring 18000, hvilket stemmer overens med den forudsagte molekylvægt på 18664 for uglycosyleret leucyl-aminoterminalt lymphotoxin baseret på den afledte amino-5 syresekvens. For yderligere at karakterisere dets biologiske aktiviteter blev det rensede rekombinante lymphotoxin prøvet for cytolytisk aktivitet in vitro og antitumor-aktivitet in vivo.

EKSEMPEL 5 10 In vivo biologisk aktivitet af rekombinant lymphotoxin

Rekombinant og lymphoblastoid-lymphotoxin blev prøvet ved en in vivo tumornecrose-prøvning. MethA(a)-sarcomer blev dyrket i 7 - 10 dage i modtagelige mus [BALB/C x C5781/6fl eller CB6fl], og tumorerne derpå direkte inji-15 ceret med lymphotoxin fra eksempel 4, lymphoblastoid-lymphotoxin (fremstillet og renset som beskrevet ovenfor) eller kontrolprøver. Efter 20 - 24 timer blev musene aflivet, og tumorerne blev udtaget og histologisk bedømt for graden af necrose. Som vist i tabel 1 frembragte både 20 rekombinant og lymphoblastoid-lymphotoxin signifikant necrose af MethA(a)-sarcoma in vivo. Kontrolprøver inducerede ikke necrose af MethA(a)-sarcomerne.

DK 172382 B1 48

TABEL JL

Necrose af Meth(a)sarcoma in vivo med rekombinant og naturligt lymphotoxin

Antal mus

Sarcoma-necrose-bedømmelse

Behandling +++ ±± ± r.

Puffer 1 kontrol 3

Lymphoblastoid-lymphotoxin, 4 25000 enheder

Lymphoblastoid-lymphotoxin, 4 - - - 10000 enheder

Rekombinant lymphotoxin, 14 2 2 - 200000 enheder

Rekombinant lymphotoxin, 3 - - 1 25000 enheder

Rekombinant lymphotoxin, 3 - 1 10000 enheder

Puffer 2 kontrol 9

Lymphoblastoid-lymphotoxin blev injiceret opløst i puffer 1 (0,01 M "Tris"-HC1, 0,05 M (NHA)2HC03, pH 8,0), og re-5 kombinant lymphotoxin blev injiceret opløst i puffer 2 (0,15 M NaCl, 0,1 M natriumacetat og 0,1 M "Tris"-HCl, pH 7,8).

Fraværet af carbonhydrat på rekombinant lymphotoxin viser sig ikke at påvirke den biologiske aktivitet, da den spe-10 cifikke aktivitet af lymphotoxin produceret af rekombinant kultur [(2 - 10) x 107 enh./mg] er tilnærmelsesvis DK 172382 B1 49 den samme som den, der er rapporteret for lymphoblastoid-lymphotoxin (4 x 107 enh./mg).

Aktiviteten af rekombinant lymphotoxin viste også en lignende termolabilitet som naturligt lymphotoxin, dvs. in-5 aktivering i vandig opløsning efter opvarmning i 1 time til 80 °C.

EKSEMPEL 6

Konstruktion af en ekspressionsvektor for methionvl-his-tidyl-aminoterminalt lymphotoxin 10 Konstruktion af et plasmid, som dirigerer ekspressionen i E. coli af methionyl-histidyl-aminoterminalt lymphotoxin er skitseret i fig. 3. Et syntetisk oligonucleotid blev indsat i ekspressionsplasmidet således, at det kodede for en methionin-startkodon op til histidylkodonen i 15 histidyl-aminiterminalt lymphotoxin (rest 24 i fig. 2A). Dette blev gennemført ved at isolere et 4630 bp vektorfragment fra pLTtrspl ved Xbal- og Clal-nedbrydning, præparativ 1% agarosegel-elektroforese og elektroeluering.

Et 570 bp BamHI-Clal-fragment indeholdende det meste af 20 lymphotoxinkodesekvensen blev også isoleret fra pLTtrpl på samme måde. To syntetiske oligonucleotider blev syntetiseret ved de tidligere omtalte fremgangsmåder og blandet med oligonucleotiderne 6, 7, 52 og 53 i fig. 1A. Omkring 50 pmol af hvert oligonucleotid blev behandlet med 25 polynucleotidkinase som beskrevet i eksempel 1. Oligonucleotiderne blev annealet og derpå ligeret med en blanding af 570 bp BamHI-Clal-f ragmentet og 4630 bp Xbal-Clal-vektorfragmentet. Ligeringsblandingen bive transformeret ind i E. coli ATCC 31446, og rekombinanter blev se-30 lekteret på basis af resistens over for tetracyclin.

DK 172382 B1 50

Plasmidet p20KLT blev udvundet fra én af transformanterne. Plasmidet p20KLT blev karakteriseret ved restriktionsenzym- og DNA-sekvens-analyse.

EKSEMPEL 7 5 Fremstilling af cytotoxisk lymphotoxinfusionsvariant

Et plasmid indeholdende DNA, som koder for en fusion af lymphotoxin med et bakterielt protein, blev konstrueret ved kloning af en sekvens, som koder for en bakteriel signalsekvens op til strukturgenet for lymphotoxin. Se-10 kvensen af genet for det varmestabile Enterotoxin II (STII) i E. coli er blevet karakteriseret (R.N. Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" 42. s 269-275) og koder for en signalsekvens på 23 aminosyrer, som dirigerer sekretionen af STII til det periplasmiske rum i E. coli.

15 Plasmidet pWM501 (Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" 42.(1): 269-275) indeholder genet for det varmestabile enterotoxin (STII). En portion af DNA'en, som omfatter STII-genet, blev udvundet fra pWM501 under anvendelse af de følgende trin. pWM501 blev nedbrudt med Rsal, 20 og 550 bp DNA-fragmentet blev isoleret. Dette genfragment blev ligeret til fagen M13mp8 (J. Messing et al. in the Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), s. 143-153), der i forvejen var blevet nedbrudt med Smal. Den 25 ligerede DNA blev anvendt til at transformere E. coli JM101, en kommercielt tilgængelig stamme til anvendelse med Ml3-fagen. Klare plakker blev udvundet. Det dobbeltstrengede Ml3mp8-STII-Rsa-derivat blev isoleret fra en E. coli JM101 inficeret med denne fag under anvendelse af 30 standardprocedurer (J. Messing et al., ovenfor). Ved an- DK 172382 B1 51 vendeisen af den netop beskrevne M13mp8-subkloningsproce-dure er fragmentet på omkring 550 basepar indeholdende STII-leder-genet nu afgrænset af en række forskellige re-striktionsendonuclease-steder tilvejebragt af fagen.

5 M13mp8-STII-Rsa-derivatet blev derpå nedbrudt med EcoRI og PstI, og et DNA-fragment lidt større end 550 bp DNA-fragmentet blev isoleret.

EcoRI-Pstl-fragmentet blev subklonet i pBR322. Dette blev gennemført ved nedbrydning af pBR322 med EcoRI og PstI og 10 isolering af vektoren. Den isolerede vektor blev ligeret til EcoRI-Pstl-DNA-fragmentet. Denne DNA-blanding blev anvendt til at transformere E. coli ATCC 31446, og te-tracyclinresistente kolonier blev selekteret. Et plasmid blev isoleret fra en resistent E. coli koloni og betegnet 15 pSTII-partial.

pSTII-partial blev nedbrudt med Mnll og BamHI, og et 180 bp fragment indeholdende STII-Shine-Dalgarno-sekvensen, STII-signalsekvensen og de første 30 kodoner af det modne STII-gen blev isoleret. 180 bp DNA-fragment blev ligeret 20 til et plasmid indeholdende trp-promotoren. Et sådant plasmid, pHGH207-l, er blevet beskrevet tidligere (H. de Boer et al., 1982, i: Promotor: Structure and Function,

Eds R. Rodreguez et al. Chamberlin, Praeger Pub., New York, NY, s. 462-481). Et derivat af dette plasmid, 25 pHGH207-l*, hvori EcoRI-stedet 5' for trp-promotoren var blevet omdannet til EcoRI* ved udfyldning med DNA-polymerase I(DNA pol I) og sammenføjning af de stumpe ender ved ligering (S. Cabilly et al., 1984, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 8.1: 3273-3277), blev anvendt i dette ek-30 sempel. Det trp-promotor-holdige plasmid blev nedbrudt med Xbal og behandlet med DNA pol I og alle fire dNTP'er til udfyldning af den udragende sekvens. DNA-præparatet blev derpå nedbrudt med BamHI, og det vektorholdige frag- DK 172382 B1 52 ment isoleret. Dette vektorfragment blev derpå ligeret til det ovenfor isolerede 180 bp DNA-fragment indeholdende STII-signalet. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli ATCC 31466 til ampicillinresistens.

5 Et plasmid betegnet STII-leder blev isoleret fra en ampi-cillinresistent koloni.

En Ml 3-fag indeholdende STII-kodende sekvenser blev først konstrueret ved ligering af 180 bp Xbal-BamHI-fragmentet af pSTII-leder ind i Xbal og BamHI-nedbrudt M13mpl0. Den 10 resulterende fag-DNA, pSTII-skyttel blev karakteriseret ved restriktionsendonuclease-analyse og nucleotid-sekvens-bestemmelse. Lymphotoxin-kodende sekvenser blev derpå indført i denne vektor ved ligering af 7 00 bp Hbal-EcoRI-fragmentet af pLTtrpl ind i Smal-EcoRI-nedbrudt 15 dobbeltstrenget pSTII-skyttel-DNA i replikativ form (RF); Smal-og Hpal-stederne er begge gjort stumpendede og ligeret sammen, (hvilket resulterer i tabet af begge steder).

Den resulterende fag-DNA, M13-STII-LT, blev karakteriseret og derpå udnyttet til mutagenese som følger; primeren 20 5' p CAAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG, blev kinasebehandlet og blandet med skabelonen (M13-STII-LT) i nærvær af liga-sepuffer og Xbal-EcoRI-nedbrudt M13mpl0-RF-DNA (for at fremme start af DNA-syntese, som rapporteret af J.P. Adelman et al., 1983, "DNA" 2; 183-193)? blandingen blev 25 opvarmet til 95 °C og fik derpå lov at anneale ved stue temperatur i 30 minutter og blev så anbragt på is i 30 minutter. Alle fire deoxynucleotidtriphosphater tilsattes derpå sammen med ATP, T4-DNA-ligase og det store fragment (Klenow) af E. coli DNA-polymerase I. Blandingen blev in-30 kuberet i en time ved 14 °C og derpå anvendt til at transficere kompetent E. coli JM101, en kommercielt tilgængelig stamme, eller enhver anden M13-fag-vært. Korrekt mutageneret fag blev identificeret ved hybridicerings- o 9 screening under anvendelse af den P-radio-mærkede pri- DK 172382 B1 53 mer som sonde. Den resulterende fag SI-LT-mut blev karakteriseret ved DNA-sekvens-analyse. DNA i replikativ form blev præpareret ud fra denne fag og anvendt til isolering af et 761 bp Xbal-EcoRI-f ragment indeholdende DNA for 5 STII-signalsekvensen op til kodesekvensen for leucyl-aminoterminalt lymphotoxin. Denne DNA blev ligeret med Xbal-BamHI-nedbrudt p20KLT (det store 4285 bp vektorfragment) og 375 bp EcoRI-BamHI-fragmentet af pBR322. Det resulterende plasmid, pST18LT, blev karakteriseret ved re-10 striktonskortlægning og DNA-sekvensbestemmelse. Der blev fremstillet en lignende konstruktion, som kodede for en fusion af STII-signalet aminoterminalt for histidinresten i histidyl-aminoterminalt lymphotoxin. De resulterende plasmider blev transformeret ind i E. coli ATCC 31466.

15 Plasmiderne pSTLT18 og pSTLT16 blev udvundet. De blev bekræftet at kode for STII-fusionen ved restriktionsenzymanalyse og dideoxysekvensbestemmelse. E. coli transformeret med plasmidet pSTLT18 eller pSTLT16 syntetiserer STII-signalsekvens-fusioner med leucyl-aminoterminalt og 20 histidyl-aminoterminalt lymphotoxin som bestemt ved overensstemmelse med de beregnede molekylvægte ved gelelek-troforese. E. coli-lysaterne indeholdende disse fusionsproteiner udviste cytotoxisk aktivitet.

Eksempel 8 25 Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonalt museantistof. som er i stand til at neutralisere lymphotoxin

Renset lymphoblastoid-lymphotoxin opnået i eksempel 1 blev dialyseret over for phophatpufret saltopløsning (PBS). 200 )ig lymphotoxin/ml var indeholdt i dialysatet.

30 Der tilsattes glutaraldehyd til dialysatet til en koncentration på 70 mM glutaraldehyd, blandingen blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur, der tilsattes mere gluta- DK 172382 B1 54 raldehyd for at bringe dets totale tilsatte koncentration op til 140 mM, inkubationen fortsattes i yderligere 6 timer, og blandingen blev derpå dialyseret overfor PBS. 50 Hg af det glutaraldehyd-tværbundne lymphotoxin (i det 5 følgende betegnet "polylymphotoxin") og 0,5 ml "Freund's complete adjuvant" blev injiceret subkutant i mus (stamme BALB/c). Efter en uge blev musene forstærkningsimmuniseret med 50 pg polylymphotoxin og 0,5 ml "Freund's incomplete adjuvant" halvdelen intramuskulært og halvdelen i 10 det peritoneale hulrum. Serum blev høstet efter 7 dage og prøvet for anti-lymphotoxin-aktivitet ved en ELISA-prøv-ning.

ELISA-prøvningen blev gennemført som følger: en pufret opløsning af renset lymphotoxin blev anbragt i mikroti-15 terhuller anbragt til at overtrække hvert af hullerne med ca. 100 ng lymphotoxin. Den uadsorberede lymphotoxinop-løsning blev suget op fra hullerne. 50 μΐ passende fortyndet prøve blev kombineret med 100 μΐ PBS indeholdende 5 mg/ml okseserumalbumin (PBS-BSA-puffer) og tilsat til 20 hvert hul; inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur, vasket med PBS indeholdende 0,05% "TweenR20", 100 μΐ peberrod-peroxidase-mærket gede(anti-muse)IgG i PBS-BSA-puffer tilsattes til hvert hul, og blandingen blev inkuberet i en time. Hvert hul blev vasket med PBS indeholdende 0,05% 25 "TweenR20", og derpå blev citrat/phosphat-puffer, pH 5, indeholdende 0,1 mg o-phenylendiamin/ml substratopløsning og vandigt 30% H2O2 (i en mængde på 4 μΐ 30 volumen-% H2O2 pr. 10 ml substratopløsning) tilsat til hvert hul. Hullerne blev inkuberet i 30 minutter, reaktionen stoppet 30 med 50 μΐ 2,5 N svovlsyre, og absorbansen målt ved 492 nm. Huller, som viste absorbans større end 1, blev betragtet som anti-lymphotoxin-positive.

Prøverne blev også prøvet for evnen til at neutralisere den cytolytiske aktivitet af lymphotoxin ved muse-L929- DK 172382 B1 55 prøvningen. Serum høstet fra immuniserede dyr eller hy-bridomasupernatanter blev fortyndet efter behov i RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt okseserum og omkring 100 lymphotoxinenheder/ml og udsåeti mikrotiterhuller in-5 deholdende de dyrkede L929-celler som det iøvrigt er konventionelt ved cytolyseprøvningen. I kontrollerne blev alle cellerne lyseret. Neutraliserende antistof blev de-tekteret ved, at lymphotoxinet ikke lyserede L929-celler.

Dyr immuniseret med glutaraldehyd-polymeriseret lympho-10 toxin dannede antistoffer, som var aktive ved ELISA-prøvningen, men der blev ikke detekteret nogen serumneutraliserende aktivitet.

En suspension indeholdende 100 pg lymphotoxin og 1 ml af en 1,64 vægt/vol.-% suspension af aluminiumhydroxid 15 [(Al(OH)3] blev fremstillet og anvendt til at immunisere den samme mus. Musen blev injiceret roed 100 μΐ af suspensionen intramuskulært og 400 μΐ intraperitonealt. Efter en uge blev musen injiceret intravenøst med 10 pg upoly-meriseret og uadsorberet lymphoblastoid-lymphotoxin i 100 20 μΐ PBS. En prøvning af en 1/80 fortynding af dyrets serum 3 dage senere viste tilstedeværelsen af lymphotoxin-neutraliserende antistof.

Milten fra dette dyr blev udtaget. 3 x 107 miltceller blev sammensmeltet med 5 x 107 musemyolomaceller og udså-25 et i mikrotiterhuller indeholdende HAT-medium og omkring 3 000 peritoneale makrofager/mikrotiterhul ifølge proceduren beskrevet af S. Fazekas De St. Groth, 1980, "J. Immunol. Meth." 25.! 1-21. Hybridomer fra huller indeholdende supernatanter, som var positive ved den ovenstående 30 ELISA-prøvning, blev dyrket i 1 ml DMEM-medium med 20% føtalt kalveserum, 10% NCTC-135-medium, 5 x 10"S Μ β-mercaptoethanol og HAT, fordelt i mikrotiterhuller i et statitisk gennemsnit på én celle pr. hul og derpå dyrket DK 172382 B1 56 i et volumen på 1 eller 5 ml af det samme medium. Super-natanten blev derefter prøvet for neutraliserende antistof. Statistisk syntetiserede omkring 2% af de ELISA-positive hybridomer fra aluminiumhydroxid-immuniseringen 5 neutraliserende antistof. Højaffinitets-lymphotoxinanti-stof vælges eventuelt fra denne gruppe af hybridomer.

Eksempel 9

Steds-specifik mutapenese af lymphotoxin

Fremgangsmåden fra eksempel 3 følges nøjagtigt i dette 10 eksempel, undtagen at segment 6 af det syntetiske oligo-nucleotid blev modificeret til at have sekvensen 5'CTCAACTCTGCACCCA3' og dets komplementære streng (segment 53) modificeret til at have sekvensen 3'AGACGTGGGTCGTCGT5'.

15 De modificerede oligonucleotider anneales til de resterende oligonucleotider og ligeres ind i ekspressionsvektoren som beskrevet i eksempel 6. Denne vektor indeholder en 2 bp udskiftning, som ændrede lysinkodonen +28 fra ly-sin til histidin. Histidinmutanten udtrykkes ved trans-20 formation af E. coli ATCC 31446.

Andre steds-dirigerede mutanter fremstilles på samme måde, fortrinsvis idet der vælges kodoner således, at der ikke indføres et EcoRI-restriktionssted, som ville kræve anvendelsen af en delvis EcoRI-restriktionsnedbrydning 25 ved nedbrydningen af pLTXBl ifølge eksempel 3. Mutationerne bør heller ikke indføre yderligere Xbal- eller Bam-HI-steder i fragment A (se fig. IB), BamHI- eller Hin-dlll-steder i fragment B eller Hindlll- eller Bglll-steder i fragment C. Ellers vil der kræves delvise ned-30 brydninger for at samle pLTXBl-mutanten rigtigt; fuldstændig nedbrydning ville give en deletionsmutant frem DK 172382 Bl 57 for den udskiftningsmutant, som er formålet i dette tilfælde .

Eksempel 10

Identifikation af aeonomisk DNA. som koder for muse- oo 5 okse-lvmphotoxin: aminosvresekvens af muse- oa okse-lym-photoxin

Muse- og okse-lymphotoxin-generne blev isoleret fra geno-miske λ-biblioteker. Humant-lymphotoxin-cDNA-fragmentet (PvuII-EcoRI, 600 bp) blev radiomærket med 32P ved hak-10 translation og anvendt som sonde til at screene et muse-genomisk-DNAA-bibliotek (musestamme M600-genomisk DNA i XCharon4A, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, s. 31, 1982) og, uafhængigt deraf, et okse-genomisk DNA-biblio-tek (EP 88622A). Hybridisering gennemførtes ved lav 15 stringens i 20% formamid (Gray and Goeddel "P.N.A.S. USA" 80; 5842-5846 [1983]), og filtre blev vasket 2 gange med en vandig opløsning af 0,3 M natriumchlorid, 0,03 M natriumcitrat og 0,1% SDS. Flere fager, der hybridiserede med den humane lymphotoxin-sonde, blev plakrenset (T. Ma-20 niatis et al., "Cell" 15:687-701 [1978]). Fag-DNA blev præpareret (T. Maniatis et al., "Cell" 15.: 687-701

[1978]), nedbrudt med restriktionsendonucleaser og analyseret ved Southern-hybridisering. Et 3500 bp EcoRI-muse-DNA-fragment og et 2200 bp EcoRI-okse-DNA-fragment hybri-25 diserede hver for sig med den humane lymphotoxin-sonde. Disse DNA-fragmenter blev subklonet i plasmid pBR322 og derpå sekvensbestemt ved dideoxy-kædeafslutnings-metoden (A.J.H. Smith, Methods in Enzymology £5* 560-580 [1980]).

, Den afledte proteinsekvens af muse- og okse-lymphotoxin 30 sammen med sekvensen af humant lymphotoxin til sammenligning, er vist i fig. 4.

DK 172382 B1 58

Eksempel 11

Ekspression af lymphotoxin i aar under styring af ADH-promotoren

Plasmid pLTtrpl nedbrydes med Xbal for at åbne plasmidet 5 ved Xbal-stedet helt nær ved lymphotoxin-startkodonen. De Xabl-kohæsive ender gøres stumpe med Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I med fire dNTP'er. En EcoRI-adaptor.

OH

10 5' ^AATTCCCGGG 3' 3' j-GGGCCC-P 5'

OH

ligeres til det stumpe plasmidfragment, de udragende 5'-15 hydroxyl-ender phosphoryleres under anvendelse af polynu- cleotidkinase, ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli ATCC 31446, og ved restriktionsanalyse identificeres et plasmid pLTtrplRI, som indeholder et yderligere EcoRI-sted proximalt til lymphotoxin-start-20 kodonen. Plasmidet pLTtrplRI isoleres, nedbrydes med Eco-RI, og det lymphotoxin-DNA-holdige fragment Sp udvindes.

Plasmidet pFRPn (EP 60 057) nedbrydes med EcoRI, behandles med alkalisk phosphatase for at forhindre recirkula-risering, ligeres til SP-lymphotoxin-fragmentet under an-25 vendelse af T4-ligase, og ligeringsblandingen anvendes derpå til at transformere E. coli ATCC 31 446. Ampicil-linresistente kolonier giver 2 rækker af plasmider med SP-indsætningen i modsatte orienteringer bestemt ved restriktionsanalyse på agarose-elektroforese-geler. Plasmi-30 derne oprenses fra E. coli transformanter og anvendes til at transformere gær med trpl-mutationen (f.eks. gærstamme RH218, uindskrænket ATCC-deponering nr. 44076) til trp+- DK 172382 B1 59 fænotypen. Plasmider orienteret således, at startkodonen af segment SP er lokaliseret op til alkoholdehydrogenase-promotcr-fragmenter, findes at transformere gæren til lymphotoxin-ekspression. Lymphotoxin udvindes fra eks-5 trakter af gærtrans formanterne. Plasmidstabiliteten ved gæringer i stor målestok kan forbedres ved at anvende et ekspressionsplasmid indeholdende 2 μπι replikationsorigi-net i stedet for det pFRPn-kromosomale replikationsorigin (ars 1) og en kompatibel værtsstamme (J. Beggs, 1978, 10 "Nature" 215l' 104-109).

Eksempel 12

Ekspression af lvmphotoxin i pattedvrceller λΒΤΐΙ (eksempel 2) nedbrydes med EcoRI, og det lympho-toxin-DNA-holdige fragment (den reverse transskript) ud-15 vindes. Plasmidet pEHER (EP 117 060A) nedbrydes med EcoRI, behandles med kalve-intestinal alkalisk phosphatase og ligeres til den med EcoRI-linker forsynede reverse transskript af XLTll. De resulterende plasmider blev dyrket på E. coli ATCC 31446 (EP 117 060A) og betegnet pE-20 HERLT I og pEHERLT II. De indeholdt lymphotoxin-DNA'en i modsatte orienteringer bestemt ved restriktionsanalyse på polyacrylamidgeler. Disse plasmider anvendes til at transficere og selektere CHO DHFR-DUX-B11, CHO 1 og Ltk” celler.

25 Vævskulturceller transficeres ved blanding af 1 pg pEHERLT I eller pEHERLT II fremstillet ovenfor med 10 pg rottebærer-DNA i et volumen på 250 pi, 0,25 M CaCl2, ef-, terfulgt af dråbevis tilsætning af 250 pi HEPES-pufret saltopløsning (280 mM NaCl, 1,5 mM Na2POi,, 50 mM HEPES,

30 pH 7,1). Efter 30 minutter ved stuetemperatur tilsættes opløsningen til vævskulturceller voksende i 60 mM pla-stik-vævskultur-skåle. Der anvendes CHO 1, CHO

60 DK 172382 B1 DHFR-DUX-B11 og Ltk" celler. Skålene indeholder 3 ml kulturmedium passende til værtscellen.

For CHO 1 DHFR DUX-Bll celler er mediet Ham F-12 medium (Gibco) suppleret med 10% kalveserum, 100 pg/ml penicil-5 lin, 100 pg/ml streptomycin og 2 pmM L-glutamin. For Ltk" cellelinien er mediet Dulbecco-modificeret "Eagle's medium" (DMEM) suppleret som ovenfor.

Efter 3-16 timer fjernes mediet, og cellerne vaskes med 20% glycerol i phosphatpufret saltopløsning. Frisk medium 10 sættes til hver plade, og cellerne inkuberes i to dage til.

Selektion af transficerede værtsceller udføres ved tryp-sinering af cellerne efter to dages vækst (hvilket omfatter behandling af cellerne med sterilt trypsin 0,5 mg/ml 15 indeholdende 0,2 mg/ml EDTA) og tilsætning af omkring 3 x 105 celler til 10 mm vævskulturplader med selektive medier. For dhfr" celler er mediet en sammensætning af (F-12 GIBCO)-medium, som mangler glycin, hypoxanthin og thymi-din (GHT‘ medium). For DHFR+ værtsceller tilsættes met-20 hotrexat (100 - 1000 nM) til det normale vækstmedium.

Kontroller køres under anvendelse af transfektionsbetingelser uden noget plasmid og med plasmidet pFD-11 (EP 117 060A) indeholdende normalt DHFR. Kolonier stammende fra celler, som optager og udtrykker DHFR-25 plasmidet, er synlige indenfor 1-2 uger. Der identificeres transformanter, som udtrykker modent lymphotoxin.

i

Claims (35)

1. Lymphotoxinderivat med cytotoxisk aktivitet, kendetegnet ved, at det omfatter den i fig. 2A viste aminosyresekvens, hvori en eller flere aminosyrerester er 5 blevet (a) deleteret eller (b) udskiftet med en eller andre rester, eller (c) en eller flere andre aminosyrerester er blevet indsat; idet lymphotoxinderivatet dog ikke omfatter humant lymphotoxin, som har den i fig. 2A viste sekvens med aminotermini ved Leu+1 eller His+24.

2. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1, som er et humant lymphotoxin.

3. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1, som er et animalsk lymphotoxin.

4. Lymphotoxinderivat ifølge krav 3, hvor det animalske 15 lymphotoxin er bovint.

5. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1, hvori resterne -34 til -1 er blevet deleteret, og som desuden indeholder en indsætning på mindst en aminosyrerest.

6. Lymphotoxinderivat ifølge krav 5, hvori indsætningen 20 er en fusion af et polypeptid med lymphotoxins carboxyl- terminus .

7. Lymphotoxinderivat ifølge krav 6, hvori polypeptidet er sammensmeltet med lymphotoxin via et hydrolysesite for et proteolytisk enzym.

8. Lymphotoxinderivat ifølge krav 7, hvilket derivat er cytolytisk inaktivt før den proteolytiske hydrolyse.

9. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1, som er et hybridt animalsk-humant lymphotoxin. DK 172382 B1

10. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1 omfattende et tumor-necrosefaktor-fragment.

11. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1 indeholdende en udskiftning af en enkelt aminosyrerest.

12. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1 indeholdende en en kelt deletion på fra 1 til ca. 30 aminosyrerester.

13. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1 indeholdende en indsætning af en enkelt aminosyrerest.

14. Lymphotoxinderivat ifølge krav 1, hvori udskiftningen 10 er en udskiftning af en rest fra klasserne af neutrale, sure eller basiske aminosyrerester med en rest, som ikke tilhører den samme klasse som den udskiftede aminosyre.

15. Antistof, som neutraliserer den cytolytiske aktivitet af et lymphotoxinderivat ifølge et hvilket som helst af 15 de forudgående krav, og som er frit for ikke-neutra-liserende antistoffer.

16. Antistof ifølge krav 15, som er et monoklonalt antistof .

17. Antistof ifølge krav 15 eller 16 mærket med et detek-20 terbart stof.

18. Antistof ifølge krav 17, hvori det detekterbare stof er et fluorescerende, kemiluminescent eller radioisoto-pisk mærke.

19. Antistof ifølge krav 15, som er immobiliseret på en 25 overflade eller matrix.

20. Antistof ifølge krav 15, som neutraliserer den cytolytiske aktivitet af et humant lymphotoxinderivat. DK 172382 B1

21. Nucleinsyre, som koder for et lymphotoxinderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14.

22. Nucleinsyre ifølge krav 21, som koder for et humant lymphotoxinderivat.

23. Nucleinsyre ifølge krav 21 eller 22, som er c-DNA.

24. Nucleinsyre ifølge krav 21 eller 22, som er kovalent mærket med et detekterbart stof.

25. Replikerbar vektor omfattende en nucleinsyre ifølge krav 21 eller 22.

26. Vektor ifølge krav 25, som er replikerbar i prokaryo- ter.

27. Vektor ifølge krav 25, som er replikerbar i eukaryo-ter.

28. Vektor ifølge krav 26, som yderligere omfatter en 15 bakteriel promotor operabelt forbundet med nucleinsyren, som koder for lymphotoxinderivatet.

29. Vektor ifølge krav 26, hvori nucleinsyren koder for en fusion af en bakteriel sekretorisk ledersekvens og lymphotoxinderivatet.

30. Vektor ifølge krav 25, som er pLTtrpl.

31. Vektor ifølge krav 25, som er p20KLT.

32. Heterolog celle transformeret med en nucleinsyre ifølge krav 21 eller 22.

33. Celle transformeret med en vektor ifølge krav 25.

34. Celle ifølge krav 33, som er en prokaryot. DK 172382 B1

35. Fremgangsmåde, som omfatter, at man dyrker en celle ifølge krav 33 eller 34, lader lymphotoxinderivatet akkumuleres i kulturen og udvinder lymphotoxinderivatet fra kulturen.