DK172882B1 - DNA indeholdende udtrykkelseskontrolregion fra et eukaryot varmechokproteingen, vektor og eukaryot celle indeholdende DNA'e - Google Patents

Description

i DK 172882 B1 - » Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt kombi nationssystem af genudtrykkelsesenhed og værtsceller, hvilket system er ejendommeligt ved det i krav 1 angivne, plasmider som angivet i krav 12 og 13 (pRV15 med ATCC ac-5 cessionnummeret 39597 og PR84 med ATCC accessionnummeret 39596/ deponeret i overensstemmelse med Budapesttrakta-ten) og fremgangsmåder til fremstilling af et sådant kombinationssystem, som er ejendommelige ved det i krav 14's kendetegnende del angivne. Opfindelsen angår endvidere 10 udtrykkelsesvektorer, som er ejendommelige ved det i krav 17's kendetegnende del angivne, DNA-konstruktioner, som er ejendommelige ved det i krav 23's kendetegnende del angivne, samt fremgangsmåder til fremstilling af translationsprodukter af kompetente gener, hvilken fremgangsmåde 15 er ejendommelig ved deti krav 25's kendetegnende del angivne .

Den industrielle produktion af proteiner, som kodes af specifikke gener, såsom gener, der indkoder hormoner, 20 størkningsfaktorer, virusproteiner, insulin, interferon og lignende, involverer en udvælgelse og isolation af gen-sekvenser ud fra virale, eukaryote og andre RNA- eller DNA-typer, en splejsning af disse sekvenser i form af DNA til DNA-vektorer til opnåelse af rekombinant DNA samt 25 en indføring af det rekombinante DNA i værtsceller, der er i stand til at udtrykke disse gener. Vektorerne kan bibringe de transformerede værtsceller en fænotypisk karakteregenskab, som benyttes til isolations- og kloningsformål. Gen-produkterne isoleres fra cellekulturerne ved 30 hjælp af sædvanlige teknikker.

Indtil nu har bestræbelserne indenfor dette område sædvanligvis været baseret på en tilpasning af mikroorganismer til anvendelse som værtsceller til udtrykkelse af ge-35 ner af interesse. I praksis er de valgte organismer ofte bakterier, eftersom disse kan dyrkes hurtigt, i store DK 172882 B1 2 mængder og ved lave omkostninger. Fremmed DNA kan let indføres i bakterieceller ved anvendelse af vektorer såsom plasmider, cosmider, virustyper og lignende.

i 5 En anvendelse af bakterielle værtsceller er imidlertid ikke altid tilstrækkelig til at opnå en udtrykkelse af udviklede eukaryote proteiner. Mange vigtige eukaryote proteiner modificeres ved glycosylering, acetylering, phosphorylering, specifik proteolytisk kløvning eller på ! 10 lignende måde. I mange tilfælde er post-transskriptionale og post-translationale modifikationer af afgørende betyd-; ning for at kunne bestemme de endelige biologiske egen- : skaber af protein-produkter. Ikke-proteolytiske post- translationale modifikationer af bestemte proteiner, ek-15 sempelvis ved glycosylering, acetylering, phosphorylering _ eller på lignende måde, forløber muligvis ikke på korrekt måde, hvis de overhovedet forløber, i bakterier eller celletyper, der afviger væsentligt fra den celletype, hvori gen-produktet er af interesse, normalt produceres i 20 organismen. Den korrekte form af disse modifikationer kan vise sig at være kritisk ved syntesen af fuldstændigt j kompetente gen-produkter ved molekylært kloning. Når gen produktet f.eks. er et glycoprotein, såsom hæmagglutinin fra influenzavirus, kan den nøjagtige natur af glycosyle-25 ringen påvirke effektiviteten af de antistoffer, som frembringes imod dette syntetiske protein for at beskytte mennesker eller dyr imod infektioner med influenzavirus.

Når endvidere en glycosylering, acetylering, phosphorylering eller en anden modifikation kræves for at stabilise-30 re, aktivere eller formidle den intracellulære transport eller udskillelse af et protein, kan nøjagtigheden af sådanne modifikationer være kritisk for udnyttelsen af disse genetisk frembragte protein-produkter i praksis.

35 På grund af de ovennævnte ulemper ved at anvende bakterier ved syntesen af komplicerede gen-produkter har der væ DK 172882 B1 3 ret gjort et antal forsøg på at indføre DNA som koder, for specifikke eukaryote proteiner, i eukaryote celler.

DNA kan indføres ved co-transformation til passende mu-tante celler, som er utilstrækkelige ved produktionen af 5 et bestemt enzym, såsom thymidinkinase eller hypoxanthin-phosphoribosyl-transferase. Ved derefter at dyrke cellerne i et selektivt medium, som er utilstrækkeligt med hensyn til enzym-produktet, kan man udvælge de transformerede celler efter deres evne til at vokse, dvs. efter deres 10 evne til at producere enzymet. Alternativt kan man co-transfektere cellerne i positiv forstand med henblik på at addere et gen, som vil transducere cellerne til at blive selektivt resistente over for et medikament eller et selektivt medium, såsom methotrexat, neomycin eller 15 lignende. Selv om mange af disse bestræbelser til en vis grad er faldet heldigt ud, har udbytterne af de udviklede gen-produkter i de fleste tilfælde været meget begrænsede .

20 Med henblik på at maksimere udbytterne ved udtrykkelse af fuldstændigt kompetente gen-produkter af interesse vil det være ønskeligt, at det anvendte enhedssystem af værtscelle og genudtrykkelsesenhed består af en udtryk-kelsesvektor, der er afledt af en celletype eller orga-25 nisme, som er i stand til at syntetisere de nævnte kompetente gen-produkter, og at denne udtrykkelsesvektor styrer syntesen af gen-produkterne i den samme eller tilsvarende celletype eller organisme, der anvendes som værtscelle .

30

Varmechok-fænomenet er blevet studeret mest extensivt i Drosophila-melanogaster; se f.eks. Ashburner og Bonner (1979) Cell 1]_: 241-254. Når Drosophila-celler eller -organismer, der normalt befinder sig ved omkring 25 °C, 35 udsættes for en varmebehandling ved 35-37 °C, aktiveres en familie af varmechok-gener, og størstedelen af de ge- DK 172882 B1 4 ner, der er aktive ved 25 °C, transskriberes ikke længere. Syv gener koder for polypeptider med molekylvægt på mellem 22 000 og 84 000 dalton. Under varmebehandlingen syntetiseres næsten udelukkende disse varmechok-5 polypeptider, som efter 8 timers forløb udgør 10% af den totale mængde cellulære proteiner P. Arrigo, (1979), doktorafhandling, universitetet i Geneve). Under varmebehandlingen af Drosophila-celler koder størstedelen af det polysombundne mRNA for varmechok-proteiner (McKenzie et 10 al. (1975) 72: 1117-1121; Mirault et al. (1978) Cold

Spring Harbor Symp. Quant., Biol. £2: 819-827).

Samtlige syv Drosophila-varmechok-protein-gener er blevet klonet. Der kan i denne forbindelse henvises til Livak et 15 al. (1978) PNAS 75: 5613-5617; Schedl et al. (1978) Cell 14: 921-929; Craig et al. (1979) Cell 16: 575-588; Holmgren et al. (1979) Cell 18: 1359-1370; Wadsworth et al.

(1980) PNAS 77: 2134-2137; Corces et al. (1980) PNAS 77: 5390-5493 og Voellmy et al. (1981) Celle 23: 261-270. Et 20 antal af disse gener er blevet sekventeret, se Karch og Torck (1980), Nueleic Acid res. Q: 3105-3123, og Ingola og craig (1982) PNAS 79: 2360-2364.

Alle eukaryote organismer synes at besidde varmechokge-25 ner, se Kelly og Schlesinger (1978) Cell 15: 1277-1288.

Mange af disse varmechok-gener synes at blive bevaret i vidt forskellige arter, og Drosophila-varmechok-gener har vist sig at blive transskriberet i museceller (Corces et al. (1981) PNAS 78.: 7038-7042), frøceller (Voellmy og 30 Rungger (1982) PNAS 79: 1776-1780) og abeceller (Pelham (1982) Cell 3Ό; 517-528. Fusionsgener, der består af Dro-sophila-varmechok-gen-regioner og gen-regioner af Herpes Simplex virus og thymidin-kinase, transskriberes også i disse heterologe cellesystemer. Der er ikke fremlagt no-35 gen vidnesbyrd, som kunne foreslå, at protein-produkterne af disse gener dannes; se f.eks. H. Pelham og M. Bienz, i i DK 172882 B1 5 (1982) p. 43-48 i "Heat Schok from Bacteria to Man", redigeret af Schlesinger, Ashburner og Tissiéres, Cold Spring Harbour Press, og Corces et al (1982) p. 27-34 i "Heat Shock from Bacteria to Man", redigeret af Schlesin-5 ger, Ashburner og Tissiéres, Cold Spring Harbour Press.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes DNA- konstruktioner, der omfatter kontrolelementer afledt af var-mechok-gener knyttet til gener af interesse, hvilke DNA-10 konstruktioner muliggør udtrykkelse af interessante gener i såvel prokaryote som eukaryote celler. Til effektiv syntese af fuldstændigt kompetente gen-produkter anvender man nærmere bestemt en homolog kombination af en udtryk-kelsesenhed og en værtscelle ved udtrykkeisen, og arten 15 af dette homogene system er den samme som arten af den tilsvarende celletype eller organisme, der normalt producerer det pågældende gen-produkt.

Det har overraskende vist sig, at ved den foreliggende 20 opfindelse, hvorved der anvendes fremmede konstitutive gener, som initieres af eukaryotiske varmechok-promoto-rer, tillades produktion i stor målestok af fuldt kompetente og modne proteiner. Det har ligeledes overraskende vist sig, at ved anvendelsen af sådanne varmechok-promo-25 torer hverken inaktiveres trin involveret i udskillelsen af proteiner eller gribes forstyrrende ind i eksporten.

Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til de medfølgende tegninger, hvor 30 fig. la er en skematisk fremstilling af et udsnit af restriktionsdiagrammet for en del af plasmid 132E3, der indeholder to varmechok-protein-gener (hsp) med en størrelse på 70 kdal (fuldt optrukne linier), hvis orienteringer 35 er vist ved pile. Den nederste del af fig. la repræsente- DK 172882 B1 6 rer det relevante partielle restriktionsdiagram for plasmid 51 til sammenligningsformål, fig. Ib er et forstørret billede af et mere detaljeret 5 restriktionsdiagram for en del af plasmid 51 med tilføjede restriktionssteder, herunder de to karakteristiske Sau3A-steder, fig. 2 repræsenterer den fuldstændige DNA-sekvens af en 10 af DNA-strengene, der går forud for hsp-genet med størrelsen 70 kdal i plasmid 51 med undtagelse af de hvide sekvenser på sort baggrund, som findes i en anden gensekvens med størrelsen 70 kdal, som bestemt ved proceduren beskrevet af Maxam og Gilbert (1977), PNAS 74: 560), 15 samt nogle andre vigtige restriktionssekvenser såvel som startstedet for transskription og .translation (vist ved pile), fig. 3a-3d er diagrammer, der viser proceduren ved kon-20 struktion af plasmid pRV15.

Nærmere bestemt viser fig. 3a et restriktionsdiagram for plasmid 51 som efter digestion med Sau3A giver anledning til et fragment med en omtrentlig størrelse på 650 bp, 25 der i det følgende betegnes 650 bp-fragmentet, hvis ene ende er vist i detaljer på fig. 3c (venstre del).

fig. 3b er et restriktionsdiagram for plasmid pMC1403, der efter restriltion med BamHI efterlader den ene ende 30 med en struktur, som er vist i detaljer på fig. 3c (højre del), fig. 3c viser detaljerne af sekvenserne i de ender, der produceres af restriktions-digestionsprodukterne af plas-35 miderne 51 og pMC1403, DK 172882 B1 7 . fig. 3d repræsenterer strukturen af plasmid, som viser bindingen af Sau3A-fragmentet af plasmid 51 til BamHI-stedet i plasmid pMC1403. Positionen af β-galactosidase-genet og af Drosophila-DNA'et er vist i plasmidet ved 5 kraftige linier. Nogle af restriktionsstederne er ligeledes vist, fig. 4a er et fotografi, der viser, hvorledes man karakteriserer strukturen af plasmid pRV15, vist på fig. 3d, 10 ved koloni-hybridiseringsprøven beskrevet af Grunstein og Hogness (1975) PNAS 72: 3961. Dette blev gjort ved at anvende radioaktive prøver fremstillet ved translation af udsnit (Maniatis et al., (1975) PNAS 72: 1184) af enten et 2 kbp Xbal-fragment udskåret fra plasmid 132E3 (se 15 fig. la) eller et mærket 650 bp Sau3A-fragment fra plasmid 51 (fig. 4b). Et antal transformanter, der produceredes ved anvendelse af konstruktionsskemaet på fig. 3, blev testet sammen med nogle kolonier af pMC1403 som kontrol. Disse kolonier er vist ved pile på fig. 4a, 20 fig. 4b viser en tilsvarende koloni-hybridiseringsprøve, hvor der dog som prøvemateriale anvendes Sau3A 650 kbp fragmentet fra plasmid 51. Kontrolkolonierne af pMC1403 er vist ved pile, 25 fig. 5 viser karakteriseringen (ved restriktionsanalyse) af strukturen for plasmid pRV15angivet på fig. 3d. Fragmenternes størrelser, udtrykt i basepar, er anført.

30 Nærmere bestemt er fig. 5a et fotografi, der viser vandringen af forskellige DNA-fragmenter under elektrofore-se. DNA*et blev fremstillet ud fra mini-plasmidpræparater (Davis et al., (1980), Methods in Enzymology, redigeret af Grossmann og Moldave, 55: 404-414) for plasmid 35 pMC1403, pRV15 og to lignende isolater, pRV25 og pRV5.

Disse plasmider blev digereret med restriktionsenzymer * DK 172882 B1 8 som anført nedenfor, og de producerede DNA-fragmenter blev underkastet elektroforese på 0,85% agarose-geler ved en spænding på 150 V i 4 timer, hvorefter båndene blev visualiseret ved farvning med ethidiumbromid efterfulgt 5 af UV-spektrofotometri. Identifikationen af banerne er følgende:

Bane 1 pMC1403 - Sau3A/XhoI

2 " " - Sall/Xbal

10 3 " " Sall/BcoRI

4 pKV25 - Sall/Xhol 5 " " - Sall/Xbal

5 " " Sall/BccRI

7 pRV15 - Sall/Xhol 15 8 " " Sall/Xbal

9 " " Sall/EcoRI

10 pR75 - Sall/Xhol 11 " " - Sall/Xbal

12 " " - Sall/EcoRI

i 20 fig. 5b svarer til fig. 5a med hensyn til et antal digestioner og analyser, som blev udført på identisk måde. Banerne er følgende: 25 Bane 1 pKVl5 - Xhol 2 " " - Xbal 3 " " - Sall/Xhol 4 " " - Sall/Xbal 5 " " - Sall 30 - 6 pKV5 - Xhol 7 n " - Xbal 8 " " - Sall/Xhol 9 " " - Sall/Xbal 35 10 " " - Sall DK 172882 B1 9 fig. 5c svarer til fig. 5a og 5b og angår restriktionsdigestioner og analyser, der er udført for fragmenter separeret på geler af 5% polyacrylamid. Elektroforesen blev gennemført ved 40 V i 14 timer.

5

Bane 1 51 - Sau3A/XbaI

2 51 - Sau3A/XhoI

3 bi - Sau3A

4 pMCl403 - Sau3A

10 5 pRVl5 - 5au3A/XbaI

6 pRVl5 - Sau3A/XboI

7 pRVl5 - San3A

8 Skematisk fremstilling af 51 - Sau3A

9 Skematisk fremstilling af pBR322 - 5au3A 15 fig. 6a-6b refererer til en analyse af orienteringen af Drosophila 70 kdal hsp genets Sau3A-fragment i plasmid pRVl5.

20 Nærmere bestemt er fig. 6a en skematisk fremstilling af størrelserne af de forudsete restriktionsfragmenter, som vil opstå, hvis den ønskede orientering af Drosophila-elementerne og E. coli-p-galactosidase-genet faktisk 25 forekommer i plasmid pRV15.

fig. 6b er et fotografi af en acrylamid-gelanalyse (5%) af resultaterne af en restriktion af plasmiderne pRV15 og pBR322, foretaget for at afprøve den i diagrammet på fig.

30 6a fremførte forudsigelse. Analyserne blev udført som beskrevet for tilfældende repræsenteret ved fig. 5c:

Bane 1 pBR322 - Kinfl

2 pHV15 - EcoRI

3 pRV15 - Xbal/EcoRI

O J

4 pJrølS - Xhol/EcoRI

5 pRVl5 - Xhol DK 172882 B1 10

Positionen af båndene med størrelserne 517, 220 og 154 basepar er angivet ved pile og er udledt af de kendte størrelser af de fragmenter, der opnås ved restriktion af plasmid pBR322 med HinfI.

5

Fig. 7a-7e, som viser plasmider eller fragmenter af plas-mider efter digestion med restriktiorisenzymer, repræsenterer skematisk konstruktionen af plasmid 520, som består i, at man inkorporerer Smal-Sall-fragmentet af pRV15, der 10 indeholder lac-operon-fragmentet og Drosophila 650 bp kontrolelementet, i plasmid pSVod indeholdende BamHI-Sall-restriktionsstedet.

Nærmere bestemt repræsenterer fig. 7a plasmid pRV15, fig.

15 7c repræsenterer pSVad; fig. 7b repræsenterer et Smal-

Sall-fragment af pRV15; fig. 7d repræsenterer pSVod efter udskæring af et MabHI-Sall-fragment; og fig. 72 repræsenterer p520, 20 fig. 8a er et restriktionsdiagram for plasmid-vektor 520, som angiver positionen af de udvalgte restriktionssteder i strukturen af plasmidet, fig. 8b er et fotografi af en agarose-gelanalyse af re-25 striktionsenzym-digestioner af plasmid 520, foretaget som beskrevet i tilfældet med plasmid pRV15 (se fig. 5a) :

Bane 1 - Hindlll

2 - Xhol/EcoRI 30 3 - Hindlll/EcoRJ

4 - PstI

5 - Hindlll/PstI

6 - Pstl/Kindlll/EcoRI

35 7 ” Pstl/EccRI

i DK 172882 B1 11 fig. 8c er et fotografi, der ligeledes refererer til karakteriseringen af plasmid 520. Det viser en agarose-gelanalyse af forskellige restriktions-digestioner af plasmiderne pSVod, pRV15 og 520-lignende plasmider, dvs.

5 plasmiderne 639, 520, 519, X, Y og Z:

Bane 1 639 - SalX/EcoRI

2 520 - " " 3 519 - " 10 4 516 - " " 5 X - " ·' 6 Y - " ·» 7 Z - " « 8 pSVod - " " 15 9 pRV15 - '· "

10 pSVod - Xhol/EcoRI

11 pRV15 - " "

Det bemærkes, at digestionerne i banerne 8 og 9 er ufuldstæn-20 dige.

fig. 8d er et fotografi, der viser yderligere restriktions-digestioner af plasmid 520 i sammenligning med digestionerne af plasmiderne pSVod og pRV15: 25

Bane 1 pSVod - Pstl/EcoRI

2 pSVod - Hindlll/Sall

3 pRVl5 - Pstl/EcoRI

4 pRVl5 - FTindlll/Sall 30 5 pR7l5 - Sall/Xbal

6 520 - Pstl/EcoRI

7 520 - Hindlll/Sall 8 520 - Sall/Xbal 35 Det bemærkes, at digestionerne i banerne 2 og 7 er ufuldstændige .

DK 172882 B1 12 fig. 9a-9c refererer til konstruktion af plasmid PRBI.

Nærmere bestemt repræsenterer fig. 9a Mount Sinai A/PR8/ms/4,76 plasmidet, hvorfra et fragment (benævnt nr. 20) 5 blev udskåret med BamHI og Hindlll. Fig. 9b repræsenterer pSVod, der mangler et Hindin-Sall-fragment, og fig. 9c repræsenterer plasmid PR81, dvs. ligationsproduktet af BamHI-Hindlll-fragmentet 20 med et SaII-HindIII-dige-stionsprodukt, 10 fig. 9d og 9e er fotografier af en Grunstein kolonihybri-diseringsanalyse af PR81-ligende plasmider, foretaget som beskrevet for pRV15 (se fig. 4). Den i udsnit translate-rede prøve, som blev benyttet, var BamHI/Hindlll-fragment 15 for A/PR/8/ms/4,76. Som en kontrol er nogle pSVod-indeholdende kolonier vist ved pile, fig. 9f er et fotografi af en restriktionsanalyse af de PR81-lignende plasmider, der er vist ved kolonihybridise-20 ringsanalyse på fig. 9d og 9e:

Bane 1 Filter 21, prove 30 - EcoRI

2 " 21, prøve 44 - " " 3 " 22, prøve 11 - " " 9 " 22, prøve 24 - " " ^ 5 " 23, prøve 10 - ” ” 6 " 23, prøve 31 - " " 7 " 24, prøve 8 - " "

8 pSVOD

9 PR B/ms/4,76 30 10 filter 21, prøve 30 - HindHI/Sall 11 " 21, prøve 44 - " " 12 " 22, prøve 11 - " " 13 " 22, prøve 24 - " " 14 " 23, prøve 10 - " " 15 " 23, prøve 31 - " " 16 " 24, prøve 8 - " " 17 pSVod 18 PR B/ms/4,76 " " i DK 172882 B1 13 fig. 10a-10e refererer til konstruktionsplanen for plasmid PR84. Dette plasmid blev konstrueret som vist på fi-5 guren, og konstruktionen består i, at man indsætter hæ-magglutinin-genet (HA) 20, der er til stede i plasmid PR81, i stedet for β-galactosidase-genet i plasmid 520.

Nærmere bestemt repræsenterer figur 10a plasmid 520/ fig.

10 10c repræsenterer plasmid PRBI; fig. 10b repræsenterer et

NeoI-PvuII-fragment udskåret fra 520; fig. lOd repræsenterer PR81 efter digestion med Hindlll og Neol; og fig. lOe repræsenterer PR84 skematisk, 15 fig. lOf er en mere detaljeret fremstilling af PR84 med en streng af basepar indeholdende den sekvens, der hidrører fra PR B/ms. Kun den betydningsfulde sammenknyttende region imellem Drosophila-HS-kontrolelementet og HA-start-sekvensen er vist i detaljer, 20 fig. 11 refererer til en efterprøvning af resultaterne opnået ved konstruktionen af PR84. Nærmere bestemt er fig. 11a et fotografi, der refererer til restriktionsdigestionen af plasmiderne PRBI, PR 8/ms/34, pSVod og 520:

25 Bane i pusl - Hindlll/EcoRI

2 PR81 - Xhol/EcoRI

3 PR81 - ffcol 4 PHB1 - tfcolAhol

5 PR 8/ms/34 - Hindlll/EcoRI

30 6 PR 8/ms/34 - Xhol/EcoRI

7 PR 8/ms/34 - Ncol 8 PR 8/ms/i4 - Ncol/Xhol 9 pSVod - Ncol/Sall 10 pSVod - PvuII/Sall

35 11 pevbd - Hindlll/EcoRI

12 pSVod - Hinfl STANDARD

DK 172882 B1 14

Bene 13 520 - PvuII

14 520 - PvuII/Xbal

5 15 520 - PvuII/XhoI

16 520 - PvuII/EcoRI

17 520 - PvuII/NcoI

18 520 - tfcol 19 520 - Ncol/Xbal 10 20 520 - Kcol/Xhol fig. 11b(1) og 11b(2) refererer til en Grunstein koloni-hybridiseringsanalyse af PR 84-lignende plasmider. En i udsnit translateret radioaktiv prøve (omkring 10° cpm/pg) af : plasmid 51 Sau 3A/Xho I Drosophila-kontrolelement-fragmentet 15 blev benyttet ved disse forsøg, fig. 11c refererer til en 5% polyacrylamid-gelanalyse af Xhol-digestionsprodukterne af PR84-lignende plasmider udvalgt fra de positive kolonier identificeret i. fig. 11b:

O O

Bane 1 filter 3, prøve 12 - Xhol 2 " 3, " 15 (PRB2) - " 3" 3, "22"-" 4 " 3, " 42 (PR84) - " c «» i w ae " _ 'i 25 5 ' 6 " 4, n 19 " - " 7 " 4, " 40 " - " 8 " 5r " 16 " - " 9" 5,” 28"-" 30 10 " 5, " 39 " - "

11 pSVod " - Hinfl STANDARD

fig. Ild refererer til en yderligere restriktionsanalyse af plasmiderne, der giver Xhol-digestionsmønstrene vist 35 på b anerne 2, 4, 6 og 8 på fig. 11c. Analysen blev udført som beskrevet for fig. 11c: •1 DK 172882 B1 15

Bone i 0 x 174 RF - Hael 11 STANDARD

2 filter 5, prøy.e 16 - Xbal/Ncol 5 3 " 5, " 16 - Xhol/Ncol 4 " 4, " 19 - Xbal/Ncol 5 " 4, " 19 - Xhol/Ncol 6 " 3, " 42 - Xbal/Ncol 7 " 3, " 42 - Xhol/Ncol 10 8 " 3, 15 - Xbal/Ncol 9 " 3, " 15 - Xhol/Ncol fig. 12 beskriver karakteriseringen af plasmid p629, 15 fig. 12a refererer til en 5% polyacrylamid-gelanalyse af nogle mulige plasmider fra 629-serien:

Plasmid

Bane 1 629/8 Bglll/EcoRI

20 2 629/7 3 629/6 " 4 629/4 5 DNA-standard 25 fig. 12b refererer til en anden 5% polyacrylamid-gelanalyse af alle otte mulige plasmider fra 629-serien:

Plasmid

Bane 1 629/1 Xhol 30 2 629/2 " 3 629/3 " 4 629/4 " 5 629/5 » 6 629/6 " 35 7 629/7 " 8 629/8 » 5 DK 172882 B1 16 fig. 12c viser en Grunstein koloni-hybridiseringsprøve under anvendelse af det delvis translaterede Xho-Bglll-fragment fra plasmid p622b, fig. 12d viser en Grunstein koloni-hybridiseringsprøve, der gør brug af det delvist translaterede Hindlll/BamHI-Ha-gen-fragment fra plasmid A/PR 8/mx/ 34.

10 Hed den foreliggende opfindelse tilvejebringes metoder og midler til kontrolleret udtrykkelse af et gen i en euka-ryot værtscelle. Den foreliggende opfindelse er særligt nyttig til udtrykkelse af gener fra pattedyr i værtsceller fra pattedyr, typisk i en værtscellekultur, der sva-15 rer til eller er identisk med værtscellen, hvori genet udtrykkes naturligt. På denne måde opnår man post-trans-skriptionale og post-translationale modifikationer af gen-produkterne, hvorved man sikrer, at sådanne resulterende gen-produkter er kompetente.

20

Der anvendes DNA-sekvenser, som omfatter en inducerbar udtrykkelseskontrolregion afledt af et eukaryot gen af et varmechok-protein (hsp). Sådanne kontrolregioner er indu-cerbare, F.eks. ved forhøjede temperaturer, og de omfat-25 ter sekvenser, som er ansvarlige for både den transskrip-tionale og den translationale kontrol af hsp gen-aktiviteten, eksempelvis promotor-regionen (RNA-polymerase-gen-kendelses- og bindingssteder) og sandsynligvis også kontrolsekvenser for varmechok-protein-gener, som er blevet 30 modificeret på en sådan måde, at de tillader en konstitu-tiv udtrykkelse af efterfølgende kodningssekvenser. Kontrolregionen kan også omfatte andre dele af de translaterede og ikke-translaterede regioner i hsp-genet, som deltager i den transskriptionale og/eller translationale re-35 gulering, herunder de 3?-ikke-translaterede sekvenser.

Endvidere kan de sekvenser, der er afledt af den 3'-ikke- DK 172882 B1 17 translaterede region, som flankerer strukturgenet (dvs. den ikke-kodende del af genet af interesse), være omfattet. Man kan bekvemt anvende hele hsp-genet, der omfatter den strukturelle region, såvel som de 5’- og 3'-flanke-5 rende regioner. I det sidstnævnte tilfælde kan genet af interesse indføres internt i strukturregionen, hvorved der efter translation opnås et sammensat protein. Proteinet af interesse kan derefter udvindes på konventionel måde.

10

Betegnelsen "varmechok protein-gen" (hsp) anvendes i nærværende beskrivelse til at betegne hele det område af genet, som er ansvarligt for den inducerbare udtrykkelse af varmechok-proteiner, i særdeleshed omfattende de 51-15 regiurende sekvenser, der kommer før strukturregionen, selve strukturregionen, som indkoder mRNA-transskriptionsproduktet (herunder ikke-translaterede ledersekvenser), og den 3’-flankerende region, der kommer efter strukturgenet.

20

Varmechok-proteingener kan fås fra de fleste højere eukaryote organismer. Man har identificeret særlige varmechok-proteiner i bananfluer (Drosophila), mus, frøer, aber og mennesker. Varmechok-gener, som kan anvendes som 25 kilde for kontrolregionerne ifølge opfindelsen, kan opnås fra enhver af disse eller fra andre eukaryote organismer.

Selv om varmechok-gener afledt fra en bestemt art kan udtrykkes i andre arter og endda i prokaryoter, er det generelt ønskeligt for at optimere fordelene ved udtrykkel-30 se af varmechok-kontrolelementer på både det transskrip-tionale og det translationale niveau, at disse elementer er afledt fra den samme (eller en dertil svarende) organisme eller celletype, som anvendes til udtrykkelse af genet af kommerciel interesse. F.eks. kan de konstruktio-35 ner, der inkluderer gener under kontrol af Drosophila- DK 172882 B1 18 varmechok-elementer, mest fordelagtigt udtrykkes i Dro-sophila-celler under dyrkning.

I den efterfølgende eksperimentelle del benyttede man en inducerbar udtrykkelseskontrolregion opnået fra et varme-5 chok-proteingen, som koder for et 70 kdal varmechok-protein, der findes i Drosophila, til at udtrykke E. co-Ιί-β-galactosidase-genet i E. coli, COS I abeceller og Xenopus occytes. Den samme region blev benyttet til at ! kontrollere udtrykkeisen influenzahæmagglutinin-genet i 10 COS I-celler.

Den inducerbare udtrykkelseskontrolregion ifølge opfindelsen kan kombineres med et ekstrachromosomalt replika-tionssystem for en på forhånd bestemt værtscelle til op-15 nåelse af en udtrykkelsesvektor for denne værtscelle. Sådanne vektorer vil omfatte DNA-sekvenser, der har ét eller flere restriktionssteder til indføring af ét eller ’ flere gener i 3'-stillingen i forhold til kontrolregio nerne, hvorved der opnas en reguleret transskription og ! 20 translation af de indførte gener. Vektoren kan også om- ^ fatte markeringer for udvælgelse i bakterier og i euka ryote værtsceller, et prokaryot replikationssystem, der tillader en kloning af vektoren i en prokaryot værtscelle, og andre DNA-regioner af interesse.

25

Alternativt kan udtrykkelseskontrolregionen knyttes til et ønsket strukturgen, og de resulterende DNA-konstruk-tioner kan indføres direkte i værtscellerne. Metoderne til en sådan direkte overførelse omfatter en indsprøjt-30 ning af DNA i kernerne (Cappechi (1980) cell 22λ 479-488) og en co-transformation ved calcium- phosphat-udfældning (Wigler et al. (1979) Cell JL6: 777-785) eller med DEAE-dextran (J.H. MeCutchan og J.S. Pagano (1968), J. Nat.

Cancer Inst. £1: 351-357).

35 DK 172882 B1 19

Som anført ovenfor kan DNA-konstruktionerne ifølge opfindelsen omfatte forskellige dele af hsp-genet. Disse konstruktioner omfatter i det mindste en 5'-regulerende region, som bærer promotoren, regulerende sekvenser såsom 5 operatorer, aktivatorer, cap-signaler og signaler, der forøger den ribosomale binding, samt andre sekvenser såvel som yderligere DNA-ledersekvenser, der er ansvarlige for den transskriptionale og den translationale kontrol. DNA-konstruktionerne kan også omfatte en del af den pro-10 tein-kodende sekvens af hsp-genet, hvilket resulterer i en produktion af sammensatte proteiner, når det fremmede gen, som skal udtrykkes, indføres efter hsp-sekvenserne.

Hvis man ikke ønsker et sammensat protein, vil det være nødvendigt at fjerne de hsp-kodende sekvenser fra det 15 isolerede hsp-DNA ved sædvanlige metoder, såsom restriktion ved hjælp af enzymer og exonuclease-digestion.

Det kan vise sig ønskeligt at efterlade i det mindste en del af hsp-strukturgenet på et sted i positiv retning fra 20 det naturlige translation-start-codon. På denne måde opnår man et sammensat protein, der omfatter de amino-terminale aminosyresekvenser fra varmechok-proteinet. Når der produceres sådanne sammensatte proteiner, kan det være ønskeligt at indføre selektive kløvningssteder, såle-25 des at det ønskede protein kan separeres fra præcursor-proteinet; se USA patentskrift nr. 4 366 246, som beskriver, hvorledes sådanne kløvningssteder kan indføres.

Udtrykkelseskontrolregionen ifølge opfindelsen kombineres 30 sædvanligvis med en terminator for at opnå en fuldstændig transskriptional kontrol af det indførte strukturgen.

Denne terminator kan bekvemt være afledt fra varmechok-genet selv, omend det indførte strukturgen også kan bære sin egen eller enhver anden passende terminator-sekvens.

35 DK 172882 B1 20

Ekstrachroinosomale replikationssystemer kan også anven des. Blandt egnede replikationssystemer kan anføres autonomt replikerende sekvenser, som beskrevet af Struhl et al. (1979) PNAS 73: 1471-1475, og det 2 pm lange plasmid 5 til replikation i gær. Replikationssystemer til brug i pattedyr kan udledes fra papovavira, såsom abevirus 40 og okse-papillomavirus, adenovira, fugle-retrovira, såsom fuglesarcoma-virus, samt retrovira fra pattedyr, såsom Maloney leukæmivirus.

10 i Ud over det eventuelle eukaryote replikationssystem er det en fordel at tilvejebringe et prokaryot replikationssystem for at muliggøre en kloning af vektoren i en bakteriel værtscelle. Dette gør det muligt at dyrke store 15 mængder af vektoren i velkarakteriserede bakteriesystemer, inden den eukaryote værtscelle transformeres. Egnede prokaryote replikationssystemer er velkendte og omfatter plasmider såsom pBR322, pRK290 og ColEl, samt bakteriop-hager, f.eks. kdv. De prokaryote replikationssystemer vil 20 nødvendigvis omfatte et oprindelsessted for replikation, som kan genkendes af en prokaryot værtscelle, og de vil sædvanligvis omfatte en eller flere markeringer til udvælgelse af transformanter i den prokaryote værtscelle.

Sådanne markeringer omfatter biocid-resistens, toxin-25 resistens og lignende. Alternativt kan man anvende en komplementering, der gør det muligt at dyrke en auxotro-fisk værtscelle i et selektivt medium. Sådanne teknikker er velkendte for fagmanden og behøver ikke yderligere omtale.

30 Sædvanligvis vil de anvendte markeringer være forskellige ved udvælgelse af prokaryote og eukaryote værtsceller. Forskellige markeringer med dominant virkning er nyttige til udvælgelse af transformerede cellelinier fra patte-35 dyr. De omfatter sædvanligvis et specifikt gen, hvis ud-trykkelse bibringer en ny medikament-resistent fænotype DK 172882 B1 21 til pattedyr-cellerne i et passende selektivt medium.

Blandt de specifikke markeringer kan nævnes xanthin-guanin-phosphoribosyltransferase-gen, som kan udvælges i et medium indeholdende mycophenolinsyre og xanthin 5 (Mulligan et al., (1981) PNAS 78: 2072-2076). Transfor-manter med vektorer, der bærer et muse-cDNA-fragment, som koder for dihydrofolat-reductase, kan udvælges til anvendelse i et medium indeholdende aminopterin (Subramani et al. (1981) Mol. Cell Biol. _1: 854-861), og et bakterielt 10 plasmid-gen, der specificerer en aminoglucosid-phospho-transferase, som inaktiverer den antibakterielle virkning af neomycin-kanamycin-derivater, kan udvælges til anvendelse i et medium indeholdende G418, som er et neomycin-derivat, der er toxisk over for de fleste pattedyr-15 cellelinier (Colbere-Garapin et al. (1981). J. Mol. Biol.

150: 1-14).

Det er indlysende, at antallet af kopier af genudtrykkel-sesenheder, der indføres i en værtscelle, kan variere, og 20 at man tilsvarende kan forøge antallet af kopier af integrerede genudtrykkelsesenheder ved en proximal kombination af et af generne, der kan amplifikeres, og ved induktion af amplifikationen af det tilknyttede amplifiker-bare gen og det proksimale DNA. Som eksempel herpå kan 25 nævnes co-amplifikationen af dihydrofolat-reductase-cDNA og E. coli XGPRT (xanthin-guanin-phorphoribosyltransfera-se) genet i ovarie-celler (G. Rungold et al., (1981). J.

Mol. and Appl. Genetics, 1^, 165-175) .

30 Ved den illustrative fremgangsmåde til fremstilling af vektorerne ifølge opfindelsen indføres både udtrykkelses-kontrolregionen af varmechok-proteingenet og det eukaryote replikationssystem i et egnet prokaryot plasmid. Måden og rækkefølgende, hvormed indføringen foretages, er ikke 35 kritisk, og det er blot nødvendigt, at den resulterende 22 DK 172882 B1 vektor tilbageholder levedygtige replikationssystemer for prokaryote og, og nødvendigt, eukaryote værtsceller.

DNA-konstruktionerne, der indeholder kontrol-segmenter 5 fra Drosophila-varmechok-gener, der funktionelt er bundet til et strukturgen af interesse, kan benyttes til at syntetisere produkter af dette gen i Drosophila-celler eller dyrkede celler, der er nært beslægtede med Drosophila.

Eftersom strukturgenet er under transskriptionskontrol og 10 om nødvendigt translationskontrol af varmechok-kontrol-elementet, kan dets udtrykkelse forøges ved f.eks. at hæve omgivelsestemperaturen for cellerne, eksempelvis til området 37-42 °C. Ved en sådan induktion vil en stor fraktion af det netop fremstillede mRNA blive afledt fra 15 strukturgenet. Hvis strukturgenet er et humant gen, der indkoder et protein, som kræver en kompliceret forarbejdning, indeholder udtrykkelsesvektoren fortrinsvis, ud over strukturgenet, replikationselementerne og de markerende gener, et varmechok-kontrolelement udledt fra et 20 humant varmechok-gen. Denne konstruktion kan med fordel indføres i dyrkede humane celler ved de ovenfor beskrevne procedurer, hvilket fører til produkter af det nævnte humane gen. I nødvendigt omfang foretages valget af modtagende humane celler på basis af cellernes kompetence med 25 hensyn til korrekt at udtrykke det fuldstændigt fremstillede genprodukt.

Man kan indføre en lang række forskellige strukturgener i de omhandlede vektorer, hvorved man bliver i stand til at 30 fremstille forskellige gen-produkter, herunder polypepti-der, såsom enzymer, proteiner, hormoner, nye proteinstrukturer og lignende.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksem-35 pier.

DK 172882 B1 23 EKSEMPEL 1

Konstruktion af plasmid pRV15, som indeholder E. coli β-galactosidase-genet under kontrol af et Drosophila-varme-5 chok-kontrolelement_

Et DNA-fragment ved en størrelse på 650 basepar (bp) fra et af de to Drosophila 70 kdal varmechok-protein-gener, indeholdende et kontrolelement for transskriptionen af et 10 varmechok-gen, en komplet RNA-ledersekvens, et translationsstartsignal og en sekvens, der koder for de første få aminosyrer i Drosophila 70 kdal varmechok-proteinet, blev opnået fra en subklan af en del af plasmid 132E3 (Schedl et al. (1978) Cell 14: 921-929; se fig. 1). Plas-15 mid 132E3 indeholder to komplette gener for 70 kdal varmechok-proteinet, og den ovennævnte isolerede sub-klon, som benævnes plasmid 51 (Karch et al. (1981) J. Mol Biol.

148: 219-230), indeholder et fragment af det første varmechok-gen i plasmid 132E3. Dette fragment blev isoleret 20 ved digestion af plasmid 51 med restriktions-endo-nueleaserne Bglll og BamHI.

Den øverste del af fig. la viser et udsnit af plasmid 132E3, og figuren viser de to gener, der indkoder 70 kdal 25 varmechok-proteiner (kraftige linier), og nogle af de identificerede restriktionssteder. Den nederste del af fig. la viser en del af plasmid 51 indeholdende Bglll-BamHI-segment et, der indeholder det ovennævnte 650 bp fragment, afgrænset af Sau3A-kløvningsstederne.

30

Fig. Ib er en mere detaljeret fremstilling af den interessante del af p51 med angivelse af yderligere restriktionssteder, og figuren viser også positionen af 650 bp-fragmentet imellem to Sau3A-steder.

35 DK 172882 B1 24

Fig. 2 angiver DNA-sekvensdata for en af strengene indeholdt i det ovennævnte fragment på 650 basepar. Grænserne for denne sekvens er angivet ved positionen af Sau3A-restriktionsstederne (GATC). Endvidere er Xbal-, Xhol- og 5 Pstl-genkendelsesstederne for restriktion anført, og positionen for transskriptions- og translationsstartsekvensen er angivet ved henholdsvis pilen la og pilen lb.

Fragmentet på 650 bp blev funktionelt indført i plasmid pMC1403 i en position, der muliggjorde kontrol af udtryk-10 kelsen af testgener i dette plasmid. Plasmid pMCl403 (Casadaban et al. (1980) J. Bacteriol. 143: 971-980) er et derivat af plasmid pBR322 (Bolivar et al. (1977) Gene 2: 95-113, der indeholder det samlede E. coli-lac-operon med undtagelse af de sekvenser, der koder for de første 15 syv aminosyrer i β-galactosidase og alle sekvenserne, der befinder sig i 5'-positionen i forhold til den β- galactosidase-protein-kodende region (promotor, riboso-malt bindingssted og translations-startkodon). Det betyder, at lac-stammer af E. coli, såsom MS 1061 (Casadaban 20 et al. (1980) J. Mol. Biol. 138: 179-207), der bærer plasmid pMCl403, ikke producerer β-galactosidase. En po-ly-binder (EcoRI, Smal, BamHI) ved 5'-enden af lac-sekvenserne i pMC1403 tillader en indføring af fremmede DNA-sekvenser på et sted, der kommer før den β- 25 galactosidase-kodende region. En indføring af et segment, der indeholder en funktionel promotor og RNA-ledersekven-ser, vil resultere i produktion af β-galactosidase-aktivitet. Det skal bemærkes, at den amino-terminale ende af β-galctosidase ikke er af afgørende betydning for den 30 enzymatiske aktivitet (B. Muller-Hill og J. Kania (1974)

Nature 561-563) . Alt hvad der kræves er derfor, at den indførte promotor/RNA-ledersekvens tillader en aflæsning i den korrekte aflæsningsramme med den ufuldstændige β-galactosidase-kodende region. Derfor blev 650 bp segmen-35 tet legeret til BamHI-stedet i plasmid pMCl403 foran det ufuldstændige β-galactosidase-gen. Det således opnåede DK 172882 B1 25 nye rekombinante plasmid (se fig. 3) blev betegnet pRV15.

Proceduren ved konstruktion af dette plasmid er vist på skematisk form på fig. 3. På denne figur viser den øverste venstre del (fig. 3a) et udsnit af det ovennævnte 5 plasmid 51 indeholdende 650 bp fragmentet 2, der skal ud-kløves ved hjælp af Sau3A og indføres i BamHI-stedet i plasmid pMC1403 vist på fig. 3b. Det afstumpede lac-operon i plasmid pMCl403 er vist ved den kraftigt optrukne linie med tallet 3 på diagrammet vist på fig. 3b. Det 10 omfatter også et strukturgen for ampicillin-resistens.

Plasmid p51 digereres med Sau3A for at udskære det ovennævnte fragment med en størrelse på 650 bp, der er vist til venstre på fig. 3c ved tallet 2. Dette fragment blev oprenset fra polyacrylamid-geler (se fig. 5c) ved elek-15 traeluering. Fragmentet blev indført på BamHI-stedet i pMC1403 i begge orienteringer. Ligationsblandingen blev derefter benyttet til at transformere lac-stammen af E. coli MC1061. Transformanterne blev udspredt på medier indeholdende ampicillin og X-gal (X-gal er 5-brom-4-chlor-20 3-indolyl-N-D-galactosid), som er et substrat for β- galactosidase, og som efter kløvning med enzymet producerer et identificerbart farvet produkt (se J. Miller, Experiments in Molecular Geneties, pp. 47-55, Cold Spring Harbor, N.Y. 1972). Plasmid pMC1403 producerede ikke β-25 galactosidase-aktivitet ved denne prøve, mens plasmid pRV15 og et stort antal andre transformanter, som var fremstillet som beskrevet ovenfor, viste sig at producere betydelige mængder β-galactosidase, som bestemt ved den frembragte farveændring på X-gal-plader.

30

Endvidere blev β-galactosidase-kodende plasmid-konstruk-tioner såsom pRV15 analyseret yderligere ved koloni-hybridiseringsprøven beskrevet af Grunstein (Grunstein og Hogness (1975) PNAS 72,: 3961-3966), idet man enten an-35 vendte radioaktivt mærkede 650 bp Sau3A-fragmenter fra p51 (se fig. 4b) eller det 2 kbp store Xbal-gen-fragment DK 172882 B1 26 (se fig. la og 4a) fra plasmid 132E3 som hybridiserings-prøver. Disse fragmenter blev radioaktivt mærket ved delvis translation (Maniatis et al. (1975) PNAS 7£: 1184) .

Som det kan ses på fig. 4a og 4b, hybridiserede alle de 5 udvalgte transformanter til begge de radioaktive prøve-DNA'er, hvilket viste tilstedeværelsen af begge DNA-sekvenser i rekombinante plasmider såsom pRV15.

Tilstedeværelsen af det 650 bp store fragment indeholden-10 de kontrolelementet for Drosophila 70 kdal varmechok-genet blev bekræftet ved restriktionsanalyse, se fig. 5a, I 5b og 5c. Plasmid pMCl403 indeholder enkeltstående re- j striktionssteder for EcoRI og Sall, men ingen restrikti onssteder for Xhol eller Xbal. Det 650 bp store Sau3A-15 fragment fra plasmid p51 indeholder imidlertid enkeltstående restriktionssteder for Xhol og Xbal, men indeholder ingen steder for restriktionsenzymer såsom EcoRI og Sall.

I modsætning hertil skulle rekombinante plasmider såsom pRVl5 indeholde enkeltstående steder for alle de oven-20 nævnte fire enzymer (se fig. 3) . En restriktion af rekom-binant DNA fra plasmider såsom pRV15 med Xhol og Sall eller med Xbal og Sall skulle frembringe to fragmenter med en størrelse på omkring 4 og omkring 6,5-7 kbp, hvis den på fig. 3 viste struktur for pRV15 er korrekt. Plasmid 25 pMC1403 skulle imidlertid blive lineariseret. Fig. 5a vi ser et fotografi af DNA-fragmenter frembragt af de ovennævnte restriktionsenzymer efter elektroforese på aggaro-se-geler, og fotografiet bekræfter strukturen af plasmid pRVl5 vist på fig. 3. Disse resultater er igen anført på 30 fig. 5b, hvor det også eftervises, at en digestion med Sall, Xhol eller Xbal hver for sig kun lineariserer pRVl5, hvilket yderligere bekræfter strukturen vist på fig. 3.

35 Hvis pRV15 desuden indeholder det 650 bp store Sau3Afragment af plasmid p51 indført på BamHI-stedet i

= 1 I

DK 172882 B1 27 pMC1403, skulle det være muligt at udvinde det 650 bp store Sau3A-fragment ved digestion af rekombinante DNA’er såsom pRV15 med restriktionsenzymet Sau3A. At dette faktisk er tilfældet, er vist på fig. 5c, bane 7, ved pile-5 ne. Desuden er identiteten af det udskårne fragment med størrelsen 650 bp bekræftet ved dets restriktion med Xbal eller med Xhol; se fig. 5c, bane 5 og 6.

Eftervisningen af, at det 650 bp store Sau3A-fragment og 10 de β-galactosidase-kodende sekvenser har den orientering, der er vist for pRV15 på fig. 3, er anført på fig. 6a og 6b. På fig. 6a er den korrekte orientering vist på skematisk form, og på grundlag heraf vil de respektive dobbelte digestioner med EcoRI og Xbal eller med EcoRI og Xhol 15 kunne forudsige udskæringen af fragmenter fra det 650 bp store fragment, der er korrekt orienteret med hensyn til β-galactosidase-genet 12, hvilke fragmenter har en størrelse på henholdsvis 150 og 220 bp. På fig. 6a viser pilen 11 den transskriptionale retning af varmechok-kon-20 trolelementerne. Den ovennævnte forudsigelse eftervises ved restriktions-gelanalyse som vist på fig. 6b, hvor den dobbelte digestion med EcoRI og Xbal frigør et fragment med en omtrentlig størrelse på 150 bp, mens den dobbelte digestion, med EcoRI og Xhol frigør et fragment med en 25 størrelse på 220 bp, hvilket eftervises ved elektroforese på 5% acrylamid-geler. Disse eksperimenter bekræfter, at plasmid pRV15 har den ønskede kontrolorientering og de ønskede kodende elementer vist på fig. 3. Positionen af båndene med størrelserne 515, 220 og 154 bp er vist ved % 30 pile markeret med den tilsvarende nummerering.

Det hybride plasmid pRV15 og andre identiske isolater, konstrueret som beskrevet i det foregående, producerer væsentlige mængder β-galactosidase, hvilket er bestemt 35 ved at undersøge farveændringerne på X-gal-plader. Tilstedeværelsen af β-galactosidase-protein produceret i E.

DK 172882 B1 28 coli under kontrol af et Drosophila-varmechok-kontrolele-ment er også blevet klart demonstreret ved immun-udfæld-ning af proteinekstrakter af E. coli indeholdende plasmid pRV15 efter radioaktiv mærkning af et netop syntetiseret I 5 protein med 35S-methionin. Et polypeptid med en omtrent lig molekylvægt på 12 000 dalton blev udfældet fra sådan-i j ne proteinekstrakter med immun-sera rettet imod autentisk E. coli-p-galactosidase.

i ! 10 Detaljerne vedrørende konstruktion og udtrykkelse af I pRV15 omtales nærmere i det følgende.

s A. Konstruktion af plasmid pRV15 s 15 10 pg plasmid p51 (fig. la, nederste del) blev digereret i 4 timer ved 27 °C med ti enheder Sau3A (som inkubationspuffere ved denne og alle de andre beskrevne digestioner anvendes de puffere, der foreslås af leverandøren af restriktionsenzymerne: New England Biolabs Cat. 1982).

20 Koncentrationen af DNA under digestionen med Sau3A var 40 “ pg/ml. Digestionsprodukterne blev underkastet elektrofo- rese på en ikke-denaturerende 5% polyacrylamid-gel i 1 x TBE (10,9 g Tris-base, 5,5 g borsyre, 0,93 g NA^EDTA pr.

1 Hz0) puffer. Et Sau3A-digestionsprodukt af pBR322 blev 25 underkastet en elektroforese parallelt hermed og tjente til at identificere det 650 bp store 51 Sau3A promotorfragment (fig. 5c). DNA-fragmenterne blev visualiseret med ethidiumbromid (EtBr). Den region, der indeholdt promotor-fragmentet, og som er angivet ved pilene på fig.

30 5c, blev udskåret fra gelen, og fragmentet blev elektro- eleueret i en dialysepose. Elektroelueringen blev gennemført i 5 timer ved 200 V i 1 x TBE-puffer. Eluatet blev opsamlet i et 15 ml silicone-behandlet Corex-rør og udfældet med ethanol natten over ved -20 °C. Bundfaldet 35 blev opsamlet ved centrifugering (Sorvall, 30 min., 10 000 rpm, SS34 rotor), tørret ved lyofilisering og på in tftif DK 172882 B1 29

ny suspenderet i 200 μΐ TE-puffer (10 mM Tris. HC1, pH

7,5, 1 mM Na2EDTA) . DNA'et blev derefter ekstraheret to gange med TE-roættet phenol og to gange med ether. Opløsningen blev derefter ledt igennem en Sephadex G75 mini-5 kolonne (i en Pasteurpipette). DNA'et i eluatet fra kolonnen blev udfældet to gange med ethanol, tørret og re-suspenderet i 20 μΐ TE-puffer. En mængde på 10 μΐ blev inkuberet med flere enheder Xbal i en passende digestionspuffer i 1 time ved 37 °C. Det partielt digererede DNA 10 blev underkastet elektroforese på en 5% polyacrylamid-gel. Dette eksperiment (fig. 5c) viste, at det isolerede segment var det 650 bp store Sau3A-fragment, eftersom promotor-fragmentet indeholder det eneste Xbal-sted i plasmidet p51.

15

Et μΐ plasmid pMC1403 blev digereret med fire enheder BamHI i 30 minutter ved 37 °C. De digererede DNA blev ekstraheret tre gange med phenol og derefter tre gange med ether. DNA’et blev yderligere renset ved to på hinan-20 den følgende udfældninger med ethanol. Den resulterende DNA-tablet blev tørret og derefter resuspenderet i 20 μΐ TE-puffer.

Prøver på 10 μΐ af opløsningerne indeholdende det 650 bp 25 store promotor-fragment og det digererede pMC1403 blev kombineret og derefter inkuberet natten over ved 14 °C med et overskud af T4 DNA ligase i et totalt volumen på 25 μΐ (inkubationspuffer som anbefalet af New England Biolabs 1982 Cat.). Ligationsblandingen blev derefter inku-30 beret i flere timer med otte enheder BamHI ved 14 °C.

Derefter benyttedes prøver (1, 3 og 7 μΐ) til at transformere 0,5 ml prøver af CaClj-behandlet E. coli MC 1061.

Prøver (0,1 ml) af transformationssuspensionen blev derefter anbragt på LB-agar indeholdende 10^g/ml ampicillin 35 og 40 μπν/ml X-gal. Der observeredes blå kolonier efter inkubation af pladerne natten over ved 37 °C. Omkring 80 DK 172882 B1 30 β-galactosidase-producerende kolonier blev isoleret. Tilstedeværelsen af p51 Sau3A promotor-fragmentet i rekombi-I nanterne blev eftervist ved Grunstein koloni- , hybridisering (fig. 4b). Hybridiseringprøverne blev frem- i 5 stillet på følgende måde: Sau3A promotor-fragmentet fra p51 blev isoleret som beskrevet ovenfor. 50 pg 132E3 blev digereret med 50 enheder Xbal i 2 timer ved 37 °c. Dige-I stionsprodukterne blev separeret på en 0,9% agarose-gel.

Det 2 kbp store fragment (70 kdal) af varmechok-protein- - 10 genet blev elueret elektroforetisk fra gelen og renset som beskrevet ovenfor. Det sidstnævnte fragment og Sau3A-fragmentet af p51 blev derefter 32P-mærket ved delvis translation til en specifik radioaktivitet på 2 χ 108 ^ cpm^g. De to prøver blev derefter denatureret og hybri- - 15 diseret til to nitrocellulosefiltre indeholdende DNA af de 80 udvalgte transformanter og af pMCl403 (fig. 4a og = 4b) . Begge prøver hybridiserede kraftigt til DNA’er af alle 80 rekombinanter, hvilket tydede på, at alle rekom-binanterne indeholdt det 650 bp store promotor-fragment.

20 Klonerne 5, 15, 25, 35, 45 og 55 blev udvalgt til yderligere studier. Små mængder DNA blev fremstillet ud fra hver af disse kloner (Davis et al.,(1980) Methods in En-zymology, redigeret af Moldave, 65: 404-414). Disse DNA'er og pMCl403 DNA blev yderligere sammenlignet ved 25 restriktionsdigestion og elektroforese på 0,9% agarose-geler (fig. 5a og 5b) . Disse resultater antyder, at en restriktion af rekombinante plasmider såsom pRV15 med Xhol og Sall eller med Xbal og Sall frembringer to fragmenter med en størrelse på henholdsvis 4 og 6,5-7 kbp, 30 hvilket bekræfter strukturen af plasmid pRV15 som vist på fig. 3d.

B. Udtrykkelse af et sammensat gen af Drosophila-varme-chok-kontrolelementet og E. coli-P-galactosidase i E. f I 35 coli DK 172882 B1 31

Bakterier, som indeholder det hybride plasmid pRV15, og andre isolater konstrueret som beskrevet i det foregående afsnit producerer betydelige mængder β-galactosidase, hvilket kan eftervises ved at undersøge farveændringerne 5 på X-gal-plader. Tilstedeværelsen af et β-galatosidase-protein, der er produceret i E. coli under kontrol af et Drosophila-varmechokkontrolelement, er også eftervist ved immun-udfældning (Bromley et al. (1979) J. Virol. 86" 93) af proteinekstrakter af E. coli indeholdende plasmid 10 pRV15 efter radioaktiv mærkning af nyligt syntetiserede proteiner med 35S-methionin. Et polypeptid med en molekylvægt på omkring 120 000 dalton blev tydeligt udfældet fra sådanne proteinekstrakter ved hjælp af immun-sera rettet imod autentisk E. coli-p-galactosidase.

15 C. Udtrykkelse af et varmechok-P-galactosidase-hybrid-gen i Xenopus Oacytes

Plasmid pRVl5 (50-100 pg) blev digereret med et overskud 20 af Sall og EcoRI. De to resulterende restriktionsfragmenter blev derefter separeret på 0,85% agarose-geler. Det 7kb fragment, der indeholdt hybrid-genet, men ingen vektor-sekvenser, blev renset ved elektroeluering og gelfil-trering på Sephadex G75. Dette fragment blev derefter 25 inkuberet med et overskud af Ί4 DNA ligase i et totalt volumen på 25 μΐ som beskrevet ovenfor for at muliggøre en cirkeldannelse. De ligerede fragmenter blev indiceret i ooeytes som beskrevet af Voellmy og Rungger (1982) PNAS 79: 1776-1780. Efter en 6-20 timers præinkubation ved 20 30 °C injiceredes oocytes endnu en gang med a-32P-GTP, hvorefter de enten blev varmebehandlet i 2 timer ved 37 °C eller holdt ved 20 °C i det samme tidsrum. Den totale mængde RNA fremstillet fra disse ooeytes eller fra oocytes, der ikke indeholdt fremmed DNA, blev hybridiseret 35 til "Southern blots" af Sal Ι/Eco RI digestionsprodukter af plasmid pMCl403. Ooeytes, der ikke indeholdt hybrid- DK 172882 B1 32 genet, producerede ikke målelige mængder RNA komplementet til β-galactosidase-genet. Både varmebehandlede og ikke-behandlede oocytes, der indeholdt pRVl5-fragmentet, viste sig at have frembragt β-galatosidase-RNA i omtrent lige 5 store mængder.

I en anden forsøgsrække blev ikke-mærket RNA isoleret fra oocytes, der indeholdt hybrid-genet, som enten var blevet varmebehandlet i 2 timer eller inkuberet ved 20 °C i sam-10 me tidsrum i nærværelse eller fravær af en lav koncentration af α-amanitin (Voellmy og Rungger (1982) PNAS 79: ! 1776-1780). Disse oocyt-RNA'er blev mærket ved omvendt transskription som beskrevet af Bromley et al. (1979) J.

Virol. 3L·. 8693 og hybridiseret til pMC1403 "Southern 15 blots". På ny var der β-galatosidase-transskriptionspro-dukter til stede i RNA'erne for såvel varmebehandlede som ikke-behandlede ooeyter. α-amanitin standsede faktisk transskriptionen af hybrid-genet ved begge temperaturer, hvilket tyder på, at RNA polymerase B (dvs. II) var an-20 svarlig for hele den observerede transskriptionale aktivitet.

EKSEMPEL 2 25 Konstruktion af plasmid PR.84, som indeholder et hæmagglu-tinin-gen fra humant influenzavirus, under kontrol af et Drosophila-varmechok-kontrolelement, og anvendelse af plasmidet i eukaryote celler__ 1 2 3 4 5 6

Et plasmid betegnet 520 blev konstrueret ud fra plasmid 2 pRV15 og plasmid pSVod (Mellon et al.(1981) Cell 27: 279- 3 288), hvilket plasmid er i stand til at replikere enten i 4 prokaryote celler eller i visse eukaryote celler. Plasmid 5 520 muliggør en hurtig analyse af den transskriptionale 6 kontrol, eftersom det omfatter et origin for replikation fra SV40-virus og er i stand til at replikere effektivt i DK 172882 B1 33 SV40-mutant-transformerede, transformations-antigen-posi-tive COS celler (Gluzman (1981) Cell Z3: 175-182) .

Den skematiske form af konstruktionen af plasmid 520 er 5 vist på fig. 7. Plasmid pRV15 (fig. 7a, vist på lineær form) blev digereret med Smal og derefter digereret med Sall, og det resulterende fragment med en størrelse på 7 kbp (fig. 7c), der indeholdt det 650 bp store Drosophila-kontrolelement 2 og lacgen-fragmentet 3, hidrørende fra 10 pMC1403 til stede i PRVI5, blev isoleret ved elektrofore tisk eluering fra en præparativ agarose-gel.

Plasmid pSVod (fig. 7c) blev digereret med BamHI, og de kohæsive ender, blev udfyldt med et Klenow fragment af 15 DNA-polymerase, hvorpå DNA'et til slut blev digereret med Sall.

På fig. 7c angiver tallet 10 det sted for udslettelsen af den lkb store pBR322-sekvens, som hævdes at være begræn-20 sende for replikation i eukaryoteceller. Det således dannede afskårne pSVod-fragment (fig. 7d) blev legeret til det 7kbp store fragment, der blev isoleret fra pRV15, og ligationsblandingen blev benyttet til at transformere E. coli MC1061. Strukturen af plasmid 520 er vist på fig.

25 7e, som også giver en mere detaljeret fremstilling af det 650bp store segment med Xbal-, Xhl og Pstl-restriktions-sæderne. Et andet restriktionssted (PvuII) er også angivet og svarer til CAGCTG-sekvensen imellem 60 og 70 bp som angivet på fig. 2. Betydningen af dette PvuII-sted 30 vil blive nærmere beskrevet i det følgende. Plasmid 520 er vist på cirkulariseret form på fig. 8a, hvor segmenterne a, y og z repræsenterer gener af lac-operon'et.

Tallet 11 angiver det fragment, der indeholder SV40-origin'et.

35 DK 172882 B1 34

Tranformanterne blev udspredt på Xgal-ampicillin-plader som tidligere beskrevet, og de blå transformanter, som forventedes at indeholde plasmid 520, blev isoleret. Ud fra strukturen vist på fig. 8a må det forventes, at plas-5 mid 520 fører til de følgende fragmenter, når det digere-res med de angivne restriktionsenzym-kombinationer:

Fragmentstørrelse i kbp Enzymer

0,75/1,1/8,5 Pstl/EcoRI

2,6/7,2 Hindlll/Sall 3,1/6,7 Sall/Xbal

Plasmid 520 frembragte faktisk fragmenter med de korrekte 10 størrelser, når det blev digereret som angivet ved gelanalyserne på fig. 8b, 8c og 8d. Andre fragmenter, som produceres ved forskellige kombinationer af enzym-diges-tioner tjener som kontrolfragmenter ved fortolkningen af de ovennævnte digestioner.

15

Plasmid p81 anbringer et gen, som indkoder for et euka-ryotprotein, i den korrekte aflæsningsramme med det 650 bp store varmechock-kontrolelement af p520. Som udgangsmateriale for denne konstruktion anvendtes, plasmid 20 A/PR8/ms/34 (Mount Sinai), klon nr. 4,76 indeholdende et humant influenza-hæmagglutinin-gen (1775 bp, ciffer 20) indført på PvuII-stedet i vektor PAT 153/Pvu II/8, som opnåedes fra Dr. G. Brownlee (University of Oxford, Department of Pathology, England). Plasmidet indeholdende 25 hæmagglutiningenet (HA), som er det indførte stykke 20 vist på fig. 9, blev digereret med BamHI, og enderne blev udfyldt med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. Efter digestion med HindiII blev hæmagglutanin-genfragmentet renset på agarose-geler. Det indførte stykke 20 indehol-30 der en komplet HA-protein-kodningssekvens, et RNA-leder-segment og 40 bp af en 3'-ikke-translateret sekvens. Det DK 172882 B1 35 HA-gen-indeholdende-fragment blev indført i plasmid-vektoren pSVod til opnåelse af plasmid PR81 på følgende måde: pSVod DNA blev digereret med SALI og enderne blev udfyldt som beskrevet ovenfor, hvorpå DNA’et yderligere 5 blev digereret med Hindlll (se strukturen på fig. 9b) . HA-fragmentet 20 og Sall/Hindlll-digestionsproduktet af pSVod blev ligeret sammen ved anvendelse af T4 DNA ligase i nærværelse af BamHI og Sall til opnåelse af PR81 (se fig. 9c), og ligationsblandingen blev benyttet til at 10 transformere E. coli C 600.

Transformanterne blev analyseret for tilstedeværelse af PR81-lignende plasmider (se fig. 9c med hensyn til den foruddagte struktur) på følgende måde: en Grundsteinkolo-15 nihybridisering blev foretaget på en måde svarende til den måde, der tidligere er beskrevet i forbindelse med pRV15 (se fig. 4) . En delvis translateret prøve af HA-genet (BamHI/Hindlll-fragmentet fra pA/PR 8/34/ms/4,76 kb) blev fremstillet og hybridiseret til de pR81-lignende 20 transformanter (se fig. 9d og 9e) . Fig. 9d og 9e viser autoradiogrammerne af otte kolonier. Det kan ses af fig.

9d og 9e, at denne DNA-prøve hybridiserer til størstedelen af transformanterne. Negative kontrolprøver tilvejebringes af de pSVod-indeholdende kolonier, der på fig. er 25 vist ved pile.

De PR81-lignende plasmider blev yderligere karakteriseret ved restriktionsanalyse som vist på fig. 9f. Den angivne struktur for PR81 på fig. 9c verificeres ved dannelsen af 30 DNA-fragmenter med de følgende størrelser efter digestion med de nedenfor anførte restriktionsenzymer:

Plasmider Størrelse af fragmenter, kbp Anvendte enzymer PR81 3,2; 1,5 - 1,6 EcoRI

DK 172882 B1 36

PR 8/34 3,8; 1,3 EcoRI

pSVod 3,3 EcoRI

PR81 4,5 Hindlll/Sall PR 8/34 3,3; 1,7 - 1,8 Hindlll/Sall pSVod 2,7; 0,6 - 0,7 Hindlll/Sall

Resultaterne vist på fig. 9f viser tilstedeværelsen af de ovennævnte fragmenter.

5 Konstruktionsskemaet for plasmid PR84 er vist på fig. 10a til lOe. I korte træk er teknikken, at plasmid PRB4 placerer HA-genet under kontrol af udtrykkelseskontrolregio-nen af Drosophila-varmechock-genet beskrevet i det foregående. Selve hybrid-genet placeres under replikations-10 kontrol af plasmid pSVod. En digestion af plasmid 520 (fig. 10a) med PvuII og NcOI resulterer i dannelse af to fragmenter, der hver har en længde på omkring en kbp, og hvoraf det ene (fig. 10b) indeholder en den af SV40-sekvensen med origin for replikation og en del af det 650 15 bp store varmechock-kontrolelement, herunder 400 bp af en 5’-ikke-transcriberes sekvens og 60 bp af RNA-leder-sekvensen. De to fragmenter med en størrelse på omkring 1 kbp blev isoleret ved en elektrophorese på preparative geler bestående af 1,2% agarose med lavt smeltepunkt.

20

Plasmid PR81 (fig. 10c) blev digereret med Hindlll, og enderne blev udfyldt med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase, hvorefter DNA'et blev yderligere digereret med NcOI, som har et enkelt overskæringssted i dette 25 plasmid, der befinder sig inden for SV40-sekvensen med origin for replikation (se fig. lOd) . De resulterende PR81-fragmenter blev legeret med de fra plasmid 520 isolerede fragmenter med en størrelse på 1 kbp, og ligationsblandingen blev benyttet til at transformere E. coli C 30 600. De resulterende transformanter omfatter plasmider såsom PR84, hvis forudsete struktur er vist på fig. lOe.

DK 172882 B1 37

En mere detaljeret struktur for PR84, der omfatter forud-5agte strukturer af partielle DNA-sekvenser, er vist på fig. lOf i form af en enkeltstrenget fremstilling af 5 plasmid-sekvenser. Som vist på fig. lOf består PR84 successivt, regnet fra 5'-enden, af et 250 bp stort segment hidrørende fra SV40 og indeholdende et origin for repli-kation, en 346 bp stor sekvens fra pBR322, en 400 bp 5'ikke-transscriberes Drosophila-sekvens (p51; pl32E3, se 10 Karch et al. (1981) J. Mol. Biol. 148: 219-230), der oprindeligt var inkluderet i den 650 bp store varmechok-kontrolsekvens, et Drosophila 65 bp hsp gen-RNA-lederfragment (basepar nummereret 1 til 65), et bindingssegment på 8 basepar, et hæmagglutinin (HA) RNA-15 ledersegment (basepar nummereret 1-32), et HA-signalpep-tid-kodende segment (basepar nummereret 33-83) og et HA-protein-kodende segment (basepar fra 84 og opefter).

Dette temmeligt komplicerede konstruktionsskema, der ud-20 valgtes for plasmid PR84, blev efterprøver ved restriktionsdigestionsanalyse i anvendte forældre plasmider, og resultaterne af disse analyser er vist på fig. 11a. De følgende restriktionssteder kunne forudsiges for plasmi-derne: 25 PR81: 1 Ncol-sted, 1 Hindlll-sted og Ncol-stedet i SV40-sekvense med origin for replikation.

PR 8/ms/34: 1 Ncol-sted, intet sted i HA-gen.

520: 1 Ncol-sted, flere PvuII-steder i lac-operonlet et 30 par Ikbp NeoI/PvuII-fragmenter, af hvilke det ene indeholder origin-hsp 70 promotor-fragmentet.

At disse forudsigelser passer med strukturerne af plasmi-derne, der er illustreret i kanstruktionsskemaerne, vises 35 ved resultaterne af restriktionsanalyserne angivet ved gel-mønstrene på fig. 11a. De to NcoI/PvuII-fragmenter DK 172882 B1 38 med størrelsen I kbp ses klart og er på fig. 11a (bane 17) vist ved en pil.

En yderligere karakterisering af de PR84-lignende plasmi-5 der blev foretaget ved anvendelse af Grunstein-kolonihybridiseringsproceduren beskrevet i det foregående (se fig. 4) . I dette tilfælde anvendtes en delvis translateret probe (omkring 100 cpm/ug) af Sau3A/XhoI-fragmen-tet fra plasmid p51 (indeholdende Drosophila-hsp-kontrol-10 elementet), og resultaterne er vist på fig. 11b.

i j Et antal af de positive kolinier, som identificeres på denne måde, blev opdyrket med henblik på fremstilling af j små mængder af hvert plasmid som beskrevet i det foregå- 15 ende, og der udførtes et antal restriktionsanalyser. De således opnåede gel-mønstre er vist på fig. 11c og lid.

Det forventede mønster for produkterne, der dannes ved s Xhol-digestion, og som kan forudsiges ud fra strukturen : af PR84 vist på fig. 10, er følgende: et Xhol-fragment på 20 405 bp og et meget stort fragment. Fig. 11c viser resul taterne af denne analyse, og plasmid-klonerne i banerne 5 2, 4, 6 og 8 har de forventede mønstre i sammenligning = med HinfI-standard-digestionsmønsteret af pSVod. Disse - plasmider blev udvalgt til yderligere analyse, hvorunder 25 de blev digereret med enten Xhol/Ncal eller Xbal/Ncol. De opnåede resultater er vist på fig. lid. De forventede størrelser af fragmenterne produceret ud fra diagrammet vist på fig. 10 vil være et fragment på omkring 700 bp, et stort fragment og et fragment på 405 bp med Xhol/Ncol, : 30 og med Xbal/Ncol vil de forventede størrelser være et fragment på 650 bp og et stort fragment. Fig. Ild viser værdien af disse forudsigelser for alle de analyserede plasmider.

35 DNA fra plasmid PR84 blev benyttet til transfektion af eukaryote celler. Som egnede celler til udførelse af så- DK 172882 B1 39 danne eksperimenter valgtes COS-celler (Gluzman (1981)

Cell ,23: 175-182) på grund af deres anvendelighed til hurtig udtrykkelsesanalyse af gen-konstruktioner. (Gething og Sambrook (1981) Nature 293: 620-625). Efter transfek-5 tion blev cellerne inkuberet ved enten 37 °C eller 42 °C i nærværelse af mærket methionin (3*S). Derefter blev cellernes indhold analyseret ved immun-udfældning under anvendelse af kanin-antiserum frembragt imod PR 8/ms influenzavirus (en gave fra Dr. J. Skehel, M.R.C.Laborato-10 ries, Mill Hill, London, England). Komplekserne, som blev renset på protein A og Sepharose , blev endeligt underkastet elektrophorese på polyacrylamid-geler og identificeret ved fluorografi. Analyseresultaterne viste tilstedeværelsen (i godt udbytte) af et protein (Mr = 75.000), 15 der ikke kunne skælnes fra autentisk glycosyleret hæmag-glutinin (Elder et al. (1979) Virology 95: 343-350). Syntesen af hæmagglutinin optrådte både ved 37 °c i mindre omfang ved 42 °C Der observeredes ikke nogen sådanne specifikke polypeptider under anvendelse af andre transfek-20 terende DNA’er end PR84 eller i andre immun-komplekser end komplekserne med anti-PR 8-antisera.

Detaljerne vedrørende konstruktion og udtrykkelse af de eukaryote udtrykkelsesvektorer fremgår af det følgende.

25 A. Konstruktion af plasmid 520 50 mikrogram plasmid pRV15 blev først digereret ved 50 enheder Smal i 2 timer ved 37 °C og derefter digereret 30 med 50 enheder Sall i 2 timer ved 37 °C (puffere som anbefalet af New England Biolabs). Digestionsproduktet blev derefter underkastet elektrophorese på en 0,9% agarose-gel. Den region, der indeholdt det 7 kb store lac-fragment, blev udskåret af gelen, og DNA'et blev udvundet 35 ved elektroeluering (200 V, 6 timer).

DK 172882 B1 40 DNA'et i eluatet blev opsamlet ved udfældning med ethanol. Fragmentet blev derefter tørret og resuspenderet i 200 mikroliter TE-puffer, ekstraheret to gange med phenol og ether og derefter ledt igennem en lille Sephadex G75 5 kolonne som beskrevet i det foregående. DNA'et i kolonne-eluatet blev udvundet ved udfældning med ethanol.

10 mikrogram plasmid pSVod blev digereret med 10 enheder BamHI i 2 timer ved 37 °C. Det digererede DNA blev renset 10 ved 3 ekstraktioner med phenol, 3 ekstraktioner med ether og 2 udfældninger med ethanol. Det tørrede DNA blev derefter resuspenderet i TE-puffere og inkuberet med flere enheder af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase i nærværelse af 0,5 mM deoxyadenosintriphosphat (dATP), deoxycy-15 tidintriphosphat (dCTP), deoxyguanosintriphosphat (DGTP) og deoxythymidintriphosphat (DTTP) ved 6-7 °C i en time.

DNA'et blev igen renset ved gentagne ekstraktioner med phenol og ether samt udfældning med ethanol. Det rensede DNA blev derefter digereret med 10 enheder Sall i 2 timer 20 ved 37 °C. Digestionsprodukterne blev renset på ny som beskrevet ovenfor. Det 7kbp store pRV15 Smal/Sall fragment og de ovenfor beskrevne pSVod fragmenter blev derefter inkuberet natten over (i et molært forhold på 10:1) med et overskud af T4 DNA ligase ved 14 °C. Denne ligati-25 onsblanding blev benyttet til at transformere E. coli MC 1061.

Smal og BamHI blev inkluderet i ligationsblandingen. Transformanterne blev udspredt på LB-plader indeholdende 30 10 mikrogram/ml ampicillin og 40 mikrogram/ml Xgal. Der isoleredes blå transformanter. DNA fra sådanne rekombi-nanter blev fremstillet som beskrevet af Schedl et al.

(1978) Cell ^4; 921-929. Rekombinanterne blev identificeret ved restriktionsanalyser.

35 B. Konstruktion af plasmid PR81 OK 172882 B1 41 50 mikrogram plasmid A/PR 8/34 klon nr. 4,76, opnået fra prof. G. Brownlee, University of Oxford, England blev digereret med 30 enheder Hindlll og BamHI i 2 timer ved 37 5 °C. Digestionsproduktet blev underkastet elektrophorese

på en 0,85% agarose-gel. Hindlll-BamHI hæmagglutinln-genfragmentet blev renset ved elektroeluering som beskrevet ovenfor. Prøver af dette DNA blev translateret i udsnit for at tjene som prøver ved identifikationen af PR81 10 og lignende rekombinanter ved Grunstein kolonihybridise-ring (specifik radioaktivitet af prøverne: omkring 10B

cpm/mikrogram).

50 mikrogram A/PR 8/34/4,76 blev digereret med 50 enheder 15 BamHI i 2 timer ved 37 °c. DNA'et blev ekstraheret 3 gange med phenol, ekstraheret med ether og udfældes med ethanol. Det tørrede DNA blev derefter resuspenderet i 25 mikroliter TE-puffer og inkuberet med flere enheder af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase og 0,3 mM af alle fi-20 re deoxynucleotid-triphosphater i et totalt volumen på 100 mikroliter i 90 minutter ved 6-7 °C. DNA'et blev derefter renset ved ekstraktioner ved phenol og ether som anført ovenfor. Efter udfældning med ethanol blev DNA'et tørret og derpå resuspenderet i 25 mikroliter TE-puffer.

25 Det blev derefter digereret med 54 enheder Hindlll i 1 time ved 37 °C. Det digererede DNA blev på ny renset ved ekstraktion med phenol.

10 mikrogram plasmid pSVod (Mellon et al. (1981) cell 27: 30 279-288) blev digereret med 30 enheder Sall i 1 time ved 37 °C. DNA’et blev renset ved ekstraktion med phenol som ovenfor og derefter inkuberet med flere enheder Klenow-fragment i 100 mikroliter blanding i nærværelse af 0,5 mM, DATP, DCTP, DGTP og DTTP i 1 time ved 37 °C. Efter 35 fornyet rensning ved ekstraktion med phenol blev DNA'et DK 172882 B1 42 digereret yderligere med 25 enheder Hindlll i en time ved 37 "c og igen renset ved ekstraktion med phenol.

!

Et A/PR 8/34 digestionsprodukt (1,5 pg) og et pSVod dige-

5 stionsprodukt (2 pg) blev inkuberet natten over ved 14 °C

* med et overskud af T4 DNA ligase i et totalt volumen på 30 mikroliter. Flere enheder BamHT og Sall blev inklude- s ret i ligationsblandingen. Det ligerede DNA blev renset ; ved ekstraktion med phenol som beskrevet ovenfor. Det ‘ 10 blev derefter digereret med 6 enheder BamHI i en time ved ΐ 37 °C og inkuberet med 12 enheder Sall i en time ved 37 ’ °C. Prøver af denne reaktionsblanding blev benyttet til i 5 at transformere CaCl:-behandlet E. coli C 600. Transfor- j manterne blev isoleret på LB-plader indeholdende 10 mi- ~ 15 krogram/ml ampicillin. Omkring 350 kloner blev renset og analyseret ved kolonihybridisering, idet man anvendte det delvis translaterede Hindlll - BamHI hæmagglutiningen-fragment beskrevet ovenfor som prøve. Omkring 80-90% af klonerne blev fundet at indeholde et indsat hæmaggluti-20 nin-gen.

7 af de positive kloner blev opdyrket, og ud fra disse kloner fremstilledes DNA. Disse DNA’er blev sammenlignet med de originale kloner A/PR 8/34 og pSVod ved restrikti-25 onsdigestion og elektrophorese på en 0,9% agarose-gel.

Beregnede fragmentstørrelser

Digestion med EcoRI

Rekombinanter 3,2 kbp; 1,5 - 1,6 kbp A/PR 8/34 3,8 kbp; 1,3 kbp pSVod 3,3 kbp

Digestion med Hindlll og SAII

Rekombinanter 4,5 kbp A/PR 8/34 3,3 kbp; 1,7 - 1,8 kbp pSVod 2,7 kbp; 0,6 - 0,7 kbp *1 i _ 5 DK 172882 B1 43

Fem af de syv rekombinanter, er blevet analyseret, udviste det forventede digestionsmønster. PR81 er en af disse fem kloner.

PR81 DNA blev fremstillet ved metoden beskrevet af Schedl et al. (1978) Cell 921-919 og blev yderligere analyseret ved restriktionsenzym-digestion.

10 C. Konstruktion af plasmid PR84 75 ug plasmid 520 DNA blev digereret med 25 enheder PvuII i 1 time ved 37 °C og derefter med 20 enheder Neol i 2 timer ved 37 °C. Digestionsproduktet blev underkastet 15 elektroforese på en 1,2% lavtsmeltende agarose-gel indeholdende 0,05 ug/ml EtBr. Den region, der omfattede de to I kbp NcoI/PvuII fragmenter (et af dem er et hsp 70 genpromotor-fragment) blev udskåret fra gelen. Agarose-stykket og 10 voluminer TE-puffer blev opvarmet til 65 °C 20 i 10 minutter, hvorefter DNATet blev ekstraheret med et tilsvarende volumen phenol. Efter en yderligere ekstraktion med phenol og chloroform og tre ekstraktioner med ether blev DNA’et udfældet to gange med ethanol.

25 10 ug PR81 DNA blev digereret med 15 enheder Hindlll i en time ved 37 °C. Efter rensning ved ekstraktion med phenol blev DNA'et inkuberet med flere enheder Klenow-fragment og med 0,5 mM af alle fire deoxyribonueleotid-triphospha-ter i 1 time ved 6-7 eC. Efter fornyet rensning blev 30 DNA'et digereret med ti enheder Ncol i 90 minutter ved 37 °C og underkastet endnu en rensning ved ekstraktion med phenol.

Prøver (0,25 ug) af p520 1 kbp NcoI/PvuII fragmenterne og prøver (0,05-0,1 ug) af PR81 fragmenterne blev inkuberet 35 natten over ved 14 °C med et overskud af T4 DNA ligase.

Den opnåede blanding blev benyttet til at transformere E.

DK 172882 B1 44 coli C 600. Omkring 600 ampicillinresistente transforman-ter blev isoleret og undersøgt ved Grunstein koloni-hybridisering under anvendelse af et i udsnit translateret p51 Sau3A/XhoI promotor-fragment som prøve (omkring 5 10 8 cpm/pg) (fig. 11b) .

Der opdyrkedes ti positive kloner, og ud fra disse kloner fremstilledes DNA. Prøver af disse DNA'er blev digereret med Xhol og analyseret på 5% polyacrylamid-geler.

10

Tilstedeværelsen og størrelserne af Xhol-fragmenterne var gode tegn på, at der i de rekombinante DNA'er var både hsp 70 kdal gen-promotoren og hæmagglutiningenet til stede. Fire ud af de ti afprøvede kloner viste det forvente-15 de restriktionsmønster (to fragmenter: et stort på omkring 5 kbp og et på 400 bp) (fig. 11c og lid).

yderligere digestioner med Ncol/Xhol og Xbal/Ncol bekræftede den tidligere analyse. PR84 er et af de fire plasmi-20 der, der har den korrekte struktur.

D. Udtrykkelsesforsøg under anvendelse af plasmid PR84 COS-I celler (Gluzman (1981) Cell 23: 175-1B2) blev opbe-25 varet i Dulbecco's MEM med 10% serum fra nyfødte kalve og sub-dyrket i 1 dag inden transfektionen til opnåelse af kulturer indeholdende omkring l0*-celler i hver Petriskål med diameter 6 cm efter yderligere 1 dags dyrkning. Transfektionen af celler blev foretaget på følgende måde: 30

Mediet blev fjernet fra cellekulturerne ved stuetemperatur, og kulturerne blev vasket to gange med 5 ml af en phosphat-pufret mættet saltopløsning (PBS). Derefter tilsattes 1 ml af de efterfølgende præparater til hver 35 skål: DK 172882 B1 45 1. 1 ml Dulbecco's MEM uden serum, men indeholdende DEAE dextran (500 pg) og chloroquin (200 pg).

2. Som 1, men desuden indeholdende 10 pg plasmid 520 DNA.

5 3. Som 1, men desuden indeholdende 10 pg plasmid PR84 DNA.

Transfektionerne blev foretaget på 5 skåle med celler for 10 hver af de tre tilstande angivet ovenfor.

Cellekulturerne blev holdt ved stuetemperatur i 30 minutter under lejlighedsvis forsigtig omrystning for at fordele transfektionsopløsningen over hele cellekulturen.

15 Efter fjernelse af transfektionsopløsningen tilsattes 5 ml Dulbecco's MEM med 10% serum til hver skål. Cellekulturerne blev yderligere inkuberet ved 37 °C i 36 timer.

Halvdelen af hver af de to kulturer blev inkuberet ved 42 °C i de sidste fire timer af denne periode. Efter udløbet 20 af denne periode blev mediet fjernet, og kulturerne blev vasket en gang med Dulbecco's MEM indeholdende 3 mg/I L-methionin og 1% kalvefosterserum. Cellekulturerne blev mærket ved at sætte 1 ml af dette samme medium med lavt methionin-indhold til hver skål, denne gang under tilste-25 deværelse af 35S-methionin (50 pci/ml, 968 Ci/mmol). Kulturerne blev inkuberet i 1 time ved enten 37 °C eller 42 °C, når der var tale om varmechok-prøver. Efter denne mærkningsperiode blev 35S-methionin-mediet fjernet, og kulturerne blev vasket tre gange med isafkølet PBS, hvor-30 efter cellerne blev skrabet ned i 1 ml NET-puffer (0,1 M NaCl; 0,01 M Tris-HCl pH 7,8; 0,001 M EDTA; 0,5% NP 40).

Efter en voldsom pipettering for at nedbryde de ydre cellemembraner fjernede man kernerne og de cellulære rester ved centrifugering ved 5000 x g i 5 minutter ved 4 °C. De 35 cytoplasmatiske supernatanter blev fjernet, og der blev udtaget prøver til immunudfældning på følgende måde: DK 172882 B1 46

Prøver (500 μΐ) af de cytoplasraatiske ekstrakter blev holdt på is, og der tilsattes 5 μΐ specifikke antistoffer, hvorefter opløsningerne forsigtigt blev blandet ved 5 4 °C i 2 timer. De anvendte antistoffer var følgende:

Normalt kanin-antiserum, antiserum frembragt imod renset E. coli-p-galactosidase og antiserum frembragt imod PRB influenzavirus (opnået fra Dr. J. Shekel, MRC Laboratories, Mill Hill, London, England). Anti-HA-antisera blev 10 præ-adsorberet i 30 minutter i NET-puffer under anvendelse af cytoplasmatiske ekstrakter af ikke-mærkede COS-celler inden anvendelsen til, immun-udfældning af mærkede prøver.

15 Man isolerede antigen-antistof-komplekserne ved at til-sætte 50 μΐ af en 50% suspension af protein A-Sepharose (Pharmacia), fortsætte omrystningen ved 4 °C i 1 time og derefter udvinde de bundne komplekser ved centrifugering ved 15 000 x g i 1 minut. Komplekserne på protein A-20 Sepharose blev vasket og centrifugeret fire gange under anvendelse af 1 ml NET og tre gange under anvendelse af 1 ml RIPA-puffer (0,15 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl pH 7,5; 0,02 M EDTA; 1 M urinstof, 1% Triton x 100 og 1% natriumdeoxy-cholat). De endelige Sepharose-tabletter blev kogt i 3 25 minutter i 100 μΐ prøvepuffer (Laemmli (1970) Nature 227: 680-685) . Efter centrifugering ved 15 000 x g i 1 minut blev prøverne udsat For elektrofosere på 10% polyacryl-amid-geler som anført af Laemmli (1970), supra. 1 2 3 4 5 6 Når der er tale om cellekulturer transfekteret med plas 2 mid PR84 DNA, hvori de mærkede cytoplasmatiske ekstrakter 3 var blevet immun-udfældet med antiserum frembragt imod 4 PR8 influenzavirus, viste en gel-analyse ved fluorografi 5 (Laskey og Mills (1975) Eur. J. Biochem. 56: 335-341) 6 klart tilstedeværelsen af et protein, som med hensyn til størrelse (Mr = 75 000) ikke kan skelnes fra autentisk DK 172882 B1 47 glycosyleret hæmagglutinin (Elder et al. (1979) Virology 95: 343-350). En mulighed for forarbejdning til opnåelse af polypeptider med Mr-værdier på omkring 42 000 og 36 000 blev observeret i nogle af disse eksperimenter.

5 Syntesen af hæmagglutinin forekom både, når mærkningen blev foretaget ved 37 eC, og i mindre grad, når mærkningen blev foretaget ved 42 °C. Der observeredes ikke nogen sådanne specifikke polypeptider, når der anvendtes noget andet transfekterende DNA end PR84, heller ikke ved andre 10 immun-udfældninger end med anti-PR8-antisera.

I en anden række af tilsvarende transfektionseksperimen-ter blev COS-celler, der havde undergået transfektion med PR84, udsat for en periode med varmechok af størrelsesor-15 denen 5 timer ved 42 °C, hvorefter cellerne blev mærket med 1S-methionin som beskrevet ovenfor, dog ved 37 °C i 14 timer. Efterfølgende immunoudfældninger med anti-HA-antisera indikerede en større mængde HA-produkt end i ik-ke-varmebehandlede prøver, der var blevet mærket under 20 tilsvarende betingelser.

Disse resultater antyder, at Drosophila-varmechok- promotoren fungerer bedre ved varmechok-temperaturen i abeceller end ved kontrol temperaturen 37 °C. Man må muligvis 25 forvente en vis aktivitet af denne promotor ved 37 °C, idet temperaturen 37 °C som tidligere bemærket anvendes som varmechok-temperatur for Drosophila-celler. Den forbedrede syntese af HA, når cellerne tilbageføres til 37 °C efter en periode med varmechok, tyder på, at den 30 translationale kontrol af Drosophila-varmechok-promotor-fragmentet, i særdeleshed det ribosomale bindingssted i Drosophila, ikke fungerer, eller kun fungerer i ringe grad, i abeceller, i det mindste ved den højeste temperatur. Selv om promotionen af transskriptionen foregår ved 35 42 eC under anvendelse af Drosophila DNA-sekvenser, er det således muligt, at den ribosomale binding og starten DK 172882 B1 48 af translationen kan foregå optimalt ved 37 °c under anvendelse af det HA-ribosoraale bindingssted.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes udtrykkelsesvektorer, 5 som giver en effektiv transformation af eukaryote værtsceller og høje udtrykkelsesniveauer inden for værtscellerne. Nærmere bestemt har man isoleret den transskripti-onale/translationale kontrolregion af et 70 kdal varme- chok-protein og knyttet denne kontrolregion til et repli- i 10 kationssystem udledt fra et abevirus. Et humant influen- zavirus-hæmagglutiningen blev indført i den resulterende vektor under kontrol af den ovennævnte kontrolregion, og det resulterende plasmid blev benyttet til transfektion af en cellekultur fra pattedyr, hvorved der produceredes 15 tilsyneladende glycolyseret hæmagglutinin.

Konstruktion af plasmid p629

Der blev foretaget en yderligere Drosophila-kontrolele-20 ment/HA-gen-konstruktion for at udvide anvendeligheden af plasmid-konstruktioner såsom PR84. Dette at HA-genet er et viralt gen gør det temmelig specialiseret som model - for andre eukaryotiske gener, på grund af 3’-ende signalerne og RNA-1edersekvensen, og således indeholder 25 PR84-konstruktionen både en HA-RNA-leder og en Drosophi-la-RNA-leder.

Som et mere generelt eksempel på konstruktionen af en genudtrykkelsesenhed under anvendelse af varmechok-30 kontrolelementer konstrueredes plasmid p629. Ud over Dro-sophila-varmechok-promotoren indeholdt dette plasmid hele varmechok-RNA-lederregionen, men det var knyttet til et HA-gen, der manglede de første 40 aminosyre-codon’er. Af bekvemmelighedsgrunde anvendtes et plasmid p622b (en per-35 sonlig gave fra R. Voellmy). Dette plasmid indeholder et Xhol/Bgl 11-fragment med størrelsen 450 bp, der bærer Dro- DK 172882 B1 49 sophila hsp 70 promotoren og RNA-ledersekvensen (repræsenteret ved XhoI/Sau3A-fragmentet af plasmid pRV15 beskrevet tidligere). Plasmid p622b er et derivat af COS-cellevektoren pSVod. Sekvensen rundt om Bglll-stedet er 5 anført herunder: ......hsp 70-AlCCATCCACAl CT.CGAC.....HA-gen......

* T

<-450 bp-> Og] 11 Xhol BamHI

Xhol 10

Eksperimentel konstruktion af p629 15 pg p622b blev digereret med 12 enheder (pr. 15 min.) 15 BG1II, og 15 pg PR 8/ms/34 med 15 enheder Xhol. Digestio-nerne foregik i 2 timer ved 37 °C. Derefter blev DNA'erne ekstraheret tre gange med phenol og tre gange med ether og udfældet to gange med ETOH. Begge DNA'er blev resus-penderet i 20 pi TE-puffer, og enderne blev udfyldt i en 20 reaktion, der involverede flere enheder DNA-polymerase (Klenow-fragment) og 0,5 mM af hver af de fire deoxyribo-nueleotid-triphosphater (totalt volumen: 100 pi; reaktion ved 6 °C i 2 timer). Begge DNA'er blev på ny ekstraheret med phenol og renset som angivet ovenfor, hvorefter de 25 igen blev opløst i 20 pi TE-puffer. De blev derefter digereret individuelt med 15 enheder BamHI (totalt volumen 100 pi; 37 °C i 2 timer) . Efter ekstraktion med phenol blev DNA'erne opsamlet ved udfældning med ETOH og opløst i 15 pi TE-puffer. Der gennemførtes forskellige sæt af 30 ligationer indeholdende 1 pi 622b digestionsprodukt og 1-5 pi PR 8/ms/34-digestionsprodukt i et totalt volumen på 25 pi (enzym: 1-2 pi T4 DNA ligase, New England Bialabs, inkuberet natten over ved 14 °C). Ligasen blev inaktive-ret ved 65 °C i 10 minutter, hvorefter prøverne blev di-35 gereret ved flere enheder Clal og Sall (successivt under anvendelse af de af New England Biolabs foreslåede betin- DK 172882 B1 50 gelser) i 2 timer ved 37 °C i volumener på 50 μΐ. DNA-blandingerne blev derefter benyttet til at transformere E. coli MC1061.

5 Omkring 300 individuelle transformanter blev karakteriseret yderligere ved anvendelse af Grunstein kolonihybridi-sering. Der gennemførtes to separate sæt af hybridiserin-ger. De anvendte prøver var: a) 450 bp Xho-Bglll-fragmen-j tet fra p622b og b) 1775 bp Hindlll/BamHI gen-fragmentet 10 fra PR8.4.76. Fragmenterne var blevet separeret i lavt-! smeltende agarose-geler og derefter elueret fra disse ge ler. Derefter blev fragmenterne mærket ved delvis trans-! lation (107-10a cpm/ng; 105 cpm/filter). Der udvalgtes 8 \ kolonier, som hybridiserede over for begge prøver {se 15 fig. 12c og 12d), og der fremstilledes DNA ud fra disse prøver ved anvendelse af den tidligere beskrevne mini-DNA-præparationsprocedure. DNA'erne blev digereret med ~ Xhol eller med Bglll/EcoRI, og digestionsprodukterne blev analyseret på 5% polyacrylamid-geler. Xhol forventedes at 20 ville give to fragmenter med størrelser på henholdsvis ^ 450 bp og ca. 5 kb. BglII/RI-digestionsproduktet skulle give fragmenter på 1130 bp, 1100 bp og ca. 2,6 kb. Tre af de otte afprøvede kloner havde de korrekte restriktions-“ mønstre (se fig. 12a og 12b).

25

Udtrykkelseseksperimenter ved anvendelse af plasmid p629

Transfektionen af COS I-celler blev foretaget analogt, med den beskrevne måde til udtrykkelse ved hjælp af plas-30 mid PR84. Immun-udfældninger, foretaget som beskrevet i det foregående, udfældede et betydende og et antal mindre betydende polypeptider med molekylvægte omkring 75 000 dalton. Når mærkningen med 35S-methionin blev foretaget i nærværelse af 1 μg/ml tunicamycin, observeredes et bety-35 dende bånd (Mr - 75 000) alene, hvilket tydede på, at de mindre betydende bånd var resultater af en glycosylering.

ΚΛΙ

KU

DK 172882 B1 51

Syntesen af HA-protein var større under en mærkningsperi-ode på 14 timer ved 37 °C, der fulgte efter en periode med varmechok, end i parallelle mærkningsperioder i fravær af varmechok.

5 I det foregående er den foreliggende opfindelse blevet beskrevet i detaljer ved hjælp af illustrationer og eksempler, men det skal bemærkes, at det er muligt at foretage visse ændringer og modifikationer inden for patent-10 kravenes rammer.

Claims (35)

1. Kombinationssystem af genudtrykkelsesenhed og værtscelle, hvor genudtrykkelsesenheden består af (a) en indu-cerbar udtrykkelseskontrolregion på 650 bp eller mindre 5 liggende før ATG i den kodende region udledt fra et euka-ryot varmechok-proteingen; hvilken region er funktionelt bundet til et strukturgen (b), hvis udtrykkelsesprodukter er af interesse, og at værtscellesystemet omfatter euka-ryotiske celler transformeret med genudtrykkelsesenheden, 10 kendetegnet ved, at produkterne af interesse, som udtrykkes af strukturgenet er translationsprodukter.

2. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at strukturgenet af interesse er indført på mindst ét sted i udtrykkelsesenheden.

3. Kombinationssystem ifølge krav 2, kendeteg net ved, at kontrolregionen af varmechok-genet er udledt fra genom-DNA'et af Drosophila melanogaster. _

4. Kombinationssystem ifølge krav 3, kendeteg net ved, at kontrolregionen af varmechok-genet er ud-= 20 ledt fra et vilkårligt gen, der indkoder varmechok-prote- inerne af Drosophila melanogaster med molekylvægte på 70 kilodalton.

5. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at i det mindste en del af kontrolregionen af 25 det funktionelle varmechok-gen er af syntetisk oprindelse .

6. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at udtrykkelsesenheden yderligere omfatter mindst én selektiv markering, som er bundet til udtryk- 30 kelsesenheden, og som muliggør en udvælgelse af transformerede værtsceller. DK 172882 B1

7. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at udtrykkelsesenheden yderligere omfatter et prokaryotisk replikationssystem, som muliggør en formering af udtrykkelsesenheden, og mindst ét antibiotisk re- 5 sistens-gen.

8. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at udtrykkelsesenheden er bundet til et fragment, der indeholder et eukaryot extrachromosomalt replikationssystem.

9. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at et varmechok-pr omo tor element er bundet til den komplette kodende RNA-region i et strukturgen af interesse .

10. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg- 15 net ved, at et eukaryot ledersegment bestående af et varmechok-gen og promotor-RNA er bundet til den proteinkodende region af et strukturgen af interesse.

11. Kombinationssystem ifølge krav 1, kendeteg net ved, at kontrolelementet af et eukaryot varmechok- 20 gen er bundet til i det mindste en del af den DNA-kodende region af et strukturgen af interesse.

12. Plasmid pRV15 identificeret som ATCC accessionsnummer 39597.

13. Plasmid PR84 identificeret som ATCC accessionsnummer 25 39596.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et kombinationssystem af en genudtrykkelsesenhed og en værtscelle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man indfører udtrykkelsesenheden i værtscellen ved co-transformation med 30 en udvælgelig markering. DK 172882 B1

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at udtrykkelsesenheden indføres i værtscellen med et amplifikerbart gen.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet 5 ved, at udtrykkelsesenheden indføres i værtscellen ved transformation eller transfektion.

17. Udtrykkelsesvektor, kendetegnet ved, at den omfatter: et eukaryot extrachromosomalt replikationssystem, 10 en udtrykkelseskontrolregion på 650 bp eller mindre liggende før ATG i den kodende region udledt fra et eukaryot varmechok-protein og mindst ét strukturgen under transskriptional og translational kontrol af udtrykkelseskontrolregionen.

18. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 17, kendeteg net ved, at den er befriet for et codon for start af translationen imellem udtrykkelseskontrolregionen og genet .

19. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 17, kendeteg-20 n e t ved, at den omfatter et codon for start af translationen beliggende før genet.

20. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et prokaryot replikationssystem, som muliggør en stabil opretholdelse i 25 prokaryote værtsceller.

21. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den endvidere omfatter en udvælgelig markering, som muliggør en udvælgelse af transformerede værtsceller. i DK 172882 B1

22. Udtrykkelsesvektor, kendetegnet ved, at den omfatter: et eukaryot extrachromosomalt replikationssystem, en kontrolregion af et varmechok-gen, der er homolog med 5 en sekvens på 650 basepar liggende før ATG i den kodende region, der kontrollerer transskriptionen af det 70 kilodalton tunge varmechok-protein i Drosophila melano-gaster, og mindst ét strukturgen under transskriptional og transla-10 tional kontrol af varmechok-genets kontrolregion.

23. DNA-konstruktion på mindre end 15 kbp, kendetegnet ved, at den omfatter en udtrykkelseskontrol-region på 650 eller mindre basepar liggende før ATG i den kodende region udledt fra et eukaryot varmechok-gen og 15 mindst ét strukturgen under transskriptional og translational kontrol af varmechok-genets kontrolregion.

24. DNA-konstruktion ifølge krav 23, kendetegnet ved, at varmechok-genet indkoder det 70 kilodalton tunge varmechok-protein af Drosophila melanogaster.

25. Fremgangsmåde til fremstilling af translationsproduk ter af kompetente gener, kendetegnet ved, at man: knytter et strukturgen af interesse til en udtrykkelses-kontrolregion på 650 eller mindre basepar liggende før 25 ATG i den kodende region udledt fra et eukaryot varmechok-gen, indfører strukturgenet og kontrolregionen i en eukaryot værtscelle, der er egnet til udtrykkelse af strukturgenet, og DK 172882 B1 dyrker værtscellen, hvorved det nævnte translationsprodukt produceres ved at påføre varmechok.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at strukturgenet og kontrolregionen er knyttet sam- 5 men i en udtrykkelsesvektor, der indeholder et eukaryot extrachromosomalt replikationssystem.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at strukturgenet og kontrolregionen indføres i værtscellen ved co-transformation med en udvælgelig mar- 10 kering.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at strukturgenet, som er under kontrol af reguleringssekvenserne i et varmechok-gen, indsættes i et plasmid, som bærer en udvælgelig markering.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at udtrykkelseskontrolregionen er udledt fra et var-mechok-gen, som indkoder et 70 kilodalton tungt varme-chok-protein i Drosophila melanogaster.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet 20 ved, at varmechok-genet er udledt fra en anden eukaryot art end værten.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 25, kendetegnet ved, at strukturgenet er et pattedyr-gen.

32. Fremgangsmåde ifølge krav 31, kendetegnet 25 ved, at værten er en pattedyr-cellekultur.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 30, kendetegnet ved, at strukturgenet er et humant gen.

34. Fremgangsmåde ifølge krav 33, kendetegnet ved, at værten er en pattedyr-cellekultur. ?! 9 DK 172882 B1

35. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kendetegnet ved, at værten er en COS I-cellekultur.