DK173077B1 - Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, dets anvendelse til fremstilling af et lægemiddel samt farmaceutisk præparat - Google Patents
Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, dets anvendelse til fremstilling af et lægemiddel samt farmaceutisk præparat Download PDFInfo
- Publication number
- DK173077B1 DK173077B1 DK199100878A DK87891A DK173077B1 DK 173077 B1 DK173077 B1 DK 173077B1 DK 199100878 A DK199100878 A DK 199100878A DK 87891 A DK87891 A DK 87891A DK 173077 B1 DK173077 B1 DK 173077B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- gly
- asp
- cys
- ser
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims description 11
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 241000500851 Poecilobdella manillensis Species 0.000 claims abstract description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 241000289659 Erinaceidae Species 0.000 claims description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 abstract description 49
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 15
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 15
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 2
- 241000237677 Hirudinaria Species 0.000 description 2
- 241000237903 Hirudo Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- PEHXUQXNPFLMHR-VIFPVBQESA-N (2r)-2-(2-pyridin-2-ylethylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NCCC1=CC=CC=N1 PEHXUQXNPFLMHR-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzenesulfonyl chloride Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229940122079 Cathepsin G inhibitor Drugs 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122644 Chymotrypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710137926 Chymotrypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000218195 Lauraceae Species 0.000 description 1
- 235000017858 Laurus nobilis Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 235000005212 Terminalia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000003811 acetone extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060849 hirudin PA Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/655—Somatostatins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
i DK 173077 B1
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte anti-thrombiner, især hidtil ukendte anti-thrombiner hidrørende fra iglevæv og iglesekreter.
Hirudin er et velkendt og godt karakteriseret poly-5 peptid, der vides at være specifikt for thrombin, og som fås som en ekstrakt fra igler af arten Hirudo medicinalis.
Polypeptidet har en forholdsvis lav molekylvægt (ca. 7000) og er sammensat af 65 aminosyrer. Sekvensen af den første iso-form af hirudin er blevet bestemt af Dodt, Muller, See-10 muller og Chang ("The complete amino acid sequence of hirudin, a thrombin-specific inhibitor", FEBS 165. 180-184 (1984)) som værende som følger: 15 10 15 15 Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys- 20 25 30
Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp 35 40 45 -Gly-Glu-Lya-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gin- 20 50 55 60 65
Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lie-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gin so3h 25 To varianter af hirudin er også blevet karakteriseret, og aminosyresekvenserne er blevet bestemt. En første variant er beskrevet af Dodt, Macleidt, Seemuller, Maschler og Fritz ("Isolation and characterisation af hirudin isoinhibitors and sequence analysis of hirudin PA"), Biol. Chem. Hoppe-30 Seyler, 367, 803-811 (1986). Denne variant afviger fra den tidligere beskrevne i de følgende henseender: 1. -Ile- i position 1 i stedet for -Val- 2. -Thr- i position 2 i stedet for -Val- 3. -Lys- i position 24 i stedet for -Gln- 35 4. -Asn- i position 33 i stedet for -Asp- 5. -Lys- i position 35 i stedet for -Glu- 6. -Gly- i position 36 i stedet for -Lys- 7. -Asn- i position 47 i stedet for -Lys- DK 173077 B1 2 8. -Glu- i position 49 i stedet for -Gln- 9. -Asn- i position 53 i stedet for -Asp-
En anden variant er beskrevet af Harvey, Degryse, 5 Stefani, Schamber et al. ("Cloning and expression of a cDNA coding for the anti-cuagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinallis"), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1084-1088 (1986) . Denne variant er identisk med den førstnævnte variant fra positionerne 1 til 32 og har dernæst de 10 følgende afvigelser fra det førstnævnte hirudin: 1. -Gin- i position 33 i stedet for -Asp- 2. -Lys- i position 35 i stedet for -Glu- 3. -Asp- i position 36 i stedet for -Lys- 4. -Gin- i position 53 i stedet for -Asp- 15 5. -Pro- i position 58 i stedet for -Glu- 6. -Asp- i position 62 i stedet for -Glu- 7. -Asp- i position 64 i stedet for -Leu- 8. -Glu- i position 65 i stedet for -Gln- 20 Som ovenfor angivet er hirudin hidrørende fra igler af arten Hirudo medicinalis. Hirudinaria manillensis minder om Hirudo medicinalis derved, at de begge er i stand til at ernære sig af blod fra amfibier og pattedyr. Hirudinaria er imidlertid udviklingsmæssigt mere avanceret end Hirudo 25 medicinalis. Det kan ikke med nogen sikkerhed forudsiges, hvorvidt et aktivt stof, der er til stede i sekreterne fra en første art af igler kan tænkes at være til stede i en derfra forskellige art, og, såfremt der findes stoffer med tilsvarende aktiviteter, hvorvidt disse sandsynligvis har i 30 det væsentlige identiske aminosyresekvenser eller markant forskellige aminosyresekvenser.
Der er nu blevet isoleret et hidtil ukendt anti-throm-bin fra Hirudinaria manillensis, og dette anti-thrombin har den følgende aminosyresekvens: DK 173077 B1 3 1 5 10 * 15 * X-Y-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Tyr-Cys-Leu-Cys-Val- 4 20 * 25 * * * 30 * * .* 5 Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Glu-Gly-Asp-Asn-Cys-Asn-D-Gln-Letf-Ser- * * 35 * 40 * 45 * * 50
Ser-Ser-Gly-Asn-Gln-Cys-Val-E-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-F-Pro-Gln-Ser- * * * 55 60 ♦ 65 10 Gln-Thr-Glu-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Asp-Glu-Z-Ile-Lys hvor hvert af symbolerne X, Y og Z betegner en vilkårlig aminosyrerest, D betyder Cys eller Pro, E betyder Glu eller Asp eller His, P betyder Asp, Trp eller Lys, og * betegner 15 positioner i anti-thrombin-molekylet, der afviger fra positionerne i den ovenfor nævnte, første variant af hirudin.
Sammenligning med hirudin-sekvensen viser ca. 62%'s homologi, dvs. ca. 38% forskelle, hvilket er en overraskende væsentlig forskel. Der er i særdeleshed signifikante for-20 skelle ved den betydningsfulde C-terminal samt de følgende, klare forskelle: i position 13 (-Tyr- i stedet for -Leu); i position 17 (-Val- i stedet for -Glu-); i position 24 (-Glu- i stedet for -Gin-); 25 i position 26 (-Asp- i stedet for -Asn-); i position 27 (-Asn- i stedet for -Lys-); i position 29 (-Asn- i stedet for -Ile-) ; i position 30 (-Pro- eller -Cys- i stedet for -Leu-); i position 31 (-Gin- i stedet for -Gly-); 30 i position 32 (-Leu- i stedet for -Ser-) ,· i position 33 (-Ser- i stedet for -Asp-); i position 34 (-Ser- i stedet for -Gly-); i position 35 (-Ser- i stedet for -Glu-); i position 36 (-Gly- i stedet for -Lys-); 35 i position 41 (-Glu- eller -Asp- eller -His- i stedet for -Thr-); i position 47 (-Asp-, -Lys- eller -Trp- i stedet for -Pro-); DK 173077 B1 4 i position 51 (-Gin- i stedet for -His-); i position 52 (-Thr- i stedet for -Asn-); i position 53 (-Glu- i stedet for -Asp-); i position 61 (-Asp- i stedet for -Glu-); 5 i position 64 (-Ile- i stedet for -Leu-); og i position 65 (-Lys- i stedet for -Gin-).
Forskellene i positionerne 61 (aspartat i stedet for glutamat), 64 (isoleucin i stedet for leucin) og 65 (lysin i stedet for glutamin) menes at være af særlig betydning, 10 eftersom sekvensen 55-64 antages at være et kritisk domæne for den inhiberende virkning af hirudin jf. i denne forbindelse Owen et al., "N-terminal replacement of small peptide anti-coagulants based on hirudin", J. Med. Chem. 1009- 1011 (1988). Tilstedeværelsen af aspartat (-Asp-), isoleucin 15 (-lie-) og lysin (-Lys-) i anti-thrombinet ifølge opfindelsen resulterer i et nyt thrombin-inhiberende domæne. Sekvensen 54-65 alene antages at være hidtil ukendt i sig selv og at have hidtil ukendte anti-thrombin-egenskaber.
Opfindelsen angår derfor yderligere et polypeptid, 20 der specifikt inhiberer thrombin og indeholder aminosyrese-kvensen:
Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Asp-Glu-Z-Ile-Cys, hvor Z betegner en vilkårlig aminosyrerest, eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller derivat deraf eller en bio-25 precursor derfor.
Aminosyren i stilling 63 (repræsenteret ved Z i den ovenfor angivne formel) kan være tyrosin (Tyr), der typisk er sulfateret. I modsætning hertil er rekombinant hirudin almindeligvis ikke sulfateret i denne position.
30 Det fra igler hidrørende anti-thrombin ifølge opfin delsen (og tilsvarende DNA-sekvenser, der kan ekstrapoleres derfra) er ikke-homologt med eglin, der er en kendt ela-stase/chymotrypsin-inhibitor, der vides at være til stede i den medicinske igle Hirudo medicinalis og er beskrevet af 35 Seemuller et al. i "Eglin: elastase-cathepsin G-inhibitor from leeches", Meth. Enzymol. 80, 804-816 (1981).
DK 173077 B1 5
Anti-thrombinet ifølge opfindelsen isoleres typisk enten fra vævet af arten Hirudinaria manillensis ved metoder, der omfatter opløsningsmiddelekstraktion og påfølgende fraktionering ved hjælp af chromatografisk teknik eller lignende, 5 og alternativt kan anti-thrombinet isoleres på lignende måde fra sekreter, f.eks. spyt, fra Hirudinaria manillensis.
Ifølge et yderligere aspekt af opfindelsen er et polypeptid ifølge opfindelsen derfor fortrinsvis hidrørende fra væv eller sekreter af igler af arten Hirudinaria manil-10 lensis. Polypeptidet er et anti-thrombin, som er specifikt i sin aktivitet over for thrombin.
Opfindelsen omfatter yderligere et rekombinant eller protein-konstrueret ækvivalent til polypeptidet ifølge opfindelsen.
15 Anti-thrombinet ifølge opfindelsen kan anvendes i et farmaceutisk præparat sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller et strækkemiddel derfor. Et sådant præparat kan typisk anvendes til intravenøs indgivelse, i hvilket tilfælde bæreren almindeligvis er steril saltopløsning eller 20 vand med en acceptabel renhed. Anti-thrombinet ifølge opfindelsen er egnet til behandling af thromboemboliske tilstande, f.eks. blodkoagulation. Ifølge en udførelsesform for opfindelsen indgives anti-thrombinet sammen med en plasminogen--aktivator, f.eks. vævsplasminogen-aktivator, idet anti-25 -thrombinet ifølge opfindelsen har vist sig at være foreneligt med den sidstnævnte aktivator.
Eksempler på fremgangsmåder til isolering af anti-- thrombin ifølge opfindelsen fra iglevæv vil fremgår af de efterfølgende udførelseseksempler.
30
Eksempel 1
Trin 1 - acetoneekstraktion 600 g Hirudinaria manillensis-igler dehydratiseres i ca. 2 liter 96%'s ethanol i 24 timer. Den forreste del af 35 dyrene dissekeres bort fra resten af kroppen og dehydratiseres yderligere i ca. 2 00 ml 96%'s ethanol i yderligere 24 DK 173077 B1 6 timer.
Dehydratiserede iglehoveder hakkes fint i små stykker, og der tilsættes en blanding af 40 ml acetone og 60 ml vand.
Blandingen omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur, cen-5 trifugeres i 15 minutter ved 2700 omdr./min., og den ovenstående væske dekanteres fra.
Den fremkomne pellet gensuspenderes i yderligere 100 ml af en blanding af acetone og vand i forholdet 40:60, efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Blan-10 dingen centrifugeres ved 2700 omdr./min. i 15 minutter, og den ovenstående væske dekanteres fra og slås sammen med den oprindelige ovenstående væske. Der sættes 80 ml acetone og 20 ml vand til den samlede ovenstående væske, og pH-vær-dien nedsættes til 4,4 med iseddike.
15 Blandingen centrifugeres ved 2700 omdr./min. i 15 minutter, og den ovenstående væske dekanteres fra. pH-værdien af denne opløsning indstilles på 6,0 under anvendelse af 30%'s ammoniak. Rumfanget formindskes til ca. 30 ml ved rotationsfordampning ved 35°C.
20 Der tilsættes trichloreddikesyre-krystaller til ned sættelse af opløsningens pH-værdi til 1,8, efterfulgt af centrifugering til fjernelse af udfældninger. Det rå anti -thrombin udfældes fra opløsningen under anvendelse af et ni gange så stort overskudsrumfang af acetone.
25 Blandingen centrifugeres ved 2700 omdr./min. i 15 minutter, og den ovenstående væske kasseres. Den fremkomne pellet gensuspenderes i 50 ml acetone og centrifugeres ved 2700 omdr./min. i 10 minutter. Vaskevæskerne kasseres, og fældningen tørres i en vakuumdesikkator i 1 time. Råt an-30 ti-thrombin rekonstitueres i 4,0 ml vand.
Proteinmængden anslås ved hjælp af absorbansen ved 280 nm til at være 78 mg pr. ml. Aktiviteten anslås ved, at hindringen af thrombin/fibrinogen-sammenklumpningen finder sted ved 2400 anti-thrombin-enheder pr. ml (eller ca. 10.000 35 anti-thrombin-enheder pr. 200 g ituhakkede hoveder). Den totale aktivitet er 9600 anti-thrombin-enheder, og den spe- DK 173077 B1 7 cifikke aktivitet beregnes som 30,7 anti-thrombin-enheder pr. mg protein.
Trin 2 - ethanolekstraktion 5 Den rå anti-thrombin-opløsning afkøles til 3°C. Seks 1,2 ml aliquoter af iskold 96%'s ethanol tilsættes med mellemrum på 5 minutter. Blandingen henstilles ved 3°C i yderligere 10 minutter og centrifugeres derpå ved 2400 omdr./min. i 10 minutter. Den ovenstående væske dekanteres fra og bi-10 beholdes.
Den fremkomne pellet gensuspenderes i 4 ml iskoldt destilleret vand og blandes med 7,2 ml iskold 96%'s ethanol.
Dette materiale får lov at henstå ved 3°C i 30 minutter og centrifugeres derefter ved 2400 omdr./min. i 10 minutter.
15 Den ovenstående væske skilles fra ved dekantering og slås sammen med den oprindelige ovenstående væske.
Den fremkomne pellet gensuspenderes i en blanding af 4 ml iskold 96%'s ethanol og henstilles i 30 minutter ved 3°C. Blandingen centrifugeres dernæst ved 2400 omdr./min. i 20 10 minutter, og den ovenstående væske dekanteres fra og slås sammen.
Den samlede ovenstående væske afkøles til 0°C på is, og der tilsættes derefter 50,7 ml ethanol indeholdende 0,5% ammoniumacetat ved -10eC. Denne blanding henstilles i 30 25 minutter og centrifugeres derpå i 10 minutter ved 2400 omdr./min.
Den ovenstående væske kasseres, og fældningen vaskes med 50 ml iskold ethanol. Fældningen tørres derpå i en vakuumdes ikkator i 1 time.
30 Denne fældning rekonstitueres derefter i vand, afprø ves for anti-thrombin-aktivitet og proteinindhold og kommes dernæst i hætteglas og frysetørres. Det fremkomne rumfang er 1,5 ml.
Proteinmængden anslås at være 19 mg/ml på baggrund 3 5 af absorbansen ved 280 ntn.
Aktiviteten anslås som værende 1000 anti-thrombin- DK 173077 B1 8 -enheder (ATU/ml) ved anvendelse af thrombin/fibrinogen-sammenklumpningsprøven. Den specifikke aktivitet beregnes til at være 52,6 ATU/mg protein.
5 Eksempel 2
Trin 1 som i eksempel 1 gentages, efterfulgt af trin 2 og trin 3 som følger:
Trin 2 - kationionbvtterchromatoarafi Råt anti-thrombin rekonstitueres i 10 mM ammoniumace-10 tat/eddikesyre med en pH-værdi på 4,0 og filtreres til fjernelse af uopløselige stoffer.
En carboxymethylcellulose-gel, der er kommercielt tilgængelig under varemærket CM Sephadex C50, for-kvældes i puffer (10 mM ammoniumacetat/eddikesyre, pH = 4,0) og pakkes 15 i en 3 0 cm lang søjle med en diameter på 2,6 cm. Prøven anbringes på søjlen.
100 ml puffer ledes gennem søjlen og opsamles som spildmateriale. Pufferen ændres dernæst til 10 mM ammoniumacetat med en pH-værdi på 4,2. Der opsamles dernæst 10 ml-20 -fraktioner, og disse afprøves med hensyn til anti-thrombin--aktivitet og proteinindhold. Den specifikke aktivitet for hver fraktion beregnes, og fraktioner over en tærskelværdi for specifik aktivitet slås sammen, fryses og frysetørres.
25 Trin 3 - anionbvtterchromatoqrafi
Frysetørret råekstrakt, der er fremstillet enten ved ethanolekstraktion eller ved CM Sephadex-ekstraktion, rekonstitueres med 10 mM tris/HCl-puffer med en pH-værdi på 7,5 og chromatograferes på en DEAE-Sephadex A-25-søjle (0,9 x 7 30 cm) , der er for-ækvilibreret med den samme puffer. Søjlen fremkaldes ved en strømningshastighed på 15 ml pr. time, indtil absorbansen af den udstrømmende væske ved 234 nm er under 0,15. Det bundne materiale elueres derpå med en lineær gradient på fra 0 til 1 M NaCl i ækvilibreringspufferen (60 35 ml i hvert reservoir). Den udstrømmende væske opsamles i fraktioner på 2 ml til måling af absorbans og indhiberende DK 173077 B1 9 aktivitet. De opnåede elueringsprofiler er vist for ethanol--ekstraheret materiale (fig. 1 på tegningen) og for CM Se-phadex-ekstraheret materiale (fig. 2 på tegningen).
Fraktionerne indeholdende anti-thrombin-aktivitet 5 slås sammen, koncentreres og afsaltes på Sephadex G-25 inden yderligere rensning. Den delvis rensede prøve fraktioneres yderligere ved affinitetechromatografi på thrombin-Sepharose.
Søjlen vaskes med ækvilibreringspufferen (0,1 M tris/HCl, pH = 8,0) , og det bundne anti-thrombin elueres med 1 M benz-10 amidin. Det eluerede materiale frysetørres og afsaltes som før. Materialet renses dernæst ved HPLC (high performance liquid chromatography) . 50 μΐ koncentreret prøve påføres en Mikropore RP-300 C-8-søjle (3 x 0,21 cm), der er for-ækvi-libreret med 0,1% TFA ved stuetemperatur. Det bundne mate-15 riale elueres med en lineær gradient på fra 0 til 100% af 60% acetonitril indeholdende 0,09% TFA i 35 minutter ved en strømningshastighed på 0,25 ml/min.
Absorbansen af den udstrømmende væske overvåges ved 215 nm. Hver spids eller partielt opløst spids opsamles som 20 en særskilt fraktion til måling af dens inhiberende aktivi tet. Den opnåede elueringsprof il er vist i fig. 3 på tegningen og viser, at de spidser, der indeholder anti-thrombin--aktivitet (spidserne 5, 6 og 7) er adskilt fra andre spidser .
25
Sekvensbestemmelse
Hovedspidser indeholdende anti-thrombin-aktivitet (svarende til spidserne 5, 6 og 7 i fig. 3 på tegningen) tørres under vakuum og analyseres for N-terminal aminosyre-30 sekvens på et automatiseret Applied Biosystems-gasfasese-kvensbestemmelsesapparat (model 470A), der er forbundet til en on-line analysator (model 120) til identifikation af PTH--aminosyrer.
Renset anti-thrombin-prøve anbringes direkte på fil-35 teret til sekvensbestemmelse. Cysteinrester i sekvensen bestemmes efter derivatisering til pyridylethyl-cystein ved DK 173077 B1 10 omsætning af den rensede prøve med dithiothreitol og 4-vi-nylpyridin.
Tryptiske digestioner af det reducerede og pyridyl-ethylerede anti-thrombin opnås med TPCK-trypsin. Reaktionen 5 udføres i 0,05 M ammoniumbicarbonat-puffer ved 37°C i 4 timer, og reaktionen standses ved frysetørring og gensuspension i 0,1% TFA. Fragmenter adskilles ved HPLC i omvendt fase under betingelser, der minder om de, der er beskrevet i det følgende i eksempel 3, trin 5.
10 C-terminal-sekvensbestemmelse udføres ved kombination af carboxypeptidase Y-digestionen og DABS-Cl-metoder som beskrevet af Chang i FEBS Letts. 164. 307-313 (1983) . Den således bestemte sekvens er som ovenfor angivet.
15 Eksempel 3
Trin 1 og 2 som i eksempel 2 gentages, efterfulgt af trin 3 og 4 som følger:
Trin 3 - anionbvtterchromatoarafi Opløsningen fra trin 2 indstilles på en pH-værdi på 20 7,0 med 0,1 M NaOH og påføres på en søjle indeholdende en anionbytter, der er kommercielt tilgængelig under handelsbetegnelsen Q-Sepharose, ækvilibreret i 20 mM tris-HCl-puffer med en pH-værdi på 7,0. Pufferen pumpes gennem denne søjle, indtil ubundet protein (detekteret ved absorbans ved 280 25 nm) er fjernet, hvorefter en gradient af salt (NaCl i den samme puffer) påføres på lineær eller trinsvis måde til eluering af det bundne anti-thrombin. En typisk chromatogra-fisk profil er vist i fig. 4 på tegningen.
Fraktioner indeholdende anti-thrombin-aktivitet slås 30 sammen og koncentreres ved ultrafiltrering til et rumfang på 25-50 ml. På dette trin har anti-thrombin-præparaterne en specifik aktivitet på 100-400 anti-thrombin-enheder pr. mg protein.
DK 173077 B1 11
Trin 4 - gelfiltrering
Opløsningen fra trin 3 påføres en gelfiltreringssøjle, der er kommercielt tilgængelig som Superdex 200, ækvilibreret og elueret med 50 mM tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH = 7,5. En 5 typisk chromatografisk profil er vist i fig. 5 på tegningen.
Fraktioner indeholdende anti-thrombin-aktivitet samles, slås sammen og frysetørres. På dette trin har anti--thrombin-præparaterne typisk en specifik aktivitet i området fra 1000 til 4000 anti-thrombin-enheder pr. mg protein.
10
Trin 5 - afsluttende rensning
Materiale fra trin 4 påføres en affinitetssøjle af thrombin-Sepharose ækvilibreret i 0,1 M tris-HCl, pH = 8,0, og det ubundne materiale elueres med den samme puffer. Det 15 bundne anti-thrombin elueres fra søjlen med 1 M benzamidin, frysetørres og afsaltes derefter under anvendelse af en søjle af Sephadex G 25.
Materiale renset ved affinitetschromatografi renses yderligere ved HPLC (high performance liquid chromatography) 20 under anvendelse af en søjle med omvendt fase (RP-300 C-8).
I et typisk eksempel, jf. fig. 6 på tegningen, påføres der prøve på en søjle ækvilibreret i 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) ved stuetemperatur, og det bundne anti-thrombin elueres med en lineær gradient af 60% acetonitril indeholdende 0,9% 25 TFA. Spidser af protein (detekteret ved absorbans ved 215/280 nm) opsamles, og de, der indeholder anti-thrombin, tørres under vakuum.
Bestemmelse af anti-thrombin-aktivitet 30 Anti-thrombin-aktivitet bestemmes ved måling af in- hiberingen af koagulationsaktiviteten af thrombin på fibrinogen i det væsentlige som beskrevet af Markwardt i Methods in Enzymology, XIX, side 924, "Hirudin as an inhibitor of Thrombin" (1970), eller ved måling af inhiberingen af throm-35 bin-spaltning af specifikke para-nitrophenol-afledte chro-mogene substrater såsom S-238, der er kommercielt tilgæn- DK 173077 B1 12 geligt fra Kabi.
Aktiviteten af anti-thrombinet ifølge opfindelsen neutraliseres ikke ved en høj koncentration af neutraliserende monoklonale antistoffer, der er specifikke for hirudin 5 (dette er en yderligere immunologisk bekræftelse på, at anti-thrombinet ifølge opfindelsen og hirudin er forskellige) .
Anti-thrombinet ifølge opfindelsen og hirudin har imidlertid ensartede partielle thromboplastin-tider for 10 ækvivalente doser. Dette antyder, at de har ensartede anti--koagulerende egenskaber i forhold til humant blod.
Claims (10)
1. Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, og som indeholder aminosyresekvensen: Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Asp-Glu-Z-Ile-Lys, 5 hvor Z betegner en vilkårlig aminosyrerest, eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller derivat deraf eler en bio-precursor derfor.
2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den følgende aminosyresekvens:
10 X-Y-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Tyr-Cys-Leu--Cys - Val - G ly - Ser-Asn-Val -Cys-Gly-Glu-Gly-Asp-Asn-Cys-Asn--D-Gln-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Asn-Gln-Cys-Val-E-Gly-Glu-Gly--Thr-Pro-F-Pro-Gln-Ser-Gln-Thr-Glu-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile--Pro-Asp-Glu-Z-Ile-Lys; 15 hvor X betegner en vilkårlig aminosyrerest, Y betegner en vilkårlig aminosyrerest, Z betegner en vilkårlig aminosyrerest, D betyder Cys eller Pro, og E betyder Glu eller Asp eller His, F betyder Asp, Lys, eller Trp, eller er et farmaceutisk acceptabelt salt eller derivat deraf eller en 20 bioprecursor derfor.
3. Polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at X betegner Val.
4. Polypeptid ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at Y betegner Ser.
5. Polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-4, ken detegnet ved, at Z betegner Tyr eller et sulfateret derivat deraf.
6. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegne t ved, at det hidrører fra væv eller sekreter fra igler 30 af arten Hirudinaria manillensis.
7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en vandig opløsning af et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-5.
8. Anvendelse af et polypeptid ifølge ethvert af 35 kravene 1-6 til fremstilling af et lægemiddel til behandling af thromboemboliske tilstande. 5 14 DK 173077 B1
9. Anvendelse af et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-6 til fremstilling af et lægemiddel til indgivelse til en patient sammen med en plasminogen-aktivator.
10 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8826428 | 1988-11-11 | ||
| GB888826428A GB8826428D0 (en) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | Antithrombin |
| PCT/GB1989/001345 WO1990005143A1 (en) | 1988-11-11 | 1989-11-13 | Anti-thrombins |
| GB8901345 | 1989-11-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK87891D0 DK87891D0 (da) | 1991-05-10 |
| DK87891A DK87891A (da) | 1991-06-21 |
| DK173077B1 true DK173077B1 (da) | 1999-12-20 |
Family
ID=10646705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK199100878A DK173077B1 (da) | 1988-11-11 | 1991-05-10 | Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, dets anvendelse til fremstilling af et lægemiddel samt farmaceutisk præparat |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5472942A (da) |
| EP (1) | EP0373767B1 (da) |
| JP (1) | JP2865345B2 (da) |
| KR (1) | KR0153774B1 (da) |
| AT (1) | ATE111484T1 (da) |
| AU (1) | AU636857B2 (da) |
| CA (1) | CA2002924C (da) |
| DE (1) | DE68918246T2 (da) |
| DK (1) | DK173077B1 (da) |
| FI (1) | FI912240A7 (da) |
| GB (1) | GB8826428D0 (da) |
| HU (1) | HUT62016A (da) |
| IE (1) | IE64652B1 (da) |
| RU (1) | RU2050160C1 (da) |
| WO (1) | WO1990005143A1 (da) |
| ZA (1) | ZA898655B (da) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5721098A (en) * | 1986-01-16 | 1998-02-24 | The Regents Of The University Of California | Comparative genomic hybridization |
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| GB9007879D0 (en) * | 1990-04-06 | 1990-06-06 | Biopharm Ltd | Treatment of thrombotic events |
| IL101062A0 (en) * | 1991-02-28 | 1992-11-15 | Erba Carlo Spa | Anti-thrombin polypeptides and their preparation |
| US6514730B1 (en) * | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| US7534567B2 (en) * | 1992-03-04 | 2009-05-19 | The Regents Of The University Of California | Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization |
| GB9309509D0 (en) * | 1993-05-07 | 1993-06-23 | Merck Patent Gmbh | Thrombin inhibitors |
| IT1266561B1 (it) * | 1993-07-22 | 1997-01-09 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Analoghi di un polipeptide anti-trombinico e procedimento per la loro preparazione |
| US5510330A (en) * | 1994-03-25 | 1996-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof. |
| US6008320A (en) * | 1995-04-27 | 1999-12-28 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Elastase inhibitor and process for preparing the same |
| TWI238827B (en) * | 1995-12-21 | 2005-09-01 | Astrazeneca Ab | Prodrugs of thrombin inhibitors |
| US6077825A (en) | 1997-03-13 | 2000-06-20 | Auburn University | Antithrombin protein and DNA sequences from black fly |
| RU2242992C2 (ru) * | 1999-05-03 | 2004-12-27 | Астразенека Аб | Фармацевтический препарат, содержащий ингибитор карбоксипептидазы u и ингибитор тромбина |
| RU2170101C1 (ru) * | 2000-02-17 | 2001-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "БИОНОКС" | Средство для лечения воспалительных заболеваний |
| WO2005079474A2 (en) | 2004-02-17 | 2005-09-01 | The Regents Of The University Of California | Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization |
| US8501241B1 (en) | 2012-09-17 | 2013-08-06 | Biopep Solutions, Inc. | Treating cancer with a whole, leech saliva extract |
| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
| CN115677850B (zh) * | 2021-07-24 | 2024-03-08 | 王大勇 | 具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4390630A (en) * | 1980-10-28 | 1983-06-28 | The Regents Of The University Of California | Hementin--a fibrinolytic agent |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| GB8504025D0 (en) * | 1985-02-16 | 1985-03-20 | Biopharm Ltd | Hyaluronidase |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| US5139944A (en) * | 1985-08-10 | 1992-08-18 | Biophram (Uk) Limited | Collagen-specific enzyme with platelet aggregation inhibition properties |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| EP0333356A3 (en) * | 1988-03-04 | 1990-12-19 | Biogen, Inc. | Hirudin peptides |
| EP0347376B1 (en) * | 1988-06-11 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel polypeptides with an anticoagulant activity |
-
1988
- 1988-11-11 GB GB888826428A patent/GB8826428D0/en active Pending
-
1989
- 1989-11-13 JP JP1511701A patent/JP2865345B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-13 US US07/721,536 patent/US5472942A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-13 DE DE68918246T patent/DE68918246T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-13 WO PCT/GB1989/001345 patent/WO1990005143A1/en not_active Ceased
- 1989-11-13 HU HU896934A patent/HUT62016A/hu unknown
- 1989-11-13 KR KR1019900701389A patent/KR0153774B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-13 ZA ZA898655A patent/ZA898655B/xx unknown
- 1989-11-13 IE IE363789A patent/IE64652B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-11-13 EP EP89311739A patent/EP0373767B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-13 AU AU45225/89A patent/AU636857B2/en not_active Ceased
- 1989-11-13 RU SU894895517A patent/RU2050160C1/ru active
- 1989-11-13 FI FI912240A patent/FI912240A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-11-13 AT AT89311739T patent/ATE111484T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-14 CA CA002002924A patent/CA2002924C/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-10 DK DK199100878A patent/DK173077B1/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0373767A1 (en) | 1990-06-20 |
| CA2002924C (en) | 1999-08-03 |
| FI912240A0 (fi) | 1991-05-09 |
| AU4522589A (en) | 1990-05-28 |
| US5472942A (en) | 1995-12-05 |
| DK87891A (da) | 1991-06-21 |
| GB8826428D0 (en) | 1988-12-14 |
| ATE111484T1 (de) | 1994-09-15 |
| EP0373767B1 (en) | 1994-09-14 |
| KR900701832A (ko) | 1990-12-04 |
| DE68918246D1 (de) | 1994-10-20 |
| KR0153774B1 (ko) | 1998-10-15 |
| AU636857B2 (en) | 1993-05-13 |
| DE68918246T2 (de) | 1995-02-16 |
| HUT62016A (en) | 1993-03-29 |
| DK87891D0 (da) | 1991-05-10 |
| RU2050160C1 (ru) | 1995-12-20 |
| CA2002924A1 (en) | 1990-05-11 |
| ZA898655B (en) | 1990-08-29 |
| JP2865345B2 (ja) | 1999-03-08 |
| JPH04502907A (ja) | 1992-05-28 |
| WO1990005143A1 (en) | 1990-05-17 |
| IE64652B1 (en) | 1995-08-23 |
| FI912240A7 (fi) | 1991-05-09 |
| HU896934D0 (en) | 1991-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173077B1 (da) | Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, dets anvendelse til fremstilling af et lægemiddel samt farmaceutisk præparat | |
| DK173509B1 (da) | Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf | |
| Electricwala et al. | Isolation of thrombin inhibitor from the leech Hirudinaria manillensis | |
| HU205149B (en) | Process from extracting material having anticoagulant activity from haementeria ghilianii leech and for purifying same | |
| Nowak et al. | Hirudin–the long and stony way from an anticoagulant peptide in the saliva of medicinal leech to a recombinant drug and beyond | |
| RU2138275C1 (ru) | Ингибиторы тромбина, способы их получения и фармацевтическая композиция на их основе | |
| NL8900943A (nl) | Protease inhibitor. | |
| Chopin et al. | Amino acid sequence determination and biological activity of therin, a naturally occuring specific trypsin inhibitor from the leech Theromyzon tessulatum | |
| HU198512B (en) | Process for producing peptide with anticoagulant effect and pharmaceutical composition comprising same | |
| EP0789764B1 (en) | A novel family of protease inhibitors, and other biologic active substances | |
| KR0185973B1 (ko) | 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐 | |
| IE64674B1 (en) | Amblyommin a new active substance for anticoagulant therapy | |
| DK175408B1 (da) | Isohirudiner, fremgangsmåde til deres fremstilling, pharmaceutisk middel samt fremgangsmåde til dets fremstilling | |
| IL93915A (en) | Peptides from hirudinaria manillensis having anti-thrombin activity and their use. | |
| KR0137519B1 (ko) | 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로 부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법 | |
| Voelter et al. | Complete Structural Characterization of a Chitin‐Binding Lectin from Mistletoe Extracts | |
| US5232912A (en) | Anticoagulant peptides | |
| JPH07126294A (ja) | 新規システインプロテアーゼインヒビター | |
| US6184346B1 (en) | Protease inhibitors derived from guamerin | |
| JPH05208999A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
| EP0875564A1 (en) | Biologically active extract from the leech 'Limnatis nilotica' |