DK173217B1 - Anvendeise af en leuconostoc carnosum-bakteriestamme og et vakuum-eller gaspakket koedprodukt - Google Patents

Description

i DK 173217 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af en Leuconostoc camaywm-bakteriestamme og et vakuum- eller gaspakket kødprodukt.

Blandt forbrugerne er der en stigende interesse for kødvarer, der ikke er tilsat kunstige konserveringsmidler. For at opretholde en god produktsikkerhed kræver dette, at kødvarens 5 forarbejdning foregår under særdeles hygiejniske forhold. Alligevel kan den mikrobielle udvikling løbe løbsk inden den påstemplede sidste forbrugsdag. Dette er især tilfældet ved varmebehandlede kødvarer, der slices og emballeres i vakuum- eller gaspakning. Det skyldes, at små bakterieforureninger, som uundgåeligt påføres kødet i forbindelse med f.eks. sliceningen, kan vokse hovedsagelig konkurrencefrit i det varmebehandlede produkt.

10 Det er muligt at hindre væksten af patogene eller fordærvende bakterier ved at tilsætte en konkurrerende starterkultur til sådanne kødvarer inden emballeringen. En ulempe ved disse generelt virkende kulturer er dog, at de ofte producerer så mange metabolitter, at kødvarens sensoriske karakterer ændres.

Igennem de sidste årtier er adskillige bacteriocin-producerende mælkesyrebakterier blevet 15 karakteriseret. Bacteriociner er peptider, små proteiner eller proteinkomplekser, som har en bactericid eller bacteriostatisk virkning mod bestemte bakteriearter eller -stammer.

Det er således muligt at reducere antallet af bestemte typer bakterier i f.eks. kødvarer, uden at ændre varens sensoriske karakter, ved at tilsætte produktet konserveringmiddel indeholdende bacteriocin. I JP-07115949-A er f.eks. beskrevet et konserveringmiddel 20 omfattende bacteriociner produceret af Leuconostoc-bzkteiKT og en yderligere komponent valgt blandt organiske syrer, m.fl. En bakteriekultur dyrkes ved 37 °C, og det dannede bacteriocin blandes sammen med organiske syrer i f.eks. en fars, der formes til hamburgere, som varmebehandles. Hamburgerne kan opbevares ved 25 eC. EP-0325.062-A1 og EP-0384.319-A1 beskriver fremstilling af et bacteriocinholdigt middel, der kan tilsættes til 25 levnedsmidler med henblik på at øge holdbarheden. Pediococcus eller en blanding af Pediococcus og Streptococcus dyrkes ved f.eks. 35 °C, og det dannede bacteriocin sættes efterfølgende til levnedsmidlet. Der er her tale om en mindre eller kortvarig virkning på antallet af skadelige bakterier. Dette gælder også for den i WO-92/16118-A1 beskrevne DK 173217 B1 2 fremgangsmåde til at hindre vækst af Listeria monocytogenes i fødevarer ved hjælp af en Pediococcus-stomme, der ikke udviser vækst i produktet.

I EP-0640.291-A1 og DK-9400266-U4 er beskrevet anvendelse af becteriocin-producerende organismer, der har en hæmmende virkning på skadelige bakterier under fermentering 5 (fremstilling) af kødvarer. Det drejer sig om Lactobacillus- og Pediococcus-bakterier, som tilsættes til kødfarsen inden fermentering til f.eks. salami. Fermenteringen foregår ved temperaturer over stuetemperatur.

Listeria monocytogenes udgør et særligt problem i levnedsmidler, der opbevares på køl. Arten er vidt udbredt i naturen og vil derfor relativt nemt kunne overføres til levnedsmidler. Listeria 10 monocytogenes vokser godt ved de lave temperaturer, som anvendes ved opbevaring af f.eks. vakuumpakkede kødprodukter og kan i tilstrækkelig mængde forårsage alvorlige sygdomsforløb hos mennesker.

En metode til at bekæmpe skadelige bakterier i f.eks. kødvarer kunne være at tilsætte produktet en bacteriocin-producerende kultur, der vokser i pakningen, så kulturen under 15 lagringen danner et bacteriocin med bactericid eller bacteriostatisk virkning. Et problem ved denne metode er, at kulturerne f.eks. kan vise god anti-listeriel virkning under laboratorieforhold på agar-medier, men ikke er i stand til at vokse under praktiske forhold, når de anvendes i vakuum- eller gaspakkede kødprodukter ved lav temperatur. Det er imidlertid vigtigt, at kulturerne netop under disse forhold kan producere bacteriocin i 20 tilstrækkelige mængder til, at der opnås en væsentlig reduktion i antallet af Listeria organismer, som kan holde i hele holdbarhedstiden.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en kultur, der kan anvendes i kødvarer uden de ovennævnte problemer, og som desuden giver høj produktsikkerhed ved at være i stand til vedvarende at formindske antallet af I/j/ma-organismer under kødvarens lagring på køl 25 i vakuum- eller gaspakning.

Ved de til grund for opfindelsen liggende forsøg er udført en screening af bakteriestammer, der er isoleret fra vakuumpakkede kødprodukter, som var sensorisk acceptable omkring * DK 173217 B1 3 holdbarhedstidens udløb. Disse stammer udmærker sig ved, at de kan vokse eller i det mindste ikke går til grunde under vækstforholdene i pakningen. Bakterierne blev screenet for deres evne til at producere bacteriocin mod Listeria-organismer på BHI-agar ved 10 °C. Blandt organismerne blev fundet kulturer, som producerede bacteriocin på kogte, 5 vakuumpakkede, slicede kødprodukter ved kølerumstemperatur. Ved videre praktiske forsøg viste det sig overraskende, at bakteriestammer tilhørende arten Leuconostoc camosum ikke alene udviser god og vedvarende vækst på de vakuumpakkede kødvarer, men også har så stor en bacteriocin-produktion, at der sker en meget væsentlig reduktion i antallet af Listeria organismer i pakningen, således at der opnås høj produktsikkerhed i hele holdbarhedstiden 10 (f.eks. fire uger). Fra et udgangsniveau på ca. 104 cfu/g blev antallet af Listeria monocytogenes i kødvaren reduceret med flere log enheder. Bakterierne viste sig endvidere at tilhøre den gruppe kulturer, der ikke ændrer kødvarens lugt og smag.

Bacteriocin-producerende organismer tilhørende arten Leuconostoc camosum kan derfor med fordel anvendes til reduktion af antallet af L/rterrø-bakterier i en vakuum- eller gaspakket 15 kødvare, der lagres på køl, med henblik på forbedring af produktsikkerheden. Disse organismer vokser ved lagringen og danner herved vedvarende bacteriocin i gode mængder, så skadelige bakterier i kødet hæmmes i lagringsperioden.

Opfindelsen består derfor i anvendelse af en Leuconostoc camasrøn-bakteriestamme og er kendetegnet ved, at Leuconostoc camosum-stammtn påføres på et kødprodukt, der vakuum-20 eller gaspakkes, og at stammen udvikler bacteriociner i det pakkede kødprodukt ved lagring af pakningen på køl.

Ved kødprodukt skal i foreliggende forbindelse især forstås kødvarer, der er blevet varmebehandlet og herved er blevet næsten sterile. Typisk varmebehandles til mindst 65 °C i centrum. Der kan f.eks. være tale om kødpølser af forskellig art, kogt skinke eller 25 hamburgerryg. Kødproduktet kan eventuelt også være en ikke-varmebehandlet kødvare, f.eks. bacon eller røget filet.

Leuconostoc camøsHm-bakteriestammen anvendes med særlig fordel på kødprodukter, der er skåret i skiver, strimler eller tern, idet sådanne produkter er særlig udsatte for at blive DK 173217 B1 4 forurenet med bakterier rinder skæringen. Der kan f.eks. være tale om slicede pålægsvarer, såsom fortrinsvis kogt skinke, kødpølse eller hamburgerryg.

Bakteriestammen påføres fortrinsvis på kødproduktet umiddelbart før eller i forbindelse med pakningen. Den påføres fortrinsvis ved påsprøjtning af en vandig opslæmning af kulturen, 5 f.eks. i form af en tåge. En anden mulighed er at anvende en emballage, hvis indvendige side er belagt med kulturen, enten i tør eller våd form.

Hvis der er tale om et slicet produkt påføres bakteriestammen fortrinsvis på kødproduktet i forbindelse med sliceningen.

Fortrinsvis påføres mellem 103 og 10 cfu bakteriestamme pr. g kødprodukt. Mængden 10 afhænger af de praktiske forhold, f.eks. om man ønsker en hurtig reduktion i antallet af lister/o-organismer i pakningen.

For at imødekomme forbrugerønsker påføres stammen fortrinsvis uden eller med så få tilsætningsstoffer som muligt (hvorved vand, salt og andre stoffer, der indgår i kødvaren, ikke anses for tilsætningsstof)· I overensstemmelse med dette påføres fortrinsvis en tør kultur eller 15 en vandig suspension af kulturen indeholdende mindre end 10 % hjælpestof. Dette er muligt, fordi stammen uden nogen ekstra hjælp kan vokse under de rådende næringforhold.

Pakningen lagres på køl, hvilket i sig selv kan hæmme eller forsinke væksten af skadelige organismer, og dertil kommer virkningen af bacteriocinet, der produceres under hele lagringen af den omhandlede bakteriestamme. Fortrinsvis lagres ved en temperatur på mellem 20 5 og 10 °C.

Der anvendes fortrinsvis en stamme, der udviser vækst ved 5-10 °C på et vakuum- eller gaspakket kødprodukt og i en periode på mindst fire uger producerer bacteriocin i en mængde, som er tilstrækkelig til at reducere antallet af Listeria monocytogenes i pakningen.

Den anvendte bacteriocinproducerende Leuconostoc camosum-bakteristamme har fortrinsvis 25 flere af følgende karakteristika: DK 173217 B1 5 producerer bacteriocin ved 5 til 10 °C, - den antimikrobielle forbindelse maldiveres med proteolytiske enzymer (f.eks. pronase E og proteinase K), - producerer ingen afvigende aroma i vakuumpakkede kødprodukter lagret ved 5-10 °C, 5 - producerer ikke mælkesyre af betydning i vakuumpakkede kødprodukter, og - giver kun et svagt pH-fald i vakuumpakkede kødprodukter.

Eksempler på organismer er sådanne, der giver de i fig. 4A viste proteinprofiler ID 2318, 2319 og 2320 ved SDS PAGE-analyse (stamme nr. 1043, 1084 eller 1093) samt har en kulhydratforgæring i API 50 CHL som vist i fig. 4B. Disse organismer opbevares i Danish 10 Meat Research Institute Culture Collection (DMRICC), Slagteriernes Forskningsinstitut, Roskilde under betegnelserne DMRICC 4010 XX, DMRICC 4011 XX og DMRICC 4012 XX. Imidlertid kan anvendes andre bacteriocinproducerende organismer, der tilhører Leuconosloc camosum, og som er isoleret fra kommercielle, vakuum- eller gaspakkede kødvarer på i og for sig kendt måde, se især eksempel 1, 2 og 5.

15 Det omhandlede vakuum- eller gaspakkede kødprodukt er kendetegnet ved, at pakningen tillige med kødvaren indeholder en tilsat, bakteriocin-producerende Leuconosloc camosum-bakteriestamme. Produktet har høj sikkerhed i relation til uønsket vækst af Listeria-organismer.

I det foreliggende er anvendt følgende forkortelser: 20 BHI: Brain Heart Infusion MRS: Man de Rogosa & Sharp APT: All Purpose with Tween HSGC: Headspace Gas Chromatography PC A: Principal Component Analysis 25 FKP: Fysiologisk kogsaltopløsning med 0,1 % pepton cfii: Colony Forming Unit OD620: Optisk densitet ved 620 nm API 50 CHL: Analysekit fra fa. BioMérieux sa, Frankrig DK 173217 B1 6

Alle de heri angivne procenter er vægtprocenter, undtagen hvis andet er anført.

Ved et gaspakket kødprodukt skal især forstås en kødvare, der er pakket under en atmosfære af nitrogen eller en anden inaktiv gas. Der kan eksempelvis også være tale om kød pakket under en atmosfære af C02 eller en blanding af C02 og N2.

5

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende ved hjælp af nedenstående eksempler med tilhørende tegning, hvori - fig. 1A og IB viser diagrammer over den antimikrobielle virkning overfor L. monocytogenes af tre forskellige Leuconostoc caraøji/m-stammer, der er podet på 10 kødfarsskiver, - fig. 2A og 2B tilsvarende diagrammer ved et højere podeniveau af stammerne, fig. 3A og 3B diagrammer over totalkimtallet på kødfarsskiver, der er podet med en blanding af fem forskellige lis/ena-stammer eller en af Leuconostoc camosum-stammerne, 15 - fig. 4A et dendrogram af en cluster-analyse på Leuconostoc «777!<Mrøn-stammeme, og fig. 4B en tavle over disse stammers forgæringer af forskellige kulhydrater (API 50 CHL).

Eksempel 1

Screening 20 Formålet med dette forsøg er at isolere bakterier, som har antimikrobiel aktivitet mod en eller flere patogene bakterier eller fordærvelsesbakterier. Bakterierne isoleres fra kommercielle, vakuumpakkede kødprodukter, der er skiveskåret. Til forsøget anvendes kun kødprodukter, hvis sensoriske egenskaber er acceptable ved prøveudtagning omkring sidste salgsdag (fire uger efter fremstillingdagen). Sensorisk acceptable produkter vil sige, at der ikke forekommer 25 bilugt (sur, putrid), misfarvning, synlig slimdannelse eller luftproduktion (bombage). Når der anvendes sådanne kommercielle kødprodukter sikres, at der kun fås stammer, der er DK 173217 B1 7 levedygtige i pakningen under praktiske forhold, og som ikke umiddelbart giver anledning til sensoriske forringelser af produktet.

Bakterierne isoleres fra rå produkter (røget filet, bacon og spegepølse/salami) og kogte produkter (hamburgerryg og skinke).

5 Der blev isoleret 151 kolonier med antimikrobiel aktivitet på BHI-, MRS- og APT-agar. Ved agar-spot assay blev det testet, om den antimikrobielle virkning kunne fjernes med proteolytiske enzymer (pronase E og proteinase K), idet dette er tegn på bacteriocin-produktion. Der blev fundet 43 isolater, hvis antimikrobielle virkning var følsom overfor proteolytiske enzymer. De blev karakteriseret ved bl.a. API 50 CHL-identifikation.

10 Eksempel 2

Formålet med dette forsøg er at undersøge, om udvalgte bakteriestammer kan producere bakteriociner i kogte kødprodukter, og om bakteriocineme kan ekstraheres fra disse produkter. I forsøget anvendes et kogt farsprodukt og et kogt kamprodukt.

Der blev anvendt nedenstående kulturer, som er isoleret ved screeningen ifølge eksempel 1.

15 Nr. Kultur 103 Leuconostoc spp.

117 Leuconostoc spp.

126 (Camobacterium piscicola) 1043 Leuconostoc camosum 20 1066 Camobacterium piscicola 1078 Camobacterium piscicola 1084 Leuconostoc camosum 1089 Leuconostoc spp.

1093 Leuconostoc camosum 25 Identifikationen er mindre god for organismen, der er angivet i 0· DK 173217 B1 8

Kulturerne blev taget fra fryserør og renheden kontrolleret. Hver kultur blev podet i 100 ml BHI-bouillon og dyrket i 2 døgn ved 20 °C. Bouillonen blev centrifugeret ved 10.000 omdrejninger pr. minut i 10 min. ved 5 °C. Bakteriecellerne blev resuspenderet i sterilt FKP til en OD620 på ca. 0,3-0,4. Der blev bestemt kimtal på de fortyndede kulturer.

5 Kamprodukt

Der blev anvendt udbenede kamme fra so-grise. Kammene blev multistiksprøjtet til en tilvækst på 15 % ved hjælp afen sprøjtelage indeholdende 76,00 % vand, 2,93 % phosphat, 18,33 % nitritsalt og 2,74 % vakuumsalt. Kødet blev tumblet i en 40 l's tromle med bløde medbringere. Der blev tilsat 1 % dextrose inden tumblingens start.

10 Kammene blev stoppet i fibertarm med en fyldekaliber på 107 mm, og produktet blev varmebehandlet til 75 °C i centrum. Derefter blev kødet kølet til 2 °C.

Kammenes overflade blev steriliseret ved kogning i 2 min. Efter afkøling i sterile poser blev tarmen fjernet sterilt. Ved hjælp af en steril kniv blev der skåret skiver af kødet. Til hver prøve blev anvendt to skiver, ca. 60 g i alt. Skiverne blev podet på den ene side med 5 ml af 15 den ovenfor fremstillede kulturopløsning. Prøverne blev anbragt i sterile vakuumposer, der blev lukket under vakuum.

Farsprodukt

Der blev fremstillet fars efter nedenstående opskrift.

DK 173217 B1 9

Ingrediens Procent

Bove (15 % fedt) 53,04

Snitter (40 % fedt) 17,42

Is/vand 21,20 5 Kartoffelmel 3,73

Soyaisolat 1,40

Kaseinat 1,40

Phosphat 0,31

Vakuumsalt 1,50 10 Nitrit 60 ppm

Udbenede bove uden svær og snitter uden svær blev delt i passende stykker, hvorefter de blev hakket hver for sig gennem 3 mm hulskive på autoklaveret hakker.

Farsen blev blandet i mixer. Skåle, indsatser, mv., der kom i berøring med kød eller 15 ingredienser, var afsprittet inden brug. Farsen blev stoppet i 340 ml's dåser og presset mest muligt i dåserne for at minimere luftlommer. Dåserne blev fyldt med ca. 300 g fars, mærket og lukket på vakuumlukker.

Dåserne blev varmebehandlet i vandbad ved 80 “C i 50 minutter. Efter varmebehandlingen afkøledes dåserne under koldt, rindende vand i 60 minutter til en kemetemperatur på ca. 20 20 “C.

Fra dåserne blev der sterilt udtaget prøver af farsen. Gelerne blev skåret i skiver å ca. 30 g i dåsens højderetning (10 skiver pr. dåse, 4 mm tykke) med sterile knive og skæreplader. Til hver prøve blev anvendt to skiver, ca. 60 g i alt. Der blev tilsat 5 ml af den ovenfor fremstillede kulturopløsning. Prøverne blev anbragt i sterile vakuumposer, der blev lukket 25 under vakuum.

10 DK 173217 ΒΊ

Inkubering

De vakuumpakkede prøver blev inkuberet ved 10 °C i 6,9 og 13 dage. Fra hver kødtype blev der efter 6, 9 og 13 dage udtaget to poser pr. bakteriestamme.

Bakteriernes vækst på kødprodukteme 5 Kimtallene for podekultureme lå i intervallet 7,5 til 8,5 log cfti/ml. Det beregnede kimtal i kødprøveme til starttidspunktet lå således mellem 6,4 og 7,4 log cfu/g.

Til bestemmelse af totalkimtallet på BHI-agar ved 20 °C blev udtaget i alt ca. 10 g materiale fra midten af skiverne.

Kimtal (log cfti/g) i fars- og kamprøverne efter 6, 9 og 13 dages inkubering ved 10 °C: 10 Fars Kam

Nr. Dag 6 Dag 9 Dag 13 Dag 6 Dag 9 Dag 13 103 8,7 8,3 8,6 8,4 8,2 8,0 117 8,7 8,6 9,1 8,2 8,2 8,2 126 8,2 8,2 8,6 7,4 7,6 7,6 15 1043 8,9 8,7 9,2 8,5 8,7 8,4 1066 8,5 8,5 8,6 7,8 7,6 7,7 1078 8,6 8,2 8,8 7,6 7,9 7,6 1084 8,8 8,5 8,9 8,0 8,2 8,0 1089 8,9 8,8 9,0 8,1 8,2 7,9 20 1093 8,7 8,9 8,9 8,0 8,1 7,8 I løbet af de første 6 dage er væksten i kødfarsen mellem 0,8 og 2,3 log cfu/g. I den efterfølgende inkuberingsperiode indtil dag 13 er der ingen ændringer af betydning i farsprøvernes kimtal. I kammene udviser alle kulturer vækst fra starten og til dag 6, bortset fra kultur nr. 126, som har hovedsagelig samme kimtal i hele inkuberingsperioden.

DK 173217 B1 11

Bacteriocin-produktion i kødprodukteme

De tilbageværende ca. 50 g af hver prøve blev tilsat 5-10 ml steril 0,02 M HC1 og stomacheret i 1 min. 1 ml ekstrakt fra hvert af kødprodukterne blev overført til et sterilt eppendorf-rør, som centrifugeredes i 10 min. ved 13.000 omdrejninger pr. minut.

5 Supematanten blev brugt til screening for antimikrobiel aktivitet ved radialdiffusions-assay.

Til radialdiffiisions-assayet blev der støbt BHI-agarpIader tilsat indikatororganismen Usteria monocytogenes VDL 144 i niveauet 105 cfu/ml. Efter afkøling af agarpladerne blev der udstanset huller med 4 mm "gelpuncher". Til hullerne blev tilsat 20 μ\ centrifugeret ekstrakt af kødprodukterne. Pladerne blev inkuberet ved 20 °C, til væksten af indikatororganismen 10 var tydelig (1-2 dage). Diameteren af inhiberingszoneme blev målt.

Den anti-listerielle effekt af ekstrakterne er vist i følgende tabel. Diameteren af inhiberingszonen er angivet i mm.

Fars Kam

Nr. Dag 6 Dag 9 Dag 13 Dag 6 Dag 9 Dag 13 15 103 0 0 0 0 0 0 117 8 7 5 0 7 5 126 16 15 14 13 11 9 1043 16 14 15 15 16 15 1066 0 0 7 0 0 13 20 1078 0 0 0 0 0 8 1084 16 14 15 15 15 15 1089 6 0 0 5 9 6 1093 16 15 15 14 14 14

Som det fremgår af tabellen, producerer alle kulturerne (undtagen nr. 103) stoffer, som kan 25 hæmme Listeria monocytogenes. Produktionen kan variere med tiden og produkttypen. Fire kulturer (nr. 126, 1043, 1084 og 1093) udmærker sig ved at producere anti-listerielle stoffer til alle de undersøgte tider og i begge kødsystemer.

DK 173217 B1 12

Eksempel 3

Formålet med forsøget er at undersøge, om udvalgte bacteriocin-producerende bakteriestammer giver uønskede aromastoffer i kødprodukter.

Kulturer blev taget fra fryserør og renheden kontrolleret. Hver kultur blev podet i 100 til 500 5 ml BHI-bouillon og dyrket natten over ved 20 °C på rystebord. Kulturerne blev centriftigeret ned ved 10.000 rpm. i 10 min. ved 5 °C og resuspenderet i sterilt 0,85 %'s saltvand til en OD620 på 0,31-0,48.

Følgende kulturer blev testet:

Nr. Kulturnavn 10 103 Leuconostoc spp.

117 Leuconostoc spp.

126 (Camobacterium pisdcola) 133 (Lactobacillus delbruchii) 136 (Leuconostoc spp.) 15 176 (Pediococcus acidlactici) 1043 Leuconostoc camosum 1066 Camobacterium pisdcola 1078 Camobacterium pisdcola 1079 (Lb. plantarum) 20 1081 Leuconostoc spp.

1084 Leuconostoc camosum 1089 Leuconostoc spp.

1093 Leuconostoc camosum

Hvis identifikationen er mindre god, er kulturens navn angivet i Q.

DK 173217 B1 13

Udbenede kamme fra so-grise blev anvendt til fremstilling af kødproduktet. Kammene blev multistiksprøjtet til en tilvækst på 15 % ved hjælp af en lage indeholdende 76,00 % vand, 2,93 % phosphat, 18,33 % nitritsalt og 2,74 % vakuumsalt.

Kammene blev tumblet i en 40 l's tromle med bløde medbringere. Der blev tilsat 1 % glucose 5 inden tumblingens start.

Efter tumbling under vakuum henstod kammene under vakuum ved 7 °C i ca. 30 timer. Efter massering og dræning blev kammene stoppet i fibertarm med en fyldekaliber på 107 mm. Produkterne blev varmebehandlet til 75 °C i centrum og derefter afkølet til 2 °C.

Kammenes overflade blev steriliseret ved kogning i 2 min. Efter afkøling i sterile poser blev 10 tarmen fjernet sterilt, og kammene skåret i skiver ved hjælp af en steril kniv. Til hver prøve anvendtes 2-3 skiver, ca. 100 g ialt. Der blev tilsat 10 ml af den ovenfor fremstillede kulturopløsning til hver prøve, svarende til ca. 106 cfu/g. De podede prøver blev derefter vakuumpakket i sterile poser og lagret ved 7 “C.

Efter 10 og 20 dages lagring blev der udtaget prøver til mikrobiologisk og gaschromato-15 grafisk undersøgelse. Fra hvert hold blev udtaget to poser efter 10 dage og to poser efter 20 dage. På midten af skiverne blev udtaget prøver til totalkim-bestemmelse. Prøven blev udtaget på midten af skiverne. De resterende dele af skiverne, ca. 30 g, blev brugt til HSGC-FID.

Totalkimtal (log cfu/g): DK 173217 B1 14

Nr. 10 dage 20 dage 103 7,9 8,4 117 7,6 8,5 126 7,6 7,9 5 133 7,6 8,0 136 8,0 8,4 176 7,2 7,8 1043 8,0 8,3 1066 7,5 8,8 10 1078 7,5 8,1 1079 6,9 8,2 1081 7,7 8,2 1084 7,6 8,1 1089 8.1 8,3 15 1093 7,7 8,0

Alle kulturerne kunne vokse i det kogte kødprodukt. Analyserne viser, at der sker en stigning på ca. 2 log cfu/g fra dag 0 til dag 20.

Data fra den gaschromatografiske undersøgelse blev analyseret ved principal component 20 analyse (PCA) og plottet i scores- og loadingsdiagrammer. Det viste sig, at prøverne kan deles i to grupper. 1 gruppe I ligger upodede kontrolprøver samt prøver tilsat kulturerne nr.

103, 117, 133, 136, 176, 1043, 1079, 1081, 1084, 1089 og 1093. Disse kulturerne danner ikke nogen lugtstoffer af betydning, og kulturerne kan derfor være egnede som biokonserverende kulturer i vakuumpakkede produkter af f.eks. "hamburgerryg-type", 25 forudsat de også har en biokonserverende effekt.

I gruppe H ligger prøver tilsat kulturerne nr. 126, 1066 og 1078. De danner 3-methylbutanal, 2-methylbutanal, 3-methylbutanol, 2-methylpropanal og 2-methylpropanol/acetoin i kødproduktet. Forbindelserne 3- og 2-methylbutanal dannes i så store mængder i kødproduktet, at det får indflydelse på produktets aroma. Disse kulturer er derfor ikke egnede 30 som biokonserverende kulturer.

DK 173217 B1 15

Eksempel 4

Formålet med forsøget er at undersøge, i hvilken grad fem forskellige Listeria monocytogenes-stammer er følsomme over for bacteriocineme, som produceres af kultur nr.

1043, 1084 og 1093 i et kødprodukt. Kulturerne er alle blevet identificeret som Leuconostoc 5 camosum-sXzmmtT.

Forforsøg

Dråber (5 μΐ) af kulturerne nr. 1043, 1084 og 1093 blev placeret på BHI-agar, og der inkuberedes i 16-18 timer ved 20 eC. Soft BHI-agar, der er podet med en af Listeria monocytogenes-stammerne, blev forsigtigt hældt over. Der inkuberedes i ca. 18 timer ved 20 10 °C, og hæmningszonernes radius blev aflæst fra kanten af den bacteriocin-producerende kultur til vækst af Listeria-organismer i dæklaget.

Hæmningszoner (radius, mm): Leuconostoc camosum 1043 1084 1093

Listeria monocytogenes A2, serotype 17 3 4 15 Listeria monocytogenes A5, serotype 14 11

Listeria monocytogenes A6, serotype 4 6 3 4

Listeria monocytogenes A9, serotype 4 7 3 3

Listeria monocytogenes C5, serotype 14 0 1

Det ses, at alle fem stammer af Listeria monocytogenes er følsomme over for bacteriocineme, 20 der produceres af Leuconostoc camosum 1043, 1084 og 1093 i BHI-agar, bortset fra at Listeria monocytogenes C5 ikke hæmmes af kultur nr. 1084. Bacteriocineme er således bredspektrede over for Listeria monocytogenes.

I de nedenstående undersøgelser anvendes en blanding af de fem stammer. Den betegnes kort Listeria monocytogenes.

DK 173217 B1 16 Kødfarsforsøg I dette forsøg blev anvendt følgende bakteriekombinationer og podeniveauer:

Serie Bakteriekultur Podeniveau

Bl) Listeria monocytogenes 104 cfu/g 5 Cl) Leuconostoc camosum 1043 105 cfu/g C2) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1043 105 cfu/g C3) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1043 107 cfu/g 10 Dl) Leuconostoc camosum 1084 105 cfu/g D2) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1084 l O5 cfu/g D3) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1084 107 cfu/g 15 El) Leuconostoc camosum 1093 10s cfu/g E2) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1093 105 cfu/g E3) Listeria monocytogenes 104 cfu/g + Leuconostoc camosum 1093 107 cfu/g 20

Der blev fremstillet en kødfars af følgende ingredienser: DK 173217 B1 17

Ingrediens Procent

Bove (15 % fedt) 51,77

Snitter (40 % fedt) 18,03

Is/vand 21,20 5 Kartoffelmel 3,73

Soyaisolat 1,40

Kaseinat 1,40

Phosphat 0,31

Vacuumsalt 2,00 10 Nitrit 60 ppm

Udbenede svinebove og -snitter uden svær blev delt i passende stykker og hakket hver for sig gennem 3 mm hulskive på autoklaveret hakker. Stykkerne blev nedhakket i en hurtighakker og blandet med de øvrige ingredienser.

Farsen blev fyldt i 340 ml's dåser ved hjælp af en dåsefylder. Der blev anvendt vakuum for 15 at undgå luftlommer. Dåserne blev fyldt med ca. 300 g fars, mærket og lukket på vakuumlukker. Dåserne blev varmebehandlet i kogekar ved 80 °C i 150 minutter (kerne-temperatur 70 °C). Efter varmebehandlingen blev dåserne afkølet under koldt, rindende vand i 60 minutter (kemetemperatur ca. 20 °C). Under sterile forhold blev den steriliserede kødfars skåret i skiver på ca. 4,5 cm x 4,5 cm x Vi cm (vægt: ca. 10 g).

20 Farsskiverne blev enkeltvis anbragt i vakuumposer. De blev podet med hver sin bakterieblanding B1-E3 (0,1 ml kulturvæske på hver side af skiverne). Posen blev lukket under vakuum.

Efter 1 dag, 1 uge, 2 uger, 3 uger og 4 uger ved 5 °C og 10 °C blev udtaget prøver til mikrobiologisk undersøgelse. Pr. prøveudtag blev udtaget tre pakker. Totalkimtallet blev 25 bestemt på BHI-agar og antallet af Listeria monocytogenes blev bestemt på Oxford-agar.

DK 173217 B1 18

Serie Bl (kun Listeria)·.

Når farserne kun podes med Listeria monocytogenes, stiger antallet af disse organismer i pakken ved såvel 5 °C som 10 °C (figur 1A, IB, 2A og 2B). Ved 5 °C stiger antallet af Listeria monocytogenes fra 4 log cfu/g til 8,5 log cfu/g i løbet af de fire uger (figur ΙΑ, 2A).

5 Ved 10°C stiger antallet af Listeria monocytogenes fra 4 log til 8 log cfu/g i løbet af den første uges lagring, hvorefter tallet forbliver konstant (figur IB, 2B).

Serie Cl, Dl, El (Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093):

Ved podning af farserne med Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093 findes, at de alle tre vokser godt i farsproduktet ved såvel 5 °C som 10 °C (figur 3A og 3B). Ved 10°C stiger 10 kimtallet fra 5 til 8 log cfu/g i løbet af en uge, hvorefter det er konstant. Ved 5°C vokser kulturerne fra 5 log cfu/g ved forsøgets start til 8 log cfu/g efter 14 dages lagring, hvorefter tallet er konstant.

I figur 3A ses det, at væksten af starterkultureme ved 5 eC er væsentlig hurtigere end væksten af Listeria monocytogenes. Ved 10 °C er der derimod ikke den store forske] i 15 væksthastigheden af Listeria monocytogenes og starterkultureme (fig. 3B), hvorfor produktionen af antimikrobielle metabolitter med drabseffekt over for Listeria monocytogenes sandsynligvis har den største betydning for reduktionen af L/$teria-organismerne.

Serie C2, D2, E2 (Listeria + Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093 i lavt podeniveau): 20 1 figur 1A ses udviklingen i antallet af Listeria monocytogenes i farsskiver, der er blevet podet med Listeria monocytogenes i niveauet 4 log cfu/g og en af kulturerne Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093 i niveauet 5 log cfu/g og derpå lagret ved 5 °C. Det ses, at Listeria monocytogenes vokser 1 log under den første uges lagring, hvorefter niveauet falder under den efterfølgende lagring. Efter 4 ugers lagring er antallet af Listeria monocytogenes faldet 25 væsentligt og ligger i intervallet fra mindre end 10 cfu/g til ca. 100 cfu/g.

DK 173217 B1 19

Ved lagring af samme type prøver ved 10 “C forekommer der ingen vækst af Listeria monocytogenes (figur IB). Antallet af Usteria monocytogenes formindskes under lagringen. Efter 4 ugers lagring lå antallet af Usteria monocytogenes i intervallet fra mindre end 10 cfu/g til ca. 1000 cfu/g.

5 Serie C3, D3, E3 (Usteria + Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093 i højt podeniveau): I figur 2A ses udviklingen i antallet af Usteria monocytogenes efter podning af farsskiverne med Usteria monocytogenes i niveauet 4 log cfu/g og kulturerne Leuconostoc camosum 1043, 1084 eller 1093 i niveauet 7 log cfu/g og lagring ved 5 °C. Det ses, at antallet af Usteria 10 monocytogenes falder. Efter 2 uger er antallet af Usteria monocytogenes i alle prøver reduceret til under 100 cfu/g (detektionsgrænsen) og holder sig på eller under dette niveau efter 3 uger og 4 uger.

Ved 10 °C opnås ved alle tre kulturer en reduktion af Usteria monocytogenes til under 100 cfu/g (detektionsgrænse) allerede efter 1 uges lagring (figur 2B). Efter 2, 3 og 4 uger holdes 15 Listeria monocytogenes-l&Mti under dette niveau.

For alle kombinationer af kultur, temperatur og podeniveau opnås således en reduktion i antallet af Listeria monocytogenes efter 3 og 4 ugers lagring, fra et udgangsniveau på 4 log cfu/g til ca. 2 log cfu/g eller mindre. Leuconostoc camosum-kulwieT er således ikke alene i stand til at sænke Usteria-niveauet i kød, men har også en langtidseffekt, der især er nyttig 20 i den sidste del af kødvarens holdbarhedstid. Denne effekt gælder et bredt udvalg af Usteria-stammer.

Eksempel 5

Dette forsøg beskriver identifikationen af isolaterne nr. 1043, 1084 og 1093 ved hjælp ad 1D-protein gelelektroforese (SDS-PAGE) og API 50 CHL-metoden.

DK 173217 B1 20 SDS PAGE- og cluster-analyse

Isolaterne blev dyrket under aerobe betingelser på MRS-agar i 24 timer ved 25 °C.

Celleekstraktionen og protein-gelelektroforesen blev udført ifølge foreskrifterne, der er angivet af Research Group of the Laboratory for Microbiology, University of Ghent, Belgien, 5 jvf. B. Pot, P. Vandamme og K. Kersters: "Analysis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints" i Chemical Methods in Bacterial Systematics (J. Wiley and Sons, Chichester (1993)).

De normaliserede og digitaliserede proteinbånd blev analyseret numerisk og grupperet ved hjælp af referenceprofiler, der er lagret i en database over kendte stammer og isolater. I fig.

10 4A er vist et dendrogram af cluster-analysen. Isolaterne nr. 1043, 1084 og 1093 viste sig alle at være Leuconostoc camosum-bakietieT. I dendrogrammet bærer de ID-betegnelserne: ID 2318, ID 2319 og ID 2320. De findes i Danish Meat Research Institute Culture Collection, Slagteriernes Forskningsisntitut, Roskilde under deponeringsbetegnelseme DMRICC 4010 XX, DMRICC 4011 XX og DMRICC 4012 XX.

15 APl-identifikation

En enkelt koloni af kultur nr. 1084 og 1093 blev opformeret på MRS-agar ved 30 °C. Kultur nr. 1043 blev opformeret på BHI-agar ved 20 eC i 3 dage. En kraftig bakterie-suspension blev fremstillet ved at overføre bakterierne til 2 ml sterilt vand. Den kraftige suspension blev blandet godt op i API 50 CHL-medium. Brøndene i kittet fyldtes forsigtigt med det podede 20 API 50 CHL-medium. Alle brønde blev dækket med olie og inkuberet i 72 timer ved 30 °C (kultur nr. 1084 og 1093) eller 20 °C (kultur nr. 1043) med aflæsning efter 24, 48 og 72 timer. Farveskift til gult viser, at bakterien omdanner det pågældende substrat under syredannelse. Esculin (brønd 25) bliver sort. Forgæringen blev gradueret efter følgende skala: DK 173217 B1 21 5: gul positiv 4: gul-grøn positiv 3: grøn-gul positiv 2: gul-purpur negativ 5 1: grøn-purpur negativ 0: ingen ændring (purpur) negativ I fig. 4B er vist stammernes forgæring af de forskellige kulhydratkilder. Et mørkt felt indikerer, at stammen forgærer det pågældende kulhydrat. Forgæringsmønsteret er et udtryk for stammens identitet, der kan estimeres på grundlag af tavlen ved brug af AP1LAB Plus 10 computeridentifikationsprogram fra fa. BioMérieux sa, Frankrig.

Claims (10)

1. Anvendelse af en Leuconostoc ca/non/rø-bakteriestamme, kendetegnet ved, at Leuconostoc camosum-stammen påføres på et kødprodukt, der vakuum- eller gaspakkes, og at stammen udvikler bacteriociner i det pakkede kødprodukt ved lagring af pakningen på køl.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kødproduktet er skåret i skiver, strimler eller tern.

3. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bakteriestammen påføres på kødproduktet umiddelbart før eller i forbindelse med pakningen.

4. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bakteriestammen påføres på kødproduktet 10 i forbindelse med slicening.

5. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der påføres mellem 105 og 10 cfu bakteriestamme pr. g kødprodukt.

6. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der påføres en tør kultur eller en vandig suspension af kulturen indeholdende mindre end 10 % hjælpestoffer.

7. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pakningen lagres ved en temperatur på mellem 5 og 10 °C.

8. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen udviser vækst ved 5-10 °C på et vakuum- eller gaspakket kødprodukt og i en periode på mindst fire uger producerer bacteriocin i en mængde, der er tilstrækkelig til at reducere antallet af Listeria monocytogenes 20 i pakningen. DK 173217 B1

9. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen har flere af følgende karakteristika: - producerer bacteriocin ved 5 til 10 °C, - den antimikrobielle forbindelse inaktiveres med proteolytiske enzymer (f.eks. pronase 5 E og proteinase K), - producerer ingen afvigende aroma i vakuumpakkede kødprodukter lagret ved 5-10 °C, - producerer ikke mælkesyre af betydning i vakuumpakkede kødprodukter, og - giver kun et svagt pH-fald i vakuumpakkede kødprodukter.

10. Vakuum- eller gaspakket kødprodukt, kendetegnet ved, at pakningen tillige med 10 kødvaren indeholder en tilsat, bakteriocin-producerende Leuconostoc camosum- bakteriestamme.