DK173597B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et membranfrit trunkat af et membranbundet polypeptid - Google Patents

Description

l DK 173597 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et membranfrit trunkat af et membranbundet polypeptid, hvilket trunkat mangler membranbindende domæne, hvorved poly-peptidtrunkatet er fri for denne membran, og hvilket 5 trunkat har eksponerede antigene determinanter, som er i stand til at fremkalde neutraliserende antistoffer ved in vivo-udsættelse for et patogen, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at der udtrykkes DNA, som koder for trunkatet, i en stabil eukaryot cellelinje, der er transit) ficeret med DNA'et.

Analysen af*imrounreaktionen på en række forskellige infektiøse midler, har været bpgrænse.t af, at det ofte' „ har* vist sig vanskeligt at dyrke patogener i tilstrækkelige mængder til at muliggøre isoleringen af vigtige 15 celleoverfladeantigener. Fremkomsten af molekylær kloning har overvundet nogle af disse begrænsninger ved at tilvejebringe et middel, hvorved genprodukter fra patogene=midler kan udtrykkes 1 praktisk taget ubegrænsede mængder i en ikke-patogen form. Overflade antigener 20 fra sådanne virus som influenza (1), mund- og klovsyge · (2), hepatitis (3), vesicular stomatitis ¢4), rabies (5), og herpes simplex (6) virus, er nu blevet udtrykt i'E. coli og S. cerevisiae, og giver løfte om, i fremtiden at kunne tilvejebringe forbedrede underenhedsvaccine».

25 Det er imidlertid klart, at udtrykkeisen af overfladeantigener i lavere organismer ikke er helt tilfredsstil-'lende, fordi potentielt vigtige antigeniske determinanter kunne gå tabt på grund af ufuldstændig forarbejdning (f.eks. proteolyse, glycosylering) eller ved denaturering 5Q under rensningen af det klonede genprodukt.

Oette er især tilfældet med membranproteiner, som på grund af hydrophobe transmembrandomæner har tendens til at aggregere og blive uopløselige, når de udtrykkes i E. coli. Klonede gener, som koder for membranproteiner, 35 kan udtrykkes i pattedyrceller, hvor værtscellen tilveje-bringer de faktorer, som er nødvendige for rigtig forarbejdning, polypeptidfoldning og inkorporering i cellemembranen (7, 8). Hedens disse undersøgelser viser, 2 DK 173597 B1 at membranproteiner kan udtrykkes på overfladen af en rekombinarit værtscelle, Og, f.eks. (8)*~ at et afkortet membranprotein, som mangler det hydrophobe carboxyterminale domæne, kan secerneres langsomt fra værtscellen 5 . fremfor at blive" bundet til den, er det ikke klart, at det således udtrykte. membranbu’ndne protein eller . . det således'secernerede afkortede protein faktisk vil være i stand til at fremkalde antistoffer, som er’ effektive over for. det patogen, hvorfra proteinet .er afledt.

10 Herpes simpléx (HSV) er et ONA-virus, som forekommer i to beslægtede, men skelnelige, former i humane infektioner. Mindst fire af det store antal virus-indkodede proteiner har vist sig at være glycosyleret og til stede på overfladen af både virionet og de inficerede celler 15 (9). Disse glycoproteiner, betegnet gA/B, gC, gD og gE, findes i både HSV type 1 (HSV1) og HSV type 2 (HSV2), medens der i tilfalde af HSV2 er blevet rapporteret at være fundet et yderligere glycoprotein (gF). Selv om deres funktioner forbliver noget af et mysterium, 20 er disse glycoproteiner uden tvivl involveret i virue-tilknytning til celler, cellefusion og en rakke forskellige værtsimmunologiske reaktioner på virusinfektionen (11). Selv om HSV1 og HSV2 kun viser ca. 50 % DNA-sekvens-homologi (12), synes glycoproteiner for 25 størstedelen at være type-fælles. Således viser gA/B, gD og gE et stort antal type-fælles antigeniske determinanter (13 - 16), medens gC, som tidligere blev antaget for at være fuldstændigt type-specifik (17, 18), også har vist sig at have nogle type-fælles determinanter.

30 Type-specifikke antigeniske determinanter kan imidlertid påvises ved anvendelse af monoklonale antistoffer for nogle af glycoproteiner (10, 19), hvilket viser, at der er sket nogle aminosyreændringer, siden HSV1 og HSV2 skiltes ad.

35 Et af de vigtigste glycoproteiner med hensyn til virusneu-tralisering er gD (11). Der er fremført et betydeligt materiale, som stærkt tyder på, at de respektive gD-pro- DK 173597 B1 teiner hos HSV1 og HSV2 ér beslægtede. Fweks. har rekombinationskortlægning· lokaliseret de respektive gener * til colineære områder i begge yirusgenomer. Aminosyreana-lyse viste,stor homolog! mellem de to proteiner. gD-pro-teinerne inducerer neutraliserende antistoffer for både type 1 og type 1i virus på en type-fælles, made. (19,-21). Desuden er de fleste monoklonalé antistoffer dannet over for disse glycoproteiner type-fælles, hvilket ogeå tyder på en høj grad af strukturelt slægtskab mellem 10 de to typer af glycoproteiner (20). Nogle monoklonalé antistoffer fandtes imidlertid at reagere type-specifikt, hvilket tyder på væsentlige forskelle mellem proteinerne (19). Peptidkort over proteinerne afslørede også med sikkerhed sådanne forskelle (22a). Selv om disse resulta-15 ter antyder, at disse polypeptider er beslægtede, er de dog utilstrækkelige til at indicere nøjagtigt hvor nært slægtskabet er.

For at undersøge arten af type-fællesskabet hos HSV1-og HSV2-gD-proteiner, blev DNA-sekvenserne af gO-generne 20 fra HSV1 og HSV2 bestemt. De afledte aminosyresekvenser viste lighed. De resulterende afledte proteinsekvenser blev også analyseret for strukturforskelle ved anvendelse af et program beregnet til at bestemme hydrophobe og hydrophile områder af proteinet. Denne analyse viste 25 en høj grad af bevarelse på et groft strukturniveau·

Selv om der fandtes flere aminosyreudskiftninger mellem de to glycoproteiner, var størstedelen af disse udskiftninger bevarende, hvilket antyder et vigtigt strukturkrav i dette glycoprotein for viruset.

30 I modsætning til HSV1 viser HSV2 sig at kode for endnu et glycoprotein, betegnet gF (22b, 10, 22c, 22d). Selv om HSV2-gF havde en elektroforetisk mobilitet, som var meget hurtigere end HSVl-gC, afslørede kortlægningsundersøgelser med rekombinante virus, at dette protein var 4 DK 173597 B1 indkodet i et område af HSV2-genomet, som var tilnærmelsesvis colineært. m'ed genet for HSVl-gC‘(22d, 22d). Desuden er det for nylig blevet påvista,t et monoklonalt antistof over for HSV2-gF vil. krydsreagere"svagt med 5 HSVl-gC (22f), og at et polyklonalt antiserum Fremstil let ov.er for HSVl-verion-hyisterproteine.r udfældede. gF (22d), hvilket antyder en mulig strukturel homoiogi mellem de to glycoproteiner. Således forekom det, at en mulig homolog til HSVl-gC var HSV/2-gF-proteinet.

10 Dette slægtskab blev undersøgt i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

BIO/TECHNOLOGY, april 1983, side 146-147, beskriver initiale fremgangsmåder til fremstilling af vaccinekandidater, som vil kræve yderligere processering, testning og ^ modificering, før de kan blive til vacciner. Artiklen om taler arbejder udført af Gething, Sveda og Rose og nævner bl.a. på s. 146, første spalte, om Gethings fremgangsmåde, at den letter fremstillingen af enzymer, receptorer og virale antigener til vacciner.

20 Om Svedas protein siges på s. 147, første spalte, at den udskilte form ikke var strukturelt identisk med den mem-branbundne form, måske fordi noget af det polypeptid, der var nødvendigt til korrekt processering, var blevet dele-teret.

25 Rose angives længere nede i samme spalte at have lagt vægt på, at Gethings fortjeneste lå i, at hun havde opnået ekstremt høje udbytter af proteinet; der er ingen omtale af opnåelsen af et udskilt produkt, som i immunogen henseende svarer til den membranbundne form.

30 Om Gethings arbejde siges endvidere et par linjer længere nede, at måske den enkleste anvendelse af denne teknologi er fremstilling af virale antigener til subunit-vacciner; og der fortsættes nogle linjer senere, at ankerløse mutanter af sådanne proteiner kunne være en udmærket kilde 5 DK 173597 B1 til antigen til vacciner. Et teknisk problem med disse subunits er, at de er monoklonale og derfor mindre immunogene end de aggregater, som udgøres af isolerede molekyler, der indeholder membranankerpeptidet. Det fremhæves 5 af Dennis Kleid, at den lette isolering af antigen (det træk, som Gething og andre har fremhævet) har sekundær betydning i forhold til, hvorvidt proteinet er immuno-gent. Dr. Gething citeres for at have svaret herpå, at dette ville blive klaret ved at tværbinde dem eller måske 10 ved andre fremgangsmåder (som ikke specificeres) , og at man klart har behov for polyvalente komplekser for at opnå immunogenicitet, men at de ikke er vanskelige at fremstille, samt at simpel oprensning fra mediet er vigtigere end en eventuel ulempe ved at gøre proteinerne polyvalen- 15 te *

Alt det ovenstående peger væk fra det, der er beskrevet i forbindelse med den foreliggende opfindelse, idet en fagmand, som læser artiklen, alene vil se, at dette kunne 2o være en god måde, hvorpå man kunne gøre det lettere at oprense normalt membranbundne proteiner. De resulterende produkter kunne måske udgøre kildemateriale til forskellige typer af nyttige slutprodukter. Blandt sådanne mulige slutprodukter er vacciner, men det ville være usand-25 synligt, at de trunkerede proteiner ville være immunogene i sig selv. De ville snarere kræve yderligere processe-ring såsom tværbinding for at gøre dem til kandidater til en vaccine.

30 Som det fremgår af ovenstående, var det således på basis af artiklen fra BIO/TECHNOLOGY overraskende, at der alene ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås membranfrie trunkater, som er i stand til at fremkalde neutraliserende antistoffer ved in vivo-udsættelse for et patogen.

35 Ved undersøgelse af beslægtetheden mellem HSV1 og HSV2 er det i denne beskrivelse blevet fastslået, at en DNA-sekvens på et 2,29 kb område i HSV2-genomet er colineær med HSVl-gC-genet. Translation af en stor åben aflæsnings 6 DK 173597 B1 ramme i dette område viser, at et protein, som har væsentlig homologi til HSVl-gC er indkodet i dette område.

Det antages, at dette område kpder for HSV2-gF-genet, og at gF-proteinet er den HSV2-homologe til HSVl-gC.

5 I lyset af denne information om strukturen af gD-proteinet, som beskrevet nærmere i det følgende, blev det besluttet at udtrykke gD-pro-téin-DNA i pattedyrceller for at se, om dette var muligt, og hvis det var muligt, om det udtrykte protein ville bindes til værtscellemembranen, og om en afkortet form af proteinet, som manglede membranbindingsdomænet ville secerneres fra værtscellen, og i hvert af de sidstnævnte tilfælde, om udtrykkelsesproduktproteinerne kunne fremkalde antistoffer, som var effektive over for HSV1 og/el-ler HSV2. Som resultaterne angivet i det følgende viser, er disse formål blevet opnået. Især gør opfindelsen det muligt at anvende disse proteiner opnået ved rekoro-nant-DNA-processer, som komponenter i en vaccine, der er effektiv over for HSV type 1 og HSV type 2. Således beskrives en beskyttende vaccine over for forekomsten 2Π af.’herpes-infek'tion og en reduktion i hyppigheden og aly.oren af genopstået herpes-infektion hos individer, s.om allerede er inficeret.

Der beskrives også en anden klasse 25 af glycoproteiner opnået ved rekombinant-DNA-processer, der er nyttige som komponenter i en vaccine over for HSV type 1 og/eller HSV type 2. .Nærmere bestemt inkluderer denne klasse af glycoproteiner HSVl-gC (effektiv over for HSV1), HSV2-gF (mere korrekt betegnet som et HSV2-gC, effektiv over for HSV2) eller kombinationer af de to 30 proteiner (effektive over for begge virus). Andre sådanne glycoproteiner inkluderer gA, g8 og gE. Det antages, at en vaccine baseret på de kombinerede glycoproteiner, gC og gD, ville være væsentligt mere effektiv end en vaccine baseret på hvert glycoprotein alene.

7 DK 173597 B1

En udførelsesform for opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med antigeniske determinanter, som er i stand til specifikt at fremkalde komplementært antistof over for Herpes simplex type 1 og 5 Herpes simplex type 2 virus, men som ikke er funktionelt forbundet med overflademembranen. Som anført mere detaljeret nedenfor er et sådant polypeptid et afkotftet*, membranfrit derivat af et membranbundet polypeptid. Derivatet dannes ved udeladelse af et mem-10 branbindende. .domæne, fra polypeptidet, hvilket tillader' det· at secerneres fra det, rekombinante værtscellesystem# hvori det er blevet produceret. I en anden 'udførelsesform dannes polypeptidet førs.t.i funktionel forbindelse med . en overflademembran, 6g derefter opløses polypeptidet, 15 fortrinsvis i' et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, -for at frigøre det fra membranen.

I denne beskrivelse henfører betegnelsen "rekombinant" til celler, som er blevet transficeret med vektorer 20 konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi og således transformeret med evnen til at producere det her omhandlede polypeptid. ’’Funktionel forbindelse" betyder bundet til membranen, typisk ved at rage ud til begge sider af membranen, på en sådan måde, at antige-25 niske determinanter ligger blot foldet i en nativ konfor-mation, som kan genkendes af antistof udløst over for de.t native patogen. ’'Membranbundet” med henvisning til de her omhandlede polypeptider henfører til en klasse af polypeptider, som almindeligvis produceres i eukaryo-30 tiske celler og er karakteriseret ved at have en signalsekvens, som antages at hjælpe med til deres sekretion igennem forskellige cellemembraner såvel som et membranbindende domæne (sædvanligvis af hydrophob art og forekommende ved den C-terminale ende), som ntenes at ude-.

35 lukke deres fuldstændige sekretion igennem cellemembranen. Således forbliver polypeptidet funktionelt forbundet med eller bundet til membranen. Denne opfindelsen er særligt rettet mod udnyttelsen af de membranbundne polypeptider, som er forbundet med patogene organismer, f.eks. herpes-virus.

3 DK 173597 B1 I denne beskrivelse anvendes betegnelserne "HSV2-gF", "HSV2-gCM og HgC-2" valgfrit for at betegne en glycopro-teindel af HSV2', soro er stærkt homolog med HSVl-gC, og som er i stand til. at fremkalde tilstrækkelige anti-5 stoffer til at være nyttige som vaccine.

Når ferst de antigeniske .determinanter i polypeptiderne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er tilvejebragt ved funktionel forbin- delse med oVe’rflademembra’nen,’ kan membranen derefter 10 fjernes fra polypeptiderne uden ødelæggelse af de antigeniske egenskaber. Således kan det membranbundne poly-peptid f.eks. fjernes fra membranen ved solubilisering med en egnet opløsning, fortrinsvis en, der indeholder et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, for at fjerne 15 polypeptidet .fra membranen. En fordel ved at gøre dette er at polypeptidet isoleres fra fremmed cellemateriale, hvilket forøger den potentielle styrke ved dets anvendelse i en vaccine. En teknik til fjernelse af membran nen fra polypeptidet er beskrevet nedenfor.

20 Der kan også opnås membranfrie præparater ved skabelse af et sekretionssystem. Som beskrevet mere detaljeret nedenfor har et sådant secerneret polypeptid mindst nogle af de antigeniske centre, som er nødvendige for antistofstimulering.

2 5' Kort forklaring af tegningerne

Fig. 1A og IB viser DNA-sekvensen og den afledte amino-syresekvens af HSV1- og HSV2-gD-generne og omgivende* flankerende områder.

Fig. 2 viser en hydropatianalyse af gD-proteinérne fra 50 HSV1- og HSV2-proteinerne.

Fig. 3 er et diagram over plasmidet p’gO-dhfr, konstrueret til udtrykkelse af en membranbundet form af HSVl-glycopro-tein D.

9 DK 173597 B1

Fig. 4 viser resultatet af mærkning af gDl2-celler med humane .anti'stoffer over for HSV,‘ idet (A) er en visualisering med fasekontrastoptikog (B) et fluorespensbillede af de samme celler* 5 Fig. 5.viser radioimmunofældninger af klonet gQ fra den her omhandlede gD12-cellelinie og nativt gD fra HSVl-inficere'de humane celler.

Fig. 6 viser bindingen af humane anti-HSV-antistoffer til gD12-celler og udgangs-CHO-cellelinien.

10 Fig. 7 er en skematisk gengivelse af HSVl-gO-protein og belyser placeringerne af signalsekvens og membran-bindende domæne.

Fig. 8 er et diagram af udtrykkelsesplasmidet pgDtrunc-dhfr for eh secerneret form af HSVl-gO-protein.

15 Fig. 9 viser radioimmunofældninger fra den her omhandlede gD10.2-cellelinie.

Fig. 10 viser radio immuno fældninger fra for forstærkede og forstærkede gD10.2-cellelinier.

Fig. 11 viser den grad af forstærkning, som opnås med 20 den Mtx-forstærkede gD10.2-cellelinie.

Fig. 12 viser fragmenterne af pgL'2Sal2.9, som blev underkastet DNA-sekvensanalyse.

Fig. 13 viser DNA-sekvensen afledt fra pgC2SA12.9 sammenlignet med ONA-sekvensen af HSVl-gC-området.

25 Fig. 14 belyser Southern-afdupningsanalyse aF HSV2-ge-nomisk DNA og pgC,,Sal2.9-DNA.

DK 173597 Bl 10

Fig. 15 belyser translationen af den store åbne HSV2-af-læsningsramme og sammenligning med HSVl-gC-aminosyre-sekvensen.

Fig. 16 belyser hydropatianalyse af HSVl-gC-proteinet og proteinet fra den store åbne HSV2-aflæsningsramme..

Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksemp--ler.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel omhandler gD-protein.

10 Virusvækst og isolering af viral DNA.

HSV1 (stamme Hzt) og HSV2 (stamme G) blev dyrket på Hep 2 celler ved henholdsvis 37 °C og 33 °C. Den virale DNA blev isoleret fra inficerede cellekulturer ved nedbrydning med proteinase K og dannelse af bånd med CsCl 15 (23).

Kloning af gD-generne fra HSV1 og HSV2.

Forudgående kortlægnings- og kloningsundersogelser har lokaliseret HSVl-gD-genet til et ca. 6,6 kb BamHI-frag-ment (6,24). HSV1-DNA blev spaltet med BamHI, og 6 -20 7 kb området blev isoleret ved agarosegel-elektroforese.

Dette fragment blev ligeret ind i BamHI-nedbrudt pBR322, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 (ATCC nr.- 31446). De plas-mider fra de ampicillinresistente tetracyclinsensitive 25 kloner blev sigtet for det rigtige HSVl-fragment ved restriktionsenzymnedbrydning. Det korrekte gD-holdige SstI-fragment blev subklonet i Sstl-nedbrudt plasmid pFM3 (EP offentliggørelsesskrift nr. 0060693).

• 11 DK 173597 B1

Selv om gD-genet fra H5V2 i Forvejen var kortlagt ved rekombination med HSV1, var den" nø j.agtige placering af dette gen ukendt. Derfor blev et ca. 10 kb Hindlll- fragment fra det. lille unikke område af .HSV2-'genomet .

5 (4) ligeret ind i HindHI-centret af bakteriofag-^-klo- ningsvektoren 590 (25). In vitro pakket, fag blev udpladet i lav tæthed og 'sigtet ved Benton-Davis-proceduren med en P-mærket subklon af gD-genet fra HSV1 (26). Positivt.

hybridiserende pletter blev dyrket, DNA'en isoleret, 10 og gD-genet lokaliseret ved Southern-afdupning og hybri- 32 disering med det P-mærkede HSVl-gD-gen (27). De positivt hybridiserende, HSV2-gD-holdige fragmenter blev subklo-net i plasmidet pUC9 (28).

DNA-sekvensbestemmelse og datamatanalyse.

15 Forskellige fragmenter fra HSV1- og HSV2-gD-generne blev subklonet i ml3-fag-vektor-mp9 (29) og blev sekvensbestemt ved dideoxynucleotidmetoden beskrevet af Sanger (30).

Nucleotidsekvenserne blev analyseret under anvendelse 20 af HOM-programmet (31). Hydropatien af den afledte prote insekvens blev analyseret under anvendelse af en bredde på 12 og et spring på 1 (31a).;

Kloning af gD-områderne fra HSV1 og HSV2.

Andre undersøgelser havde lokaliseret HSVl-gD-genet 25 til 6,6 kb BamHI-J-fragmentet ifølge nomenklaturen angi vet af Roizman (6, 12, 24). Isolering og sekvensbestemmelse af en del af dette fragment viste, at dette fragment indeholdt HSVl-gD-genet. Da man kunne forvente, at DNA-se-kvenserne i HSVl-gD-genet ville være relativt homologe 30 med HSV2-gD-genet, anvendtes dette fragment som sonde til isolering af gD-genet fra HSV2-genomet.

DK 173597 B1 1Å

Da de fleste af generne fra HSV1- og HSV2-genomerne * · viser sig at ligge co.lineært på kortet (35), blev området fra det lille unikke område af H5V/2-genomet, som svarede til HSVl-gD-området (Hindlll-L-fragmente.t (12)), 5 klonet i .en ^V*fag-vektor. Sigtning af de resulterende pletter med en P-?mærket HSVl-gD-gen-subklon afslørede positivt hybridiserende pletter, hvilket antyder, at der virkelig var nucleinsyresekvenshomologi mellem de to virusgenomer i dette område. Isolering af fag-D'NA'en 10 og efterfølgende Southern-afdupningsanalyse afslørede det område af dette fragment, som svarede til gD-genet.

Dette område blev subklonet til DNA-sekvensanalyse.

Kodningsområderne.

Fig. 1 belyser de to gD-DNA-sekvenser sammenlignet ved 15 HOM-programmet (31). Nucleotid nr. 1 vælges som A'et i ATG-startcodonen, der koder for methionin. Åbninger er blevet indført af HOM-datamatprogrammet for at maksimere sekvenshomologierne (31). Nucleotidforskelle er vist ved symbolet (*), medens aminosyreforskelle er 20 vist ved indramning. Aminosyreforskelle mellem den her rapporterede HSVl-gD-sekvens, bestemt for Hzt-stammen af H5V1, og den der er rapporteret af Watson et al.

(6) for Patton-stammen, er angivet ved symbolet (+).

Starten af HSVl-gD-gen-transcriptionen, vist ved en 25 pil, er fra Watson et al. (32). Mulige N-forbundne glyco- syleringscentre er vist gråtonet. To mulige MTATA"-sekven~ ser er vist 5' for starten af gO-transcriptionen, medens en tredje mulig "TATA"-sekvens er vist 5' for en anden åben aflæsningsramme ved 3'-enden af HSV2-sekvensen.

30 To områder af ikke-kodningssekvens-homologi bør bemær kes 5' for gD-generne og 5' for den anden åbne aflæsningsramme fra HSV2-sekvensen.

13 DK 173597 B1

Hydropatien af gD-proteiner.

Hydropétien af hvert glycoprotein blev analyseret under anvendelse af det program, der er udviklet af Hopp .et al. (51a). Som vist i fig. 2 vindes der et hydrophobt .5 transmembran-domæne ved. 3'-enden af. genet. Tolv aminosyrer, lange strækninger blev analyseret, og gennemsnitshydro-patien blev udregnet. Forskelle i rester mellem de to glycoproteiner er vist med bevarede ændringer markeret (*) og ikke-bevarende ændringer markeret (+). A) HSVl-gD-10 protein-hydropati, 8) HSV2-gD-protein-hydropati.

DNA-sekvensanalyse viser, at HSV1- og HSV2-gD-proteiner-ne er 80 % homologe. Hovedparten af de forskelle, der blev fundet mellem disse to proteiner, var i de amino-og carboxyl-terminale områder. Disse proteiners amino-ter-15 minale område indeholder et stærkt hydrophobt område, ' som indeholder en argininrest nær ved det amino-terminale methionin. Dette hydrophobe domæne er signalsekvensen, som er karakteristisk for secernerede og membranbundne proteiner, og som antageligvis har den funktion at diri-20 gere mindst en del af proteinet ind i rummet af det endoplasmiske reticulum (33). En sammenligning af de første 20 amino-terminale aminosyrer viste, at der var ialt 12 forskelle mellem type 1- og type 2-genet. Praktisk taget alle forskelle er imidlertid bevarende, da 25 de koder for andre hydrophobe aminosyrer. Undtagelserne er gly-arg-udskiftningen ved rest nr. 3 og arg-gly-ud-skiftningen ved rest nr. 7. Selv om disse udskiftninger ikke er bevarende, ændrer de dog ikke net tostrukturen af signaldomsnet. Begge gener bevarer en positivt ladet 30 rest i de første 10 aminosyrer.

Hydropatikurven i fig. 2 afslørede et hydrophilt carboxyl-» terminalt domæne efter et hydrophobt område. Denne struk tur er karakteristisk for membranbundne glycoproteiner 14 DK 173597 B1 og er tidligere blevet fundet i andre virale overfladeantigener (5, 34). Dens funktion er at forankre proteinet i de cellulære.og virale membraner, og den spilder som sådan en vigtig rolle for virusinfektion. Der blev fundet 5 12 aminosyreændringer i dette område af gD-proteinerne fra rest 333 til rest 362, hvoraf de fleste er bevarende.

Dette antyder, at det eneste kriterium for aminosyrerne i dette område er, at de er overvejende apolære for at spænde over lipid-dobbeltlaget. Desuden viser området 10 éfter membrandomænet (resterne 363 - 375), der hovedsa-' geligt tjener til at forankre proteinet i membranen (33),t;5 ændringer i dets første 13 aminosyrerester efterfulgt af en homolog strækning. Dette resultat antyder, at de første 10 - 15 rester i det carboxyl-terminale 15 hydrophile domæne kun har en forankrende funktion og derfor kun behøver at være ladet, medens de efterfølgende 23 rester kan have en anden funktion, som er specifikt vigtig for gD-proteinet.

Selv om der findes mange andre aminosyreændringer igennem 20 disse to proteiner, er det store flertal af ændringerne bevarende. Dette understreges af den struktur, som er afsløret af det i fig. 2 viste hydropatiprogram. Som det kan ses ved denne sammenligning, viser de to glyco-proteiner meget ens kurver. De aminosyreændringer, som 25 ikke er bevarende, viser sig ikke at ændre proteinets hydropati. -

Udtrykkelse af HSVl-gD.

For at etablere en permanent cellelinie, som producerer membranbundet gD, blev det gD-holdige fragment ligeret 30 (fig. 3) ind i en pattedyr-udtrykkelsesvektor (36) inde«· holdende den selekterbare markør, dihydrofolatreductase (dhfr). Fig. 3 viser et diagram af plasmidet pgO-dhfr, konstrueret til udtrykkelse af HSVl-glycoprotein D.

15 DK 173597 B1

Udtrykkelsesplasmidet bestod af repliceringsoriginet og p-lactamase-genet (smpr) afledt fra E. coli plasmidet pBR322 (37), en cDNA-indsætning, der koder for muse-dhfr (36, 38) Under·styring af den tidlige, SV40~promotor 5 og et 4,6 kb Hindlll-BamHI-fragment indeholdende gD-genet også under styring af den tidlige SV40-promotor. Hindlll-enden af dette fragment ligger 74 bp til. 5*-siden for start-methionincodonen og inkluderer mRNA-cap-centret. Hindlll-centret ligger 250 bp til 3’-siden for Goldberg-10 Hogness-kassen i SV40-promotoren. Kodeområdet af det gD-kodende fragment er 1179 bp langt og slutter sig til et stort (1,9 kb) 3'-område, som indeholder mindst en del af gE-genet (24, 32), en translationsstop-codon og et polyadenyleringscenter.

15 Plasmidet pgD-dhfr blev konstrueret som følger: 4,6 kb Hindlll-BamHI-fragmentet indeholdende hele gO-kode-sekvensen blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSVl-genomet (se ovenfor). 2,8 kb HindilI-Sall-frag-mentet indeholdende en SV40-origin/tidlig promotor og 20 pBR322-ampicillinresistens-genet og -originet for ØNA-re-plicering blev isoleret fra plasmidet pEHBal 14. 2,1 kb Sall-BamHI-fragmentet indeholdende en muse-dihydro-folatreductase-cDNA-klon under styring af en anden SV40-origin/tidlig promotor blev isoleret fra plasmidet 25 pE348HBV E400D22 (36). Disse 3 fragmenter blev ligeret sammen i en tredobbelt ligering under anvendelse af T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294. De resulterende kolonier blev dyrket·, og plasmid-DNA1 en sigtet ved ned-30 brydning med Sac 2. Den korrekte DNA-konstruktion, pgD-dhfr (fig. 3), blev anvendt til yderligere transfektionsunder-søgelser.

Plasmidet blev indført i kinesisk-hamster-ovarieceller (CHO), som var deficiente med hensyn til produktion 16 DK 173597 B1 af dhfr (39), under anvendelse af calciumphosphatfældningsmetoden (40). Kolonier, som var i stand til at vokse i medier, der manglede hypoxanthin, glycin og thyroidin, blev opnået, og 9 dhfr+-kloner blev analyss-5 ret. Af disse kunne gD detekteres i 5 kolonier under anvendelse af anti-HSVl-antistoffer ved radioimmunofald-nings- og indirekte immunofluorescens-prøvninger. En af de fem linier (gD12) blev udpeget til yderligere undersøgelse. For at karakterisere det klonede gD-gen-10 produkt blev gD12-cellér metabolisk mærket med ’55S-methb- nin eller ^H-glucosamin og analyseret ved radioimmuno-fældning. Den anvendte procedure var som følger: celler blev dyrket i Ham's F12-medium (Gibco) suppleret med 7 % kommercielt dialyseret føtalt okseserum (Gibco), 15 penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml).

Da kulturerne var omkring 80 % konfluente, blev mediet fjernet, cellerne blev vasket to gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), og der tilsattes et mærkende medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium indeholdende 20 enten 1/10 af den normale koncentration af methionin 2 eller glucose) til en slutkoncentration på 0,064 ml/cm .

Der tilsattes enten "^S-me thionin (SJ.204, Amersham Int.) (50 - 75 ^,uCi/ml) eller ^H-glucosamin (100 ^uCi/ml), og cellerne blev dyrket i yderligere 18 - 20 timer.

25 Efter mærkningen blev mediet indhøstet, og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernet fra kulturskålene ved behandling med PBS indeholdende 0,02 % EDTA. Cellerne blev derpå solubiliseret i lysepuffer bestående af: PBS, 3 % NP-40, 0,1 % okseserumalbumin, 5 x 10”^ M phenyl-30 methylsulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12000 x G. Til immunofældningsreaktioner blev celle-lysaterne fortyndet tredobbelt med PBS, og aliquoter (typisk 180 ^ul) blev blandet med 2-5 ^ul antisera 35 og inkuberet ved 4 °C i 30 minutter. Immunkomplekser blev derpå adsorberet til fikserede S. aureus celler 17 DK 173597 B1 ved Kessler’s metode (40a) og blev genudfældet ved cen^ trifugering ved 12000 x G i 30 sekunder. S. aureus cellerne blev derpå vaskes 3 gange med vaskningspuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3 Sf natriumdodecylsulfat), og immunkomplek-5 serne blev elueret med 20 yul polyacrylamidgél-prøv'epuf- fer (62,5 mM "Tris"-HCl-puffer, pH 6,8, indeholdende 10 % glycerol, 5 % 2-mercaptoethanol, 0,01 % bromphenol-blåt) ved 90 °C i 3 minutter. Efter centrifugering i 30 s blev supernatanterne påført 10 % polyacrylamid-10 gelplader ifølge Laemmli's metode (45).

Fig. 4a sammenligner autoradiografier opnået med g012-cel-lelinien og HSVl-inficerede celler: kontrolimmunofældning fra gD12-cellelysatet med normal kaninserum (bane l)j immunofældning af nativt gO dyrket i HEL-celler (bane 15 2) og A549-celler (bane 3) med det monoklonale anti-gD-an- tistof, 55-S (41); immunofældning af klonet gO fra gD12-cellelysatet med polyklonale kaninantistoffer (Dako *

Corp.) for HSV1 (bane 4) og det monoklonale antistof, 55-S (bane 5); immunofældning af klonet gD fra gD12-cel-20 lerne, som var metabolisk mærket med ^H-glucosamin, med polyklonale kan.in-anti-HSVl-antistoffer (bane 6).

Det ses (bane 4 og 5) at et diffust bånd på 59 - 60 kilodalton blev.specifikt fældet fra gD12-cellelinien under anvendelse af enten kanin-anti-HSVl-antistoffer 25 eller det monoklonale anti-gD-antistof, 55-S, som er specifikt for HSVl-proteinet (41). Denne molekylvægt stemmer godt overens med den, der er rapporteret for gD isoleret fra HSVl-inficerede KB-celler (42). Det ses, at det samme monoklonale antistof fældede prote-30 iner af lignende, men forskellige molekylvægte fra HSV1- inficerede humane cellelinier. Hovedproduktet, som blev fældet fra den humane lungecarcinoma-cellelinie A549 (bane 2) var på 53 kilodalton, og det, der blev fældet fra den humane embryoniske lunge-cellelinie (HEL) var 18 DK 173597 B1 på 56 kilodalton (bane 3). Tidligere undersøgelser (43) har vist, at molekylvagten af HSV-glycoproteiner varierer afhængigt af værtscellen, og at denne forskel skyldes forskelle i glycosylering. For at bestemme, om det .

5 i CHO-celler producerede gD.-protein faktisk var glycosy- leret, blev cellerne metabolisk mærket med ^H-glucosamin.

Da der blev Odfældet bånd af identiske molekylvægte (bane 5 og 6) efter metabolisk mærkning med "^S-methio-ning eller ^H-glucosamin, konkluderede vi, at det i 10 CHO-celler producerede gD-protein er glycosyleret.

De humane cellelinier A549 (ATCC CCL 185) og HEL 299 (ATCC CCL 137) blev dyrket til konfluens i 3,5 cm livskulturskåle og inficeret med HSV1 i en multiplicitet på 10 pfu pr. celle. Virus-inficerede celler blev mærket 15 ved en metode mage til den, der er beskrevet af Cohen et al. (44). 4 Timer efter infektionen blev mediet fjer--i net, og cellerne blev vasket én gang med frisk, medium * .(Dulbecco’s modificerede Eagle's medium) og én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS). Derpå sattes 20 frisk medium indeholdende 1/10 af den normale koncen tration af methionin til cellerne sammen med ^S-methio-nin (Amersham, International) til en slutkoncentration på 75 ^uCi pr. ml medium. Cellerne blev dyrket i yderligere 20 timer og derpå indhøstet ved behandling af de 25 vaskede celler med PBS indeholdende EDTA (0,02 %). Virale proteiner blev solubiliseret i lysepuffer bestående af PBS, 3 % NP-40, 1 % okseserumalbumin, 5 x 10 ^ M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin.

Det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering 30 ved 12000 x G i en mikrocentrifuge. Til immuno fældnings reaktioner blev cellerne eller viruslysaterne fortyndet tredobbelt med phosphatpufret saltopløsning, blandet med 2-5 ^ul af det passende antiserum og inkuberet i 30 minutter ved 4 °C. Antistof-antigen-komplekser 35 blev fjernet fra reaktionsmediet ved tilsætning af 25 /ul 19 DK 173597 B1 af en 10 % oplosning af fikseret S. aureus (Kessler (40a)) og blev udfaldet ved centrifugering ved 12000 x G i 30 s. S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskepuffer (PBS, 1 % HP-40, 0,3 % natriumdodecyl-5 sulfat), og cellerne blev suspenderet i 20 ml polyacryl- amidgel-prøvepuffer (10 % glycerol, 5 % 2.mercaptoethanoiy 0,0625 M med hensyn til pH 6,8 "Tris"-puffer, 0,01 % bromphenolblåt) og inkuberet ved 90 °C i 3 minutter.

Efter centrifugering (12000 x G) i 30 s blev supernatan-10 terne påført 10 S polyacrylamidgelplader (45).·

For yderligere at udforske den post-translatiohelle forarbejdning af klonet gD gennemførtes impuls-forfølgel- ses-undersøgelser. Fig. 4B viser immunofaldning af klonet gD fra gD12-celler med kanin-anti-HSVl-antistoffer (Dako, 15 Corp.) til forskellige tider efter impulsmærkning med 35 S-methionin. Fig. 4B viser en impulsmarkning af g012-celler. Ved disse undersøgelser blev celler dyrket til konfluens i 10 cm vavskulturskåle og mærket med "^S-methionin som beskrevet ovenfor med undtagelse, at msrk-20 ningsreaktionen blev udført i 15 minutter på is, cellerne vasket 3 gange med frisk medium cg derpå ført tilbage til inkubatoren og inkuberet ved 37 °C i forskellige tidsrum. Reaktionerne blev afsluttet ved vaskning af cellerne i kold phosphatpufret saltopløsning og solubi-25 lisering af cellerne som beskrevet ovenfor. Proteiner blev immunofældet ved de Følgende tider efter impulsmærkning: bane 1, 5 minutterj bane 2, 15 minutter; bane 3, 30 minutter; bane 4, 60 minutter; bane 5, 120 minutter. Forstadie formen af gD med en molekylvægt på 51 kd blev 30 specifikt udfaldet fra gD12-cellelinien 5 minutter efter en impuls med ^S-methionin, og dette forstadium blev fulgt ind i formen med højere molekylvægt (59 kd) efter omkring 60 minutter. Ud fra disse undersøgelser bedømmer vi halveringstiden for denne post-trans lationeIle be-35 givenhed til at være omkring 45 minutter. Forstadie- 20 DK 173597 B1 produktets Forbindelse mellem 51 kd båndet og 59 kd båndet minder nært om den, der er rapporteret For virus-produceret gO (14, 42, 46, 47), og kinetiken for denne proces ligner den, der er beskrevet aF Cohen et al.

5 (42). I virusinFicerede celler er forskellen i molekyl vægt mellem Forstadiet og produktet blevet tilskrevet både N-Forbundne og O-Forbundne oligosacchårider (48).

For at bestemme om gD blev eksporteret til celleoverfladen udførtes indirekte immunofluorescens-undersøgelser.

10 Ued disse undersøgelser blev kanin-, muse- og humant anti-HSU-antistof omsat med ufikserede celler under betingelser, som ikke permeabiliserer cellemembranen (49). g012-celler og udgangs(CHO)-cellerne (forhold 1:1) blev udpladet på glasdækplader (2,2 x 2,2 cm) og 15 dyrket, indtil cellerne var omkring 60 % konfluente.

Humant serum, som vides at indeholde antistoffer over for HSV1 (50), blev fortyndet 40 gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), og 100 ^ul blev pipetteret ud på vaskede celler, og cellerne blev inkuberet i 30 minutter 20 ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Cellerne blev neddyppet 3 gange i PBS for at bortvaske ubundet antistof og blev derpå inkuberet med 100 yul 20 gange fortyndet tetramethylrhodaminisothiocyanat-mærkede gede-antihuman-IgG-antistoffer (Cappel Laboratories) i yderligere 30 25 minutter. Oet ubundne mærkede antistof blev bortvasket med PBS, og cellerne blev dehydratiseret i -iskoldt 50 % ethanol og 100 % ethanol og rehydratiseret med glycerol på et mikroskop-præparatglas (49). Cellerne blev derpå betragtet under Fasekontrast- og Fluorescens-optik i 30 fluorescensmikroskop (Zeiss). Fig. 5 viser: A, g012- og CHO-celler set visualiseret med Fasekontras toptik; B, fluorescensbillede af de samme celler som i A. Sammenligning af fasekontrastbillederne med Fluorescensbillederne (Fig. 5) viste, at gD12-cellerne var kraftigt 35 mærket, medens udgangs-CHO-cellerne kun vandt lidt eller 21 DK 173597 B1 intet mærket antistof. Ved kontrolforsøg med normale musesera, normale kaninsera eller' humane sera, som vides at være negative for HSV-antistoffer, kunne der ikke detekteres nogen specifik mærkning af cellerne. Disse 5 undersøgelser tydede på, at gD-proteinet blev eksporte ret til celleoverfladen. Forsøg med CHO- og gD12-celler fikseret før mærkningen med midler, som videns at permeabi-lisere cellemembranen (methanol eller acetone) gav et forskelligt mærkningsmøn3ter. Ved disse undersøgelser 10 blev der iagttaget en kraftig perinucleær mærkning af gD12-cellerne med anti-HSVl-antistoffer og ingen specifik msnkning af CHO-cellerne.

For at bestemme om gD12-celler udtrykte antigeniske determinanter relevante for humane HSV1- og HSV2-infek-15 tioner undersøgtes bindingen af antistoffer fra individer, som man vidste havde anti-HSVl- eller anti-HSV2-antistof-fer (50). Radioimmunofældning - af lysater fra metabolisk mærkede gD12-celler gav resultater, som var sammenlignelige med dem, der blev opnået med gnaver-anti-HSV-sera 20 (fig. 4). På lignende måde gav humane anti-HSVl-sera specifik mærkning af gD!2-celler ved en indirekte immuno-fluorescens-prøVning (fig. 5) og mærkede ikke udgangs-CHO-cellelinien. Tilsammen giver resultaterne opnået med forskellige gnaver-anti-HSVl- og -HSV2-antisera, 25 monoklonale anti-gD-antistofFer og humane anti-HSV-anti- sera =.bevis for, at gD udtrykt på overfladen af gD12-cel-ler har et antal antigeniske determinanter fælles med det native virus, og at strukturen af disse determinanter ikke er afhængig af samvirken med andre HSVl-proteiner.

30 Den kendsgerning, at et af de prøvede monoklonale anti stoffer (1-S) vides at neutralisere HSV1 in vitro (41) og viser, at det gO, der produceres i CHO-celler, har mindst én af de neutraliserende antigeniske determinanter fælles med det native virus.

22 DK 173597 B1

For at få et kvantitativt mål for bindingen af anti-HSVl-antistoffer til g012-celler udvikledes en enzymforbundet immunosorptionsprøvning (ELISA) (52), Ved disse undersøgelser blev gD12-celler og CHO-celler udpladet og kemisk 5 fikseret til skiftende huller i 96 hullers mikrotiter- vavskulturplader. Forskellige antisera, som vides at indeholde antistoffer over for HSV, blev derpå rækkefor-tyndet og fik lov at reagere med de fikserede celler.

Ved prøvningens afslutning blev absorbansen i hvert 10 hul målt, og der blev konstrueret normalbindingskurver. *

Den specifikke binding af antistoffer til gD12-cellerne blev bestemt ved subtraktion af værdierne opnået med udgangs-CHO-cellerne fra dem, der blev opnået med gD12-céllerne. Specifik binding af høj-titer-sera kunne detek-15 teres i fortyndinger på 1:10000.

Serumtitere bestemt under anvendelse af gD12-celle-ELISA-prøvningen blev sammenlignet med anti-HSVl- og anti-HSV2-.titere bestemt ved konventionelle metoder. Humane sera, som i forvejen var titreret (50) over for HSV ved kon-20 ventionelle prøvninger, dvs. inhibering af hæmagglutina- tion (IHA) eller komplementfiksering (CF), blev rskkefor-tyndet i huller på mikrotiterplader indeholdende enten gD12-celler eller udgangs-CHO-cellelinien, og bindingen af anti-gD-antistoffer blev kontrolleret ved en ELISA-25 prøvning. gD12-cellerne og udgangs-CHO-cellerne blev podet i skiftende huller på 96 hullers mikrotiter-vævs-kulturplader (Falcon Labware) og blev dyrket til konfluens i F12-medium (GIBCO) indeholdende 10 % føtalt okseserum.

Cellerne blev vasket 3 gange med phosphatpufret saltop-30 løsning (PBS) og blev derpå kemisk fikseret med 0,0625 % glutaraldehyd i PBS. Cellerne blev igen vasket 3 gange med PBS og opbevaret indtil anvendelsen ved A °C i PBS indeholdende 1 % okseserumalbumin, 100 mM glycin, 1 mM NaNj. For at måle anti-gD-antistoftitere blev cellerne 35 vasket med PBS og rækkefor tyndede antisera fik lov at 23 DK 173597 B1 reagere med de fikserede celler (50 yVl slutvolumen) i 1 time ved stuetemperatur. Ubundet antistof blev vasket bort» og cellerne blev inkuberet med 50 ^ul 1:2000 fortyndet gede-antihumant-IgG koblet til peberrod-peroxi-5 dase (Tago» Inc.). Det enzymforbundne antistof fik lov at reagere i 1 time ved stuetemperatur» og cellerne blev derpå vasket 3 gange med PBS. Efter inkubation tilsattes per'oxidase-substratet, o-phenylendiamin (200 yul), og reationen fik lov at skride frem i 10 minutter.

10 Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2,5 M ^SO^ (50 ^ul), og absorbansen af reaktionsmediet fra hvert hul blev bestemt med et automatiseret pladeaflæsnings-spektrofotometer (Titertek). I fig. 6 udviste serumet, repræsenteret ved de åbne og lukkede cirkler, en HSVl-15 CF-titer på 128 og HSV1- og HSV2-IHA-titere på 4096.

Serumet, repræsenteret ved åbne og lukkede kvadrater, udviste en HSVl-CF-titer på <8 og HSV1- og HSV2-IHA-ti-tere på <8. A, lukket cirkei og lukket kvadrat angiver binding til gD12-celler, åben cirkel og åbent kvadrat 20 angiver binding til CHO-celler. B, lukket cirkel og lukket kvadrat repræsenterer den specifikke binding til gD12-celler udregnet ved subtraktion af værdierne i A. I fig. 6 kan det ses, at et serum med en høj anti-HSV-titer bestemt ved konventionelle prøvninger gav 25 en høj ELISA-titer, medens et andet serum med lave anti- HSV-titere ikke gav nogen detekterbar binding ved gD12-ElISA.

De beskrevne undersøgelser viser, at stabile cellelinier konstitutivt på deres overflade udtrykker et transficeret 30 genprodukt, som forbinder sig med antistoffer frembragt af herpes-virus-infektion.

Immunisering af mus med gD12-celler.

20 BALB/c-hunmus (5 uger gamle) blev skaffet fra Simonsen 24 DK 173597 B1

Laboratories (Gilroy, California). Musene blev delt i to grupper på hver 10 mus: en "forsøgs”-gruppe og en "kontrol"-gruppe. Hver mus i forsøgsgruppen blev injiceret med gD12-celler, som vides at udtrykke HSVl-5 glycoprotein D på deres overflade. Hver mus i kontrol gruppen blev injiceret med udgangs-CHO-cellelinien, hvorfra gD12-cellelinien var afledt. Til immunisering af mus blev begge typer celler dyrket til konfluens i 15 cm vsvskulturskåle. CHO-cellerne blev dyrket i 10 Hams F12-medium (GIBCO) suppleret med 7 % kommercielt dialyseret føtalt okseserum (GIBCO), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml). gD12-cellerne blev dyrket i det samme medium uden glycin, hypoxanthin og thymidin. For at indhøste cellerne blev hver skål 15 vasket to gange med 15 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derpå behandlet med 15 ml PBS indeholdende 0,02 % EDTA. Efter 15 - 20 minutter blev cellerne fjernet fra skålen og peletteret ved centrifugering i 5 minutter ved fuld hastighed i en klinisk centrifuge (IEC modol 20 CL clinical centrifuge, rotor model 221). Supernatanten blev smidt væk, og cellerne blev gensuspenderet i PBS til en slutkoncentration på 1 ml PBS pr. hver 15 cm skål med celler. Hver mus blev derpå injiceret med 0,5 ml cellesuspension (ca. 5 x 10° celler) fordelt som 25 følger: 0,25 ml injiceret intraperitonealt og 0,25 ml injiceret subcutant i den løse hud i nakken. Musene blev derpå forstarkningsinjiceret 2 gange med friske celler (fremstillet som beskrevet ovenfor) den 38. dag og den 55. dag efter den oprindelige immunisering. Musene 30 blev blødtappet via halevenen den 68. dag for at opnå sera til in vitro neutraliseringsundersøgelser- Musene blev udsat for H5V1 (MacIntyre stamme) den 70. dag. Virusudsættelsen skete ved en intraperitoneal injektion på 2 x 107 pfu virus i hver mus. Musene blev bedømt 35 dagligt for dødelighed og hver anden dag for vagtændring og indtræden af lammelse. Alle musene i kontrolgruppen 25 DK 173597 B1 døde inden for 7 dage for virusudsættelsen, medens alle Forsøgsmusene blev beskyttet og ikke viste noget tegn på infektion. Disse undersøgelser fører til den konklusion, at immunisering med gD12-cellerne beskytter mod 5 en dødelig HSVl-udsættelse.

En varietet af transfektionsskemaer er selvfølgelig mulig under anvendelse af en række forskellige selekter-bare markører. F.eks. kan muse-L-celler nyttigt trans-ficeres under anvendelse af et utant dhfr-gen som en 10 selekterbar markør. gD-genet blev transficeret ind i sådanne celler via en vektor, der indeholder en sådan markør. I princippet kunne den beskrevne strategi anvendes til enhver situation, hvor der ønskes udtrykkelse af et membranprotein.

15 Udtrykkelse af en afkortet form af gD-genet.

Den forudgående beskrivelse angår fremstillingen af membranbundet gD-protein. Som omtalt ovenfor i forbindelse med fig. 2 blev der imidlertid ved analyse af amino-syresekvenserne af gD-proteinet i HSV1 og HSV2 i hvert 20 tilfælde identificeret et hydrophobt/hydrophilt carboxyl- terminalt membranbindende domæne (fig. 7).

Et skematisk diagram af HSVl-glycoprotein D (gD).

Hydrophobe (gråtonet) og hydrophile (mærket +) områder af proteinet blev bestemt ud fra hydropatianalysen af 25 gD-proteinsekvensen afledt fra gensekvensen. Kun de områder, som menes at være vigtige for membranlokalisering og -binding, er vist. De funktionelle domæner er: a) signalsekvensen (33), b) det hydrophobe transmembrandomæne og c) det ladede membrananker. De 3 formodede 30 N-forbundne glycosyleringssteder er vist med bogstavet G. Udtrykkelsesplasmidet bestod af det bakterielle pBR322- 26 DK 173597 B1 repliceringsorigin og -ampicillinresistensgen, en cDNA-indsstning, son koder for muse-dihydrofolatreductase-genet under transcriptionsstyring af den tidlige SV40-promotor (53) og et HindliI-Hinfl-fragment, som koder 5 for de første 300 aminosyrer af gD under transcriptions styring af' en anden tidlig SV40-promotor. HindIII-cen-tret i dette fragment ligger 74 bp til 5'-siden for gD-genets start-methionincodon. HindllI-centret i vektorens tidlige SV40-område (36) ligger 250 bp til 3*-10 siden for SV40-promotorens Goldberg-Hogness-kasse. Hinfl- centret (gjort stumpt med Klenow-DNA-polymerase og 4 deoxynucleotidtriphosphater) ligeres til Hpal-centret i det 3'-utranslaterede område af hepatitis-B-virus-over-fladeantigen-genet (36). Denne metode er også nyttig 15 til fremstilling af et afkortet HSV2-gen. Den resulteren de sekvens skaber en stopcodon (TAA) umiddelbart efter aminosyre 300 i gD-genet. Transcriptionsafslutnings-og -polyad.enyleringscentre for den afkortede gD-gen-trans-cript er indkodet af det 31-utranslaterede område af 20 hepatitis-B-overfladeantigen-genet (36).

Plasmidet pgDtrunc.dhfr blev konstrueret som følger: det gD-holdige SacI-fragment på 2,9 kb blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSVl-genomet (se ovenfor) i plasmidet pFM3 (se ovenfor) skåret med SacI. Et Hindlll-25 BstNI-fragment på 1,6 kb indeholdende hele gD-genet blev subklonet ind i HindiII-BstNI-nedbrudt pFM42 (EP ansøgning nr. 68693). Dette plasmid blev derpå skåret med Hinfl, gjort stumpt med Klenow-DNA-polymerase og 4 deoxynucleotidtriphosphater og derpå skåret med Hindlll.

30 HindiII-stump-HinfI-fragmentet på 960 bp indeholdende det afkortede gD-gen blev isoleret og ligeret til Hindlll-HpaI-bedbrudt pEHBall4. Den resulterende konstruktion (pgDCos-trunc) indeholdt det afkortede gD-gen med hepa-titis-B-overfladeantigen-genet ved dets 3'-ende. Et 35 2,3 kb HindliI-BamHI-fragment indeholdende det afkortede 27 DK 173597 B1 gD-gen blev isoleret fra pgOCos-trune. Fragmentet på 2,8 kb indeholdende originet og den tidlige promotor fra SV40 og ampicillinresistens-genet og det bakterielle repliceringsorigin fra pBR322 blev isoleret fra plasmidet 5 pEHBal 14. Fragmentet på 2,1 kb indeholdende muse-dihydro- folatreductase-cDNA-klonen under transcriptionsstyring af en anden SV40-tidlig-promotor blev isoleret fra plasmidet pE348HBVE400D22 (36). Disse 3 fragmenter blev ligeret sammen med T4-DNA-ligase, og den resulterende 10 blanding blev anvendt ved at transformere E. coli stamme' 294. Plasmid-DNA fra de resulterende kolonier blev sigtet med Sac 2, og den korrekte konstruktion pgDtrunc.dhfr (fig1.’ 8) blev anvendt til yderligere transfektionsunder-søgelser.

15 Plasmidet pEHBal 14 blev konstrueret ved spaltning af pE342ARl (beskrevet nedenfor), en SV40-hepatitis-chimæra, med Xba I, som spalter én gang i kodeområdet for HBV-over-fladeantigenet, og derpå sekventielt fjerne sekvenser, der omgiver dette Xbal-center ved anvendelse af nuclea-20 sen Bal 31. Plasmidet blev ligeret i narvær af det syn tetiske oligonucleohid 5·-AGCTGAATTC, som forbinder HBV-DNA’en med et Hindlll-restriktionscenter.

Resulterende plasmider blev sigtet for et EcoRI-HindlII-fragment på ca. 150 bp. pEHBal 14 blev sekvensbestemt, 25 hvilket bekræftede, at et Hindlli-center var blevet placeret ved et punkt lige ovenfor, hvor HBsAg-startco-donen normalt findes. Denne konstruktion placerer således et unikt HindllI-center, som er egnet til kloning ved en position, hvor et højt udtrykt protein (HBsAg) begynder 50 translation. Alle formodede signaler, som er nødvendige for høj udtrykkelse af et protein, bør være til stede på denne 5’-ledersekvens.

Plasmidet pE342, som udtrykker HBV-overfladeantigen 28 DK 173597 B1 (også betegnet som pHBs348-E), er blevet beskrevet af Levinson et al., EP offentliggørelsesskrift nr. 0073656, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning. (Kort fortalt blev originet fra abevirus 5 SV40 isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med HindlH og omdannelse af HindliI-enderne til EcoRI-ender ved tilføjelse af en omsætter (AGCTGAATTC)). Denne DNA blev skåret med PvuII, og RI-linkere tilføjet. Efter nedbrydning med EcoRl blev 348 bp fragmentet, der spænder over 10 originet, isoleret ved polyacrylamidgel-elektroforese og elektroeluering og klonet i pBR322. Udtrykkelses-plasmidet pHBs348-E blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet fra EcoRl- og BgllI-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, N.Y.

15 (1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAg) ind i pi asmidet pML (Lusky et al., Nature, 293: 79 (1981)) ved EcoRl- og BamHI-centrene. (pML er et derivat af pBR322, som har en deletion, der eliminerer sekvenser, som er inhiberende for plasmidreplicering i abeceller).

20 Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå linearise- ret med EcoRl, og 348 bp fragmentet repræsenterende SV40-ori.ginområdet blev indført i EcoRI-centret i pRI-Bgl. Originfragmentet kan indtræde i såvel den ene som den anden orientering. Da dette fragment koder for både 25 den tidlige og den sene Sl/40-protnotor foruden replice- ringsoriginet, vil HBV-gener udtrykkes under styring af såvel den ene som den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBs348-E repræsenterer HBs udtrykt under styring af den tidlige promotor). pE342 modifice-30 res ved delvis nedbrydning med EcoRl udfyldning i det spaltede center under anvendelse af Klenouz-DNA-polymerase I og ligering af plasmidet sammen igen, hvorved man fjerner EcoRI-centret forud for SV40-originet i pE342.

Det resulterende plasmid betegnes pE342ARI.

35 Den resulterende sekvens skaber en stopcodon (TAA) umid- 29 DK 173597 B1 delbart efter aminosyre 300 i gO-genet. Transcriptions-afslutnings- og polyadenyleringscentrene for afkortet-gO-gentranscripten er indkodet af det 3'-utranslaterede område af hepatitis-B-overfladeantigen-genet (36)·.

5 Den resulterende vektor blev transficeret (40) ind i en dhfr” CHO-cellelinie (39), og der blev selekteret en egnet klon gG10*2, som producerede det afkortede gD-protein og secernerede det til det omgivende medium. Proteinet blev ekstraheret fra mediet, og cellerne blev 10 prøvet for immunogenaktivitet. Fig. 9 viser resultaterne af immunofældninger af intra- og ekstracellulære ^S-methionin-mærkede ekstrakter.

Radioimmunofældning af celleforbundne og secernerede former af gD.

15 Celler blev dyrket i Ham's F12-medium (Gibco) suppleret med 7 S kommercielt dialyseret føtalt okseserum (Gibco), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml).

Da kulturerne var omkring 80 % konfluente, blev mediet fjernet, cellerne blev vasket to gange med phosphatpufret 20 saltopløsning (PBS), og der tilsattes et mærkende medium (Dulbecco's modificerede=Eagle's medium indeholdende 1/10 af den normale koncentration af methionin) til 2 35 en slutkoncentration på 0,05 ml/cm . Der tilsattes S-methionin SJ.204, Amersham Int.) til en slutkoncentration 25 på 50 - 75 yuCi/ml, og cellerne blev dyrket i yderligere 18 - 20 timer. Efter mærkningen blev mediet indhøstet, og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernet fra kulturskålene ved behandling med PBS indeholdende 0,02 % EDTA. Cellerne blev derpå solub,i 1 iseret i lysepuffer 30 bestående af: PBS? 3 % NP-40, 0,1 % okseserumalbumin, 5 x 10 ^ M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TlU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12000 x G. Til immunofældningsreaktio- 30 DK 173597 B1 ner blev cellelysaterne fortyndet tredobbelt med PBS, og aliquoter (typisk 180 ^ul) blev blandet med 2-5 ^ul antisera og inkuberet ved 4 °C i 30 minutter. For at immunofælde den secernerede form af gD blev 500 ^ul 5 konditioneret medium inkuberet med 2 yul antisera i 30. minutter ved 4 °C. Immunkomplekser blev derpå adsorbe-ret til fikserede S. aureus celler ved Kessler's metode (40a) og blev udfeldet ved centrifugering ved 12000 x G i 30 s. S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange 10 med vaskepuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3 % natriumdodecyl-sulfat), og immunkomplekserne blev elueret med 20 /u! polyacrylamidgel-prøvepuffer (62,5 mM ”Tris"-HCl-puffer (pH 6,8) indeholdende 10 % glycerol, 5 S 2-mercapto-ethanol og 0,01 % bromphenolblåt ved 90 °C i 3 minutter.

15 Efter centrifugering i 30 s blev supernatanterne påført 10 % polyacrylamidgelplader ifølge Laemmli's metode (45). A, immunofældning af fuld-længde membranbundet gD fra gD12-cellelinien. B, immunofældning af den celleforbundne form af det afkortede gD fra lysater af to 20 uafhængigt afledte cellelinier (1 og 2). C, immunofældning af det afkortede gD fra kultursupernatanterne af de to cellelinier fra B. (-) viser kontrol-kaninantiserumj (+) viser kanin-anti-HSVl-antiserum (Dako Corp.).

Der ses tydeligt en intracellular form på 35000 dalton 25 og et secerneret og tilsyneladende glycosyleret ekstracel- lulært gD-protein.

Fremstilling af afkortet gD anvendt til immunisering.

gD10.2-celler blev dyrket til konfluens i polystyren-vavs-kultur-rulleflasker (Corning 25140) i F12-medium suppleret 30 med 7 % kommercielt dialyseret føtalt kalveserum, 50 ^ug/ml streptomycin og 0,3 ^ug glutamin. Efter at der var nået konfluens, blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket 3 gange i det samme medium uden føtalt kalve- 31 DK 173597 B1 serum og suppleret med 2 mg/ml Hepes-puFfer (serumfrit medium). Cellerne blev derpå dyrket i 3 - 4 dage i serum-frit medium, og det konditionerede medium blev derpå indhøstet og opbevaret ved -20 °C. Mediet blev derpå 5 optøet ved 37 °C og centri Fugeret ved 5000 omdr./min.

i 20 minutter i en Sorvall GS-3 rotor. Efter centrifugeringen blev pillen smidt væk, og supernatanten blev koncentreret i et ultrafiltreringsapparat (Amicon) udstyret med en YM-5 ultrafiltreringsmembran. Det resulterende 10 præparat blev koncentreret omkring 150 gange i forhold til udgangsmaterialet og indeholdt omkring 8 mg protein pr. liter. Præparatet blev derpå dialyseret i udstrakt grad over for phosphatpufret saltopløsning (PBS) og anvendt til immunisering uden yderligere rensning.

15 Immunisering af mus

Hver 8 uger gamle BALB/c-mus blev immuniseret med 36 ^ug protein indeholdt i 200 ^ul af en emulsion bestående af 50 % vandigt antigen og 50 % "Complete Freund's adjuvant.". Hver mus blev immuniseret med flere intradermale 20 og subcutane steder som følger: 25 ^ul i hver bagfods- trædepude, 50 ^ul i halen og 100 yUl fordelt blandt 3-5 intradermale steder langs ryggen. 4 Uger efter den primære immunisering blev musene forstærkningsimmuniseret med 36 ^ug af proteinet som ovenfor med undta-25 gelse af, at emulsionen blev fremstillet med "incomplete

Freund's adjuvant". Til forstærkningsimmunisering modtog hver mus 200 ^ul af antigenemulsionen fordelt som følger: 50 ^ul i halen, 150 ^ul fordelt mellem 5 intradermale steder langs ryggen. 19 Dage efter forstærkningen blev 30 omkring 500 ^ul blod opsamlet Fra hver mus ved haleaf- tapning. De sera, som blev opnået Fra denne aftapning, blev anvendt til in vitro neutraliseringsundersøgelser (se nedenfor). 37 Dage efter forstærkningen blev musene anvendt til virusudsættelsesundersogelser. Kontrolmus, 32 DK 173597 B1 som passede til forsøgsmusene med hensyn til alder, køn og stamme, blev immuniseret med humant serumalbumin (15 ^ug pr. mus) under anvendelse af den samme forskrift som med forsøgsmusene.

5 In vitro neutralisering.

Sera fra 11 mus immuniseret med koncentreret gD10.2-kul- . tur-supernatant blev prøvet for evnen til at neutralisere HSV1 in vitro. Rækkefortyndet museserum (dobbeltfortyndinger: 1:8 til 1:16384) blev inkuberet med omkring 10 40 pfu HSV1 i 1 time ved 37 °C i Dulbecco's modificerede

Eagle's medium (DMEM). Efter seruminkubationen blev hver fortynding påført omkring 40000- Vero-celler indeholdt i hvert hul på en 96 hullers vævskulturplade. Efter 3-4 dage blev virusvækst bestemt ved farvning af hvert 15 hul med 0,5 % krystalviolet. Huller hvori der var virus- vækst, viste ingen farvning. Neutraliseringstitere blev udregnet ved bestemmelse af den højeste serumfortynding, som forhindrede virusinduceret celledød. Alle prøvede sera (n = 10) fra mus immuniseret med gD10.2-superna-20 tantmateriale viste H.SVl-neutraliseringsaktivitet (område .

1:16 til 1:512) og HSV2-neutra1iseringsakti vi tet (område 1:8 til 1:16). Kontrolmusesera (n = 8) gav ikke nogen neutralisering. Serum opnået fra en mus immuniseret med HSV1 gav en neutraliserende titer på 1:32.

2 5 Virusudsattelse 11 Mus immuniseret med koncentreret gD10.2-supernatant og 13 kontrolmus immuniseret med humant serumalbumin blev udsat for 10000000 pfu HSV1 (Maclntyre-stamme) ved intraperitoneal injektion. 14 Dage efter injektionen 30 af virus viste ingen af de gD10.2-immuniserede mus noget tegn på virusinfektion. I kontrolgruppen var 7 af de 13 mus døde ved den 14. dag, 3 viste alvorligt tab og 33 DK 173597 B1 lammelse, og 3 så sunde ud. Statistisk analyse (tvo tailed Fisher exact test) viste, at Forskellen mellem den immuniserede gruppe og kontrolgruppen var signifikant ved niveauet p = 0,002 (se tabel 1).

34 DK 173597 B1 jj c © —I <1> <—I •h o cn

C -U li- H C

ej c) to > ·Η (-lo?

X) Ό CO 0) Η Ό O

(U C <—I fA .. E H (J C Cj 1*- O II

tf) (D r—i h Η ·Η D d >» 0) ΙΛ O' I 3 E

r—I > Q) 4J £ 10 4) T3 C-t O Di E 33

Od) jj λ Ct © © «-(-«£(-1 jj f—i 1*— CO —4 JJ Cj O .C O' CM) a -H 0)

Jj Q) t-4 Cj Di <·- CD Ή H JJ 0) 0)

Bi © -H © E © Ό (0 W CO

tf) (DO) > o? D K\ C E Cj C JJ

tIO| . OM) N £ P <U (0 (j O -H C

O sj O C0«D> lA O Ό »TO :> © U_ C rt

T31 Ό 3WW »B C Q. Ό Di E

EX o <u i? Λ I) h 3 on jj© ce cj c eb x: rH OD Cj X) X) -U CD 0 4) 1)4) i χ> © —i © to co (j ia c ro co © JJ fl) >—( O E © Ό to -H D Cj Ό

~ jj © X) —l £3 ··"> <D T) C E O CO

<M © JJ C © © JJ © D-H e)®Ci_c

—4 E -H Dør CTjJ Cj > EB

> E O fA > 4) H C > (0 ·Η O I) (4 E

tn CO -H Cj > ·Η Cj C 1-tJJ —4 —I © x i—i jjotn co© ο. © qVjq-pj) ^ e. x (j u. ό c» e- c' CO© © Γ~·Η Ό OM) Φ (0 U- —4 © «4- O JJ © C —(

OIJC «Η C B *—( JJ © > -H © CO

,-J C EB © (4 © Cj Cj O' > •H C (4 O G) © X σ» ¢) 4) ® s ·Η JJ Cj © I i—I © ro C (!) (Ι)Ό i 3 VO o . Ό OHH H Jj (4 (4 -r( Di <U »—I BQ a U O) O JJ © © C On 8)

c ·· ·Η σιΓ 0) O E 1*-C7I O M 3 —I

t —I i—I C > E « CO ©-HEC

»—I CMIO CJ JJ © 3» © >-( ©CEN©

> CO Cj © O © JJ C D-HD

—i . in·» J) h OOH (I) o > O' E t< Ό U) χ —| D © X) O £> © HU D E © Ή ©

CD © C C O .Ω JJ —1 '"-v-t Cj > E

C b IXt O Di £) EB

I— I © T3 ΟΙΌ © IA > E Cj JJ

n Or-u) ro o ·<-)© ω ·α o © —t > O (0 (i Ό > CD O'—I Cj t>- Cj • to o> .X s —t e cd α © JJ CJ X e li- <t J-* -H Jj CO · 3 ,-t X) © *co © —i © cj ro c ro -h cm

©lA CO © Cj ϋ Cj C CO jJ Di 3 © CO C O

C·· O E C*— © cn ©JJ ΕΣΌΌ 3 O

i—i >jj© cro o de -4 I O I C O © »4- (4 O« · (-1 E o

> NO <—I O <* —I UJ X) Jj x X) CO © > -H

tn r—( >-HjQD ·ηχ © c jj © il x·· tn jj T) · »tj ε ·“· **- ·“· J3 r—i x ro © cn © > jj ©· c od o o.

C E C Ό O O CL-—- Jj W ·—)

(J -Η ·Η 10 H i CO© © S (4 © X) JJ

O U 4) ΌΗ O EB (4 E (4 <—I © C ©

CfA i*— O © C Q. > JJE © CL CO © (0 D

© © ro cj >·. cj © to cro co o x co d ro Π C JJ 0> © JJ © C-4 D H 4) -r-ι d E © •rt D © CO J3 (-4 Jj © Cj CO c: <fSH >

Jjf4 > O' D O H jJ -.-4 Cj I D Jj O -H

C JJ C © C Di <4- JJ -M > O© E C · · (4 C

<£Oin (4 -1-4 C O Jj ti-u e CO (4 Jj Jj cn x α C -r! (4 ti OT © >- -H > © © C X?

Di © Di CPX) 4)4) C D X» Cj O . © 3» Cj > > -H C © coco > ‘—> © © - >

©EB © X E *·"· Cj CO *-4 *r4 © X) Jj CO «X

—4 H 4) H CjX) Ό o 4) -4 B BH .tn JJ

CO O Cl) D · M 1) C 3 Σ JC X) C C X C

4) » Η ΙΛ Cj O (J CO Ή -—4 O) CO © D © '— CO

CD—1^4 ro O —- O © --4 c > «4- CO - C E CO Di < X t-, ti- <t »—I «—I Cj ©—4C DX)C0ECC->-4 © ao r- —i ro o —i > -h ecjj-h-m-h «4- CO C IA tA D Cj ti- X) t/S I D D CO Cj E ·«-»

©©NO £ 4) X—I Cj © © CO © D C

Gi (D Ό <—I XJ DE CO > © Cj Xl C CO X) G»

© D C ·· © nO © O D**-tn > U- D -H -H —4 -H

CO O Ω X CO —I > ON Z CO X <0 X XL' CO C C ro tn

Cj ON CTN

O O O · · U_ lA vA —I CM ΙΑ <ί 35 DK 173597 B1

Det fandtes, at det afkortede protein frigivet til mediet fra gD10.2-celler var effektivt til at beskytte mus mod en dødelig infektion af HSV1.

Antigenfremstilling til HSV2-virusudsættelse.

5 Forstarkede gD10.2.2-celler, dyrket i nærvsrelse af 250 nM methotrexat, blev podet i rullekultur flasker 2 (850 cm ) og blev dyrket i Ham's F12-medium (GIBCO) suppleret med 7 % føtalt okseserum. Efter at cellerne havde nået konfluens (cå. 5 dage) blev dyrkningsmediet 10 fjernet, cellerne blev vasket 3 gange i phosphatpufret saltopløsning (PBS) for at fjerne serumproteiner, og der tilsattes nyt "serumfrit" dyrkningsmedium. Det serum-frie medium bestod af Ham's F12-medium indeholdende 25 mM Hepes-puffer. Cellerne blev derpå dyrket i 3 dage, 15 og det resulterende konditionerede medium blev indhøstet og anvendt til antigenfremstilling. Derpå sattes frisk serumfrit medium til cellerne, og kredsløbet med indhøst-ning af konditioneret medium med 3 dages intervaller blev gentaget yderligere 1 eller 2 gange, indtil cellerne 20 døde eller ikke længere hæftede til kulturoverfladen.

Det gD10.2.2-konditionerede serumfrie medium blev derpå filtreret og centrifugeret med lav hastighed for at fjerne cellerester, og det resulterende materiale blev koncentreret 10 - 20 gange med en ultrafiltreringsindret-25 ning (YM-10 membran, Amicon). Det koncentrerede medium blev derefter dialyseret natten over imod PBS (3 udskiftninger af PBS, 1 liter pr. udskiftning). Det resulterende materiale blev prøvet for at bestemme proteinkoncentrationen og analyseret ved polyacrylamidgelelektroforese 30 for at bestemme proteinsammensætningen og bedømme præpa ratets renhed. Det ved denne fremgangsmåde fremstillede materiale blev derpå anvendt til at immunisere dyr mod HSV2-infektion som beskrevet nedenfor.

36 DK 173597 B1

Immunisering af mus mod H5V2-infektion.

40 BALB/c-hunmus blev skaffet fra the Charles River Laboratories (Boston, MA) og blev immuniseret med det secernerede gO-protein (gDtrunc) eller humant serumalbumin 5 (HSA) i en alder på 12 uger. Til den primære immunisering mod det secernerede gO-protein blev antigenet indstillet til en koncentration på omkring 70 ^ug/ml i phosphatpuf- · ret saltopløsning og blev emulgeret med et lige så stort volumen "complete Freund’s adjuvant". Hver mus blev 10 derpå immuniseret med 200 ^ul af denne emulsion fordelt som følger: 50 ^ul subcutant ved et sted ca. 1 cm fra haleroden, 25 ^ul subcutant i hver pagpotetrædepude og 100 ^ul fordelt blandt 3-5 intradermale steder langs ryggen. Musene blev derpå forstærkningsimmuniseret 15 med det samme antigen 1 måned efter den primære immuni sering. Til forstærkningsimmuniseringen blev antigenet s fremstillet ved den samme procedure som ved den primære immunisering med undtagelse af, at "complete Freund’s adjuvant" blev erstattet med "incomplete Freund's adju-20 vant". Til forstærkningsimmuniseringen blev 200 ^ul antigenemulsion injiceret i hver mus, fordelt som følger: 50 yul i halen, 25 ^ul subcutant i den løse hud over hvert lår og 100 ^ul fordelt blandt 3-5 intradermale steder langs ryggen. Kontrolgruppen af mus blev 25 immuniseret ifølge den samme forskrift som forsøgsgruppen af mus med den undtagelse, at’humant serumalbumin erstattede det secernerede gO-protein som immunogenet. Serum blev opsamlet fra musene 24 dage efter forstærkningen til anvendelse ved in vitro neutraliseringsundersøgelser.

30 HSV2-virus-udsættelse.

Både forsøgsgruppen (injiceret med secerneret gD) og kontrolgruppen (injiceret med HSA) af mus blev udsat ved en intraperitoneal injektion af HSV2 (MS-stamme) 37 DK 173597 B1 31 dage efter Forstærkningsimmuniseringen. Hver mus modtog 2 x 10^ pfu virus i 100 y-ul Dulbecco’s modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 10 % Føtalt okseserum. LD50-forsøg viste, at denne mængde virus 5 repræsenterede 100 - 500 gange den mængde virus, som kræves til at dræbe 50 % af en population af normale (uinjicerede) BALB/c-mus. De virusinjicerede mus blev iagttaget i et tidsrum på 3 uger. Alle kontrolmusene (injiceret med HSA) døde inden for 9 dage fra virusudsæt-10 teisen. Alle musene, som var vaccineret med det secerne rede gD-protein, overlevede alle 3 uger og forekom normale (dvs. de viste ikke tab eller lammelsé).

38 DK 173597 B1 »“I « i c »—i ε © -u ii- io i g>

(D Ό tO AJ E C

•Ό 00 © W D C

0) C iA O h ·· EH >>h 0)

OT © *—I 01 Η -H 3 ti 0) O

ι-Ι> -P---^ O) (O CJ U. 0)

4-1 »—I dl OH-UK (DU

jj P P 4-1 » 01 O ·γΙ 0) Λ W (l cn σοι >*(i)0) tdtjI π οι n r o ή μ D Bl α ΙΛ Ό TO > S© X>[ CN 3 (Λ M U£ i) σ\ e x © c »—1 -PECO)

© P TI ©CO

ΡΌϋ.-0-ρ-σβ» ·

0) 01H O 0) P C

I -*-> +1UH£ α © CN© *»-t C © © P <0 © 01 *—i ε α > >* m <o ρ *-t ;=» ε O -H 4J H C <4- © ©

co© -p ρ > -h to p -P

Srt -X O LO 01H 0) 4-1 « l_ χ p c © -h ta © © © p e ό w

Cns* 0-H 0) E h T3

(0ΗΗ ID « D

r-H <J- -H ta © <—I -P 3> I

• cn p et; p o © tn cn 4-1 o © © I O © © 3=> d r-ι m ·'o o jo c to

©·. -Η Ω O P > > X

c r-ι o i—( oi.c © ©·©·<-( II (0 OHOO Ό CN CN CN P -P © J3 > C © > r-t -P © O TO > —) cn m d p © □ © -p UJ X·· © © "O O CO © © p CO —I C C C O TO C O © < I P © <t Ό O'

I— CN © ~U ffl · r—I

03 > UH4l<i P4J ra rH tn © © P Ό © 4-» • O X TO 3* O P D Di © 4J CN E «4- © W Ό D .. DO © ·© 4J > > © .-I O © P Qi.’p © TO >-(

Cl gt- uh 3 -Ή I -d· I > P · 4-1 1-ttNO ·—I C O © · -H ©

> O > O^H 0) © > h C

cn ·—I to -H jQ "O P © >n

X«. Χ-ΡΌ (0ffi©4-> TO

—i ra © o*·—i +ιυ·π c ρ c ε c ex-π © 4-> ©

o ·Η -Η P 4-1 P OT SI

(^ ϋ4ΐυ e »u σ cm o©C4->o>ccm © © JJ S h λ-H c -H -H © σ c ©>©4J.p-hxp ε •H 3 >to_qpopp©

4-1 p QCTi30P©0ot P

C 4-1 <C P C SS U- SS MU---C O

<J O LO O. Ή C ·*-0 ·Η i—1 «*-

Dl I C -Η P Ε Ή E TO C

> SS © TO O P © ©P>>TOPW4-> >

—1 K © X P 4-> 3 O

•—1 jQ 4-1 ^ © 3 ·' © ra OT J3 . ^4 © O» c c 4-i ot mm S p cj —(3Ξ c © CD i—I CN DO^oD ·Η © 4-1 <c e p o _c · ό c? m © CO r- il C -H 2£ w c m o vo © >\r—i ©

© © N> (J\ H -U i) oJ

Ol TO TJ —I Ό O P -P

O DC ••©C -HOC© ot oo 2ira^-i>©>ti-OT tn ρ cn o\ o r- r-~ * · u_ mm <—i cn 39 DK 173597 B1

Afkortet glycoprotein 0 blev renset fra dyrkningsmedium, som var konditioneret ved væksten af den tidligere beskrevne gD10.2-cellelinie. Dyrkningsmediet blev koncentreret ved ultrafiltrering, og afkortet gD blev reset 5 ved immunoaffinitetschromatografi under anvendelse af et monoklonalt anti-gD-l-antistof koblet til "Sephadex® 4B"· Afkortet HSVl-glycoprotein D (gD-Ι) blev isoleret fra serumfrif medium konditioneret ved væksten af gD10.2-celler som tidligere beskrevet. Celledyrkningsmediet 10 blev koncentreret ved ultrafiltrering under anvendelse af kommercielt tilgængelige membraner (Amicon Corp.) og ammoniumsulfatfældning. gD-Ι blev derpå renset til næsten homogenitet ved immunoaffinitetschromatografi.

Immunoaffinitetssøjlen blev fremstillet ved kobling 15 af et monoklonalt antistof, produceret over for HSV1, til tværbundet sepharose*(Pharmacia Fine Chemicals) og elueret ved en metode mage til den, som er beskrevet af Axen et al. Nature 214, 1302-1304 (1967). Hovedproduktet i mediet af ufraktioneret dyrkningsmedium konditione-20 ret af gD10.2-cellelinien er den modne afkortede form af gD-Ι (omkring 43 - 46 kd) og en forstadieform af gD (omkring 38 - 40 kd). I gennemsnit repræsenterer gD proteinet 20 - 50 % af det protein, som er til stede i vækstkonditioneret medium. Fraktionering af dette 25 materiale ved immunoaffinitetschromatografi resulterede i en betydelig berigelse på gD. Det kan ses, at det eluerede materiale er frit for alle forurenende proteiner, der er detekterbare ved sølvfarvning. For at bestemme om rensning af proteinet ved denne forskrift denaturerede 30 proteinet eller brød molekylets antigeniske struktur, gennemførtes antigenicitetsundersøgelser med en række forskellige monoklonale antistoffer. Ved disse undersøgelser fandtes, at alle prøvede antistoffer undtagen dem, der er reaktive med carboxylenden, reagerede med 35 det rensede præparat. Der kunne ikke detekteres nogen forskel i antistofbindingsopførsel med det rensede præ- 40 DK 173597 B1 parat i forhold til materialet, som findes i ufraktionere-de ku ltursupernatanter.

For at bestemme om det rensede gD-l-protein kunne anvendes effektivt som basis for .en unde renheds-vaccine·til at 5 beskytte mod genital infektion med HSV2, blev marsvin vaccineret med gD-1 sammensat i forskellige tilsætningsopløsninger. Ved de første undersøgelser blev renset gD inkorporeret i "complete Freund's adjuvant" og injiceret i intramuskulære og subcutane steder på Hartley-hun-' 10 marsvin. Hartley-hurimarsvin, 2 måneder gamle og med en vagt på omkring 250 g, blev købt fra Charles River Laboratories (Portage, MI). Til undersøgelser under anvendelse af "Freund's adjuvant" bestod den primære immunisering af injektionen af 30 ^ug gD-Ι emulgeret 15 i 50 λ "complete Freund's adjuvant" fordelt som følger: 0,5 ml injiceret subcutant i den løse hud i nakken og 0,5 ml injiceret intramuskulsrt i låret. Efter 31 dage blev dyrene forstsrkningsimmuniseret med den samme mængde antigen inkorporeret i "incomplete Freund's adjuvant".

20 Kontroldyrene blev injiceret ifølge den samme forskrift som forsøgsdyrene ned den undtagelse, at der blev injiceret tilsætningsopløsning alene. Forsøgs- og kontrol-dyrene blev udsat ved intravaginal infektion med HSV2 19 dage efter forstærkningsimmuniseringen. Ved undersø-25 gelser under anvendelse af alun-tilsat gD-Ι blev 30 ^ug gD-Ι inkorporeret i enten alun-phosphat eller alunhydroxid (0,15 ml) anvendt til både den primære immunisering og forstærkningsimmuniseringen. Alun-tilsat protein blev injiceret ved intramuskulær injektion i bagbenene.

30 Dyrene blev forstærkningsimmuniseret 51 dage efter den primære immunisering og udsat for levende virus 27 dage senere. Hvert dyr modtog én primær immunisering indeholdende 30 yug renset protein inkorporeret i "complete Freund's adjuvant" og én forstærkningsimmunisering (31 35 dage senere) med den samme mængde antigen .inkorporeret 41 DK 173597 B1 i "incomplete Freund’s adjuvant". Alle dyrene blev udsat ved intravaginal indpodning af HSV2 19 dage efter forstærkningsimmuniseringen. Tabel 3 angiver resultaterne opnået ved disse undersøgelser. Det kan ses, at dyrene 5 vaccineret med gD producerede høje niveauer af antistof fer, som var i stand til at forhindre både HSV1 og HSV2-virusinfektion ved en in vitro virusneutraliseringsprøvning. Det fandtes, at seraene fra disse dyr neutraliserede HSV1 lidt mere effektivt end HSV2. Dette resultat 10 er rimeligt i betragtning af, at immunogenet var afledt fra HSV1, og at der vides at være typespecifikke anti-geniske determinanter på gD-Ι (Éisenberg, R.J. et al., J. Virol. _3å: 428 (1980); Pereira, L. et al., Infect, and Immun, 2j?: 724 (1980); Showalter, J.D. et al., Infect.

15 and Immun. „34, i 684 (1981)). Mere slående var det, at alle dyrene vaccineret med gD-Ι var fuldstændigt beskyttet mod de kliniske manifestationer af virusinfektion (dvs. rødmehævelse, vesikel-dannelse, ulceration, tab af urintilbageholdelse og dødelig encephalitis).

20 13 Af de 14 dyr, som var injiceret med tilsætningsmid del alene, udviklede alvorlige primære infektioner.

Der var talrige vesikler, som typisk koalescerede til dannelse af akutte ulcerationer. I modsætning hertil gav dyrene vaccineret med gD-Ι ingen indikation på virus-25 infektion. Disse resultater viste klart, at gD-Ι inkor poreret i "complete Freund's adjuvant" kan give effektiv beskyttelse mod genital HSV2-infektion.

Da "complete Freund's adjuvant" ikke er acceptabelt til brug hos mennesker, ønskede man dernæst at bestemme, 30 om gD-Ι kunne give beskyttelse mod HSV2-infektion, når det blev sammensat med et tilsætningsmiddel, som var egnet til human brug. Til formål blev der igangsat undersøgelser med alun-fældede proteinkomplekser (J.S. Garvey et al., Methods in Immunology (1977), side 185(17)).

35 I tabel 3 sammenlignes resultater opnået under anvendel- 42 DK 173597 B1 se af gD-1 inkorporeret i tilsætningsmidlerne alun-hydroxid og alun-phosphat. Ved kontrolundersøgelser blev dyr vaccineret med tilsætningsmiddel alene. Det kan ses, at begge de alun-baserede præparater udløste høje 5 niveauer af neutraliserende antistoffer over for HSV1, og at de neutraliserende titere over for HSV1 var sammenlignelige med dem, der blev udløst over for gD-1 inkorporeret i "complete Freund's .adjuvant". Imidlertid var titer'ne af antistof, som var i stand til at neutralise-10 re HSV2, væsentligt lavere med gD-1 inkorporeret i et af alun-præparaterne end med gD-1 inkorporeret i "complete Freund's adjuvant". Dette resultat tyder på, at inkorporering af gD-1 i alun resulterer i tabet af en eller flere antigeniske determinanter fælles for HSV1 15 og HSV2, eller at genkendelsen af krydsreaktive anti gener er mere effektiv, når proteinet er inkorporeret i "Freund's adjuvant". Disse resultater tyder også på, at alun-hydroxid er et mere effektivt tilsætningsmiddel pnd alun-phosphat, da de neutraliserende titere over 20 for HSV1 og HSV2 er væsentligt højere med det først nævnte end med det sidstnævnte.

Selv om den beskyttelse, som gives af alun-tilsætnings-præparaterne, var mindre effektiv end den, der opnås med "Freund's adjuvanf'-præparaterne var den ikke desto 25 mindre signifikant. Selv om et antal dyr viste tegn på virusinfektion, var infektionernes alvor betydeligt mindre end den, der blev iagttaget hos kontroldyr injiceret med tilsætningsmiddel alene. Således var middellæsionstallet 0,9 hos dyr vaccineret med alun-phosphat-30 vaccinesammensætningen og 0,7 hos dyr vaccineret med alun-hydroxid-vaccinesammensæthingen sammenlignet med et middellæsionstal på 3,2 for kontroldyrene injiceret med tilsætningsmiddel. Ifølge ή+ skalaen, der anvendes til bedømmelse af læsionsgrad, svarer reduktionen fra 35 et middellæsionstal på 3,2 til 0,7 til en reduktion 43 DK 173597 B1 i kliniske symptomer fra flere store vesikler (bedømmelse på 3) til mindre betydelig rødme og hævelse (bedømmelse på 0,5). Intressant er det, at den gennemsnitlige in vitro neutraliseringstiter over for HSV2 igennem disse 5 undersøgelser korrelegerede med alvoren af klinisk sygdom.

De ovenfor beskrevne resultater viser, at de kliniske manifestationer af primår genital HSV2-infektion kan reduceres væsentligt ved vaccination med rekombinant gD-1. De opnåede resultater viser, at et enkelt HSV1-. 10 afledt glycoprotein kan give fuldstændig beskyttelse mod genital HSV2-infektion, når. det indgives i forbindelse med et kraftigt tilsætningsmiddel.

44 DK 173597 B1 i d -h

C · — 1 CO

¢0 <f N Η N to (9 t3 ^ C t ·* w λ -v ·Η E H t3 •h ico h i—i*—i *—ι o α> . ε -O rH C · JZ o

E 01 O + 1 +1 +« +1 D D -DO D

O "O -H + O 4) O D >, 0) <U

0£ Ό W ·—I ΙΛ Ό N > L< T> O Li Li Ό 0] -H © CO ~ - 004)0)0)

Li s:·-«-*-» Li 4- 0) 4- U 4- O' C O* O <3

Ό CO Λ H H O U

o> * o) o »h d E i i) -r| V < Φ 3 ·Η

I JJ -Η Π (0 C

C oa) φ tn ho to .

o a-> jx t~> ~ ω u ε · H CL 03 O Γ" O CD Lt C - > O 0)4) d ε *h o <r vo .-t tu οοΗβ-υ c cl

<0 >»4J r-t -H D -H CO .C 0) C CL

C (0 to *—l -U 4)0 -h <c e ό σ ^ -l> » co σ'*-· o -,-r l a o) + h σ» O D to 4- rH 0) 0) CO- * ^ C * ^ ^ h

> * g -H t »V. to O

ία) o to co o: li -ri > Ό o ^ CO (O 3 · J) * 4) Γ to -ucn -rt k_j-u t ω

> CL-H o K\ vO ΓΛ O D ;» -H 0) <r ε -H

O ε-L» 0\ 1Λ <t 0\ f-ι X) > - 4) JO

C >x (0 S 3 X-H ·- 4J 4

OC in ε O- 1(3 L H 4 -H S

-η ·η ε jj ati to o f-t*o

-L>0) O 4) CO 0) ε Ή CO

JX D Li * C'-'CjQLi^ 0)

0)0 D Li -it NtA C C* C O *H D JZ

4- Li -H0) - - 0) ω ω CO C CO 0)0)

—) CQ. 3D f—t N »H O' ^ 4) +) XI (D T) -H

UI*HO -ri CM 0) V) CO > D

CD , I O C D 3» + J ΓΛ+Ι+ΙίΛ > -H C O O

<C CM >W -Γ-tCQLO V V 0) D (!) 4- C 4) C7> ε »- > —I D)3C O VO Γ- H m'OXOOh o o C/) o cn c-—- - - x) ec σ' o d d

mi ft-rCN CO 1Λ VO O -H D C D CL

•H »—I Li Li D w 4> -H CO DE

Ή > D 0) CT 0)CL> β >n to tn 10 O 00 N N CO ε O 4) - a> 10 -Dm c Ή r-t - - ·—I >> _* Li o Li Ό •h cn r-i —- o cm .h o) co co a) oa> C ε <0 <—I CT H to ·· Η 3 Ό 0) CU Li 3» +1 K\+l-flK\ O 0) D 4) 0) 4- CT CD C/) V V CO Lt (0 X) Ό DO) C 3 X Ι*"* N Ot D8EC+ 0)0 •O φ o) - - ω o c-i o> i*'» c x:

O CD C σ\ σ\ O Ό D <0 D CT

ε .-t C DE D ·- OD

3 O >>g tg (4 DO) C cn co o 4- ω Ό t-i -H C tf\ <J Ov O' O O' HOOCH 3 4> > ι—I r-i *—t C ·Η 4) \i£ > (0 ·Η D (i - Ε Ή 3 Li D Lc 0) ε E <0 4) 0)

CO Q) D i—C 0) CO <D ·—I CO

H D "O CO EH-Pto > JO JD

= CO -H 0) -ri Q 0) O O

4- D _C X C —i XJ >» · »CO «—I

a cqloo) co ω r-' co ε ο»η

to to CO Li r-c D Ό C tO N to D CO

Ο > Ο T3 CO D O OCO COD

Μ T) O JO >- 3 > *d (0 O' »C0 CO)

Ή C '-} CL C D Q) 0) D .~t r-i 4- OC

0) 3TDIIC0 C rH ^ Cl) ^ -HO

d <u to c c .c x) ω ε tu to -η

D Li 330. O 4- S Γ> ·Η a CO

>> C U. S CO ·—t ·—I CO LiCCeOsO·· ΉΜ

4)=D- CO CO O D -Η ·Η Ό ΙΛ O Lt HH

w σ co jo -H>co4)Ctae) 0) Ο -H CO C -Η -H Q. > (0 3 0·· C Ό4)

CD C >34) I Li Li I VO I - Ο Ό I

3 rH 3 0) C *—t ·—I O C C0-H<r<jj-f -H -HC0 ε I Ό Li α> ] I 3 '—I s: > + i-i|CSI to Σ e ε Ό Ό Lu «—t O Q ή * *—i C3 CD — CO CO O' <0 * * + 45 DK 173597 B1

Fordelene ved at anvende det afkortede protein til diagnostiske og vaccineanvendelser er, at det, fordi det er secerneret til det ekstracellulare medium, er forurenet med langt farre proteiner, end der ville findes i et 5 hel-celle-praparat.

Det vil bemarkes, at der ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en permanent cellelinie til at producere proteinet. Ved transfektion inkorporeres vektoren i celleliniens genom'og kan producere proteinet uden 10 cellelyse. Cellelinien kan således anvendes til konti nuert produktion af proteinet, især i den afkortede form, som secerneres fra cellen. F.eks. kan cellerne, der udtrykker afkortet protein, kontinuerligt anvendes i et perfusionssystem ved konstant at fjerne antigen-15 rigt medium fra cellerne og erstatte det med frisk medium.

Den bestemte, her anvendte cellelinie var en CHO-linie, som var deficient med hensyn til dhfr-produktion, trans-ficeret med en vektor indeholdende en dhfr-markør. Ved at udsatte cellelinien for methotrexat (Mtx) under egnede 20 betingelser (54) kan dhfr-produktionen og dermed den forbundne gD-produktion forstærkes. Tre cellelinier afledt ved transfektion af afkortet gD-genet ind i dhfr” CHO-celler blev udpladet parallelt, mærket med ^5S-methio-nin og immunofældet som beskrevet i fig. 2. Banerne 25 1 og 2 angiver mængden af secerneret gD immunofældet fra 500 ^ul dyrkningsmedium konditioneret af to uafhængigt isolerede cellelinier før selektion med methotrexat.

Bane 3 angiver mængden af afkortet gD immunofældet fra et lige så stort volumen dyrkningsmedium fra en celle-30 linie (gD10.2.2) selekteret for vækst i 250 nM methotrexat. Kanin-anti-HSVl-antistoffer (Dako Corp.) blev anvendt til immuno fældningerne, der er vist i bane 1-3. Bane 4 repræsenterer en kontrolimmunofældning af 500 ^ul medium konditioneret af gOlO.2.2-cellelinien med normalt 46 DK 173597 B1 kaninserum.

For at kvantificere de relative mængder af afkortet gD secerneret til dyrkningsmediet af cellelinier før og efter selektion i methotrexat gennemførtes en kompeti-' 5 tiv ELlSA-prøvning- gD12-celler, der udtrykte en membran- bundet form af gD, blev udpladet på og fikseret med glutaraldehyd til overfladen af 96 hullers mikrotiterpla-der som tidligere beskrevet. Konditioneret medium fra _ forskellige cellelinier, der var kendt for at producere 10 det afkortede gD, blev rækkefortyndet hen over mikroti- terpladen og blev inkuberet med en fikseret mængde (2 yul) kanin-anti-HSVl-antistof (Dako Corp.) i 1 time ved 20 °C. Ubundet antistof og opløselige afkortet-gD-antistof-komplekser blev fjernet ved vaskning af hvert 15 hul 3 gange med PBS. Peberrod-peroxidase koblet til gede-antikanin-IgG blev derpå omsat med de fikserede celler i 1 time ved 20 °C, og ubundet antistof blev fjernet ved vaskning 3 gange med PBS. Det kolorimetriske substrat, OPD (o-phenylendiamin), sattes derpå til hvert 20 hul og fik lov at reagere med de bundne peberrodperoxi- dase-antistof-komplekser i 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af svovlsyre til en slutkoncen-tration på 0,25 N. Absorbansen af OPD'et i hvert hul blev bestemt ved anvendelse af en automatiseret mikroti-25 terpladescanner (Titertek multiskan), og der afsattes fortyndingskurver. Bindingen af anti-HSVl-antistoffer til udgangs-CHO-cellelinien blev anvendt til at måle graden af ikke-specifik binding ved hver fortynding.

Mængden af afkortet gD i hver kultursupernatant var 30 omvendt proportional med mængden af absorbans i hvert hul. Aben cirkel, binding af anti-HSVl-antistoffer til gD12-celler i nærværelse af medium konditioneret af celler, der secernerede afkortet gD før forstærkning med methotrexat. Lukket cirkel, binding af anti-HSVl-35 antistoffer til gD12-celler i nærværelse af medium fra 47 DK 173597 B1 gD12.2.2-celler selekteret for vækst i 250 nM methotrexat. Åbent k vadrat, binding af anti-HSVl-antistoffer til gD12-celler i nærværelse af 100 gange koncentreret- medium fra uforstsrkede celler, der secernerede afkortet gD.

5 Denne procedure blev udført gD10.2-cellelinien for at producere en forstærket cellelinie gD10.2.2, som var i stand til at vokse i 250 nM methotrexat, og som secernerede omkring 20 gange mere afkprtet gD til dyrkningsmediet end udgangs-gD10.2-cellelinien (se fig. 10 og 11).- 10 dhfr-markør/f'orstarknings-systemet kan anvendes med andre celler, som er i stand til at optage og stabilt inkorporere fremmed DNA.

Opfindelsens succes med at påvise, at en afkortet form af et membranbundet protein, der mangler den del af 15 det hydrophobt-hydrophile carboxylterminale område, som er ansvarligt for at binde det til membranen, alligevel kan være immunogen, viser, at lignende resultater kan forventes med andre immunogene membranbundne proteiner, der således tilvejebringer en forbedret kilde til 20 vaccine over for virus, parasitter og andre patogene organismer.

48 DK 173597 B1 ning at fjerne den membranbindende karakter, således at proteinet secerneres til det omgivende medium.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel omhandler· et HSV2-gC-protein (tidligere 5 betegnet som et gF-protein).

Celler, virus og DNA-isolering.

HSV2 (stamme G) blev dyrket på HEp 2 celler efter inficering af cellekulturen ved en input-multiplicitet på 0,1 i 3 dage ved 33 °C i Dulbecco's modificerede Eagle's 10 medium indeholdende 10 % fatalt okseserum og antibio tika. HSV2-DNA blev isoleret ved nedbrydning med proteinase K efterfulgt åf CsCl-ultracentrifugering som beskrevet (23).

pNA-manipulationer.

15 Restriktionsenzymer, DNA-polymerase-Klenour-fragment, T4-DNA-ligase og T4-polynuclsotidkinase blev købt fra Bethesda Research Labs og blev anvendt ifølge leverandørens retningslinier.

Molekylær kloning af HSV2-DNA-restriktionsfragmenter.

20 EcoRI-"P"-fragmentet, som svarer til den tilnærmede kortposition ca. 0,650 i HSV2-genomet, blev isoleret fra EcoRI-nedbrudt HSV2-DNA på 5 % acrylamidgeler. Det isolerede fragment blev klonet ind i EcoRI-nedbrudt pUC9 (28). Dette plasmid blev kaldt pUD-RIP.

25 pUC-RIP-subklonen blev derpå anvendt til at lokalisere et SacI-fragment af HSV2-genoraet, som indeholdt EcoRI-"PM-fragmentet. Southern-afdupningsforsøg (27) viste, 49 DK 173597 B1 at et 4,9 kb SacI-fragment af HSV2 indeholdt EcoRI-"Pn-fragroentet. Oette fragment blev.isoleret på 0,7 /O 3Q3TOS6 geler og blev klonet ind i et fra pBR322 afledt plasmid, som indeholdt et unikt Sacl-center (55). Oette plasmid 5 blev kaldt pBRSacI-"En. Yderligere restriktionsenzym analyse af peRSed^'E" påviste et 2,9 kb Sall-fragment med sekvenser homologe med EcoRI-’T^-fragmentet, som var subklonet' ind i SalI-nedbrudt pUC9 soro beskrevet ovenfor. Dette plasmid blev kaldt pgC2Sal2.9.

10 DNA-sekvensanalyse af klonet HSV2-DNA.

Hovedparten af DNA-sekvenserne blev bestemt under anvendelse af dideoxynucleotid-kædeafslutnings-teknikken.

Forskellige fragmenter blev subklonet ind i den replika-tive form af ml3-fag-vektorerne mp7, mp8 og mp9, og 15 DNA-sekvensen blev bestemt som tidligere beskrevet (29).

32 I nogle tilfælde blev fragmenter P-mærket ved deres 32 5'-ender med y P-ATP og T4-polynucleotidkinase, og fragmentets DNA-sekvens blev bestemt ved anvendelse-af den kemiske degradationsmetode (56). Datamatassisteret 20 analyse af DNA- og protein-sekversdat.a blev gennemført under anvendelse af HOM-programmet (57). Hydropatien af de afledte aminosyresekvenser blev analyseret under anvendelse af en bredde på 12 aminosyrer og et spring på 1 (31a).

25 Southern-afdupningsanalyse af HSV2-DNA.

Restriktionsendonuclease-nedbrudt HSV2-DNA og plasmid-DNA blev fraktioneret på 1,5 K agarosegeler og afduppet på nitrocellulose under anvendelse af standardprocedurer.

De enkeltstrengede ender af Sac2-fragmentet, markeret 30 med en stjerne i fig. 12, blev udfyldt med KLenow-frag- mentet af DNA-polymerase I, og det resulterende sturop-endede fragment blev ligeret til SmaI-nedbrudt replikativ

Form af ml3mp7 (29) med TA-ONA-ligase. Den enkeltstren gede DNA fremstillet ud fra denne ligering og transfek- 32 50 DK 173597 B1 tion blev anvendt som skabelon for syntesen af P.-rosr-ket enkeltstrenget sonde-DNA med høj specifik aktivi-

O

5 te.t (1 x 10 tallinger/min.^ug) under anvendelse af

Klenov/-fragmentet af DNA-polymerase I. Hybridiseringer blev gennemført under anvendelse af standardprocedurer (27, 58).

Resultater 10 Molekylår kloning af gF-kodningsområdet af HSV2-genomet.

Den strategi, som blev antaget til isolering af gF-genet fra HSV2, var baseret på den antagelse, at dette gen var colinesrt med HSVl-gC-genet. Denne antagelse blev understøttet af den nylige erkendelse, at et 75000 dalton 15 glycoprotein, gF, med antigenisk beslsgtethed til HSV1- glycoprotein C findes i HSV2, og at genet for dette protein er tilnsrmelsesvis colinesrt med HSVl-gC-genet (22d, 59). Desuden tydede isoleringen af et monoklonalt antistof, som binder til både HSVl-gC og HSV2-F, yder-20 ligere på at disse to proteiner kan vare homologe med hinanden (22f). Det blev således besluttet, at DNA-se-kvensanalyse af det HSV2-genomiske område, som er colinesrt med HSVl-gC-genet, ville resultere i afledningen af proteinsekvensinformation, som ville lokalisere HSV2-25 gF-genet.

600 bp EcoRI-,,P,,-fragmentet af HSV2-genomet er blevet vist at høre til i position ca. 0,650 på kortet (12).

Dette område er tilnsrmelsesvis colinesrt med det kendte kodeområde for HSVl-gC-genet, som ligger mellem ca.

30 0,630 og ca. 0,660 på kortet over HSVl-genomet (59).

Dette fragment blev isoleret fra en EcoRI-nedbrydning af HSV2-DNA klonet i plasmidet pUC9 (28), og dets DNA- 51 DK 173597 B1 sekvens blev bestemt (29, 56). Sammenligning af den resulterende sekvens med HSVl-gC-sekvensen (59) afslørede en betydelig grad af sekvenshomologi mellem EgoRI-"P1*-fragmentet og 3'-enden af HSVl-gC-kodeområdet. S a -5 ledes blev EcoRI-"P"-fragmentet derefter anvendt som sonde til at isolere et Sacl-restriktionsendonuclease-fragment fra HSV2-genomisk DNA, der overlappede EcoRI-,,P,,-fragmentet tilstrakkeligt til at inkludere resten af HSV2-genet, som var homologt med HSVl-gC-genet. Fig.

10 12 belyser de trin, der blev foretaget for at isolere et 2,9 kb Sall-fragment fra HSV2-genomet, som indeholdt EcoRfragmentet, og som blev anvendt til efterfølgende DNA-sekvensanalyse.

DNA-sekvensanalyse af EcoRI-,,P"-området i HSV2-genomet.

15 βΒαΙ-'Έ’1-fragmentet på 4,3 kb, som blev isoleret fra HSV2-genomet baseret på dets sekvenshomologi med EcoRI-"Ρ”-fragmentet, blev yderligere nedbrudt til opnåelse af et 2,9 kb Sall-fragment, som blev betegnet pgC2Sal2.9.

Fig. 12 belyser fragmenterne fra pgC2Sal2.9, som blev 20 underkastet DNA-sekvensanalyse under anvendelse af enten * dideoxynucleotid-sekvensbestemmelsesproceduren (29) eller den kemiske degradationsprocedure (569. Desuden viser denne figur positionen af EcoRI-"P,,-fragmentet i pgC2Sal2.9 såvel som positionen af et BgllI-ce'nter, 25 der svarer til den højre ende af BglII-"N,,-fragmentet ved position ca. 0,628 i HSV2-genomet (12).

Specifikt viser fig. 12 kloningen af pgC2Sal2.9, det HSV2-område, som ligger colinesrt med HSVl-gC på kortet.

Området af HSV2-genom-kortlægningen fra ca. 0,61 til 50 ca. 0,66 blev klonet som et Sacl-fragment (pBRSac-”EM) under anvendelse af 600 bp EcoRI-"P"-fragmentet som sonde. En Sall-subklon af pBRSac-"E.", pgC2Sal2.9, blev anvendt til ONA-sekvensanalyse. Pile henfører til de sekvensbestemte områder, og lokaliseringen af en storre 52 DK 173597 B1 åben aFlæsningsramme på 479 aminosyrer afledt fra sekvensen er belyst. Forskellige restriktionscentre er belyst, herunder EcoRI-centrene, som afgrænser EcoRI-"P"-fragmen-tet, og det BglII-center, som findes ved den højre ende 5 af BgllI-"N"-fragmentet (kort position ca. 0,628) (26)..

Sad I-fragmentet markeret med en stjerne (*) blev anvendt ved Southern-afdupningsforsøg for at undersøge den deletion, som viser sig i dette område (se resultater).

Andre centre blev anvendt til DNA-sekvensbestemmelses-10 forsøg. Sm: Smal, 5a: Sac2, Rs: Rsal, Bg: Bgl2, Pv:

Pvu2, RI: EcoRI.

Fig. 13 belyser DNA-sekvensen opnået fra pgC2Sal2.9 sammenlignet med DNA-sekvensen af HSVl-gC-området (59). HSVl-gC-området (HSV-1) og sekvensen opnået fra 15 pgC2Sal2.9 (HSV-2) blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet (57). Eftersom forskellige deletioner blev udnyttet til at maksimere sekvensoverlapning, er alle positioner, herunder mellemrum, blevet nummereret for tydeligheds skyld. Stjerner er anbragt over ikke-20 overensstemmende nucleotider. Den understregede "A"-rest ved position 43 i HSVl-sekvensen er det omtrentlige transcriptionsstartcenter for gC-mRNA'en. (59). "TATA" 1 og "TATA" 2 er de sandsynlige transcriptionsstyrings-områder for henholdsvis HSVl-gC-mRNA* en og 730 base 25 mRNA'en (59, 60). Den indsatte T-rest ved position 1728 i HSVl-sekvensen blev opdaget ved gentagen sekvensbestemmelse af dette område (M. Jackson, upubliceret) og fandtes at indføre en i-fase stopcodon ved positionerne 1735 - 1737, som var homolog med stopcodonen for 30 den større åbne HSV2-aflæsningsramme. Positionen af 730 base mRNA-startcodonen i HSV1 er vist ved position 2032 - 2034 ligesom positionen af en anden HSV2-start-codon ved position 1975 - 1977. 1 fig. 13 blev den belyste afledte sekvens af HSV2 sammen-35 lignet med DNA-sekvensen af gC-genområdet i HSV1 (59), 53 DK 173597 B1 som viste, at den samlede sekvenshomologi mellem disse to Fragmenter var omkring 68 %. Imidlertid viste visse områ.der af sekvensen enten en meget højere eller en lavere grad af sekvenshomologi end andre. F.eks. viste 5 sekvenserne mellem positionerne 0 og 570 i HSV1- og HSV2-sekvenserne kun 51 % homologi, medens området mellem position 570 og 1740 viste en meget højere grad af sekvenshomologi (80 %). Et yderligere hejhomologt område (70 %) fandtes også ved enden af de to sekvenser 10 fra position 1975 til position 2419. Foruden nucleotid- sekvenssndringerne viste de to genomer forskellige de-letioner eller indsætninger, når de blev sammenlignet med·hinanden. Den mest bemærkelsesværdige var et 81 bp område ved position 346 - 426 i HSVl-gC-sekvensen, 15 som mangler i HSV2-genomet. Af denne samlede sekvens sammenligning fremgår det, at der var en høj grad af sekvenshomologi mellem HSVl-gC-området og det her sekvensbestemte HSV2-område.

Frink et al. (59) har fundet, at 5'-enden af den 2520 20 base mRNA, der koder for HSVl-gC, rækker til den under stregede A-rest ved position 43 i fig. 13. Desuden udpegede de en AT-rig ,,TATA"-kasse-sekvens (60) omkring 22 bp 5' for denne rest. Sammenligning af de to i fig.

13 viste sekvenser viser, at HSV1- og HSV2-sekvenserne 25 begge indeholdt den identiske sekvens CGGGTATAAA, i dette område. Denne sekvens er identisk med den, der er rapporteret tidligere af Whitton et al. .(61), som er fundet at forekomme ved "TATA"-kasse-områderne i mange af de hidtil bestemte HSV1- og HSV2-sekvenser.

30 Denne bevarede sekvens efterfølges også af et G-rigt område i begge virusgenomer. Foruden dette formodede transcriptionsstyringsområde fandtes en anden "TATA"-kasse i begge sekvenser ved position 1845 - 1849 i fig. 13.

Denne anden "TATA"-kasse er blevet foreslået at styre 35 transcript ionen af en 730 base mRNA i HSVl-genomet (59).

54 DK 173597 B1 Både HSV1 og HSV2 indeholder denne sekvens omgivet af GC-rige flankerende sekvenser, inkluderende en CGGGCG-sekvens, som minder pm den CGGG-sekvens, der går forud for den første "ΤΑΤΑ’'-kasse. Desuden koder begge genomer 5 for åbne aflæsningsrammer 3' for disse andre "TATA"- kasser, som det vil blive omtalt nedenfor.

For at bestemme om den ovenfor beskrevne 61 bp deletion virkelig fandtes i HSV2 genomet, eller om den var ét kunstprodukt af kloning eller sekvensbestemmelse, gen- 10 nemførtes Southern-afdupningsanalyse af den HSV2-geno- 32 miske DNA og den klonede HSV2-DNA. En P-mærket blev fremstillet ud fra et Sac2-fragment (se fragmentet i fig. 12), som spænder området, der mangler de 81 nucleo-tider. Hvis den HSV2-genomiske DNA mangler 81 bp om-15 rådet, så vil et Smal-BgllI-fragment, som spænder over det område, være på 576 bp, et SmaI-fragment vil være på 662 bp, og et Sac2-fragment vil være på 195 bp.

Fig. 14 belyser Southern-afdupningsanalyse af HSV2-genomi.sk DNA og pgC2Sal2.9~DNA. Området, der spænder 20 over 81 bp området, som mangler i den i fig. 13 viste HSV2-sekvens (HSV2-positionerne 346 - 426), blev analyseret under anvendelse af Sac2-fragmentet mærket med en stjerne i fig. 12, som overlapper det deleterede område. Banerne 1 - 3 er restriktionsnedbrydninger af 25 HSV2-genomisk DNA, og banerne 4 - 6 er restriktionsen zymnedbrydninger af pgC2Sal2.9. De nedbrudte DNA’er blev underkastet elektroforese på 1,5 % agarosegeler, denatureret, afduppet på nitrocellulose og sonderet med det P-mærkede Sac2-fragment. (Pilene viser positi-30 onen af 564 bp Hindi 11-fragmentet af fag-λ-ΟΝΑ.) Bane 1, 6: Saml + Bgl2; bane 2, 5: Smal; bane 3, 4: Sac2.

De i fig. 14 viste resultater påviser, at de forudsagte 55 DK 173597 B1 restriktionscentre omgav området, der manglede de 81 basepar, i både den HSV2-genomiske ONA og den klonede HSV2-DNA. Oesuden vandrede de HSV2-genomiske fragmenter og de kolhede fragmenter nøjagtigt sammen, hvilket påvi-5 ser, at deletionen ikke er et kunstprodukt af kloning eller sekvensbestemmelse.

Analyse af den større åbne aflæsningramme i HSV2-SalI-fragmentet på 2,9 kb

Analyse af de potentielle kodesekvenser i 2,9 kb .Sall-DNA-10 fragmentet af H5V2 afslørede en åben aflæsningsramme på 479 aminosyrer, som begyndte med methioninet indkodet ved positionen 199 - 201 af den i fig. 13 viste HSV2 sekvens og endte med TAA-afslutningskodonen ved position 1735 - 1737 af HSV2-sekvensen i denne figur. Som det 15 kan ses af fig. 13, starter både HSVl-gC-proteinet og den åbne HSV2-aflæsningsramme ved omkring samme position i de to sekvenser i forhold til ,,TATA"-kasse-homo~ logierne. Desuden har det vist sig, at medens det oprindeligt syntes, at den åbne HSV2-aflssningsramme fundet 20 i dette område sluttede 12 codoner før HSVl-gC-genet, så har gentagen sekvensbestemmelse af det carboxyl terminale område af gC-gensekvensen (M. Jackson, upubliseret) af HSVl-stamme F afsløret, at den af Frink et al. (59) rapporterede sekvens manglede et thymidin-nucleotid 25 efter position 1727, og at indsætning af denne rest resulterede i et translateret HSVl-gC-protein, der sluttede på samme sted som den åbne HSV2-aflæsningsramme (1735 - 1737 i fig. 13). Når man således tager de forskellige deletioner og indsætninger i betragtning, som belyst 30 i fig- 13» viser HSVl-gC-genet og den åbne HSV2-aflæs- ningsramme en meget høj grad af overlapning.

Fig. 15 belyser translation of den store åbne HSV2-aflæs- 56 DK 173597 B1 ningsramme og sammenligning med HSVl-gC-aminosyresekvensen.

Oer anvendtes enkelt-bogstavsaminosyresymbolerne. HSV-1 . gC henfører til HSVl-gC-sekvensen, og HSV-2 gF henfører til den åbne HSV2-aflæsningsramme-sekvens. Proteinerne 5 blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet, som maksimerede homologier ved at indsætte åbninger, hvor det var nødvendigt (57). Stjerner er placeret over ikke-homologe aminosyrer. Formodede N-forbundne glyco-syleringscentre (NXS eller NXT) (62) er gråtonede, og 10 cysteinrester (C) er indrammede. Kun aminosyrer og ikke mellemrum er nummeret. 15B belyser translationen, af den anden åbne HSV2-aflssningsramme og sammenligning med 730 base mRNA-HVSl-proteinet. HVS-2 730 bp ORF er den ufuldstændige aminosyresekvens af den anden åbne 15 HSV2-aflæsningsramme fra position 1975 til position 2606 af den i fig. 13 viste HVS2-sekvens. HVS-1 730 bp ORF er aminosyresekvensen afledt for det protein, der er indkodet af 730 base mRNA'en for HSV1 (59). Bevarende aminosyreændringer med hensyn til ladning er mær-20 ket (C) og ikke-bevarende ændringer med hensyn til lad ning er mærket (N) i både fig. 4A og 4B.

Fig. 15 belyser den høje grad af sekvenshomologi mellem HSVl-gC-genet og den åbne HSV2-aflæsningsramme på 479 aminosyrer. De første 19 aminosyrer indeholder omkring 25 80 % sekvenshomologi, hvor ændringerne i de første 25 aminosyrer alle er bevarende med hensyn til ladning.

Fra rest 124 i HSVl-gC (rest 90 i HSV2-sekvensen) til enden af begge proteiner er der omkring 74 % sekvenshomologi, hvor 75 % af aminosyreændringerne er bevarende 30 med hensyn til ladning. Fem formodede N-frobundne glyco- syleringscentre (NXS eller NXT (62)) er bevaret mellem de to proteiner, og alle syv cysteinrester er lokaliseret i homologe positioner i forhold til den C-terminale ende. Foruden den-samlede bevarelse af sekvenser i de 35 carboxytermina le 3/4 af proteinerne er der også store 57 DK 173597 B1 områder af sammenhængende aminosyresekvenshomologi med en længde på op til 20 rester (dvs. position 385 - 405 i HSVl-sekvensen og 352 - 372 i HSV2-sekvensen). Det kan konkluderes af denne sekvenssammenligning, at den 5 åbne aflæsningsramme i dette område af HVS2-genomet koder for et protein, som er homologt med HSVl-gC.

Medens HSV2-p’roteinet, som dette områder koder for, viser en betydelig grad af sekvenshomologi med HSVl-gC-se-kvensen, er der flere bemærkelsesværdige forskellige 10 mellem de to sekvenser. Den mest slående froskel er en deletion af 27 aminosyrer i HSV2-sekvensen, som findes i HSVl-gC-sekvensen fra rest 50 til rest 76 (fig. 15), og som svarer til deri ovenfor beskrevne 81 bp deletion-Foruden denne store deletion viser begge sekvenser mindre 15 deletioner på en eller to aminosyrer. Alle disse dele tioner findes i de aminoterminale områder af proteinerne. Foruden disse deletioner er der et stort antal amino-syreændringer i proteinernes aminoterminale område, som er klumpet sammen mellem resterne 29 og 123 i HSVl-gC-20 sekvensen (resterne 31 - 90 i HSV2-sekvensen). Kun 30 % af aminosyrerne i dette område er homologe, og meget åfd enne homologi skyldes bevarede prolinrester. 43 % af aminosyreudskiftningerne i dette område er ikke-bevarende med hensyn til ladning. De eneste andre områder, 25 som viste et så stort antal ændringer, er et carboxyl- terminalt hydrophont domæne (resterne 476 - 496 i HVS1-sekvensen og 443 - 463 i HSV2-sekvensen), hvor proteinerne er 55 % homologe, men hvor alle ændringerne er bevarende, uladede, hydrophobe aminosyrer, og proteinernes 30 carboxylender, hvor sekvenserne kun er 25 % homologe, men hvor den samlede aminosyresammensætning minder om hinanden (resterne 500 - 512 i HSVl-sekvensen og 467 - 479 i HSV2-sekvensen). Medens 5 af de formdoede N-forbundne glycosyleringscentre er bevaret mellem de 58 - DK 173597 B1 to proteiner, indeholder HSVl-gC-sekvensen to flere centre end HSV2-sekvensen (i alt ni mod syv). HSVl-gC-sekvensen indeholder 2N-forbundne glycosyleringscerftre i de 27 aminosyrer, som er deleteret fra HSV2-sekvensen 5 og et overlappende par centre mellem resterne 109 og 112 i fig. 15. HSV2-sekvensen indeholder 2N-forbundne glycosyleringscentre, som ikke findes i HSVl-sekvensen, hvoraf det ene er proksimalt til aminoenden.

For mere fuldstændigt at undersøge de mulige strukturelle 10 homologier mellem HSV1- og HSV2-sekvenser gennemførtes en hydropatianalyse (31a). Fig. 6 belyser hydropatiana-lysen af HSVl-gC-proteinet og proteinet indkodet af den større åbne HSV2-aFlæsningsramme. Hydropatien af hvert protein blev bestemt under anvendelse af programmet 15 angivet af Hopp og Woods (31a). Hydrophobe områder er over midterlinienr og hydriphile områder er under midterlinien. Strækninger på 12 aminosyrer blev analyseret, og gennemsnitshydropatien blev udregnet. Formodede aspara-gin-forbundne glycosyleringscentre (62) er mærket (0).

20 gC-1: HSVl-gC-protein-hydropati. gC-2 (gF): hydropati af proteinet indkodet i den større åbne HSV2-aflæsningsramme .

Fig. 16 viser, at begge proteiner udviste en yderst høj grad af strukturel homologi baseret på aminosyrese-. 25 kvensernes hydrophile og hydrophobe egendkaber. Hvert viser et N-terminalt hydrophobt domæne efterfulgt af en strækning af hydrphile aminosyrer, som indeholder enten 6 af i alt 9 (HSV1) eller 3 af i alt 7 (HSV2) formodede N-forbundne glycosyleringscentre. Toppene 30 og dalene, som følger dette hydrophile område, er meget ens i begge proteiner, inklusive det hdyrophile domæne indeholdende det afsluttende N-forbundne glycosylerings-center. Begge proteiners carboxylender viser et meget 59 DK 173597 B1 hydrophobt område på 20 rester efterfulgt af en hydro-phil carboxylende. De 27 på hinanden følgende aminosyrer, som findes udelukkende i HSVl-gC-proteinet, viser dig at kode for et relativt hydrophilt område mellem rester-5 ne 50 og 76 (fig. 16). Som konklusion afslører denne analyse, at hydropatitrækkene ved HSVl-gC- og HVS2-pro-teinerne er meget ens, og at de mindst bevarede aminotermi-nale områder af proteinerne fidnes i hydrophile områder, som har evnen til at blive stærkt glycosyleret.

10 Analyse af den anden åbne HSV2-aflasningsramme

Translation af de sidste 431 basepar afd en i fig. 13 viste HSV2-sekvens (resterne 1975 - 2406) afslørede en anden åben aflæsningsramme på 105 aminosyrer. Seiv om den her rapporterede sekvensinformation er utilstrsk-15 kelig til at indeholde hele den anden åbne HSV2-aflæsnings- ramme, afslørede en sammenligning af denne sekvens med den åbne aflasningsramme, som er indkodet af 730 base mRNA’en for HSV1, som rapporteret af.Frink et al. (10), også en høj grad af sekvenshomologi. Som det kan ses 20 i fig. 15B, viste de to sekvenser 75 % sekvenshomolgi i de overlappende områder, hvor omkring 90 % af aminosyre-ændringerne var bevarende med hensyn til ladning. Hoved-froskellen mellem de to sekvenser var et 19 aminosyrer langt N-terminalt område, som fandtes i HSV2-sekvensen, 25 men ikke i HSVl-sekvensen. Selv om Funktionen af det i dette område indkodede protein er ukendt, viste proteinerne fra HSV1 og HVS2 således en ebtydelig grad af sekvenshomologi.

Diskussion 50 De ovenstående resultater viser, at HVS2-genomet koder 60 DK 173597 B1 for en colineært kortlagt homolog til HVS-glycoprotein C. Colineariteten af de her fundne sekvenser bestyrkes ved fundet af en sekvens 3' for den større åbne HSV2-aflæsningsramme, som øjensynligt koder for en homolog 5 til 730 base mRNA'en for HSV1 (10). Tidligere kortlæg ning af HSV2-gF-genet (33) sammen med de her beskrevne egenskaber for den større åbne aflæsningsramme i dette område af HSV2-genomet inkluderende flere potentielle N-forbundne glycosyleringscentre og en tilsyneladende 10 aminoterminalsignalsekvens (5) såvel som et formodet carboxyl terminalt transmembrandomæne (28) tillader den konklusion, at det her beskrevne HSV2-protein er glycoproteinet gF. Desuden er størrelsen a fd et transla-terede HSV2-protein (ca. 52 000 dalton) mage tild en, 15 som er rapporteret med det endoglycosidae H behandlede native HSV2-gF (54 000 dalton) (22d). Endelig angiver den store grad af aminosyresekvenshomologi såvel som bevarelen af flere potentielle N-forbundne glycosyleringscentre og alle 7 cysteinrester en strukturel homo-20 logi mellem HSVl-gC og HSV/2-gF. Disse resultater tyder således stærkt på, at HSVl-gC-proteinet og HSV2-gF-pro-teinet er homologe med hinanden.

Disse resultater hjælper til at forklare tidligere resultater, som viste, at’ H5V2-gF og HSVl-gC var i hovedsagen 25 typespecifikke, men at de havde type-fælles determinanter (17, 22d, 22f, 43). Oa flere tidlige undersøgelser (17, 18, 43) viste, at disse proteiner inducerede overvejende type-specifikke antistoffer, er det rimeligt, at de mest antigenjske områder af proteiner findes i de mere 30 divergente N-terminale sekvenser, som følger de formodet hydrophobe signalsekvenser. De divergente områders hydro-phile art sammen deres høje indhold af potentielle N-forbundne glycosyleringscentre (62) tyder på, at disse områder vil være lokaliseret på proteinets overflade.

35 Blotlæggelse af disse divergente sekvenser ved proteiner- 61 DK 173597 B1 nes yderside kan vare ansvarlig for frembringelsen af type-specifikke antistoffer rettet mod disse divergente epitoper. Imidlertid kan type-falles antistoffer sandsynligvis også frembringes af de mere højtbevarede carboxyl-5 terminale 3/4 af proteinerne, da hydrophile områder bevaret mellem gC og gF kunne blotlægges på ydersiden af proteinerne og, i et tilf*lde, kan være glycosyleret (resterne 363 - 366 i HSVl-gC og 330 - 332 i HSV2-gF).

Således har HSVl-gC og HSV2-gF både type-specifikke 10 og type-falles determinanter, men det synes som om de type-specifikke determinanter er mere antigeniske.

Selv om en forklaring af de type-specifikke og typefalles determinanter i gC og gF ikke er kendt, er det muligt, at proteinerne har mindst 2 funktioner, hvoraf 15 den ene er vigtig for levedygtigheden af begge virus, det type-falles domane, og den anden er specifik for hver virus-type, det type-specifikke domane. Selv om funktionerne af gC og gF for tiden er ukendt, og selv om levedygtige gC~ mutanter af HSV1 er blevet isoleret 20 in vitro (65), er det ikke klart, at hverken gC eller gF kan undværes af virusserne under in vivo infektion af den humane og etableringen af latens. Det er muligt, at mindst nogle af de biologiske forskelle mellem HSV1 og HSV2, herunder forkærlighed for infektionssted og 25 virulens, kan skyldes de betydelige strukturelle forskelle mellem de aminoterminale områder af gC og gF.

Det kan konkluderes, selv uden nogen funktionel viden om disse proteiner, at der må virke forskellige selektionstryk på de divergente og bevarede domaner af gC og gF; 30 Tidligere sekvenssammenligning af gO-generne i HSV1 og HSV2 (58) viste, at den aminoterminale signalsekvens (63) og det carboxylsterminale transmembrandomæne (64) 62 DK 173597 B1 var i stand til at tolere et stort antal mutationer, så lange de indførte aminosyrer var hydrophobe. gC-og gF- sekvenssammenligning viser et lignende resultat i det carboxylterminale formodede transmembrandomæne (64) fra resterne 476 - 496 i gC og 443 - 463 i gF.

5 Det store antal heterologe hydrophobe udskiftninger i dette områder tyder på, at ligesom i gD enhver aminosyre, som er lipidopløselig, kan toleres i dette område.

I modsætning til gD er de aminoterminale signalsekvenser 10 i gC og gF imidlertid stærkt homologe i de første 19 rester. Således har dette område enten en vigtig bevaret funktion udover dirigering af glycoproteinerne ind i det rå endoplasmiske reticulum (3), eller der kan være et overlappende gen eller en anden funktionel sekvens 15 i dette område af genomet, som må bevares 866).

Selv om der er præsenteret utilstrækkelig HSV2-sekvens til en fuldstændig sammenligning, viser området -3' for starten af HSVl-gC-roRNA-transcription en identisk sekvens, CGGGTATAA, i både HSV1- og HSV2-genomet. Desuden efterføl-20 ges begge sekvenser af et G-rigt område umiddelbart forud for starten af transcription. Således findes der, som det tidligere blev fundet for gD-generne i HSV1 og HSV2, opstrøms- sekvenshomologier mellem de to virustyper, som antyder muligheden af, at disse områder er 25 involveret i transcriptionsregulering af disse gener.

Interessant nok viser den anden MTATA"-kasse homologi, soro er fundet i begge virusgenomer, og som sandsynligvis styrer transcriptionen af 730 base mRNA'en (59, 60), også en relativt høj grad af sekvenshomologi i HSV1 30 og HSV2. Forud for disse ,,TATA,,-kasser ligger CG-rige sekvenser, som ligner, men ikke er identiske, med dero, der ligger forud de første ”TATA”-områder vist i fig.

13, og de efterfølges begge af et 14 bp område, der viser ca. 80 £ sekvenshomologi. Hele området med homo-35 logi» som omgiver dette område, er kun på 33 bp med en samlet sekvenshomologi på ca 75 X. Hvis dette område er 63 DK 173597 B1 involveret i transcriptionsregulering af 730 base mRNA'en, forekommer det, at en relativt kort sekvens kan være tilstrækkelig til genkendelse af transcriptionsregulerende elementer.

5· Resultaterne viser, at HSVl-gC og HSV2-gF er stærkt homologe, og at de koder for type-fælles og type-spe-cifikke domæner. Da de to proteiner udviser væsentlig sekvenshomologi, og da de øjensynligt ligger coliniært på kortet, støtter vi det forslag, der er fremsat af 10 Zeulak og Spear (22d), at ændre navnet på HSV2-gF til HSV-gC eller gC-2. Desuden åbner de her rapporterede sekvensbestemmelsesdata vejen for en funktionel analyse af gC-1- og gC-2-proteinerne ved gensidig ombytning af forskellige type-specifikke områder mellem de to 13 proteiner in vitro og udtrykkelse af chimæriske sekvenser i pattedyrceller (67) eller reinkorporering af disse områder i virusset (68).

Det antages, at de klonede gC-2-glycoproteiner kan udtrykkes og præpareres til en vaccine på en måde, som 20 er analog med den, der. er angivet i eksempel 1.

Det antages endvidere, at en vaccine, som inkluderer en blanding af sådanne rekombinante gC- og gD-glycopro-teiner, vil være væsentligt mere effektiv som vaccine over forHSVl og HSV2 end en, der er baseret på et af 25 glycoproteinerne alene.

Referencerne, som er samlet i den efterfølge bibliografi, og hvortil der er henvist ved parenteser i den forudgående tekst, betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

64 DK 173597 B1

Bibiioqra F i 1. Emtage et al., Hature 283, 171 (1980); Davis et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 5376 (1981); tøeiland et al., Mature 292, 851 (1981).

2. Kupper et al.,Nature 289, 555 (1981); Kleid. et al., Science 214, 1125 (1981).

3. Charnay et al., Nucleic Acids Research 7.» 335 (1979);

Valenzuela et al., Nature 298, 347 (1982).

4. Rose et al., Proc. Natl. Acadj.Sci. (USA) 78, 6670 (1981).

5. Yelverton, et al., Science 219, 614 (1983).

6. Watson et al., Science 218, 381 (1982).

7. Gething et al., Nature 293, 620 (1981); Liu et al., DNA 2» 213 (1982); Goodenow et al., Science 215, 677 (1982); Goodenow et al., Nature 300, 231 (1982); Crowley et al., Kolec. and Cell. Biol. 3y 44 (1983).

8. Rose et al., Cell 30, 753 (1982).

9. Spear, P.G., (1930), Herpesviruses, p709-750, in H.A. Blough and J.M. Tiffaney (ed)., Cell Hembranes and Viral Envelopes, Vol.

2., Academic Press, Inc., New York.

10. Balachandran et al., J. Virol. £4, 344 (1982).

11. Norrild, Curr. Top. Microbiol Immunol. 90, 67 (1930).

12. Roizman, Cell lj6, 481 (1979).

65 DK 173597 B1 13. Baucke et al., J. Virol. 32, 779 (1979).

14. Cohen et al., 0. Virol. 27, 172.

15. Eberle et al., J. Virol: 36, 665 (1980).

16. Norrild et al., J. Virol. 26, 712 (1978).

17. Powell et al., Mature 249, 360 (1974).

18. Eberle et al., Infect, ϊπκηυη. 31, 1062 (1981).

19. Pereira- et al., Infect. Immun. £9, 724.

20. Sim, C., et al-, 0. Gen. Virpl. 19, 217 (1973).

21. Showalter et al., Infect. Immun. 34, 684 (1981).

22a. Eisenberg et al., 0. Virol. 41, 1099.

22b. Balachandran et al., J. Virol.'39,' 438 (198Γ).

22c. Para et al., d. Virol. 41^, 137 (1982).

22d. Zezulak. ét al., 0. Virol. 47, 553 (1983).

22f. Zweig et al., d. Virol. 47, 185 (1983).

23. Anderson et al., 0. Virol. 30, 805 (1979).

24. tee et al., d. Virol. 43, 41 (1982).

25. Murray et al., Mol. Genet. _150, 53 (1977).

26. Benton et al., ScienceJ96, 180 (1977).

66 DK 173597 B1 27. Southern, J. Hol. Biol. 98, 503 (1975).

28. Vieira et al., Gene 19, 259 (1982).

29. Messing et al., Nuc. Acid. Res. jl, 309 (1981).

30. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5436 (1977).

31. Atlas of Protein Sequence and Structure V.5, Supplement 2, 1976, M.O. Dayhoff, ed., The Biochemical Research Foundation, Spring, Maryland, p. 311.

31a. Hopp -et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3324 (1981).

32. Watson et al., Nucl. Acid. Res. 11, 1507 (1983).

33. Biobel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 1746 (1980).

34. Rose. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 3884 (1980).

35. Ruyechan et al., 0. Virol. 29’, 677 (1979); Roizman, Cel! 26, 481 (1979).

36. Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2495 (1983).

37. Lusky. et al., Nature 293, 79 (19S1).

38. Nunberg et al., Cell 19^, 355 (1980).

39. Urlaiib et al., Proc. Natl. Acad. Sci, (USA) 2Ζ.» 4216 (1930).

40. Graham et al., Virol. 52, 456, (1973).

40a. Kessler, J. Immuno. 115, 1617 (1975).

67 DK 173597 B1 41. .Showalter et al., Infect, and Immun. 34, 684 (1981); Monoclonal anti—gO antibodies, 1-S and S5rS were kindly provided by Or.

Martin Zweig of the Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Institute, Frederick, Maryland 21701.

42. Cohen, et a!., 0. Virol. 36, 429 (1980).

43. Pereira et al., Proc. Hatl. Acad. Sci. (USA) 78, 5202 (1981). - 44. Cohen et al.,J. Virol. 27, 172 (1973).

45. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

46. Honess. et al., 0. Virol. 16, 1308 (1975).

47. Spear, J. Virol. 17, 991 (1976).

48. 'Campadel 1 i-Fiuaie et al., 0. Viro). 43, 1061 (1982); Johnson et al., Cell 32, 987 (1933); Cohen et al., 0. Virol. 46, 679 (1983).

49. Bloch, J. Cell. Biel. 82, 629.(1979).

50. Humant herpetisk serum titreret overfor HSV-1 og HSV-2 ved hemaglutinationsinhiberings- og komplement-binefingsprøvninger blev venligst leveret af Dr.

John A. Stewart For the Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia.

51. Rector, et al., Infect, and Immun. 38, 168 (1982).

52. Kennett i Monoclonal Antibodies, K. Kerrett, T. McKearn, and B. Bechtel, eds. (Plenum Press, K.Y., 1980), pp. 376-377.

53. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Gluzman, Cell 23, 275 (1981).

68 DK 173597 B1 54. Lee et al., Nature 294, 223 (1981); Kaufman et al., Mol. and Cell. Biol. 2, 1304 (1983); Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159, 601 (1982).

55. Kleid et al., Science 214, 1125 (1981).

56. Maxam et al., Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

57. Dayhoff, M., Ed. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.

5, Supplement 2, National Biochemical Research Foundation, ’

Silver Spring, Maryland, p. 311 (1976).

58. Lasky et al., ONA, in press (1984).

59. Frink et al., J. Virol. 45, 634 (1983).

60. McKnight et al., Science 217, 316 (1982).

61. Whitton et al., Nucl. Acids Res. 13, 6271 (1983).

62. Hubbard et al., Ann. Rev. Biochem.'50,' 555 (1981).

63. Blobel, Proc. Natl-. Acad. Sci. USA 77, 1491 (1980).

64. Sabatini et al., 0. Cell. Biol. 92, 1 (1982).

65. Cassai et al., Intervirology f>, 212 (1975).

66. Hall et al., 0. Virol. 43, 594 (1982).

Claims (9)

69 DK 173597 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et membranfrit trunkat af et membranbundet polypeptid, hvilket trunkat mangler mem- 5 branbindende domæne, hvorved polypeptidtrunkatet er fri for denne membran, og hvilket trunkat har eksponerede antigene determinanter, som er i stand til at fremkalde neutraliserende antistoffer ved in vivo-udsættelse for et patogen, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at der udtrykkes DNA, som 10 koder for trunkatet, i en stabil eukaryot cellelinje, der er transficeret med DNA'et.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, som yderligere omfatter, at det trunkerede polypeptid genvindes som et sekretionsprodukt. 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller krav 2, som omfatter de foreløbige trin, hvor der fremstilles DNA, som koder for det membranbundne polypeptid, men mangler kodning for membranbindende domæne, DNA'et inkorporeres i en ekspressionsvektor, og 20 den eukaryote værtscelle transficeres med vektoren.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 2 eller 3, hvor den transficerede værtscelle er en pattedyrcel-lelinje. 25

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor cellelinjen er deficient med hensyn til produktion af dhfr, og vektoren indeholder en selekterbar dhfr-markør.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor det membranfri trunkat er et trunkat af et glycoprotein D fra et herpes simplex-virus type 1 eller type 2, og patogenet er herpes simplex-virus type 1 og/eller type 2. 70 DK 173597 B1

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor det membranfri trunkat er et trunkat af et glycoprotein C fra et herpes simplex-virus type 1 eller type 2, og 5 patogenet er herpes simplex-virus type 1 og/eller type 2.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor det membranfri trunkat omfatter den N-terminale region af gD-polypeptid op til omkring aminosyrerest 300. 10

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, som yderligere omfatter, at der formuleres en vaccine med polypeptidet.