DK174151B1

DK174151B1 - Monoklonalt antistof, hybridoma og reagens til immunoanalyse af alfa-hANP

Info

Publication number: DK174151B1
Application number: DK198804845A
Authority: DK
Inventors: Hiroo Imura; Kazuwa Nakao; Eiji Ishikawa; Masao Kono; Ken Inouye
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1987-09-01
Filing date: 1988-08-31
Publication date: 2002-07-22
Also published as: EP0306309B1; CA1335082C; DK484588D0; DE3885975D1; DE3885975T2; NO883854D0; ATE97959T1; EP0306309A2; HK1003795A1; NO174005C; ES2061664T3; KR940009281B1; NO174005B; KR890005519A; NO883854L; EP0306309A3; DK484588A

Description

i DK 174151 B1

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof, der genkender α-hANP, og en hybridoma, der fremstiller det monoklonale antistof. Nærmere bestemt angår opfindelsen et monoklonalt antistof, der genkender omkring N-terminalhalvdelen af den Met[12]hol dige ringstruktur 5 af α-hANP, og en hybridoma, som fremstiller det monoklonale antistof. Opfindelsen angår yderligere et reagens til enzymimmonoanalyse (i det følgende forkortet EIA) af α-hANP omfattende et antistof immobil i seret på en fast fase, der genkender N-terminalsiden eller C-terminalsiden af α-hANP, og et enzymmærket antistof, der genkender den modsatte side af 10 den, som genkendes af det immobil i serede antistof.

Atrialt natrluretisk polypeptid (ANP) forefindes i granuler frembragt af cellerne i atrium cordis musklen og har stærk di ureti sk og natrluretisk virkning. Denne art polypeptid findes ikke kun hos mennesker, men også hos rotter, og kaldes henholdsvis hANP og rANP. hANP og rANP 15 klassificeres hver især yderligere i tre typer: α, β og γ. α-hANP består af 28 aminosyrerester. Dets Cys[7] og Cys[23], som henholdsvis befinder sig i position 7 og 23 fra N-terminalen, danner en di sulfidbinding, og sekvensen mellem dem danner en ringstruktur (Biochem. Biophys. Res. Com-mun. (i det følgende forkortet BBRC) 118, 131-139, 1984). α-rANP afviger 20 kun fra α-hANP ved en rest i position 12 fra N-terminalen, som henholdsvis er Ile og Met i α-rANP og α-hANP (BBRC Π7, 839-865, 1983). Ø-hANP er en antiparallel dimer af α-hANP (japansk patentansøgning nr.

184098/1985). γ-hANP består af 126 aminosyrerester med 99-126 aminosyrer ved C-terminalen svarende til α-hANP. Hvad metoder til måling af ANP an-25 går, er der allerede etableret en radiolmmunoanalyse, hvortil der anvendes antiserum (Science 22§, 323-325, 1985; Nature 311» 264-266, 1985; BBRC 124, 815-821, 1984; BBRC 124, 663-668, 1984; BBRC 115, 315-323, 1984). Af disse vides det, at antiserum CR-3 genkender C-terminalfrag-ment[17-28] af ANP.

30 Monoklonale antistoffer, der reagerer med α-hANP, er kendte. Euro pæisk patent nr. 0 195 331 beskriver fremstillingen og karateri seringen af to monoklonale antistoffer, benævnt 23M-D9 og 11A-A11, der er binder til α-hANP. 23M-D9 formodes at reagere med en epitop, der omfatter aminosyrer i området 7-18 af α-hANP. 11A-A11, der også er beskrevet i Life 35 Science 38, 1991-1997, 1986, genkender en epitop, der befinder sig mellem Cys[7] og Ser[25] og omfatter disul fidbinding, men da antistoffet genkender båden den humane form (Met[12]) og rotteformen (Ile[12]), for- DK 174151 B1 n c modes epitopen ikke at omfatter position 12 i α-ΑΝΡ. I Biological Abstract, bind 82 (4), nr. 33080, 1986, beskrives et antistof, der binder såvel atriopeptin I, II, III som a-ANP fra rotter og mennesker.

Ved den konventionelle immunoanalyse af ANP har det været nødven-5 digt at ekstrahere ANP fra plasmaprøver. Der har således været et stort behov for et monoklonalt antistof med så høj en affinitet, at det var muligt at opnå en stærkt følsom analyse uden ekstraktion. Ingen af de ovenfor omtalte monoklonale antistoffer, der genkender α-hANP, er dog blevet påvist at være specifikke for den humane form. Som nævnt ovenfor 10 genkender CR-3 antiserummet for ANP imidlertid ANP's C-terminalside.

Hvis man derfor kunne opnå et antistof, der specifikt genkender N-terminal siden af ANP, ville det være muligt at udføre sandwich-immunoanalyse ved anvendelse af disse to typer antistof. Af denne årsag har der været et stærkt behov for monoklonalt antistof med høj affinitet, som speci-15 fikt genkender N-terminal siden af hANP.

Som immunoanalyse for hANP kendes radioimmunoanalyse under anvendelse af radioisotop (i det følgende forkortet RIA) og enzymimmunoanaly-se under anvendelse af enzym (EIA). For RIA's vedkommende har der været en tendens til at undgå dens anvendelse på grund af problemer med behov 20 for udstyr og faciliteter. Der har derfor været et temmelig udtrykt behov for udvikling af en stærkt følsom EIA, der kan anvendes hvor som helst. Til enzymmærkning er glutaraldehyd hidtil i almindelighed blevet anvendt som koblingsmiddel. Nutildags anvendes det imidlertid sjældent på grund af problemer med polymerisation og dårligt udbytte. Som kob-25 lingsmiddel til erstatning for glutaraldehyd er der for nylig fremkommet sådanne midler som N-hydroxysuccinimidoester af N,N'-O-phenylendimale-imid og N-(4-carboxycyclohexylmethyl)maleimid [J. Immunoassay 4, 209-327 (1983)]. Der har imidlertid ikke været nogen angivelse af, at disse kan anvendes til analyse af hANP. Det kan derfor næppe siges at, der er ud-30 viklet en stærkt følsom immunoanalyse for hANP.

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof, der genkender omkring N-terminalhalvdelen af α-hANP-ringstrukturen, der indeholder Met £ 12], og en hybidoma, der fremstiller det monoklonale antistof. Opfindelsen angår desuden et reagens til enzymimmunoanalyse af a-35 hANP omfattende et antistof immobil i seret på en fast fase, der genkender N-terminal siden eller C-terminal s i den af α-hANP, og et enzymmærket antistof, der genkender den modsatte side af den, der genkendes af det immo- 3 DK 174151 B1 biliserede antistof.

Ved målingen af α-hANP ved en konventionel RIA-metode har det været nødvendigt at ekstrahere α-hANP fra plasmaprøven. Når reagenset til immunoanalyse af α-hANP under anvendelse af det monoklonale antistof i-5 følge opfindelsen anvendes, er det derimod muligt direkte at måle a-hANP i testprøven uden ekstraktion af a-hANP.

Denne måling kan ydermere udføres ikke blot ved en totrinsmetode, ved hvilken et antistof immobil i seret på en fast fase først omsættes med α-hANP og derefter yderligere omsættes med et mærket antistof, men den 10 kan udføres ved en éttrinsmetode, ved hvilken α-hANP og et mærket antistof på samme tid omsættes med et antistof immobil iseret på en fast fase. α-hANP kan således måles let. Med etableringen af denne metode til måling af α-hANP er det blevet muligt let og nøjagtigt at diagnosticere og følge hjertesygdomme, nyresygdomme, hypertension (essentiel og sekun-15 dær), ødematøse sygdomme (levercirrose, nefrose, kataleptisk ødem, etc.) og dehydrering, der ledsages af abnorm legemsvæskebalance.

Opfindelsen beskrives nærmere 1 det følgende under henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 viser α-hANP-, a-rANP- og a-ANP-fragmenters krydsreaktivi tet med det monoklonale antistof ifølge opfindelsen, fig. 2 illustrerer standardkurven (O) for α-hANP og fortyndingskurver (φ, A,0) for plasma ved EIA, og fig. 3 viser en standardkurve (O) for α-hANP og fortyndingskurver 25 (φΆ’Β) f°r plasma ved éttrins-EIA.

Opfinderne har bestræbt sig på at udvikle et monoklonalt antistof med høj affinitet, som specifikt genkender N-terminal siden af hANP. Som resultat er der opnået et monoklonalt antistof, som genkender N-termi-30 nal siden af α-hANP-ringstrukturen. Ved anvendelse af dette antistof er der desuden etableret en yderst følsom analyse for a-hANP.

1. Fremstilling af en hvbridoma. der fremstiller et monoklonalt antistof 35 α-hANP er et polypeptid bestående af 28 aminosyrerester, og dets molekylvægt er forholdsvis lav. Dets evne til at fremkalde antistofproduktion (immunogenicitet) er følgelig lav. Af denne grund kombineres det 4 DK 174151 B1 med bovinserumalbumin eller bovinthyroglobul in, når det skal anvendes som antigen. Det opnåede konjugat emulgeres med en passende adjuvans så-som Freund's komplette adjuvans, og anvendes derefter til immunisering af mus.

5 Immunisering udføres ved intraperitoneal, subkutan eller intrave nøs inokulering af ovennævnte emulsion i mus flere gange med nogle få ugers mellemrum. Tre til fem dage efter den sidste immunisering udtages milten, der anvendes som antistofproducerende celler. Samtidig fremstilles der som parentale celler til fusionering med de antistofproducerende 10 celler til frembringelse af en hybridoma en myelomacel1 estamme med en passende markør såsom hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferase-mangel (HGPRT-) eller thymidinkinase-mangel (TK-) og myelomacellestammen fusioneres derefter de antistofproducerende celler til frembringelse af en hybridoma.

15 Som dyrkningsmedium til fremstilling af hybridomaen står sådanne medier som Eagle's MEM, Dulbecco's modificerede medium og RPMI-1640 til rådighed, og de anvendes i almindelighed tilsat ca. 15% kalvefosterserum (FCS) efter behov.

Først tilberedes myeloma som parentale celler og miltceller i for-20 holdet 1:6,5. Som fusioneringsmiddel anvendes 1 almindelighed 50% poly-ethylenglycol (PEG) på grund af høj fusionshastighed. Fusionerede stammer udvælges ved HAT-udvælgelsesmetoden. De frembragte hybridomaer screenes ved sådanne kendte metoder som membranfluorescensantistof-tek-nik, enzymkoblet immunosoirbent-analyse (ELISA) eller immunvævsfarvning 25 ved anvendelse af kultursupernatanten. Derved udvælges kloner af hybridomaer, der fremstiller et ønsket immunoglobulin. Til fremstilling af hybridomaerne anbringes monoklonale, normale miltceller som fødelag i en 96-brønds mikrobrøndplade i en mængde på 105 celler/brønd, hvor hybridomaer anbringes med mindre end én pr. brønd, og screening udføres igen 30 på voksende kloner. Monoklonale hybridomaer opnås ved gentagelse af en sådan sub-kloning.

2. Fremstilling af monoklonalt antistof 35 Til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen dyrkes den oven for opnåede hybridoma in vitro eller in vivo. Ved dyrkning in vitro kan sædvanligt medium, såsom de ovenfor nævnte, anvendes 5 DK 174151 B1 tilsat FCS. Efter dyrkning af mediet i tre til fem dage opnås det mono-klonale antistof fra kultursupernatanten. I tilfælde af in vivo-dyrkning inokuleres hybridomaen i abdominal hul en på et pattedyr. På dag syv til fjorten derefter opsamles ascites, hvorfra det monoklonale antistof op-5 nås. I sammenligning med in vitro-dyrkning giver in vivo-dyrkning effektivt en langt større mængde antistof. In vivo-dyrkning er derfor at foretrække .

Det fra kultursupernatant eller ascites opnåede monoklonale antistof renses ved en passende kombination af kendte metoder, såsom ammoni-10 umsulfat-fraktionering, DEAE-Sepharose-søjle etc. For eksempel kan rensningen udføres på en sådan måde som nævnt i eksemplet.

Som vist senere i eksemplet genkender det ifølge opfindelsen opnåede monoklonale antistof KY-ANP-I specifikt α-hANP og det viser næsten ingen affinitet overfor rANP. Det formodes, at dets epitop er N-termi-15 nalhalvdelen af α-hANP's ringstruktur, nærmere bestemt en del, der dækker Cys[7] til Gly[16]. Da det reagerer meget svagt med rANP, antages dets epitop yderligere at være en del indeholdende Met[12]. Da denne e-pitop er en del, der er fælles, ikke blot med α-hANP men også med /J-hANP og γ-hANP, udviser antistoffet også reaktivitet med Ø-hANP og γ-hANP.

20 Dette antistof udviser endvidere en høj affinitet (Ka = 3,1 x 1010 M-1) over for α-hANP. Som vist i standardkurven for α-hANP i fig. I var 10%- og 50%-i nhi bi tionskoncentrationerne (IC10 og IC50) henholdsvis 10 pg/rør og 100 pg/rør.

Hybridomaen KY-ANP-I, der fremstiller det monoklonale antistof 25 KY-ANP-I ifølge opfindelsen har været deponeret ved PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, England i henhold til Budapest-traktaten siden 20. august 1987 under løbenr. 87082001.

30 3. Kon.iuoerlnq af antistof til barer

Som fast fase for konjugering af et antistof til en bærer kan anvendes sådanne objekter som glas- eller formstofperl er, -kugler, -rør eller -plader, som kan fås i handelen og er almindeligt anvendt til im-35 munoanalyse som bærer for antigen-antistofreaktion. Et antistof, der genkender N-terminal siden eller C-terminalen af α-hANP, adsorberes på en hvilken som helst af disse bærere. Adsorptionen udføres sædvanligvis 6 DK 174151 B1 natten over i phosphatbuffer ved pH 6-10, fortrinsvis omkring neutral -punktet, ved stuetemperatur. Bæreren, hvorpå antistoffet adsorberes, opbevares under køling i nærvær af et antiseptisk middel såsom natrium-azid.

5 Både monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer kan adsor beres på bærere på samme måde som ovenfor.

4. Kaninanti-a-hANPf17-281serum 10 Kaniner immuniseres flere gange med a-hANP[17-28]-bovinthyroglo- bulinkonjugat fremstillet ved carbodiimid-metoden, og 10 til 14 dage efter den sidste immunisering opsamles blodet, hvorfra kanin-anti-a-hANP[17-28]serum fremstilles.

15 5. Fremstilling af enzvmmarket antistof

Kanin IaG. FfabM; og Fab'

Antiserum fremstillet som ovenfor beskrevet fraktioneres med natriumsulfat, som derefter ledes gennem en DEAE-cellul osesøjle, hvorved 20 IgG opnås. Det opnåede IgG nedbrydes med pepsin til frembringelse af F(ab')2, som derefter reduceres med 2-mercaptoethylamin til opnåelse af anti-a-hANP[17-28]Fab'. Fremstilling af Fab' ud fra IgG er beskrevet detaljeret i J. Immunoassay 4, 209-327 (1983) og samme procedure kan anvendes i forbindelse med opfindelsen.

25

Enzvmmærkninq af antistoffer

Som enzym til mærkning af et antistof kan anvendes alkalisk phosphatase, jS-D-galactosidase, peroxidase, glucoseoxidase etc. Ifølge op- 30 findel sen anvendes peberrodsperoxidase fortrinsvis. Som koblingsmiddel kan Ν,Ν'-o-phenylendimaleimid, N-succinimidyl-4-(N-malemimido-methyl)cyclohexanoat, N-succinimidyl-6-maleimidohexanoat, N-succin-imidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, 4,4'-dithiodipyridin og andre allerede kendte anvendes. Omsætningen af disse koblingsmidler med enzymer og 35 antistoffer kan udføres ved kendte fremgangsmåder i afhængighed af det enkelte middels egenskaber. Afhængigt af omstændighederne anvendes antistoffragmenter, såsom Fab', Fab og F(ab')z som antistof. Som koblings- 7 DK 174151 B1 middel ifølge opfindelsen er det ønskeligt at anvende N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexanoat eller N-succinimidyl-6-maleimido-hexanoat. Uanset om der er tale om polyklonale eller monoklonale antistoffer, kan enzymmærkede antistoffer opnås ved samme procedure. Enzym-5 mærkede antistoffer opnået ved anvendelse af de førnævnte to koblings-midler kan derfor vises ved følgende almene formel (I):

O

10 Γ~~Κ A-1^N_R"C0~B (η 15 hvori A betegner et antistof eller et fragment deraf, som genkender N-termlnalsiden eller C-terminal siden af o-hANP, B betegner et mærkningsenzym og R betegner 4-methylencyclohexyl eller pentamethylen.

Det er ønskeligt, at de således opnåede enzymmærkede antistoffer renses ved affinitetschromatografi således, at et mere følsom immunoan-20 alysesystem opnås. De rensede enzymmærkede antistoffer opbevares på et koldt og mørk sted sammen med en stabilisator, såsom thimerosal eller glycerol, eller efter at være lyophiliseret.

Når a-hANP måles ved anvendelse af et immunoanalysereagens fremstillet som oven for beskrevet, arrangeres en kombination af antistoffer 25 som følger: Hvis et antistof, der genkender N-terminal siden af ar-hANP, immobil iseres, enzymmærkes et antistof, der genkender C-terminal s iden.

Til immobilisering af et antistof kræves i almindelighed en forholdsvis stor mængde antistof. Til immobiliseringen er et monoklonalt antistof, der konstant kan opnås 1 stor mængde (for eksempel KY-ANP-I ifølge op-30 findelsen), derfor egnet. Et polyklonalt antistof fremstillet ud fra antiserum kan imidlertid også anvendes uden besvær. Hvad angår antistoffet, som skal enzymmærkes, kan enten et monoklonalt antistof eller et polyklonalt antistof anvendes, forudsat at det er et, som genkender den modsatte side af den, som genkendes af det immobil i serede antistof. Hvis 35 KY-ANP-I ifølge opfindelsen anvendes som immobiliseret antistof, kan for eksempel ovennævnte antiserum CR-3 eller det i eksemplet nævnte antiserum F36 anvendes som enzymmærket antistof. Det modsatte af denne kombi- 8 DK 174151 B1 nation kan også anvendes. Naturligvis kan monoklonale antistoffer, der genkender C-terminal siden af α-hANP, og antisera, der genkender N-terminal siden af α-hANP, også anvendes ifølge opfindelsen.

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende eksempel.

5

EKSEMPEL

Fremstilling af hvbridoma 10 Syntetisk cn-hANP (1,5 mg) og bovinthyroglobul in (5,4 mg) opløstes i 2 ml destilleret vand. Til denne opløsning sattes dråbevis en opløsning af 30 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid i 1 ml destilleret vand ved stuetemperatur i løbet af 10 minutter, hvorefter blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 24 timer. Denne opløsning dia-15 lyseredes 6 gange over for 3 1 destilleret vand i løbet af et tidsrum på 3 dage. Dialysatet opdeltes i 5 portioner, som opbevaredes ved -20°C (Se BBRC 124, 815-821, 1984).

Til ovennævnte opløsning, der var opbevaret i opdel te portioner (indeholdende 300 /ig or-hANP), sattes destilleret vand til 1,2 ml, hvor-20 efter der suspenderedes i 1,2 ml komplet Freund's adjuvans. Af dette injiceredes ca. 2 ml intraperitonealt og subkutant i de BALB/c-mus af hunkøn (200 /il pr. dyr). Dyrene modtog yderligere immunisering på samme måde 3 uger senere. Fem uger efter den yderligere immunisering måltes antistofferne i blodet, og de to mus, som udviste den mest fremtrædende 25 immunreaktion, modtog yderi i gere immunisering med ovennævnte opløsning indeholdende 50 //g oHiANP gennem halevenen. Fire dage derefter opsamledes miltcellerne fra de to mus til cellefusionering.

De opsamlede miltceller (1,3 x 108 celler) og myelomaceller X63-Ag8.653 (2 x 107 celler) blandedes i Dulbecco's medium (DMEM), og 30 blandingen centrifugeredes ved 1500 rpm ved 4°C i 5 minutter. De opnåede piller smeltedes ved opvarmning til 37°C, hvorefter 1 ml 50% PEB 4000 (PEG 1 g/DMEM 1 ml) tilsattes dråbevis over et tidsrum på 1 minut. Derefter fik blandingen lov til at stå ved 37°C i 2 minutter, hvorefter opløsningen fortyndedes ved dråbevis tilsætning af 10 ml DMEM på 37°C i 35 løbet af 5 minutter. Derefter vaskedes der med DMEM indeholdende 15% FCS ved centrifugering ved 4°C.

De opnåede celler udsåedes på en 96-brøndsplade og dyrkedes i HAT- 9 DK 174151 B1 medium i 2 uger og i HT-medium i yderligere 1 uge. Af i alt 768 brønde prolifereredes hybridomaer i ca. 30% (212/768), hvoraf 4% (8/212) fandtes at producere α-hANP-antistoffer.

Celler i de brønde, der viste den højeste antistoftiter, klonedes 5 ved grænsefortyningsmetoden. Som fødeceller sattes BALB/c-musethymuscel-ler til brøndene i en mængde på 106 celler/brønd, og hybridomaer anbragtes deri i en mængde på 1 stk./brønd og dyrkedes der. Denne procedure udførtes 2 gange.

Ved denne kloning udvalgtes konstant den klon, der fremstillede 10 den største mængde antistof, og den kaldtes KY-ANP-I.

Antistoftiterne i det fra de immuniserede mus og 1 supernatanten fra hybridomakulturen opnåede antiserum måltes som følger:

Antiserum fra immuniserede mus eller supernatant fra hybridomakul-turer udtoges som prøve. En blanding af 100 /il af den fortyndede opløs-15 ning af prøven, 300 μΐ analysepuffer (RIA-puffer) og 100 μΐ 125I-o-hANP (10000 cpm) fik lov til at undergå reaktion ved 4°C i 24 timer, hvorefter opløsningen blandedes med 1 ml dextranbelagt trækul, og blandingen fik lov til at reagere ved 4°C i 5 minutter. Derefter centrifugeredes blandingen ved 3000 rpm ved 4°C i 30 minutter, og radioak-20 ti vi teten af supernatanten måltes med en γ-tæller, og antistoftiteren i den fortyndede opløsning af prøven beregnedes på grundlag deraf.

Ovennævnte lz5I-or-hANP fremstilledes ved Chloramin T-meto-den. or-hANP (1 /ig) blandedes med Na1251 (1 mCi), hvortil der sattes 10 μ~\ chloramin T (5,25 mg/ml) og 10 sekunder derefter 20 μ] 25 natriumpyrosulfit (4,5 mg/ml). Dertil sattes yderligere 1 ml 2% gelatine, hvorefter der rensedes med Sep-Pak C18 (fremstillet af Waters).

Fremstilling af monoklonalt ant.^t.nf 30 BALB/c-mus forbehandledes to gange med 1 til 2 ugers mellemrum ved intraperitoneal indgivelse af pristan i en mængde på 0,5 ml pr. dyr pr. gang. Hver af musene fik derefter intraperitonealt injiceret 5 x 106 celler af hybridoma KY-ANP-I suspenderet i 200 μ] DMEM. Opnået ascites rensedes med en Protein A-Sepharose CL-4B-søjle til opnåelse af monoklo-35 nalt antistof KY-ANP-I.

10 DK 174151 B1 KY-ANP-I's egenskaber

Dette monoklonale antistofs isotype bestemtes ved Ouchterlony's metode til at være IgGx. Dets affinitet opnåedes ved udførelse af en 5 Scatchard-afbildning på basis af radiobindingsanalyse, og som resultat fandtes Ka = 3,1 x 1010 M-1.

Dets epitop bestemtes ved måling af dets krydsreaktivitet med forskellige ANP-relaterede peptider ved hjælp af RIA, og resultatet vises i fig. 1. Da det næsten ikke udviser nogen reaktion med <*-ANP[17-28] og 10 a-ANP[l-6], formodes epitopen at være indeholdt i cr-ANP[7-16]. Det reagerer desuden meget svagt oHiANP[8-22] eller a-rANP. Det formodes derfor, at det er nødvendigt for epitopen at have en ringstruktur, og at epitopen indeholder Met. Det konkluderedes, at den epitop, der genkendes af det monoklonale antistof ifølge opfindelsen, næsten er N-terminal -15 halvdelen af ft-hANP-ringstrukturen.

Imidlertid undersøgtes reaktiviteten af KY-ANP-I med /1-hANP og γ-hANP ved ovennævnte metode til måling af antistoftiter. Som resultat fandtes det, at KY-ANP-I ikke kun genkender or-hANP men også γ-hANP, og yderligere at det reagerer med Ø-hANP med 80% krydsreaktivitet.

20

Fremstilling af anti-tt-hANPri7-281bovinthvroolobulinserum cHiANP[17-28] bandtes til thyroglobulin ved den kendte cardoi-imid-metode (BBRC 117, 695, 1984). Til 0,5 ml af en vandig opløsning in-25 deholdende 3,1 mg at—hANP[ 17-28] sattes 0,7 ml af en vandig opløsning indeholdende 19 mg bovinthyroglobul in. Dertil sattes 1 ml af en vandig opløsning indeholdende 40 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodi-imidhydrochlorid, og blandingen omrørtes i 2 timer under køling med is. Reaktionsopløsningen dialyseredes 3 gange ved 4°C over for 2 1 dest i 11e-30 ret vand, hvorefter den lyophili seredes til opnåelse af 21 mg af konju-gatet. Det bundne mol forhold af or-hANP[17-28] til bovinthyroglobul in bestemtes ved aminosyreanalysemetoden til at være 30.

Immunisering og blodopsamling 35 I 0,25 ml fysologisk salineopløsning opløstes 0,25 mg af ovennævnte o-hANP[17-28]bovinthyroglobulinkonjugat. Dette suspenderedes i samme DK 174151 B1 π mængde komplet Freund's adjuvans, og opløsningen injiceredes subkutant 20 eller flere steder i ryggen på en kanin. Denne procedure udførtes 6 gange med 3 ugers mellemrum, og på 10. dagen efter den sidste injektion åreladedes kaninen fra halspulsåren til opnåelse af antiserum F36.

5

Fremstilling af kanin-IoG

Til 1 ml anti-<HiANP-serum (F36) sattes langsomt under omrøring 0,18 g natriumsulfat, og omrøring fortsattes ved 22°-25°C, efter at det 10 tilsatte materiale var opløst fuldstændigt. Derefter centrifugeredes blandingen ved 10.000 rpm ved 22°-25°C i 10 minutter. Præcipitatet opløstes i 1 ml natriumphosphatpuffer (pH 6,3; 17,5 mrnol/1), som derefter dialyseredes over for samme puffer. Supernatanten ledtes gennem en DEAE-cellul osesøjle, som på forhånd var bragt i ligevægt med samme puf-15 fer (pH 6,3; 17,5 mmol/1). Det våde volumen DEAE-cellul ose, der kræves for at bringe 10 mg protein over 1 supernatanten, er 1 ml. Den opnåede IgG-mængde var 7 mg beregnet ved anvendelse af ekstinktionskoefficienten ved 280 nm 1,5 g-1! cm-1 og molekylvægten af IgG 150.000 (Se J. Immunoassay 4, 209-327 (1983)).

20

Fremstilling af F(ab'l?

Ti mg kanin-IgG dialyseredes over for 1 ml natriumacetatpuffer (pH 4,5, 0,1 mol/1) ved 5°C. Til den dialyserede IgG-opløsning sattes 0,05 25 ml (1/20 på volumenbasis) af en vandig opløsning af natriumchlorid (2 mol/1). I denne opløstes pepsin (0,2 mg/10 mg IgG) hidrørende fra slimhinden fra svinemave. Blandingen fik lov til at reagere ved 37°C i 15-24 timer. Derefter indstilledes blandingen til pH 8 med en vandig opløsning af natriumhydroxid (1 mol/1), hvorefter blandingen sattes til en søjle 30 af Sephadex G—150 (1,5 x 45 cm til 1,0-1,5 ml, 2,0 x 45 cm til 2,0-2,5 ml) og elueredes med natriumboratpuffer (pH 8,0, 0,1 mol/1). Den opnåede mængde af F(ab')2 var 6 mg beregnet ved anvendelse af 1,48 g-1! cm-1 som ekstinktionskoefficienten ved 280 nm og 92.000 som molekylvægten af F(ab')z (Se J. Immunoassay, 4, 209-327 (1983)).

35 12 DK 174151 B1

Fremstilling af Fab'

Tre mg F(ab')2 opløstes i 45 ml natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 mol/1). Dertil sattes 2-mercaptoethylamin/natriumphosphatpuffer-op-5 løsning (pH 6,0, 0,1 mol/1) indeholdende 5 mmol/1 EDTA, idet pufferopløsningen fremstilledes umiddelbart før brug. Derefter fik blandingen lov til at reagere ved 37°C i 1\ time. Så sattes reaktionsblandingen til en søjle af Sephadex G—25 (1 x 30 cm) og elueredes med natriumphosphat-puffer (pH 6,0, 0,1 mol/1, indeholdende 5 mmol/1 EDTA). Den opnåede 10 mængde af Fab' var 2,5 mg beregnet ved anvendelse af 1,48 g-1! cm-1 som ekstinktionskoefficienten ved 280 nm og 46.000 som molekylvægten af F(ab')2 (se J. Immunoassay, 4, 209-327 (1983)).

Fremstilling af peroxidasemærket anti-orhANPi17-281Fab' 15

To mg peberrodsperoxidase (50 nmol) opløstes i 0,3 ml natrium-phosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 mol/1). En blanding af 0,65 mg (2100 nmol) N-succinimidyl-6-maleimido-hexanoat og 0,03 ml N,N-dimethyl formamid tilsattes, og blandingen fik lov til at reagere ved 30°C under omrøring i 20 \-\ time. Derefter underkastedes reaktionsblandingen centrifugering således, at reagensoverskud fjernedes som præcipitat. Supernatanten ledtes gennem en Sephadex G-25 søjle (1,0 x 45 cm) og elueredes med natrium-phosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 mol/1) med en strømningshastighed på 30-40 ml/h, idet volumenet af hver fraktion indstilledes til 0,5-1,0 ml. En 25 søjle af Sephadex G-50 (fin, Pharmacia) (1,0 x 6,4 cm, 5 ml) med et fint netfilter i bunden bragtes i ligevægt med ovennævnte puffer og centrifugeredes i et prøverør ved 100 x g i 2 minutter. Ovennævnte reaktionsprodukt (0,5 ml) sattes til søjlen og centrifugeredes på samme måde. Den opnåede fraktion koncentreredes ved centrifugering med en mikrokoncen-30 trator (CENTRICON-30, Amicon Corp.) ved 2.000 x g og 4°C.

1,8 mg (45nmol) af det således fremstillede maleimidperoxidase-konjugat opløstes i natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 mol/1). En opløsning af ca. 2,0 mg (43 nmol) Fab' i 0,2-0,4 ml natriumphosphatpuffer (pH

6,0, 0,1 mol/1) indeholdende 5 nmol/1 EDTA tilsattes, og blandingen fik 35 lov til at reagere ved 4°C i 20 timer eller ved 30°C i 1 time. Slutkon-centrationen af maleimidperoxidase-Fab'-konjugatet i reaktionsblandingen indstilledes til 50-100 jtmol/l. Denne reaktionsblanding ledtes gennem en 13 DK 174151 B1 søjle (1,5 x 45 cm) af U1trogel AcA 44 og el lieredes med natriumphosphat-puffer (pH 6,5, 0,1 mol/1) ved en strømningshastighed på 0,3-0,5 ml/min, idet volumenet af hver fraktion sattes til ca. 1,0 ml. På denne måde opnåedes ca. 2,5 mg af det ønskede peroxidasemærkede anti-a-hANP[17-5 28]Fab'. (Se J. Immunoassay, 4, 209-327 (1983)).

q-hANPri7-281-nonspecifikt kanin-IgG-kon.iugat

En opløsning af cr-hANP[17-28] (0,5 mg) i 0,2 ml natriumphosphat-10 puffer (0,1 mol/1, pH 7,0) fik lov til at reagere med 0,01 ml 105 mmol/1 N-succinimidyl-6-maleimidohexanoat i Ν,Ν'-dimethylformamid ved 30°C i 30 minutter. Omsætningsproduktet underkastedes gelfiltrering med en søjle af Sephadex G—10 (1,0 x 45 cm) under anvendelse af 0,1 mol/1 natrium-phosphatpuffer (pH 6,0) indeholdende 5 mmol/1 EDTA. Den gennemsnitlige 15 værdi af de i ot-hANP[17-28] indførte maleimidgrupper var 0,6/molekyle.

En opløsning af nonspecifikt kanin-IgG (10 mg) i 0,1 mol/1 natriumphosphatpuffer (0,6 ml, pH 7,5) fik lov til at reagere med en opløsning af 210 mmol/1 S-acetylmercaptosuccinanhydrid (0,03 ml) i N,Ν'-dimethyl formamid ved 30°C i 30 minutter. Til denne reaktionsbian-20 ding sattes 0,1 mol/1 tris-hydrochloridpuffer (0,1 ml, pH 7,0), 0,1 mol/1 EDTA (0,02 ml) og 1 mol/1 hydroxylaminhydrochlorid (0,1 ml, pH

7,0), og blandingen fik lov til at reagere ved 30°C i 5 minutter. Reaktionsproduktet underkastedes gelfiltrering med en søjle af Sephadex G—25 (1,0 x 45 cm) under anvendelse af 0,1 mol/1 natriumphosphatpuffer (pH 25 6,0) indeholdende 5 mmol/1 EDTA. Gennemsnitsværdien af de i nonspecifik kanin-IgG indførte thiolgrupper var 11/molekyle.

En portion (2,0 ml) af ovennævnte maleimid—ar—hANP[ 17-28] fik lov til at reagere med mercaptosuccinyleret nonspecifikt kanin-IgG (2,4 mg) opnået i 0,1 mol/1 natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,25 ml) indeholdende 30 5 mmol/1 EDTA ved 30°C i 30 minutter. Til reaktionsproduktet sattes 0,1 ml N-ethylmaleimid 0,01 mmol/1 for derved at blokere de resterende mercaptogrupper. Blandingen underkastedes derefter gel filtrering med en søjle af Sephadex G-25 (1,0 x 45 cm) under anvendelse af 0,1 mol/1 natriumphosphatpuffer (pH 7,0). Det gennemsnitlige antal molekyler af 35 a-hANP[17-28], som kombineredes med nonspecifikt kanin-IgG, var 8,7/mo-lekyle beregnet ud fra reduktionen af thiolgrupperne.

14 DK 174151 B1

Rensning af peberrodsperoxidasemærket anti—hANPT17-28ΊFab/ a—hANP[17-28]—nonspecifik kanin-IgG-konjugat (2 mg), bovinthyro-globulin (10 mg) og museserumprotein (20 mg) kombineredes hver især med 5 cyanogenbromid-aktiveret Sepharose 4B (1 g). Peberrodsperoxidasemærket anti-hANP[17-28]Fab' (7,8 mg) i 0,8 ml 0,1 mol/1 natriumphosphatpuffer (pH 6,5) indeholdende 1 g/1 gelatine og 50 mg/1 thimerosal ledtes gennem to søjler, dels en søjle af bovinthyroglobulin-Sepharose 4B (0,55 x 4,0 cm) og dels en søjle af museserumprotein-Sepharose 4B (0,55 x 4,0 cm), 10 ved en strømningshastighed på 0,5 ml/h og under anvendelse af 10 mmol/1 natriumphosphatpuffer (pH 7,5) indeholdende 1 g/1 gelatine og 0,1 mol/1 natriumchlorid. Rensning foretoges derefter med en søjle af or—hANP[17- 28]-nonspecifik kanin-IgG-Sepharose 4B (0,35 x 2,0 cm) under anvendelse af 3,2 mmol/1 saltsyre (pH 2,5). Eluatet (1 ml) indeholdende 0,35 mg 15 renset mærket stof blandedes straks med 0,1 ml 1 mol/1 natriumphosphatpuffer (pH 7,0) og 0,01 ml 100 g/1 gelatine. Mængden af mærket stof var ca. 0,35 mg beregnet ud fra peroxidaseaktivi teten.

Fremstilling af med monoklonalt anti-or-hANP overtrukne polvstvrenkuqler 20

Halvtreds polystyrenkugler (diameter 3,2 mm, fremstillet af Precision Plastic Ball Co., Chicago, U.S.A.) anbragtes i 1 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,0), hvortil der sattes 100 /ig/ml monoklonalt anti-or-hANP IgGj (KY-ANP-I), og blandingen henstilledes natten over 25 ved stuetemperatur. Derefter vaskedes polystyrenkuglerne med natriumphosphatpuffer (pH 7,0), hvorefter natriumazid tilsattes til 0,1%. De således fremstillede polystyrenkugler opbevaredes i køleskab.

Opsamling af plasma 30

Blod opsamledes kl. 900 om morgenen fra den antekubitale vene på raske mænd (26-32 år) anbragt i rygleje efter efter fasten natten o-ver. Blod opsamledes igen fra samme personer på samme måde efter 1 times gang med intravenøs administration af 40 mg furosemid. Blod udtoges med 35 kølede plastsprøjter og overførtes til kølede siliconebelagte glasén-gangsrør tilsat aprotinin og EDTA. Det centrifugeredes derefter (500 x

g) for at fraskille plasma. SIutkoncentrationerne af aprotinin og EDTA

15 DK 174151 B1 var henholdsvis 1.000 kaliikreininaktivatorenheder (KIU)/ml og 1 mg/ml.

Enzvmimmunoanalvse af g-hANP ved sandwichmetoden 5 En polystyrenkugle overtrukket med monoklonalt anti-a-hANP IgGj (KY-ANP-I) anbragtes i en standardopløsning af cn-hANP eller i plasma (samlet volumen 0,15 ml), som fik lov til at stå ved 4°C i 24 timer. α-hANP-standardopløsningen fortyndedes med 10 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0, indeholdende 1 mg/ml gelatine, 0,3 M natriumchlorid, 0,2 mM 10 cystin, 1 mM EDTA, 1 mg/ml natriumazid og 1.000 KIU/ml aprotinin) til et slutvolumen på 0,15 ml. Plasmaet (50 /il) blandedes med 0,1 ml 10 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0, indeholdende 1 mg/ml gelatine, 0,4 M natriumchlorid, 0,3 mM cystin, 1,5 mM EDTA, 1,5 mg/ml natriumazid og 1.000 KIU/ml aprotinin).

15 Efter fjernelse af den flydende del af reaktionsproduktet vaskedes polystyrenkugien 2 gange med 2 ml 10 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0, indeholdende 0,1 M natriumchlorid). Derefter blandedes kuglen med 50 ng kanin-anti-a-hANP[17-28]Fab'-peroxidasekonjugat renset ved affinitetskromatografi og 0,15 ml 10 mM natriumphosphatpuffer (pH 8,0, indehol-20 dende 1 mg/ml gelatine, 0,2 mM cystin og 1 mM EDTA), og blandingen fik lov til at stå ved 4°C i 24 timer. Efter fjernelse af den flydende del vaskedes polystyrenkuglen 2 gange på samme måde som ovenfor nævnt og o-verførtes til et andet prøverør. For at bestemme aktiviteten af den konjugerede peroxidase måltes fluorescensintensiteten efter reaktion i 60 25 minutter ved 30°C med 3-(4-hydroxy-phenyl)-propionsyre anvendt som substrat. Fluorescensintensiteten måltes på basis af 200 ng/ml quinin/50 mM svovlsyre.

Specificitet 30

Ved EIA efter denne fremgangsmåde var standardfortyndingskurven for α-hANP identisk med kurven for a-hANP[4-28], ar-hANP[5-28] og or—hANP[7-28], hvilket indikerede ingen indvirkning af N-terminalmodifikationer. På den anden side reducerede udeladelse af C-terminalamino-35 syrer reaktiviteten betragteligt. Der iagttoges imidlertid ingen reaktion med terminal fragmenter: arhANP[17-28] og or—hANP[1-6]. Krydsreaktionerne med /3—hANP og or-rANP var henholdsvis 4,7% og 0,01% på molær basis.

16 DK 174151 B1

Disse resultater stemte overens med specificiteten af de anvendte antistoffer: monoklonalt muselgG! immobiliseret på polystyrenkugle var specifikt for N-terminalhalvdelen af α-hANP's ringstruktur, mens kanin-Fab' konjugeret til peroxidase var specifikt for oHiANP[17-28].

5

Indvirkning af plasma

Aktiviteten af bundet oxidase (nonspecifik binding) målt i fravær af plasma og ar-hANP var identisk med den i nærvær af plasma forbehandlet 10 med 1 pmol monoklonalt anti-ar-hANP IgGx (KY-ANP-I) målte peroxidase-aktivitet. Udbytterne af ar-hANP (10-200 pg/ml) sat til plasma indeholdende 4,3-332 pg/ml ANP var 81-94%. Plasmafortyndingskurven var parallel med den i fravær af plasma opnåede standardkurve for ar-hANP, når plasma-volumenet pr. rør var i intervallet fra 1-50 jul. Der iagttoges således 15 ringe plasmainterferens, når det anvendte plasmavolumen var 50 μΐ eller derunder. Resultatet vises i fig. 2.

EIA—sensi bi 1 i tet 20 Påvisningsgrænsen for ar-hANP var 30 fg (10 amol)/rør. Når 50 μΐ plasma anvendtes, var det minimale påvisningsniveau af plasma ar-hANP 0,6 pg/ml (0,2 fmol/ml). Denne EIA-følsomhed var meget højere, en til to størrelsesordener, end følsomheden af konventionel RIA.

25 Reoroducerbarhed af EIA

Reproducerbarheden ifølge opfindelsen defineredes ved 5 forskellige niveauer over intervallet 5-158 pg/ml orhANP i plasma. Variationskoefficienter for reproducerbarhed inden for analyse og mellem analyser 30 var henholdsvis 3,2-9,4% (n=20) og 5,4-12,0%.

Plasma α-hANP-niveauer i raske individer i basal og blodvolumenkontrahe-ret tilstand ved EIA i sammenligning med RIA_ 35 Det basale plasma α-hANP-niveau hos voksne individer bestemt ved EIA var 24,5 ± 5,9 pg/ml. Plasma α-hANP-niveauet faldt til 15,3 ± 3,7 pg/ml i den blodvolumenkontraherede tilstand efter 1 times gang med in- 17 DK 174151 B1 travenøs administrering af furosemid (40 mg). Plasma a-hANP-niveauer bestemt samtidig ved RIA var henholdsvis 28,2 ± 5,7 pg/ml og 18,3 ± 3,2 pg/ml. Følgende korrelation noteredes mellem målinger af orhANP ved EIA (y) og RIA (x): 5 y = 0,78x + 1,3, x = 0,92, n = 24

Som det fremgår af ovenstående data, er EIA ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen så følsom, at det selv i den blodvolumenkontraherede 10 tilstand er muligt at måle plasma a-hANP-koncentrationen uden ekstraktion.

Plasma a-hANP-niveauer i patienter med hiertesvodomme 15 Plasma a-hANP-niveauer målt med a-hANP-målereagenset ifølge opfin delsen i patienter med hjertesygdomme var som vist i den følgende tabel 1.

20 TABEL 1

Patientnr. Opnået niveau (pg/ml) 25 1690 2 470 3 332 4 129 5 113 30 6 108 7 89 8 78 9 52 10 35 35 -.......... IL-- — - -

Bemærkninger: Patient nr. 1-3 havde alvorligt hjertesvigt.

40 18 DK 174151 B1

Anvendelse til éttri nsmetode ved EIA

EIA ifølge opfindelsen kan også udføres som en éttrinsmetode. Fig.

3 viser standardkurven for or-hANP og fortyndingskurver for plasma ved 5 éttrinsmetoden. Ved denne metode blandedes hANP, enzymmærket antistof og antistofovertrukne polystyrenkugler, alle på én gang, og reaktion fik lov at finde sted ved 4°C i 24 timer. Peroxidaseaktivitet (POD) måltes ved 30°C i 30 minutter. Andre betingelser var som for totrinsmetoden.

Claims

19 DK 174151 B1

1. Monoklonalt antistof, KENDETEGNET ved, at det genkender N-ter- 5 minalhalvdelen af a-hANP-ringstrukturen, idet det genkender et hvilket som helst delafsnit, der er indeholdt i or—hANP[7-16], og omfatter Met[12], og at det er det monoklonale antistof KY-ANP-I, der fremstilles af hybridoma KY-ANP-I (ECACC87082001).

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er immobil i seret på en fast fase.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den faste fase er en glasperle eller en polystyrenkugle. 15

4. Hybridoma, KENDETEGNET ved, at den fremstiller et monoklonalt antistof ifølge krav 1.

5. Hybridoma ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at den er hybridoma 20 KY-ANP-I (ECACC87082001).

6. Reagens til immunoanalyse af α-hANP, KENDETEGNET ved, at det omfatter to typer antistoffer, hvoraf det ene genkender N-terminal siden af α-hANP, og det andet genkender C-terminalsiden af α-hANP, og hvor det 25 ene antistof er immobiliseret på en fast fase, og det andet er mærket med et enzym.

7. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at antistoffet er bundet til enzymet ved hjælp af et koblingsmiddel. 30

8. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at enzymet er en peroxidase.

9. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at 35 koblingsmidlet er N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexanoat eller N-succinimidyl-6-maleimidohexanoat. 20 DK 174151 B1

10. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at det monoklonale antistof, der genkender N-terminalsiden af a-hANP, er et antistof ifølge krav 1. 5

11. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at antistoffet, der genkender C-terminalsiden af ο-hANP, er et anti-or—hANPf 17-28] antistof.

12. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at anti-a-hANP[17-28]antistoffet er opnået ud fra kanin-anti-a-hANP[17-28]serum.

13. Reagens til immunoanalyse ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at 15 den faste fase er en glasperle eller en polystyrenkugle.