DK174284B1 - Biologisk aktive tetrasaccharider - Google Patents

Description

DK 174284 B1

Biologisk aktive tetrasaccharider

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte biologisk virksomme tetrasaccharider.

5

Den foreliggende opfindelse er en videreudvikling af den opfindelse, som er genstand for dansk patentansøgning nr. 143/83, der blev offentliggjort 16. juli 1983. I denne patentansøgning er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af oligosaccharider bestående af eller indeholdende fragmenter af kæder 10 af naturlige mucopolysaccharider på syreform samt derivater af disse oligosaccharider. Det skal bemærkes, at udtrykket “mucopolysaccharider på syreform" betegner sådanne derivater, der ligeledes hyppigt betegnes som glu-cosaminoglucuronglycaner. Disse derivater dannes af oligosaccharider og poiysaccharider, som især udgør kæderne tilhørende biologisk aktive deriva-15 ter, såsom derivater af heparintypen og af heparansulfattypen. Disse kæder udgøres hovedsageligt af alternerende komponenter: aminosukkerart-uronsyre eller omvendt. I disse komponenter udviser aminosukkerarten især en D-glucoseaminstruktur (benævnt a), og uronsyregruppen en D-glucuronsyre-struktur (benævnt b) eller L-iduronsyre-struktur (benævnt c).

20

Den store smidighed, som er betegnende for den i ovennævnte danske patentansøgning beskrevne fremgangsmåde, gør det muligt at fremstille kædedannelser af de ønskede gentagelsesgrupper eller komponenter i overensstemmelse med den ønskede stereokemiske konfiguration og med fastlagte 25 substitutioner. Det er således især muligt at opnå sådanne oligosaccharider, som udgør analoge forbindelser til strukturen af fragmenter fra heparinkæder.

Disse fragmenter kan med fordel indbefatte den octasaccharidiske kædestruktur ABCDEFGH, som hidtil er blevet opnået af ansøgeren ved enzyma-30 tisk depolymerisation af heparin, som beskrevet i US patentskrift nr. 4 401 662, og som har strukturformlen DK 174284 B1 2 f>r y- ΟΊΌ rt -£ jyφ & y^^y °:' O so" HKS<j“ O'.'i •'•.iÅC. Oil «ftso" OM'j SHSO, λ a c d .': - c, h \

Ved depolymerisering af heparin opnås i første omfang fragmenter af forskel-5 lig længde og med forskellige sammensætninger. Ved kromatografisk fraktionering kan derefter opnås fraktioner, som overvejende indeholder forbindelser, der i struktur minder om hinanden.

I US patentskrift nr. 4 401 662 omtales det at antithrombin-aktiviteten og anti-10 Xa-aktiviteten (målt ved den såkaldte Yin Wessier titer) blev målt for visse af disse fraktioner. Ved sammenligning af måleresultaterne konkluderede man, at fraktionerne formodentlig skulle indeholde forbindelser, der omfattede sekvensen CDEF, hvis fraktionen skulle have en affinitet til antithrombin (ATIII), idet man dog konstaterede tilstedeværelsen af sekvenserne ABCDEF og 15 CDEFGH i fraktionen. Yderligere konstaterede man at fraktioner indeholdende sekvensen DEFGH havde en høj anti-Xa-aktivitet, men fraktioner af EFGH havde en lav aktivitet.

De syntetisk fremstillede oligosaccharider kan ligeledes omfatte kun en del af 20 denne kædestruktur ABCDEFGH, eller de kan bestå af denne kædestruktur.

De i formlen anførte bogstaver A - H betegner, således som de er anvendt i den foreliggende beskrivelse, en strukturtype, idet substituenterne kan være identiske eller forskellige fra de i formlen viste.

De syntetisk fremstillede oligosaccharider udgør, således som det er beskrevet i nævnte patentansøgning, særdeles interessante biologisk reaktionsdyg- 25 3 DK 174284 B1 tige substanser samt substanser anvendelige som referenceforbindelser. De er derudover i besiddelse af farmakologiske egenskaber, som bibringer dem en anvendelighed af stor vigtighed som aktive bestanddele i lægemidler.

5 Visse af disse syntetisk fremstillede oligosaccharider har ligeledes vist sig at være ganske særligt aktive i forbindelse med blodets koagulering.

Dersom man nemlig hos et trisaccharid med strukturen DEF har kunne konstatere en anti-Xa-aktivitet (målt ved den såkaldte Yin-Wessler-titer), er det 10 med et pentasaccharid af strukturen DEFGH muligt at påvise en meget kraftig affinitet til antithrombin 111 (ATIII) og en anti-Xaaktivitet (Yin-Wessler), som er meget høj, idet den udgør mindst 2.000 Yin-Wessler-enhecler/mg.

Det testede produkt har formlen og er kendt fra DK patentansøgning nr.

15 143/83 coo" r-OSO, f“OSO~ /^0. / Kr / Γ°\ /~0Vh/~°\ f\QH XqX^oh y (}A^so3 v^QA^h°~ ,/ίΛ^οι· Λ011 nhso3 OH NHSO3 OSO” VT.iS0“

Man har kunnet påvise en anti-Xa-aktivitet på mindst 2.000 Yin-Wessler-20 enheder/mg.

Man har nu under fortsættelse af de ovenfor omtalte forskningsarbejder overraskende konstateret en tilstrækkelig høj aktivitet hos en vis gruppe af lavere oligosaccharider (idet dette udtryk “lavere” skal være forstået i relation til pen-25 tasacchariderne) til at muliggøre en udnyttelse som aktiv bestanddel i anti-thrombotiske lægemidler.

DK 174284 B1 4

Videreførelsen af disse forskningsarbejder har ført til fremstillingen af en specifik gruppe af oiigosaccharider, som har vist sig på fordelagtig måde at have et bredt terapeutisk spektrum.

5 Den foreliggende opfindelse har således til formål at tilvejebringe en hidtil ukendt gruppe af tetrasaccharider, hvis struktur svarer til strukturen i fragmenter af kæderne i mucopolysaccharider.

Disse tetrasaccharider kan anvendes som reaktionsdygtige substanser inden 10 for laboratoriet og som aktive bestanddele i lægemidler.

Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen, der er af den i krav 1’s indledning angivne art er ejendommelige ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

15

De undersøgelser, som er blevet gennemført af opfinderne inden for dette område, har påvist vigtigheden af sekvensen DEFG, som svarer til den blok, der betegnes som irregulær, og som er til stede i det naturlige heparin-mole-kyle. På baggrund af tidligere kendt teknik er det særdeles overraskende at 20 denne sekvens bibringer selve tetrasaccharidet DEFG farmakologiske egenskaber, der lader sig udnytte inden for et meget bredt terapeutisk område.

De definerede tetrasaccharider indeholder således to gentagelsesenheder D-glucosamin-D-glucuronsyre (a-b) og D-glucosamin-L-iduronsyre (a-c).

25

De komponenter, der er nævnt ovenfor som indgående i forbindelserne, er indbyrdes forbundet med hverandre af bindinger af typen 1 -4, og de indbefatter følgende bindinger: o a β a 1 4b, a 1 ·* 4c og b 1 ^ 4a.

5 DK 174284 B1

Tetrasacchariderne med strukturen DEFG har på overraskende måde i sig selv vist sig at have farmakologiske egenskaber, som er tilstrækkeligt kraftige til at muliggøre en anvendelse af disse produkter som aktiv bestanddel i lægemidler.

5

Man kan måle den økonomiske interesse i disse produkter i forhold til de højere oligosaccharider i den udstrækning, hvori de kun til syntese deraf kræver anvendelsen af fire komponenter eller gentagelsesgrupper.

10 En familie, x, af tetrasaccharider, som er foretrukket på grund af deres høje anti-Xa-aktivitet og deres kraftige affinitet for ATIII, er forbindelser med den i krav 1 angivne almene formel II a, i hvilken R2 betegner en uorganisk anion.

Tetrasaccharider af denne familie, hvori R2 betegner en sulfat-anion, er gan-15 ske særlig foretrukne på grund af deres analogi med de naturlige produkter.

De særligt interessante tetrasaccharider i denne henseende indeholder ligeledes sulfatgrupper for i det mindste visse af de andre substitutioner, eller i særdeleshed for alle substitutionerne Ri og/eller Ni og N2.

20

Et foretrukket tetrasaccharid af denne type svarer til produkt nr. 12 i efterfølgende eksempel 3 med formlen: «— oso 2 coo" r"°s03 NHS03 oh nhso“ OS03

Andre uorganiske anioner kan, såsom phosphatgruppen, være til stede i stedet for sulfatgrupperne.

25 DK 174284 B1 6

En anden familie y af tetrasacchariderne, som er foretrukket, især på grund af sin fibrinolytiske aktivitet, indeholder en substituent R2, som betegner et hydrogenatom.

5

Tetrasaccharider af denne type indeholder med fordel sulfatgrupper for mindst visse af de andre substitutioner Ri og/eller Ni og N2. Et tetrasaccharid af denne gruppe svarer til formlen: oso^ coo ~ pO.SO 3 Η0ο^^ο4ΐ^01' <ivi nhS03 oh NHSo: OSO~ 10 3 3

Ligesom det er tilfældet i familien x, indeholder produkterne med fordel i stedet for en eller flere sulfatgrupper eller i stedet for det samlede antal af disse grupper andre uorganiske anioner, såsom phosphatanioner.

15 I de forskellige typer af tetrasaccharider, som er fremhævet i ovenstående, foreligger de forskellige uorganiske anioner og carboxylsyregrupper med fordel i form af salte med en uorganisk kation, især en metalkation, ganske særlig en alkalisk kation, såsom natrium, magnesium eller calcium, eller en kat-20 ion af ledt af en nitrogenholdig organisk base, såsom triethylammonium.

Man kan med fordel fremstille tetrasacchariderne ifølge opfindelsen ved hjælp af den i det følgende beskrevne syntesefremgangsmåde.

25 Man omsætter i overensstemmelse med den mest almene definition på denne fremgangsmåde to forbindelser bestående af eller henholdsvis afsluttet 7 DK 174284 B1 med komponenter med D-glucosamin-struktur, og med D-glucuron-syrestruktur eller L-iduronsyrestruktur.

Den ene af komponenterne aminosukkerart eller uronsyre består af en alko-5 hol, hvori OH-gruppen i alkoholfunktionen indtager stillingen 4. Den anden komponent besidder så et aktiveret, anomert carbonatom, dvs. indbefattende en reaktionsdygtig gruppe, som er i stand til med OH-gruppen i alkoholen at etablere den ønskede -O-glycosyleringsbinding, i overensstemmelse med den ønskede stereokemiske konfiguration til dannelse af en sekvens amino-10 sukkerart-uronsyre eller omvendt.

De grupper, der befinder sig på de komponenter, som tages i brug for at danne tetrasaccharidske kæde, bør især svare til følgende krav: 15 den reaktionsdygtige gruppe i aminosukkerartkomponenten eller uronsyre-komponenten bør være forligelig med de beskyttelsesgrupper og/eller funktionsdygtige grupper, der befinder sig på komponenterne; beskyttelsesgrupperne for OH-grupperne og eventuelt aminogrupperne eller 20 carboxylsyregrupperne bør være forligelige indbyrdes og med de grupper, som er udgangsforbindelser for aminogrupperne eller carboxylsyregrupperne, når disse er til stede; beskyttelsesgrupperne og udgangsforbindelserne bør være inerte over for 25 glycosyleringsreaktionen og i forhold til de reaktionsdygtige grupper, hvilket gør det muligt at placere under de senere behandlinger de givne substituen-ter på de forskellige placeringer og om ønsket på sekventiel måde.

Glycosyleringsreaktionen gennemføres på en sådan måde, at den ikke ænd-30 rer strukturen af komponenterne j disse produkter eller arten af de forskellige tilstedeværende substituenter.

DK 174284 B1 8

Det ovenfor beskrevne glycosyleringstrin gentages på en sådan måde, at man opnår den ønskede længde af kæden.

5 For at kunne gennemføre denne forlængelse af glucidinskelettet gør man derpå brug af aminosukkerartkomponenter eller uronsyrekomponenter, som indbefatter midlertidige beskyttelsesgrupper, dvs. grupper, som er i stand til selektivt at blokere en stilling i aminosukkerartkomponenten eller uronsyre-komponenten, som er bestemt til at indgå i en ny glycosyleringsreaktion. Det 10 drejer sig om grupper, der lader sig fjerne i nærvær af andre grupper, der foreligger på komponenterne, under gendannelse af en alkohol.

Efter tildannelsen af det ønskede glucidinskelet underkaster man den således dannede kæde en eller flere kemiske reaktioner med det formål at indfø-15 re en given type funktionelle grupper eller successivt flere typer af grupper, hvorpå man danner, hvis dette er ønsket, derivater af disse funktionelle grupper.

For at indføre specifikke substituenter, dvs. bestemte substituenter i fastlagte 20 stillinger, anvender man med fordel udgangsforbindelser indeholdende flere typer af beskyttelsesgrupper, nemlig (1) en eller flere semi-permanente grupper og (2) en eller flere permanente grupper.

De semi-permanente grupper lader sig fjerne i første omgang og gør det mu-25 ligt at indføre de ønskede funktionelle grupper i de stillinger, som de har indtaget. De permanente grupper er derimod i stand til at opretholde beskyttelsen af OH-grupperne under indføringen af funktionelle grupper i placeringerne for de semi-permanente grupper.

30 Udgangsforbindelserne af aminosukkerart-typen indeholder derudover i 2-stillingen en nitrogenholdig gruppe, som gør det muligt at opretholde tilstede- 9 DK 174284 B1 værelsen af en nitrogenholdig funktionsdygtig gruppe under iværksættelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Denne nitrogenholdige gruppe består fortrinsvis af grupper, såsom N3 eller -NHCOO-CH2-C6H5 eller en hvilken som helst anden gruppe, som udgør en precursor for aminogruppen eller for 5 et aminogruppederivat, især -NHSO3eller -NH-acyl, især -NH-COCH3.

Med hensyn til carboxylsyregrupperne i uronsyrekomponenten er disse blokeret med grupper, som er inerte over for de reaktioner, der tages i brug, ved udskiftningen af beskyttelsesgrupperne og lader sig fjerne ved syntesens 10 afslutning til frigivelse af carboxylsyregrupperne, eventuelt ved afslutningen af saltdannelsen. Disse beskyttelsesgrupper for carboxylsyregruppen vælges med fordel blandt alkylgrupper eller arylgrupper.

Disse behandlinger anvendes for at fremstille oligosacehariderne ifølge op- 15 findelsen.

Ved en foretrukken fremgangsmåde til opnåelsen af sekvensen DEFG omsætter man med fordel et halogenid, mere specielt bromidet, af et saccharid med strukturen EF, hvis syntese er beskrevet i den tidligere omtalte patent-20 ansøgning med en alkohol med en gentagelsesgruppe af strukturen G.

Disaccharidet EF indbefatter en midlertidig gruppe i 4-stillingen af komponenten E. Denne gruppe vælges med fordel blandt acylgrupper, især acetyl- eller chloracetylgruppen.

25

Kondensationsreaktionen gennemføres i et opløsningsmiddelmedium, især et organisk opløsningsmiddel særligt af typen dichlormethan eller dichlo-rethan.

30 Man anvender med fordel en katalysator,! almindelighed et sølvsalt eller et kviksølvsalt, fx sølvtrifluormethansulfonat, som i almindelighed betegnes som DK 174284 B1 10 sølvtriflat, sølvcarbonat, sølvoxid, mercuribromid eller mercuricyanid. Man anvender ligeledes en protonacceptor, såsom symcoilidin såvel som et middel til opfangelse af det vand, som eventuelt er til stede og/eller opfangelse af den dannede hydrogenhalogenidsyre, fx en molekylærsigte 4Å.

5

En undersøgelse af reaktionsbetingelserne viser, at det er passende at arbejde ved omgivelsernes temperatur eller ved en lavere temperatur, som kan nå ned på 0°C eller endnu lavere, under en atmosfære af en inert gas, såsom nitrogen eller argon.

10

Efter dannelsen af den trisaccharidiske kæde med strukturen EFG fjernes den temporære gruppe på komponenten E i overensstemmelse med klassiske fremgangsmåder til genskabelse af -OH-gruppen. Denne sidstnævnte involveres så i en glycosyleringsreaktion med halogenidet, især med bro-15 midet, af komponenten med strukturen D.

For mere specielt at fremstille tetrasaccharider med formlen (II a), hvori Ri betegner en sulfatgruppe, R2et hydrogenatom og Ni, og N2er identiske og repræsenterer sulfoaminogrupper, anvender man udgangsmaterialer inde-20 holdende følgende grupper.

Beskyttelsesgrupperne for -OH-grupperne i disse forskellige komponenter beregnet til at blive sulfateret er beskyttet med acylgrupper, især acetylgrupper, medens OH-grupperne, der er beregnet til at blive frigivet ved syntesens 25 afslutning, er beskyttet med en permanent gruppe, såsom benzylgruppen.

2-stillingeme i aminosukkerart-komponenterne substitueres med grupper, såsom N3 eller NH-COO-CH2-C6H5, og 6-stillingerne i uronsyrekomponenter-30 ne indtages af carboxylsyregrupper, som er beskyttet med en alkylgruppe, især med en methylgruppe.

11 DK 174284 B1

Trinnet til funktionalisering af den dannede tetrasaccharidiske kæde, dvs. til sekventiel indførelse af specifikke substitutioner, gennemføres nu analogt med fremgangsmåden beskrevet i den tidligere nævnte danske patentan-5 søgning 143/83.

Disse reaktionsbetingelser gør det muligt at gennemføre funktionaliserings-trinnet, for eksempel på følgende måde: 10 Man indfører først og fremmest selektivt sulfatgrupperne efter at have fjernet -O-acetylgrupperne, som er anvendt til blokeringen. Denne reaktion gennemføres på en sådan måde, at man ikke influerer på de tilstedeværende benzylgrupper og nitrogenholdige grupper og carboxylsyregrupper.

15 Med henblik herpå gennemfører man med fordel en forsæbningsreaktion ved hjælp af en stærk base, såsom natriumhydroxid.

Denne reaktion gennemføres fortrinsvis ved en temperatur lavere end omgivelsernes temperatur, mere specielt i nærheden af 0° C.

20

Man underkaster det derved opnåede reaktionsprodukt hydrolyse ved indvirkning af et alkyleringsmiddel for at indføre på carboxylsyregrupperne de beskyttende alkylgrupper, som er blevet fjernet under hydrolysen.

25 Ved reaktion med et sulfateringsmiddel opnår man først indføringen af sulfatgrupperne i de ved hydrolysen frigivne stillinger, som er blevet efterladt frie efter indvirkningen af alkyleringsmidlet.

De til gennemførelsen af sulfateringen tilfredsstillende reaktionsbetingelser 30 indbefatter anvendelsen af et sulfateringsmiddel, såsom et kompleks af tri-methylamin/SOy.

> * DK 174284 B1 12

Denne reaktion gennemføres med fordel i et opløsningsmiddel, såsom di-methylformamid. Man arbejder fortrinsvis ved en temperatur højere end omgivelsernes temperatur, i almindelighed ved 50°C, hvilket svarer til en reakti-5 onstid på ca. 12 timer.

Efter indføringen af sulfatgrupperne på alkohol-komponenten fortsætter man frigivelsen af OH-gruppeme, som er blokeret med benzylgrupper.

10 Fjernelsen af benzylgrupperne gennemføres med fordel ved katalyseret hydrogenering under betingelser, som er forligelige med opretholdelsen af sulfatgrupperne og med omdannelsen af de nitrogenholdige grupper til funktionelle aminogrupper.

15 Man arbejder fortrinsvis under et hydrogentryk og i nærvær af en katalysator af typen Pd/C.

Denne reaktion gennemføres med fordel i et organisk opløsningsmiddelmedium, især i et alkoholisk medium tilsat vand.

20

For at opnå hydrogeneringen af de nitrogenholdige grupper, der optræder som precursorer, og fjernelsen af de grupper, som er beskyttelsesgrupper for -OH-grupperne, gennemføres reaktionen med fordel med en varighed på ca.

3 - 4 dage.

25

De funktionelle aminogrupper foreligger, som det allerede er anført, i form af derivater af typen N-acetyl eller N-sulfat i de i betragtning kommende biologisk aktive molekyler.

DK 174284 B1 13

For at danne N-acetyl-grupper underkaster man reaktionsproduktet kommende fra hydrogeneringsreaktionen indvirkning af et acetyleringsmiddel. I den forbindelse udgør eddikesyreanhydrid især et særligt egnet middel.

5 For at gennemføre den selektive acetyleringsreaktion uden at indvirke på de andre substituenter, som foreligger på komponenterne, er det især ønskeligt at arbejde ved basisk pH, isæn i nærheden af værdien 8 i vandigt medium.

Man kan ligeledes ønske at danne N-sulfat-grupper, hvilket kan gennemføres 10 ved hjælp af et sulfateringsmiddel af den ovenfor angivne type. pH-værdier større end 9, med fordel i størrelsesordenen 9-10, anvendes til sulfateringen.

Efter sulfateringsreaktionen gør tilsætningen af en stærk base det muligt at frigive carboxylsyregrupperne.

15

De således dannede reaktionsprodukter kan let omdannes til salte ved hjælp af passende kationbytterharpikser. I de naturlige produkter udgøres kationen især af natron. Man anvender således med fordel natiurnkationbytterharpik- ser.

20

Man kan ligeledes danne salte af kalium, lithium, magnesium eller calcium.

Man anvender så en protonbytterharpiks, hvorpå man neutraliserer den således dannede syre med den pågældende kations base.

25 Undersøgelsen af de farmakologiske virkninger af tetrasaccharideme ifølge opfindelsen har gjort det muligt at påvise deres interesse inden for terapien.

De udøver især en aktivitet på fibrinolysen, idet de forøger indholdet af cirkulerende aktivator for plasminogen og sensibiliserer blodkoagel over for lyse.

30 DK 174284 B1 14

Man har gennemført undersøgelser på forskellige eksperimentelle modeller i overensstemmelse med den teknik, som er beskrevet af Vairel et al. i Ann. Pharmaceutiques frangaises, 1983, 41, nr. 4, side 339—353.

5 Man iagttager således 15 minutter efter injektion ad intravenøs vej på kaniner (anæstesi 20 minutter før indgift) af 0,25 mg oligosaccharider pr. kg en forøgelse af indholdet af aktivator for plasminogen i det cirkulerende blod.

Med for eksempel tetrasaccharidet DEFG med formlen (III) iagttager man en 10 gennemsnitlig forøgelse af områderne for lyse på 17,80, medens man med fysiologisk saltvandsopløsning, der anvendes som kontrolsubstans, bemærker en formindskelse på 0,5.

Undersøgelser gennemført med tetrasaccharider ifølge opfindelsen, i hvilke 15 komponenten med strukturen F indeholder en -S03.gruppe i 3-stillingen, har vist en anti-Xa-aktivitet, som klart er større end aktiviteten af heparin, og en kraftig affinitet over for AT—III. I tilfælde for eksempel af tetrasaccharidet med formlen (III) (produkt nr. 11) er anti-Xa-aktiviteten målt med et homogent substrat 600 enheder anti-Xa/mg (metodik efter Teien A.M. og Lie modifice-20 ring, Thrombosis Research nr. 10,937,388—410)

Den terapeutiske effektivitet af de pågældende produkter er blevet undersøgt med veldefinerede dyremodeller for at fastlægge deres anti-thrombose-evner under kendte patologiske betingelser.

25

Man opnåede følgende resultater med modellen for modificeret stasis hos kaniner (se Thromb. og Hemost. 46, (1) 117,1981 af Andersen et al.).

Man indgav i kaniner intravenøst 50 ug/kg af produktet opløst i en saltopløs-30 ning (i en mængde på 100 pg/kg) 5 minutter før tilførsel af et thrombogent middel. Det thrombogene middel bestod enten af kaninserum eller af midlet DK 174284 B1 15 PCC/RW (koncentrat af et kompleks af prothrombin og hugormegift (Rup-per)). Staserne i venstre og højre halsvener blev gradbedømt på en skala fra Otil 10.

5 Man iagttager en fuldstændig beskyttelse (bedømmelsen 0) over for virkningerne af thrombogener indført med kaninserum og en delvis beskyttelse over for det throinbogene middel PCC/RW (bedømmelsen 5), idet kontroldyrene viste en bedømmelse på 10.

10 Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen, i hvilke komponenten med strukturen F indeholder i 3-stillingen en OH-gruppe, synes ikke at besidde aktivitet over for Xa-faktoren, og de udviser således en meget større specificitet end den gruppe oligosaccharider, som har en S03-gruppe i 3-stillingen i komponenten med strukturen F, over for den fibrinolytiske aktivitet.

15

De toxikologiske undersøgelser af produkterne ifølge opfindelsen har vist deres uskadelighed, hvilket gør dem værdifulde ved fremstillingen af lægemidler.

20 Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen kan anvendes i farmaceutiske formuleringer og især farmaceutiske præparater, som er fri for pyrogene substanser, og som indeholder en effektiv mængde af de aktive bestanddele i kombination med farmaceutiske ekscipiens, 25 Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen er især anvendelige i sådanne præparater, i hvilke den farmaceutisk bærer er egnet til peroral indgift. Indgivnings-former, som er egnede til peroral indgift, kan med fordel være gastro-resistente gelatinekapsler, sammenpressede pulvere eller tabletter, piller, eller forbindelserne kan foreligge i form af liposomer.

30

Andre farmaceutiske præparater indeholder disse tetrasaccharider i kombi nation med ekscipiens, som er egnet til indgift gennem rectum. Tilsvarende indgiftsformuleringer består af suppositorier.

DK 174284 B1 16 5 Andre indgivningsformer består af aerosoler eller pomader.

Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen kan ligeledes anvendes i farmaceutiske præparater til injektionsbrug, som er sterile, eller som kan steriliseres, til indgift, enten intravenøst eller intramuskulært eller subkutant. Disse opløs-10 ninger indeholder med fordel produkter af familien x i en mængde på 1.000 - 100.000 enheder μ (Yin-Wessler)/ml oligosaccharider, fortrinsvis 5.000-50.000, f.eks. 25.000 μ/ml, når disse opløsninger er beregnet til indsprøjtning subkutant. De kan f.eks. indeholde 500-10.000, især 5.000 μ/ml oligosaccharider, når de er beregnet til indsprøjtning intravenøst eller til perfundering.

15 Sådanne farmaceutiske præparater foreligger med fordel i form af engangs-sprøjter, som er klar til anvendelse.

Ligeledes kan farmaceutiske præparater indeholdende de omtalte tetrasac-20 charider i kombination med andre aktive bestanddele.

De farmaceutisk præparater indeholdende tetrasacchariderne ifølge opfindelsen er især egnet til regulering (forebyggende eller kuratit) af visse trin i blodets koagulering i mennesker eller dyr, især i det tilfælde, hvor patienten 25 er underkastet risiko for hyperkoaguleringsevne, især som et resultat af kirurgiske indgreb, atheromatoseprocessen, udviklingen af tumorer, forstyrrelser af koagulationen gennem bakterieaktivatorer eller enzymatiske aktivatorer etc.

30 Til belysning af opfindelsen skal i det følgende angives et eksempel på poso-logi, som er anvendelig hos mennesker, i forbindelse med produkterne tilhø- 17 DK 174284 B1 rende familien x: Denne posologi omfatter f.eks. indgift til patienten af 1.000- 25.000 enheder μ (Yin og Wessler) subkutant, en til tre gange om dagen, afhængigt af niveauet for risikoen for hyperkoaguleringsevne eller den throm-botiske tilstand hos patienten, eller fra 1.000 til 25.000 μ/24 timer ved 5 intravenøs indgift, ved diskontinuert indgift med regelmæssige intervaller eller kontinuert ved hjælp af perfusion, eller også 1.000-25.000 μ (tre gange om ugen) ved intramuskulær eller subkutan indsprøjtning (disse indhold er angivet i Yin-Wessler-enheder). Disse doseringer kan naturligvis reguleres for hver enkelt patient som funktion af resultaterne og af de forinden gennem-10 førte blodanalyser, og af arten af de lidelser, som patienten lider af, og i al almindelighed af patientens sundhedstilstand.

Når det drejer sig om produkter af familien y, indgiver man 1-100 mg/dag, afhængigt af patientens tilstand og af den anvendte farmaceutiske form.

15

Udover de farmaceutiske præparater indeholdende tetrasaccharideme, som de foreligger, kan farmaceutiske præparater ligeledes indeholde mindst ét oligosaccharid som ovenfor defineret, som er konjugeret med en kovalent binding til et opløseligt bærestof eller til et uopløseligt bærestof, med fordel 20 ved hjælp af en sukkerart med endestillet reducerende gruppe.

Foretrukne konjugater fikseret til opløselige bærestoffer består især af tetra-saccharider AT-lll-konjugater indeholdende en sekvens DEFG med formlen (II a), især en sulfatgruppe. Sådanne produkter udgør særligt interessante 25 lægemidler til forebyggelse af thromboser, når det drejer sig om AT-lll-mangeltilstande.

Andre foretrukne konjugater med opløselige bærestoffer udgøres af tetra-saccharider med den almene formel (II a), der er fikseret til et bærestof, så-30 som et protein, især polylysin eller bovint serumalbumin.

DK 174284 B1 18

Disse produkter er anvendelige som immunogene substanser, der i sig selv er kilde til antistof-cirkulationsprodukter in vivo, eller som monoclonale antistoffer, som er klonede in vitro ved hjælp af en passende teknik.

5 De omhandlede tetrasaccharider er ved andre foretrukne konjugater bundet til uopløselige bærestoffer. Man vil her med fordel anvende de klassiske bærestoffer. Disse konjugater lader sig anvende som irnmunosorbenter, fx ved en højt specifik oprensning af AT-III samt ved bestemmelse heraf, eller til fremstilling af thrombotiske polymere, der er forligelige med blod, ved fikse-10 ring af oiigosaccharideme på biologisk forligelige polymere, når de indeholder en sekvens DEFG i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne familie x.

Tetrasacchariderne ifølge opfindelsen kan ligeledes anvendes inden for 15 nuclear-medicinen som radio—farmaceutiske produkter. Disse produkter markeres i så fald ved hjælp af en trecer, valgt blandt sådanne, som almindeligvis anvendes inden for dette område, især ved hjælp af technetium 99 m.

20 Med henblik herpå omdanner man technetium 99 m, som er opnået ud fra kommercielt tilgængelige generatorer i form af ikke-reaktionsdygtige natrium-pertechnetat med valensen 7 til technetium, som er reduceret i valens til 4, hvilket er den mest reaktionsdygtige form for technetium. Denne omdannelse gennemføres med et reducerende system, som dannes ud fra tinsalte (stan-25 nochlorid), jernsalte (ferrosulfat), titansalte (titantrichiorid) eller andre salte.

I langt de fleste tilfælde er denne simple reduktion af technetium tilstrækkelig til, at man under de fastlagte pH-betingelser kan gennemføre fiksering af technetium på det pågældende molekyle.

30 DK 174284 B1 19

Man kan anvende de omhandlede forbindelser, som på en vis måde udgør et bærestof, ved målinger i størrelsesordenen 100 - 200 enheder μ Yin— Wessler.

5 Ved videreudvikling af disse radio-farmaceutiske reaktionskomponenter kan man gå frem i overensstemmelse med den metode, som er angivet af P.V.

Kulkarni et al. i The Journal of Nuclear Medicine 21, nr. 2, side 117—121.

Man anvender med fordel de således mærkede produkter ved afprøvninger 10 in vivo til påvisningen af og diagnostiseringen af omfanget af thromboser og af thrombotiske til stande.

De omhandlede tetrasaccharider kan ligeledes anvendes til bestemmelsen af specificiteten i talrige enzymsystemer, som er involveret i glucosaminglucu-15 ronglycanernes metabolisme.

De efterfølgende eksempler belyser andre fordelagtige karakteristika knyttet til forbindelserne ifølge opfindelsen og fremgangsmåden til fremstilling deraf.

Der henvises til figurerne 1 - 5, som belyser de produkter, der anvendes ved 20 de beskrevne synteser.

I disse figurer anvendes formlernes nummereringer på samme måde som i eksemplerne til beskrivelse af ensartede produkter.

25 I de pågældende formler anvendes følgende forkortelser:

Ac — acetyl Me - methyl Bn - benzyl 30 Lev - lævinyl MCAO - monochloracetyl og DK 174284 B1 20 Z - benzyloxycarbonyl.

EKSEMPEL1 5 Fremstilling af trisaccharid nr. 3 med strukturen EFG, dvs. benzyl-0-[methyl- 2,3-di-0-benzyl-4-0-chloracetyl-p-D-glucopyranosyluronat- (1 -*4)-0-(3,6-di- 0-acetyl-2-azido-2-desoxy-a-D-glucopyranosyl)-(1—4)-O-[methyl-2-0-acetyl- 3-O-benzyl-a-L-idopyranosiduronat] 10 Man gennemfører syntesen af trisaccharid nr. 3 ved kondensation mellem et halogenid med strukturen EF og en alkohol med strukturen G. Disse reaktionskomponenter er nummereret henholdsvis 1 og 2 i beskrivelsen.

Dette kondensationstrin gennemføres som følger: 15

Man omrører ved 20 °C i nærvær af en pulverformig molekylarsigte 4 Å i pulverform en opløsning af 738 mg (0,92 mmol) af halogenidet 1 og 428 mg (1 mmol) af alkoholen 2 i 15 ml vandfrit dichlorethan. Derpå tilsættes 150 ml collidin og derpå 262 mg (10 mmol) sølvtriflat. Reaktionsblandingen fortyndes 20 efter 1 time ved -20°C med dichlormethan, hvorpå den filtreres. Den organiske fase vaskes med 10% KHS04i vand, tørres (Na2S04) og opkoncentreres derpå til tørhed. Det opnåede skum (1,07 g) kromatograferes over silicagel (toluen/ethylacetat; 4/1; v/v), hvilket fører til det rene trisaccharid 3 (699 mg; 63%) i form af et hvidt skum.

25 [cz]d: +25° (c 1,4; chloroform).

EKSEMPEL 2 30 Fremstilling af et tetrasaccharid nr. 6 med strukturen DEFG, dvs. benzyl-O-(6-0-acetyl-2-azido-3,4-di-O-benzyl-2-des-oxy-a-D-glucopyranosyl)-(1 —4)-0- DK 174284 B1 21 [methyl-2,3-di-0-benzyl-p-D-glucopyranosyluronat]-(1 -4)-0-(3,6-di-0-acetyl- 2-azido-2-desoxy-a-D-glucopyranosyl)-(1-*4)-0-(methyl-2-O-acetyl-3-O- benzyl-a-L-idopyranosiduronat).

5 Denne syntese gennemføres ved kondensation af et halogenid 5 med strukturen D og en alkohol 4 svarende til trisaccharidet 3, hvori OH-gruppen i 4-stillingen af komponenten E er blevet afblokeret.

Man beskriver altså successivt: 10 (a) opnåelse af trisaccharidet 4 ud fra trisaccharidet 3 fremstillet som beskrevet i eksempel 1, (b) kondensationen af 4 med halogenidet 5.

15

Trin a: 669 mg (0,55 mmol) af trisaccharidet 3 fremstillet som beskrevet i eksempel 1 opløses i en blanding af 3,8 ml lutidin og 1,25 ml eddikesyre. Derpå til-20 sættes methanol efterfulgt af en opløsning af hydrazindithiocarbonat opnået gennem den metode, som er beskrevet af Boeckel og Beetz i Tetrahedron letters 24 (1983) 3775-3778. Efter 2 timer ved omgivelsernes temperatur fortyndes opløsningen ved tilsætning af 200 ml dichlormethan, hvorpå den vaskes (mættet NaHCCb og vand; 10% KHSO4 i vand), tørres (Na2S04) og op-25 koncentreres til tørhed. Det rene reaktionsprodukt (530 mg; 83%) opnås efter kromatografi over silicagel (toluen/ethylacetat; 2/1; v/v).

Icc]d: -29° (c 1,29; chloroform).

30 Elementæranalyse for C54H11O20N3: < DK 174284 B1 22

Beregnet: C 60,50 - H 5,74 N 3,92 Fundet: C 60,46 - H 5,74 - N 4,11.

Trin b: 5

Man behandler en opløsning af 494 mg (0,455 mmol) af alkoholen 4 i dich-lormethan og af 1,096 g (2,2 mmol) af halogenidet 5 med 632 mg sølvtriflat i nærvær af 360 μΙ symcollidin, som det er beskrevet i forbindelse med syntesen af forbindelsen 3. Efter rensning over en søjle af silicagel (gradient 10 chloroform -* chloroform/ethylacetat; 20/1; v/v) opnår man det rene derivat 6 (575 mg; 89%).

[οφ: +43° (1,27; chloroform) 15 Elementæranalyse for C76H84O24N6:

Beregnet: C 61,61 - H 5,71 - N 5,67 Fundet: C 61,57 - H 5,76 - N 5,61.

20 EKSEMPEL 3

Fremstilling af tetrasaccharidet nr. 11 med strukturen DEFG, dvs. 0-(2-desoxy-6-O-sulfo-2-sulfamido-a-D-gluco-pyranosyl)-(1 -4)-25 0-(P-D-glucopyranosyluronat)-(1-*4)-0-(2-desoxy-3,6-di-0-sulfo-2-sulfamido-a-D-glucopyranosyl)-(1-4)-0-2-0-sulfo-a-L-idopyranuronat, octanatriumsalt.

Man opnår dette tetrasaccharid ved sekventiel afblokering af OH-grupperne og indføring af de ønskede grupper på tetrasaccharidet 6 fremstillet som be-30 skrevet i eksempel 2.

DK 174284 B1 23 Følgende successive trin tages i brug: 1 - frigørelse af OH—grupperne, som er blokeret med acetylgrupper; 5 2 - dannelse af natriumsaltene af sulfatgrupperne; 3 - dannelse af natriumsaltene af carboxylsyregrupperne; 4 - Frigørelse af OH-grupperne, som er blokeret med benzylgrupper, og 10 omdannelse af azidogrupperne til aminogrupper; 5 - esterificering af aminogrupperne.

Disse trin gennemføres som følger: 15 1 - Overførsel af -OAc til -OH førende til tetrasaccharidet 7.

Man opløser 0,340 g af derivatet 6 fremstillet som beskrevet i eksempel 2 i en blanding af 30,6 ml methanol, 3,5 ml chloroform og 4,25 ml vand. Derpå 20 tilsættes 4,25 ml 5-N hydroxidopløsning. Efter 4 timer ved omgivelsernes temperatur tilsætter man 90 ml chloroform og derpå 8 ml 8N saltsyre. Efter dekantering frasepareres chloroformfasen. Den vandige fase vaskes med chloroform (3x10 ml). Chloroformfaseme samles og tørres (Na2S04). Den efter opkoncentration til tørhed opnåede inddampningsrest methyleres med 25 diazomethan, hvorpå den kromatograferes over en silicagelsøjle, idet man eluerer med en gradient (dichlormethan — dichlormethan/ ethylacetat; 1/1; v/v). Man opnår forbindelsen 7 (0,173 g; 57%).

[ci]d: 14° (c 1; chloroform).

Elementæranalyse for CeøHreOaiNe, 0,5 H2O

30 DK 174284 B1 24

Beregnet: C 61,68 - H 5,93 - N 6,34 Fundet: C 61,62 - H 5,84 - N 6,31.

5 2 - Overførsel af -OH til -Q-SQsNa førende til tetrasaccaridet nr. 8

Man opløser 117 mg (0,068 mmol) af forbindelsen 7 i 3 ml vandfrit dimethyl-formamid, hvorpå dette sulfateres natten over ved 50°C i nærvær af 123 mg trimethylamin/ S03. Reaktionsblandingen fortyndes derpå ved tilsætning af en 10 blanding af methanol/chloroform (1/1; v/v; 3 ml), hvorpå der kromatograferes over en kolonne af “Sephadex LH 20", som er bragt i ligevægt i chloro-form/methanol (-1/1; v/v). Det således opnåede reaktionsprodukt anvendes direkte til fremstillingen af 9.

15 3 - Overførsel af COOMe til COONa førende til tetrasaccharidet nr, 9

Man opløser 357 mg (0,207 mmol) af forbindelsen 8 i en blanding af 8 ml methanol og 2 ml vand, hvorpå man tilsætter 1,2 ml 5N natriumhydroxid. Efter 3 timers omsætning lader man reaktionsblandingen passere gennem en 20 kolonne af harpiksen “Dowex 50 - H+M som er bragt i ligevægt med en blanding af ethanol/vand (8/2; v/v). Eluatet bringes til at passere gennem en søjle af "Dowex 50 - Na+", som er bragt i ligevægt med det samme opløsnings-ningsmiddel. Efter inddampning til tørhed opnår man reaktionsproduktet 9 i ren tilstand (0,267 g) efter en kromatografering over en silicagelsøjle (30 g; 25 ethylacetat/ pyridin/eddikesyre/vand; 160/77/19/42; v/v/v/v), efterfulgt af en passage over en ionbytter “Sephadex SPC 25” (18 g), som er bragt i ligevægt med Na+-formen i en blanding methanol/vand (8/2; v/v).

[oi]d: 5,50 (1,025; methanol).

30 DK 174284 B1 25 4 - Overførsel af OBn til -OH og af -N^ til -NH? førende til tetrasaccharidet nr. 10

Man opløser 256 mg (0,147 mmol) af forbindelsen 9 i en blanding metha-5 nol/vand (9/1; v/v; 10 ml), hvorpå man hydrogenerer i nærvær af en katalysator (Pd/C 10%; 130 mg) i 5 dage. Katalysatoren erstattes med frisk katalysator, hvorpå reaktionen fortsættes i 4 dage. Produktets UV-spektrum viser så fraværet af benzylerede derivater. Det opnåede produkt (0,17 g) overføres direkte til præparationen af forbindelsen nr. 11 10 5 - Overførsel af -NH? til -NHSCKNa førende til tetrasaccharidet nr. 11

Man sætter lidt efter lidt til en opløsning af 9,17 g (0,152 mmol) af forbindelsen 10 i 10 ml vand 140 mg (0,75 mmol) af komplekset pyridin/S03, idet man 15 opretholder pH ved 9,5 ved tilsætning af 2M-natriumhydroxid. En fornyet tilsætning af det sulfaterende kompleks foretages efter 1 times forløb (70 mg) og efter en nats forløb (70 mg). Reaktionsblandingen anbringes derpå på toppen af en kolonne af “Sephadex G 50" (300 x 2,5 cm), som er elueret med 0,2M natriumchlorid. Reaktionsproduktet absorberes derpå på toppen af en 20 kolonne af harpiksen "Biore AG 1 x 2" (1,6 x 10 cm) på Na+-formen elueret med en gradient af natriumchlorid (0,5M - 3M). De fraktioner, som indeholder reaktionsproduktet, samles.

Saltene fjernes ved kromatografi over "Sephadex G-25" (100 mg). Til sidst 25 lyofiliseres reaktionsproduktet (111 mg; 54%).

[a]D: + 46 (c 0,85; vand).

Man opnår, idet man tager i brug i de ovenfor beskrevne behandlingstrin en 30 komponent G indeholdende en -OCH3 i stedet for en -OBn-gruppe ved det anomere oarbonatom, tetrasaccharidet nr. 12.

DK 174284 B1 26 I den efterfølgende tabel er anført betydningerne af substituenterne A^. A5 med formlen 5, som er vist på fig. I for forbindelserne 6-12.

Αι A2 A3 A4 A5 6 Ac Bn Na Me Bn 7 H »Bn Na Me Bn 8 SOaNa Bn N3 - Me Bn 9 SOaNa Bn Na Na+ Bn

10 S03Na H NH2 Na+ H

11 SOaNa H NHSOaNa Na+ H

12 SOaNa H NHSOaNa Na+ CH3 5 NMR 1H for tetrasaccharidet ifølge opfindelsen er vist på fig. 5 i den nederste del. I den øverste del er til sammenligning anført NMR-spektre af det tilsvarende pentasaccharid indeholdende en 0SO3-gruppe i 3-stillingen i komponenten F. Man tilskriver signalet ved 5,51 ppm, som er iagttaget ved DEFGH 10 indeholdende OSO33 -gruppen, komponenten F i 3-stillingen ved den ano-mere proton i gentagelsesgruppen glucosamin-3-O-sulfat. Dette signal er forskudt til ca. 5,45 ppm ved den tilsvarende komponent F i ikke-sulfateret tilstand, og den overlejrer det tilsvarende signal fra komponenten H.

15 27 DK 174284 B1 NMR-spektralanalysekarakteristika for det til sammenligning anvendte penta-saccharid DEFGH er som følger: 1H-NMR: i D2O i forhold til TSP intern;

Komponent D; 5,64 (H-l) 3,30 (H-2) 3,63 (H-3) 3,57 (H-4) 3,90 (H-5) 4-4,5 (H-6,6).

Komponent S: 4,62 (H-l) 3,40 (H-2) 3,87 (H-3).

Komponent P: 5,45 (H-l) 3,25-3,30 (H-2).

Komponent G: 5,24 (H-l) 4,33 (H-2) 4,20 (H-3) 4,11 (H-4) 4,81 (H-5).

Komponent H: 5,44 (H-la) 4,70 <H-1&) 3,25 (H-2a) 3,05 (H-20) 3,69 (H-3) 3,79 (H-4).

5

Claims (3)

1. Tetrasaccharider, kendetegnet ved, at de har strukturen DEFG med den almene formel 5 QRj_ coo' ORj lla i'j os, n2 i:'Aj hvori grupperne R^ som er ens eller forskellige, betegner en uorganisk anion, især en sulfatgruppe eller en phosphatgruppe, 10 R2 har en af de for R} anførte betydninger, eller betegner et hydrogenatom, Ni og N2, som er ens eller forskellige, betegner -NH2, en sulfoaminogruppe, en phosphoaminogruppe eller -NH-COR3, hvori R3 betegner en alkylgruppe, 15 og salte deraf, fortrinsvis sådanne, for hvilke substituenten R2 i 3-stillingen i komponenten F betegner en uorganisk anion, især en sulfat-gruppe, og for hvilke en, flere eller alle substitutionerne R2, Ni og/eller N2 indbefatter en sulfatgruppe. 20

2. Tetrasaccharid ifølge krav 1 med formlen: p-OSOj coo' / °\ / °\/· / T°\ /“*°\ (oh /qAox / 9^,so3/qA^S0'^·°η æa: NKS03 Ofi NHS03 OS03 DK 174284 B1 29

3. Tetrasaccharider ifølge krav 1,kendetegnet ved, at substituenten R2 i 3-stillingen i komponenten (F) betegner et hydrogenatom, og at i det mindste visse af de andre substitutioner R-i, Ni og/eller N2 indbefatter en sulfat-gruppe. 5