DK174459B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid Download PDFInfo
- Publication number
- DK174459B1 DK174459B1 DK200100933A DKPA200100933A DK174459B1 DK 174459 B1 DK174459 B1 DK 174459B1 DK 200100933 A DK200100933 A DK 200100933A DK PA200100933 A DKPA200100933 A DK PA200100933A DK 174459 B1 DK174459 B1 DK 174459B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- arg
- lys
- ser
- pro
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 61
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title abstract description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 7
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 title description 4
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 title description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 4
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 claims description 3
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 claims description 3
- NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N Ala-Ser-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 2
- IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N Asp-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N 0.000 claims description 2
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2,5-diamino-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N 0.000 claims 1
- YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N Asn-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 34
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 12
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 abstract description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101150001535 SRC gene Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101150078498 MYB gene Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 4
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 4
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 4
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000009237 prenatal development Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 108700026239 src Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 2
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 2
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 108091008816 c-sis Proteins 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 108700021654 myb Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 208000036652 Adenocarcinoma of the small intestine Diseases 0.000 description 1
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101710147844 Myb protein Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010020361 Oncogene Protein gp140(v-fms) Proteins 0.000 description 1
- 108010058765 Oncogene Protein pp60(v-src) Proteins 0.000 description 1
- 108010054076 Oncogene Proteins v-myb Proteins 0.000 description 1
- 108010062618 Oncogene Proteins v-rel Proteins 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N Pro-Glu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010087776 Proto-Oncogene Proteins c-myb Proteins 0.000 description 1
- 102000009096 Proto-Oncogene Proteins c-myb Human genes 0.000 description 1
- 108010001859 Proto-Oncogene Proteins c-rel Proteins 0.000 description 1
- 102000000850 Proto-Oncogene Proteins c-rel Human genes 0.000 description 1
- 108010021833 Proto-Oncogene Proteins c-yes Proteins 0.000 description 1
- 102000007696 Proto-Oncogene Proteins c-yes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010056697 Tissue anoxia Diseases 0.000 description 1
- PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 206010073373 small intestine adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
i DK 174459 B1
Ansøgningen vedrørende dette patent er afdelt fra dansk patentansøgning nr.
PA 1983 04980 indleveret den 31. oktober 1983.
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et anti-genisk oligopeptid indeholdende op til 20 aminosyrerester og indeholdende en 5 eller flere specifikke aminosyresekvenser som er ekspressionsprodukter af re-trovirale oncogener.
Mekanismen for pattedyrcellers malignitet har været og er fortsat genstand for intens undersøgelse. Et af de områder, som er anset for lovende ved opklaring af mekanismen er de såkaldte oncogener. Selv om forekomsten af oncogener ] 0 først blev detekteret hos retrovira, synes det nu rimeligt fastslået at de virale oncogener har cellulære modparter. Betydningen eller virkningen af disse cellulære modparter er ikke opklaret. En udmærket oversigt over oncogener, deres egenskaber og især src-genet findes i en artikel af J. Michael Bishop, Scientific American, marts 1982: 81-93. Artiklen indeholder også en liste overforskellige 15 virale oncogener, hvoraf det fremgår at et antal af dem er involveret i phospho-rylering.
Det har vist sig, at src-genet ikke blot er aktivt i maligne celler hos kyllinger, men også i normale celler. Forskellen synes kun at bestå i en grads- og ikke en typeforskel, idet det enzym der udtrykkes af src-genet forekommer i meget hø-20 jere koncentration i den maligne celle sammenliget med den normale celle.
For at kunne påvise tilstedeværelsen af tumorceller er det nødvendigt at kunne skelne mellem normale celler og tumorceller. Den iagttagne egenskab, der skal benyttes ved diagnosticering af tumorcellen må derfor kunne differentieres fra en normal celle eller fra en fysiologisk væske fra en normal vært, hvis det er 25 væsken og ikke cellen, der undersøges. Endvidere må egenskaben ikke være specifik for individet, men være fælles for cellens maligne natur.
Både ved diagnose og behandling er muligheden for specifik påvisning af maligne celler meget betydningsfuld. Enhver benyttet teknik må, når en høj grad af malignitet er under mistanke, være i stand til at skelne maligne celler fra norma-30 le celler. Endvidere bør den diagnostiske teknik være egnet for et stort antal medlemmer af befolkningen og ikke være specifik for en lille befolkningsgruppe.
2 DK 174459 B1
Eftersom en cancercelle er afledt af en normal celle, vil de fleste egenskaber og bestanddele af den maligne celle være den samme som for den normale celle.
Der er endvidere en mere og mere udbredt opfattelse af, at maligniteten er et resultat af en naturlig proces, der i visse sammenhænge resulterer i malignitet.
5 Under hensyn til, at malignitet kan være baseret på normale processer, der på det pågældende tidspunkt får et afvigende resultat, er det ikke overraskende, at der har været store vanskeligheder med at påvise observerbare forskelle mellem normale celler og cancerceller for et bredt spektrum af allogeniske værter.
Følgende afhandlinger giver en genere! beskrivelse af oncogener og virkningen lO af retrovira ved tumorgenese: Bishop, Scientific American, ovenfor: Bishop,
New England J. of Med. (1980) 303: 675-681; Lancet, July 24, 1982, side 195-196; Cooper, Science (1982) 218: 801-806; Varmus, Science (1982) 216: 812-820. Artikler vedrørende specifikke oncogener inkluderer: Beckeret al., PNAS USA (1982) 79: 3315-3319; Tsuchida et al., Science (1982) 217: 937-938 og 15 Dhar et al., ibid., (1982) 217: 934-936.
Man har nu fundet at DNA der kan transformere celler hos lavere hvirveldyr til malignitet, findes i humane celler og har et meget højere niveau af transcription og ekspression i maligne celler end i normale celler. Ved at man kan bestemme det højere niveau af mRNA eller ekspressionsproduktet af sådan mRNA, er det 20 således muligt at diagnosticere tilstedeværelsen af maligne celler. Desuden kan produktionen af det højere niveau af peptider i maligne celler danne grundlaget for behandling af maligniteten. Hvis polypeptid-ekspressionsproduktet kan findes i fysiologiske væsker, såsom blod, og niveauerne af ekspressionsproduktet er væsentligt forskellige i nærvær og fravær af malignitet, kan den fysiologiske 25 væske screenes som diagnosticum for tilstedeværelsen af en bestemt tumor.
I det følgende beskrives fremgangsmåder og præparater til evaluering af sandsynligheden for tilstedeværelse af maligne celler i en gruppe af celler, især humane celler in vivo eller frisk fjernet fra en human vært. Fremgangsmåden bygger på cellulære produkter, såsom mRNA eller dens ekspressionsprodukt som 30 diagnosticum for den mulige tilstedeværelse af maligne celler. Den mRNA der udvælges til detektion bliver sædvanligvis udvalgt som resultat af at der forekommer RNA i et retrovirus-genom, hvilket retrovirus er i stand til at transformere pattedyrceller til malignitet. Endvidere er den RNA i retroviruset som udvæl- 3 DK 174459 B1 ges, en sekvens som ikke koder for en væsentlig funktion af retroviruset, men faktisk skal være hvilende.
Først defineres en DNA-sekvens, som er i stand til at forårsage malignitet af pattedyrceller. Når denne DNA-sekvens er defineret, kan der tilvejebringes po-5 lynucleotid-sekvens, der kan tjene som sonder til bestemmelse af forhøjede koncentrationer af mRNA som et mål for cellens malignitet. Sekvensen kan også anvendes til at definere polypeptidsekvenser, der kan definere komplementære receptorer med høj specificitet for peptidsekvensen. Receptorerne kan derefter anvendes til at bestemme tilstedeværelsen af eller koncentrationen af 10 peptidet i cellerne eller de fysiologiske væsker og til behandling, hvis receptorerne kan rettes mod maligne celler. Når man kender peptidets natur og funktion, kan der også skaffes andre midler til at kontrollere den forøgede produktion af det særlige peptid.
Det første trin af fremgangsmåden er at definere DNA-sekvensen. Forskellige 15 metoder kan anvendes til at definere DNA-sekvensen for et retroviralt oncogen.
F.eks. er der fundet retrovira, der er i stand til at transformere celler fra lavere hvirveldyr til malignitet. De retrovira, som er karakteriseret, har vist sig at have DNA-sekvenser, der kan sammenlignes med vildtypegener i værten, og sådanne gener kaldes nu oncogener. I tilfælde af Rous sarcoma-virus er ekspressi-20 onsproduktet for genet isoleret og karakteriseret og har vist sig at være en kina-' se. I tilfælde af denne kinase er det også vist, at kinasen normalt produceres af cellen, men i en meget lavere mængde, når src-genet fra Rous sarcoma-virus indføres. Der er allerede bestemt et stort antal virale oncogener i forskellige arter af hvirveldyr, og efterfølgende tabel er en liste over oncogenerne og deres 25 oprindelse.
4 DK 174459 B1 TABEL 1
Oncogen Oorindelsesart v-src Kylling v-fps 5 v-yes ” v-fos v-myc v-erb v-myb lO v-rel kalkun v-mos mus v-bas " v-abl v-ras rotte 15 v-fes kat v-fms v-sis abe
Andre eksempler på kilder til DNA-sekvenser der kan indføre maligne transformationer i hvirveldyrceller, kan være isoleret DNA fra en malign celle eller celle-20 linie, klonet DNA fra et genomisk bibliotek eller klonet DNA fra et mRNA- bibliotek hvor den totale mRNA fra den maligne celle er reverstranskriberet til DNA og klonet. Hvert af disse biblioteker kan undersøges for deres evne til at indføre malignitet. Et raffinement ved undersøgelsesteknikken kan opnås ved at tage den totale mRNA fra en normal celle og fremstille cDNA fra mRNAen. Man 25 kan derefter anvende den enkeltstrengde DNA som sonde til at fjerne mRNA associeret med den normale celle fra den totale mRNA fra en malign celle. Den resterende mRNA vil derpå omfatte mRNA der udtrykkes af gener associeret med malignitet. Derefter kan man anvende mRNA'en ti) at screene et genomisk bibliotek og anvende den klonede DNA som hybridiserer med mRNA ved en 30 bioassay til bestemmelse af evnen til at transformere til malignitet. Med tiden vil også andre metoder blive tilgængelige til at detektere og definere DNA-sekvenser som er i stand til at transformere normale celler.
5 DK 174459 B1
En yderligere analyse kan anvendes til at screene cDNA fra fostre med mRNA fra maligne celler. Især hvis oncogenet er et hvilende gen eller forholdsvis uvirksomt i modne hvirveldyr, men stærkt aktivt i fosteret, kan screeningen tjene til yderligere at indsnævre det område af sekvensen, der skal screenes.
5 Når man først har isoleret en DNA-sekvens der kan inducere malignitet, kan et klonet viralt oncogen eller korte polynucleotidsekvenser anvendes som sonder til bestemmelse af produktionsniveauet af mRNA i celler der mistænkes for at være maligne. Fremstillingen af både RNA- og DNA-nucleotidsekvenser, mærkningen af sekvenserne og den foretrukne størrelse af sekvenserne har I0 været genstand for omfattende beskrivelse og eksemplifikation i litteraturen. En sekvens bør normalt have mindst 14 nucleotider, sædvanligvis mindst 18 nucleotider, og polynucleotidsonderne kan være en eller flere kilobaser. Der kan anvendes forskellige mærker, sædvanligvis radionuclider, især 32P. Der kan dog også anvendes andre teknikker, såsom anvendelse af biotinmodificerede 15 nucleotider til indførelse i et polynucleotid. Biotinet tjener derefter som site for binding til avidin eller antistoffer, der kan mærkes med forskellige mærker, såsom radionuclider, fluorescerende stoffer, enzymer eller lignende. I stedet kan anvendes antistoffer, som genkender specifikke duplexer, herunder DNA-protein-duplexer. Antistofferne kan på sin side mærkes, og undersøgelsen kan 20 udføres for at finde hvor duplexen er bundet til overfladen, således at man ved dannelsen af duplex på overfladen kan bestemme tilstedeværelsen af det til duplexen bundne antistof.
Ved at isolere nucleotidsekvensen for hele oncogenet kan sekvensen af baser bestemmes på kendt måde, f.eks. ifølge Maxam and Gilbert, PNAS USA (1977) 25 74:560. Sekvensen kan anvendes til bestemmelse af aminosyre-sekvensen af det af oncogenet udtrykte protein. Ved at identificere codoneme for methionin efterfulgt af en sekvens der ikke har stopcodoner som forhindrer ekspression, kan man sædvanligvis finde en enkelt sekvens i ramme med en methionin-codon til definering af oncogenet. 1 I stedet kan anvendes hybrid DNA-teknologi til at opnå ekspression. DNA- sekvensen kan restriktionskortlægges, og de passende sites for spaltning defineres. På denne måde kan sekvensen udskæres og indføres i en vektor som har de passende reguleringssignaler. Efter at der er opnået ekspression af 6 DK 174459 B1 DNA-sekvensen, kan der fremstilles antistoffer over for polypeptidet. Ved anvendelse af oocyter til ekspression af mRNA'en som derefter translateres til fremstilling af det af oncogenet udtrykte peptid, kan det af mRNAen definerede protein produceres. Identiteten af peptidet fra oocytten som det peptid der pro-5 duceres ved ekspression af den hybride DNA, kan derefter bestemmes.
Når først proteinet er blevet identificeret og verificeret, kan man anvende proteinet eller peptid-underenheder heraf som antigen til fremstilling af antistoffer til diagnose og behandling. Antistofferne kan fremstilles på forskellige måder afhængigt af om man ønsker monoklonale eller polyklonale antistoffer. Til opnåel-lO se af polyklonale antistoffer hyperimmuniseres et hvirveldyr, normalt et husdyr, med antigenet, og kort tid efter gentagne immuniseringer opsamles blod, og γ-globulinet isoleres. Til opnåelse af monoklonale antistoffer hyperimmuniseres et lille dyr, milten udtages, og lymphocytterne sammensmeltes med en passende fusionspartner. De danne hybridomer dyrkes derefter under begrænsende 15 fortynding, og der udvælges kloner som giver de ønskede antistoffer.
I stedet for at fremstille hele peptidet kan man bestemme forskellige områder, der sandsynligvis er determinant-sites, og anvende disse oligopeptider med mindst 8 aminosyrer, sædvanligvis med mindst 10 og ikke over 20, sædvanligvis ikke over 18 aminosyrer, til at definere et hapten, der kan anvendes til at in-20 ducere antistofdannelsen. Oligopeptidet bindes til et passende immunogen og indføres i et hvirveldyr for at frembringe antistoffer, enten polyklonale eller monoklonale antistoffer som beskrevet ovenfor.
I overensstemmelse hermed er der fundet en serie oligopeptider, der svarer til antigeniske områder i peptid-ekspressionsprodukterne af RNA som er til stede i 25 retrovirus-oncogener. Eksempler på arter af antigeniske oligopeptider, som er velegnede, fremgår af efterfølgende liste, ordnet i grupper efter det retrovirale oncogen (ekspressionsprodukt), som genkendes af antistoffer produceret ud fra oligopeptidet.
7 DK 174459 B1 A. Myb pro-gln-glu-ser-ser-ly$-ala-gly-pro-pro-ser-gly- thr-thr-gly met-ala-phe-ala-his-asn-pro-pro-ala-gly-pro-leu-pro-gly-ala pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro-glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala 5 pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-thr-glu-tyr-arg-lys-met-his-gly-gly~ala-val pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-thr-glu-tyr-arg-lys-met asp-asn-thr-arg-thr-ser-gty-asp-asn-ala-pro-val-ser-cys-leu-gly-glu pro-ser-pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro-glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala-arg leu-gln-glu-ser-ser-lys-ala-ser-gln-pro-ala-val-ala-thr-ser ] 0 asn-pro-glu-val-lys-lys-thr-ser-trp-thr-glu-glu-glu-asp-arg B. Src arg-leu-ileu-glu-asp-asn-glu-tyr-thr-ala-arg-gln-gly-ala-lys-phe-pro asn-arg-glu-val-leu-asp-gln-val-glu-arg-gly-tyr-arg-met-pro tyr-arg-arg-asp-pro-glu-glu-arg-pro-thr 15 C. RasKi arg-leu-lys-lys-ileu-ser-lys-glu-glu-lys-thr-pro-gly-cys-val-lys-ileu-lys-lys asp-leu-pro-ser-arg-thr-val-asp-thr-lys-gln-ala-gln-glu-leu-ala-arg met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-gly-ala-ser-gly-val-gly-lys-ser-ala D. RasHa 20 glu-asp-ileu-his-gln-tyr-arg-glu-gln-ileu-lys-arg-val-lys-asp-ser-asp-a$p val-arg-glu-ileu-arg-gln-his-lys-ieu-arg-lys-leu-asn-pro-pro-asp-glu-ser-gly-pro met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-arg-gly-val-gly-lys-ser-ala met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-val-gly-val-gly-lys-ser-ala met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-gly-gly-val-gly-lys-ser-ala 25 val-asp-glu-tyr-asp-pro-thMIeu-glu-asp-ser-tyr-arg-lys-gln-val 8 DK 174459 B1 E. Fes arg-his-ser-thr-ser-ser-ser-glu-gln-glu-arg-glu-gly-gly-arg ser-arg-glu-ala-ala-asp-gly asn-gln-gln-thr-arg-glu-phe-val-glu-lys-gly-gly-arg 5 pro-glu-val-gln-lys-pro-leu-his-glu-gln phe-leu-arg-thr-glu-gly-ala-ala-ala-asp-glu-asp-ala-ala-ala phe-leu-arg-thr-glu-gly-ala-arg-leu-arg-met-lys-thr-leu-leu ser-ala-pro-arg-ser-ser-pro-ser-thr-ser-ser-trp-ser-ser ala-ser-pro-tyr-pro-asn-leu-ser-asn-gln-thr-arg 10 F. Myc asp-gln-gln-arg-leu-gly-arg-arg-thr-arg-arg-arg-val-arg-lys glu-arg-gln-glu-ala-glu-arg-his-asn-val-leu-glu-arg-gln-arg-arg-asn-glu arg-leu-ileu-ala-glu-lys-glu-gln-leu-arg-arg-arg-arg-glu-gln arg-lys-lys-asn-lys-lys-lys-ser-glu-glu-ileu-asp 15 pro-pro-thr-thr-ser-ser-asp-ser-glu-glu-glu-gln-glu arg-thr-leu-asp-ser-glu-glu-asn-asp-lys-arg-arg glu-arg-gln-arg-arg-asn-glu-leu-lys-leu-arg glu-gln-leu-arg-arg-arg-arg-glu-gln-leu-lys asn-asn-g)u-lys-ala-pro-lys-val-val 20 arg-arg-glu-gln-leu-lys-his G. Fos lys-glu-lys-glu-lys-leu-glu-phe-ileu-leu pro-glu-glu-glu-glu-lys-arg-arg-ileu-arg-arg-glu-arg
Flere aminosyregrupper kan kobles til begge ender af hver af de under afsnit A 25 - F ovenfor nævnte oligomere peptidsekvenser, uden at der sker nogen æn dring af det dannede peptids antigeniske karakter, op til 50, fortrinsvis 25, ami- 9 DK 174459 B1 nosyrerester, der indeholder i det mindste én af de i afsnit A - F nævnte amino-syresekvenser.
De ovenfor angivne antigeniske oligopeptider indeholdende en eller flere af de i afsnit A - F angivne aminosyresekvenser kan fremstilles syntetisk eller ved hy-5 brid DNA-teknologi. For sådanne polypeptider og oligopeptider med op til 50 aminosyrerester egner sig især konventionel fastfase-peptidsyntese. Ved denne almindelige synteseprocedure til fremstilling af peptider, der f.eks. er beskrevet i US patentskrift nr. 4 341 761, benyttes kendte sidekædebeskyttende grupper og konventionelle bærere, f.eks. polystyrenharpiks, såsom chlormethyleret har-10 piks, hydroxymethylharpiks eller benzhydrylaminharpiks, til at opnå aminosyre-kobl ingen.
Ved udøvelse af rekombinant eller hybrid DNA-teknologi, kan sådanne oligopeptider indeholdende op til f.eks. 20 aminosyrerester benyttes til at udlede co-don-sekvensen for det nucleotid (DNA), som koder for det omhandlede oligo-15 peptid. Hvis man bruger denne codon-sekvens som skabelon, kan dobbeltstrenget DNA syntetiseres på kendt måde og indsættes i en vektor-DNA eller et kloningsmedium, såsom E. coli plasmid. Transformering af en egnet vært, f.eks. en mikroorganisme, såsom E. coli eller f.eks. andre cellelinier, med rekombi-nante vektorer, giver et middel til at opnå ekspression af det ønskede oligopep-20 tid.
I overensstemmelse hermed tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid indeholdende op til 20 aminosyrerester og indeholdende en eller flere af de ovenfor angivne aminosyresekvenser, hvilken fremgangsmåde er særegen ved at der syntetiseres en 25 dobbeltstrenget DNA-sekvens, som koder for oligopeptidets aminosyresekvens, at denne dobbelststrengede DNA indsættes i et passende site i et kloningsmedium eller en vektor til dannelse af et rekombinant DNA-molekyle, hvorefter en egnet værtsorganisme transformeres med det nævnte rekombinante DNA-molekyle til opnåelse af ekspression of oligopeptidet.
30 I de situationer, hvor det humane gen er forskelligt fra v-onc, f.eks. human c-ras, kan den ovenfor beskrevne teknik anvendes til at isolere genet, mRNA'en eller pseudo-genet og opnå antistoffer over for det humane ekspressionsprodukt. Det humane oncogen forventes at have væsentlig komplementaritet over for det beslægtede v-onc, idet det normalt afviger i mindre end 5 % af baserne, og almindeligvis afviger med mindre end 5% af aminosyrerne i ekspressions- produktet.
10 DK 174459 B1
Antistofferne kan anvendes på forskellige måder. Især kan de benyttes til diag-5 nose. I de tilfælde, hvor antigenet kun kan forekomme i en fysiologisk væske ved en højere koncentration, når der forekommer malignitet, kan den fysiologiske væske, såsom serum, plasma, helblod eller cerebrospinalvæske, underkastes en undersøgelse. De ved undersøgelsen anvendte antistoffer kan være mærkede eller ikke-mærkede. Ikke-mærkede antistoffer kan anvendes til agglu-]0 tinering, de mærkede antistoffer kan anvendes i et stort antal undersøgelser, idet der anvendes vidt forskellige mærkninger, såsom radionuclider, enzymer, fluorescerende stoffer, enzym-substrater eller cofaktorer. Disse metoder er veldefinerede i litteraturen og eksempler på prøvningsprocedurer kan findes i US patentskrifterne nr. 3 817 834, 3 935 074, 4 233 402 og 4 318 980.
15 Ved nogle teknikker vil det være nyttigt at mærke antigenet eller et fragment deraf i stedet for antistoffet og have en konkurrence mellem det mærkede antigen og antigenet i prøven for antistof. I denne situation er det almindeligt at tilvejebringe kits, som omfatter en kombination af det mærkede antigen eller mærkede fragment og antistoffet i mængder, der giver optimal sensitivitet og 20 nøjagtighed.
I andre situationer kan det være ønskeligt at have en fast bærer, som enten er bundet til et antigen eller et antistof, Et polyepitopisk antigen kan tjene som en bro imellem antistof bundet til en bærer og mærket antistof i prøvningsmediet. I stedet kan man konkurrere mellem mærket antigen og ethvert antigen i prøven 25 for en begrænset mængde antistof.
Hvis antigenet ikke findes i en fysiologisk væske eller det, hvis det findes der, ikke diagnosticerer malignitet, må cellerne isoleres, og cellerne må undersøges for tilstedeværelse af rnRNA eller antigen. Metoder til bestemmelse af mRNA er allerede blevet beskrevet. Til detektering af antigenet kan vævsprøven iyseres 30 på konventionel måde, f.eks. base, detergenter eller lignende, cellerester skilles fra ved filtrering eller centrifugering, og filtratet eller supernatanten isoleres og undersøges.
11 DK 174459 B1
Ved terapeutiske behandlinger kan benyttes enten xenogeniske eller alloge-niske antistoffer i afhængighed af behandlingens art, og om de fremmede antistoffer inducerer et immunrespons. 1 litteraturen er beskrevet mange metoder til at fremstille humane antistoffer, for så vidt antistoffer fra mus eller andre patte-5 dyr ikke er tilfredsstillende. Antistofferne kan anvendes på mange måder. Ved anvendelse af den passende IgG (forskellig fra IgGi) kan man inducere lyse via den naturlige komplementproces. Alternativt kan den lyserende del af et toxin knyttes til antistoffet, især et Fab-fragment. Antistofferne kan være bundet til li-posomer for at dirigere liposomerne til de maligne celler for at blive optaget i 10 cellerne ved sammensmeltning af membranerne. Andre mærker kan også bindes til antistofferne, såsom radionuclider, fluorescerende stoffer eller enzymer.
Ved indførelse af antistofferne in vivo vil antistofferne dirigere mærket til den maligne celle, hvor tilstedeværelsen af malignitet kan diagnosticeres eller behandles.
15 Sammensætningen af antistofferne vil variere bredt, afhængigt af mærkets art, formålet med antistofferne, det site mod hvilket antistofferne er rettet, og lignende. Antistofferne indføres sædvanligvis i en fysiologisk acceptabel bærer, f.eks. saltopløsning eller en phosphatpufret saltopløsning, og injiceres i værten på det ønskede sted, hvis det er muligt, og ellers i et cirkulerende system, såsom blod.
20 De beskrevne antistoffer kan også anvendes til at isolere celler der udtrykker oncogenet, og til at fjerne celler in vitro fra en heterogen cellepopulation indeholdende celler der udtrykker oncogenet. Adskillelse kan opnås med en fluore-soensaktiveret cellesorterer (FACS). Den samme teknik kan anvendes til at identificere og isolere celler der udtrykker oncogenet. Til fjernelse af celler der 25 udtrykker oncogenet fra en blanding af celler kan de omhandlede antistoffer kombineres med komplement, sammenføjes med det lyserende fragment (A-fragment) af et toxin (se EP patentansøgning nr. 17 507 og GB patentansøgning nr. 2 034 324), eller cellerne agglutineres og separeres ved fysiske meto der.
30 Os følgende eksempler tjener til at belyse opfindelsen.
Tum<orer blev skaffet fra friske kirurgiske prøver på tidspunktet for resektion og var ubehandlet med kemoterapi eller radioterapi. Man sørgede for udelukkende 12 DK 174459 B1 at få levedygtige tumorer og at behandle vævet så hurtigt som muligt for at undgå nedbrydning af mRNA. Prøverne blev hurtigt frosset og opbevaret i flydende nitrogen indtil behandlingen for RNA blev udført. Hvis udopererede prøver omfattede større mængder normalt væv, blev noget af dette taget fra til ana-5 lyse som en intern kontrol for mængden af c-onc-genekspression. C-onc- genekspressionen kunne således sammenlignes for normalt og malignt væv fra samme patient. Så lidt som 20 pg Maloney-murinsarcoma-virus, ækvivalent med tilnærmelsesvis én RNA transcript på 3 kilobaser (kb) pr. celle eller tilnærmelsesvis 2 mikrogram poly-A-RNA påført filteret kunne bestemmes ved denne lo metode (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. (1979) 7:1541). Ved at anvende passende kontroller, herunder ubeslægtede RNA'er, poly-A-negativ-fraktion-RNA, plasmid-DNA og muse og humant DNA, kunne man i rimelig grad undgå falsk-negative såvel som falsk-positive resultater. De afsatte pletter blev kvantitativt evalueret ved hjælp af et blødlaser-skanningsdensitometer. Hvis der var 15 tilstrækkeligt materiale tilgængeligt, blev mRNA yderligere karakteriseret ved Northern-analyse for at bekræfte tilstedeværelsen af og omfanget af specifikke transcripter (Thomas, PNAS USA (1980) 77:5201).
Ekspression af 13 cellulære oncogener i 14 tumorer blev undersøgt ved DNA-RNA hybridiseringsteknik. Disse data er sammenfattet i tabel 2.
DK 174459 B1 6 £ c ε +
X T— I 1 I + i I I I I I II I
£ E + >S ttl _l (/) o C CO , III ,+ 1 + + +, , Φ P CN+i'<i'+' + + +i' ]| i §3 -+' 111 '+· + + +'· + to ^+,,,,,+ , + +,,, c ^+1 '11 >+ + +'· 1 o + c o ro CM+, ,,,,^, + +, I, 3 δ ro "c * O ^ X.....+ ' + + ' 1 1 u H- f LLI i I— + ~ z ^+,,,,,+ ,+ +,,, <
O I + I
- 2-§ „i.....i t $ « É 7 (0 + > < V *5
2| + + S
i? x...... + i - · i ro + c c -a ω , S) 0C + + + + = 4- ·- τ Γ2 ’Π E f.
1- ZJ + + , , “ 3 ο'-+'''' '+' + X' '' "o φ ω + + g •E ro * & O) *= C » ΐδ g g δ ^ O ^ T- + i ( > r < + 1 i ί 1 * 1 ^ Φ C c + +++ ]2 ro’o >* .£ ro H « «8 s c φ ^ ™ +.....± ' ΐ Ϊ * * ™ 2< o g w O -¾ ro O + +4.+ cc = O ^-+,(,, '+, + +''' &.s '=
CN ^ < S
_J
Ui o ti) * * ns .
OQ c "|2 u Δ cn 1. m ^ « to 2
< 9 o E φ ja o^roro a> £ .£ * J
h- > (jo 22UJ(0>-<U.SCCEIL1L(0 * ϊ Ϊ 14 DK 174459 B1
Der blev iagttaget 3 mønstre: 1) ekspression af specifikke c-onc mRNA-sekvenser i alle eller næsten alle tumorprøver (f.eks. c-myc); 2) påvisning af c-onc-ekspression i sporadiske tumorer (f.eks. c-fes); og 3) ingen påviselig ekspression (f.eks. c-mos).
5 Der måltes ingen væsentlig ekspression af mRNA-sekvenser, der var homologe til c-erb, c-yes, c-abl, c-mos, c-fms, eller c-sis. Dette var ikke resultat af manglende homologi mellem den virale gensonde og den humane mRNA, da det var muligt at påvise homologer af alle disse sonder i humant genomisk DNA. RNA fra mikroskopisk normalt væv indeholdt ikke nogen påviselige 10 transcripter ved denne analyse.
Fire cellulære oncogener udviste et konsistent ekspressionsmønster i forskellige humane tumorer. Disse var c-myc, c-fos, c-rasHa, og c-rasKl. Der foretoges en sammenligning af intensiteten af hybridisering, hvilket var muligt, da alle sonder var mærket til tilnærmelsesvis samme specifikke aktivitet, v-myc 15 og v-fos viste den højeste intensitet af hybridisering til humane tumor- RNA’er, hvilket antyder tilstedeværelsen af et stort antal kopier af mRNA pr. celle. Ekspression af begge disse gener blev iagttaget ved alle undersøgte maligniteter. c-rasHa- og c-rasK'-sekvenser blev også detekteret i de fleste af de humane tumorer, men med mindre intens hybridisering.
20 mRNA-sekvenser relateret til c-fes, blev kun detekteret i 2 af 14 undersøgte tumorer; begge disse var lungecancere.
C-myb-ekspression blev kun detekteret i én af 14 tumorer; denne var også en lungecancer.
C-src mRNA-sekvenser blev kun iagttaget i cirkulerende tumorceller hos en 25 patient med lymphosarcoma.
For at undersøge, hvorvidt ekspression af cellulære oncogen-sekvenser var relateret til neoplasi, blev der gjort en anstrengelse for at opnå både stort set normalt udseende væv og åbenbart malignt væv fra samme område af patienten på samme tidspunkt. Hybridiseringsundersøgelser blev derefter udført 30 på RNA-prøver fra tumoren og fra tæt beliggende ikke-involverede væv. I 6 af de 14 patienter var det muligt at gennemføre denne analyse. I ét af disse 6 15 DK 174459 B1 tilfælde blev det senere ved histologisk analyse vist, at det formodede normale væv var infiltreret med tumor. 14 af de resterende 5 tilfælde var der differentiel ekspression mellem tumoren og det normale væv idet der blev iagttaget lave eller ikke-detekterbare niveauer i de normale væv og forhøjede ni-5 veauer i maligniteten. Tre af renal-celle-carcinomerne og ét colon-carcinom viste dette fænomen.
Afdupnings-analyse af RNA fra celler i områderne af tumorprøven og kontrolprøven udviste en korrelation mellem tilstedeværelsen eller fraværelsen af tumor og c-onc-genekspression. I én tumor, et adenocarcinom fra tyndtar-10 men, blev fundet c-onc-beslægtede sekvenser i histologisk normalt tilliggende væv. Analyser af poly-A-RNA fra tumorer og kontrolvæv blev gennemført ved Northern-teknikken. To c-mys-relaterede transcripter på 4,0 og 2,0 kb blev fundet i alle de undersøgte tumorer. Foruden disse transcripter var der åbenlys nedbrydning af noget af mRNA'en ved disse hybridiseringsanalyser, 15 højst sandsynlig stammende fra nedbrydning under vævs-anoxia i perioden efter kirurgisk fjernelse af vævet. Under anvendelse af de ovenfor anførte procedurer blev adskillige andre tumor-typer, opnået fra friske kirurgiske prøver, undersøgt for c-onc-genekspression. I denne serie af prøvninger benyttedes DNA-RNA-hybridisering til at lede efter ekspression af 10 forskellige 20 cellulære oncogener i 9 tumorer. De opnåede data er sammenfattet i tabel 3 nedenfor.
DK 174459 B1 .2 + CN i ' · i ' J + + ^ i ° E +
® I
^ 3 « - + + ί + + O + + ί + + (Λ
C
ro 05 f Ό o + ' + ' i + + 1+ 1 Ϊ i
O
Z
O
TJ
C!
(Λ O
- C/> C o a *- + + +,,+% + +> ? * Ό " I— -? s LU < H 5
Z 2 I
£ O g λ — o ?· ^ C τ' *+ i I 1 i + + i i 1 < >. i 2 £ re
z S
i 1 =f ro -55 1 ε s? 3 0 -c 53 .E -<- 1 1 1 1 & ^ - Is -'ro k υ Ί·
"D
C
O
+ + + + + -s CO+lliiT + T+ i <Λ ro + + + + g o 8 C T3 v ^ 3 </> Ή.
> — ϊ— C5 CD 4. 4. + c τ-? + +«ιΤ + + +· § + + + <υ ~o
C c C
a.s =
f) J5 < S
_l UJ f, £15 * * w .-, CQ o? *υ -Q 0 — L μ ^ ιλ to i- > (Λ S2coq:<u-q:q;llw *i* 17 DK 174459 B1
De i tabel 3 angivne resultater korrelerer temmelig godt med de resultater der tidligere er rapporteret i tabel 2 derved at de cellulære oncogener c-myc, c-fos, c-rasHa og c-rasKl viser et konsistent ekspressionsmønster i de yderligere undersøgte tumor-typer. Yderligere blev c-myb, c-src og c-fes også detekte-5 ret i flere yderligere tumor-typer, mens c-rel, c-abl og c-sis ekspression ikke blev iagttaget i nogen af de yderligere undersøgte tumor-typer. Det er interessant at ingen af de cellulære oncogener som der blev søgt efter viste sig at blive udtrykt i noget væsentligt niveau i det eneste evaluerede uteruscarci-nom.
10 For at bestemme om den mRNA som blev vist at være til stede i maligne celler i forhøjede mængder var knyttet til gener som er involveret i embryogenese, blev der udført forsøg generelt som angivet i det følgende. Total RNA blev isoleret fra embryoer/føtuser af tilfældigt opdrættede schweizer-mus ved daglige intervaller begyndende med svangerskabets 6 dag (dagen for be-15 frugtning blev angivet som dag 0 for prænatal udvikling). Begyndende ved dag 10 af prænatal udvikling blev selve embryoet adskilt fra de ekstraembry-onale membraner og placenta, Den lille størrelse forud for dag 10 forhindrede adskillelse, og derfor repræsenterer embryoerne fra dagene 6-9 hele concepts som dissekeret fra uterusvæggen.
20 Aliquoter af poly{A)-indeholdende RNA (poly(A+)-RNA) blev isoleret ved affinitetskromatografi på oligo(dT)-cellulose-kolonner og anbragt som pletter på nitrocellulosepapir (dot blots) (Kafatos et al., Nucl. Acids Res. (1979) 7:1541-1552). Prøverne blev hybridiseret til [32P]-mærkede molekulært klonede on-cogen-specifikke sonder. Dot blots blev kontinuerligt evalueret ved hjælp af 25 et blød-laser-skanningsdensitometer. Transkriptionsaktivitet af c-onc'er blev yderligere studeret mere detaljeret i forskellige væv fra nyfødte og 10 dage gamle mus. Agarosegel-elektroforese efterfulgt af afdupning på nitrocellulosepapir (Northern blotting), (Thomas, PNAS USA (1980) 77:5201-5205) blev anvendt til at bekræfte de opnåede resultater fra dot-blot-analyse og yderlige-30 re at bestemme størrelsen af de forskellige c-onc-relaterede transkripter.
Mere specifikt blev RNA isoleret fra Swiss-Webster museembryoer på forskellige udviklingstrin under anvendelse af guanidin-thiocyanot-metoden 18 DK 174459 B1
(Cox, Methods Enzymol, (1967) 12:120-129; Adams et al., PNAS USA
(1980) 74:3399-3043).
Som ovenfor angivet repræsenterer Swiss-Webster- museembryoer fra dagene 6 - 9 hele concepti indbefattet alle ekstraembryonaie væv, såsom 5 membraner og de celler der giver anledning til placenta på senere udviklingstrin. I alle senere stadier blev selve embryoet dissekeret frit fra ekstraembryonaie væv. RNA blev selekteret for poly(A*)-RNA ved en cyklus af kromatografi på oligo-(dT)-cellulose-kolonne (Aviv and Leder, PNAS USA (1972) 69:1408-1412). Poly(A+)-RNA blev opløst i vand, kogt, hurtigt afkølet på is, 10 og 3 μ9 (1,5 μΙ) blev påført ark af nitrocellulosepapir som tidligere var blevet ækvilibreret med 20 x SSC (1 x SSC er 0,15 NaCI, 0,015 M natriumcitrat) og lufttørret. Efter bagning i 18 timer ved 80 °C blev afdupningerne (blots) præ-hybridiseret i mindst 4 timer ved 45 °C i en puffer indeholdende 0,75 M NaCI, 0,05 M natriumphosphat (pH 7,5), 0,005 M EDTA, 0,2 % SDS, 10 mg gly-15 cin/ml, 5 x Denhardt's reagens (1 x Denhardt's reagens er 0,02 % hver af fi-coll, okseserumalbumin og polyvinylpyrrolidon), 0,25 mg denatureret silde-DNA/ml og 50 % formamid.
Afdupningerne (blots) blev hybridiseret i ca. 20 timer ved 45 °C med 1 x 106 tællinger/min nick-translateret sonde/ml hybridisedngspuffer (præhybridise-20 rings-puffer med Denhardt’s reagens ved 1x). De klonende oncogen-frag-menter oprenset fra vektor-sekvenser ved præparativ agarosegel-elektroforese blev nick-translateret (Rigby et al., J. Mol. Bio!. (1977) 113: 237-251) i nærvær af [32P]-dCTP (3200 Ci/mmol) til specifikke radioaktiviteter på ca. 1 - 2 x I09 tællinger/min/pg DNA. Efter hybridisering blev klatterne va-25 sket 3 gange i 1 x SSC ved 50 °C i ialt ca. 2 timer og eksponeret på foreksponerede røntgenfilm med intensiveringsskærme ved -70 °C i 72 timer.
Under anvendelse af ovennævnte procedure blev et antal kendte oncogener screenet for at bestemme om de var udtrykt i embryoerne. Den følgende tabel 4 angiver de enkelte oncogener og observationerne vedrørende deres 30 ekspression i embryoniske celler.
<0 DK 174459 B1 i ] i- .3 4. 4. -k 1 _
Is I
£ K n cm JD _ oo c »— r>- x: i S δ <? c co ^ co ω cn I 7 ' + +' + + +'' + (DgS^r
i 3 O
Ό — , . rvl CM £- 0> 0 ιη^„(θ”Ν J— O ‘J; rs^ CD ^ ·-—^
9- CJ 9 £ *- CM CM
1 , OM . T- X CD ™
ε ® +++·+.+..+ ;os=«OT
g S^s||5 o 5S^agcu <π ^ r r ^ "ro ^ "Γ ro ® .5 -¾ α> 2 ro ω
Eg ΐ«ϋ"%2! g So ^?Φ0)5
§ ^ g 2 Β £ ^ S
g Φ $ LU Ο > > U. Q
5> ro <ο ra" 00 ίΓ cd 00 σ> o' 2 Έ ο υ 1 fn C 1- i— c ro ro ro t ro (/)(/) 0 _ 0 2 3 2 ro' ro c ^E^roE ^ro proro § wpoEoEEEEE .
-ο o-p^o.Eroorooo £3 σ ωθ-foo^o^oo £j ^ > w^cTroro/iironcroro -<- to CD 0 ro w c -b w ϋ3 « (/) 'to
ro C'J
ro 2N 1
ECn t~ t- LO
» g
Si,*! gS”fc 1 ,?s5Si Τ?8ο §EroEoro'>tfl^ro 8{8Ep>,5ro-2cE g £ ^ § g 8 1 § § Ϊ 8 is°§i s f s I 11 g ||E § roils
θ°φ8^Φ<Λ^Φε io^CDCO
« 9J25§ccwc-§ ro si^L-gJ
3 t φ Ϊ ^ .2 .2 2 .5 >. c b 0QjDro^>>O>C.E ~^> ^: :2 ro i- > u.<i2<<o:<(ow - Λ . ΐί “· < U -i r ^ r c ro ^¾¾°¾ Γ" ·*-* W) m Φ Q) J= (Λ ^ 2«= «5 ® -! g ~ Λ „ o o uj o °
UJ Q
CO O " ^ X /O 01 " < c H O £ro2EE<D«E^’« om co 20 DK 174459 B1
Relativt høje niveauer af c-fos-relaterede sekvenser blev detekteret i po-ly{A*)-RNA præpareret fra 6, 7, 8 og 9 dages concepti indeholdende selve embryoet og ekstraembryonale væv. Mere end 10 gange lavere fosekspression blev iagttaget i embryoer på senere udviklingsstadier dissekeret 5 fri fra ekstraembryonale væv. Data fra placentaen og ekstraembryonale membraner for føti fra dagene 10 -18 viste at ekspressionen primært var i disse væv. I postnatalt væv kunne c-fos-ekspression iagttages i alle undersøgte væv med kraftigere hybridisering til fos-specifikke sonder fra knogler.
Hybridisering viste, at for c-abl iagttages ca. tre gange højere niveauer i selve 10 embryoet end i ekstraembryonale membraner og placenta efter den tiende dag fra befrugtningen sammenlignet med den koncentration der iagttages i de 6, 7 og 9 dage gamle concepti. Ekspression af c-abl i føtuset viser sig at formindskes efter den 11. dag af prænatal udvikling. Oncogenet c-abl er transkriptionelt aktivt i alle undersøgte postnatale musevæv, idet milt- og thy-i 5 mus-poly(A+)-RNA udviser en lidt stærkere hybridisering end fra andre væv.
Oncogenet c-rasHa viste sig at blive udtrykt i betydelige, men lignende niveauer i alle stadier af prænatal udvikling, både i selve embryoet og i ekstraembryonale væv. Høje niveauer af c-rasHa-ekspression blev også observeret 20 i forskelligt væv fra nyfødte eller 10 dage gamle mus, især i knogle, hjerne, nyre, hud og milt.
Oncogenet c-myc var detekterbart ved dagene 7 og 8, men meget højere niveauer blev observeret i sen embryonisk udvikling (dagene 17 og 18).
Oncogenet c-erb havde maksimal hybridisering ved dag 13, mens der ikke 25 blev iagttaget hybridisering ved dag 6
Oncogenet c-src blev detekteret i dets højeste niveauer i den sidste halvdel af museembryonisk udvikling med en forøgelse begyndende ved dag 14, maksimum ved dag 15 og gradvist dalende derefter. For oncogenet c-s/s blev maksimal ekspression observeret ved dag 7 og 16, hvor dag 7-maksimet var 30 1,5 til 3 gange højere end alle andre dage, og dag 16-maksimet var 1,5 til 2 gange højere end ved dagene 9 -13 og dagene 17 og 18.
21 DK 174459 B1
Ved den næste undersøgelse anvendtes nucleotidsekvensen fra det formodede oncogen-område af Avian myeloblastosis virus myb (Vister et al. (1982) i ovenfor). Under anvendelse af den offentliggjorte nucleotidsekvens blev et j antal antigeniske oligopeptidsekvenser afledt, og 7 af de således afledte po- 5 lypeptider blev syntetiseret og evalueret som værende potentielt antigeniske.
Disse 7 oligopeptider, der også er anført ovenfor som antigeniske oligopepti-der, har følgende formler: (1) pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-glu-tyr-arg- lys-met (2) pro-ser-pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro- glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala- 10 arg (3) asp-asn-thr-arg-thr-ser-gly-asp-asn-ala-pro-val-ser-cys-leu-gly-glu i (4) pro-gln-glu-ser-ser-lys-ala-gly-pro-pro-ser-gly-thr-thr-gly (5) met-ala-phe-ala-his-asn-pro-pro-ala-gly-pro-leu-pro-gly-ala (6) pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro-glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala 15 (7) pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-thr-glu-tyr-arg-lys-met-his-gly-gly-ala-val
Polypeptiderne blev knyttet til albueskæl-hæmocyanin i overensstemmelse med konventionel teknik (Dockray, Regulatory Peptides (1980) 1:169), og det dannede immunogen blev anvendt til at immunisere kaniner ved en første injektion med Freund’s complete adjuvant, efterfulgt af injektioner med 20 Freund's incomplete adjuvant i perioder på 3 - 4 uger for at hyperimmunisere kaninerne. Kaninerne blev blodtappet gentagne gange i en periode på 6 måneder. Af de 7 oligopeptider som resulterede i produktion af antistoffer, blev der udvalgt antistoffer over for to peptider (5 og 7) til detaljeret analyse. Antistofferne blev omsat med radioaktivt mærkede cellelysater fra en cellelinie 25 indeholdende multiple kopier af Avian myeloblastosis virus og med lysater fra passende ikke-inficerede cellelinier. Antistof nr. 5 identificerer et specifikt protein på tilnærmelsesvis 58 000 dalton som er tilstede i den virus-inficerede cellelinie, men ikke i kontrollerne.
Antistof over for polypeptid 5 blev også omsat med plasma fra kyllinger, som 30 havde tumorer induceret af amv. Et bånd mage til det der blev observeret med de ovennævnte lysater på tilnærmelsesvis 48 000 dalton, blev identificeret.
22 DK 174459 B1
Antisera over for polypeptid nr. 5 blev også omsat med lysater af en myeloid human leukæmi-cellelinie (HL-60), der vides at udtrykke mRNA transkripter af c-myb-genet (Gallo and Wong-Staal, Blood (1982) 60: 545). Dette antistof reagerede med et protein på ca. 90 000 dalton. I frisk isolerede myeloid leu-5 kæmi-celler identificerer antistofferne en serie proteiner, 14 kd til 70 kd, som ikke findes i normale hvide blodceller.
De polyklonale antistoffer over for fragmentet nr. 5 af /7?yfc>-proteinet blev prøvet for deres evne til at dræbe normale og leukæmiske celler. Den anvendte procedure er beskrevet i Tarasaki and McClelland, nedenfor. Dataene er an-10 ført i den følgende tabel 5.
DK 174459 B1
CM T- CO CD CM i- CM CM CM
_l _i
T- T- CO ID (D t 7 Cl CN
CD
J £ 2 ,-r· 'f- co cd co μ· T- ^ — <2- c OZ to
ΰ E
Ij ® LU Cl
O CM ^— 00 *— ttx— t—- r— E
UJ m B ^ Z
z SH 8= ¥ < æ< -fer c
S LL Ό _Q
0 T- r· CODv^-^rT-Ojg >,
-1- T- > C
(T ί ' C <D
1 +l_ O (C ^ O J » > £ ^ Φ O ~ t- i: £ί M CD d _Ω ό LU ϋ j5 ^ CO CD T- -c- t- T- i- _ 3 < 1 CD 05
° 9? TO
LL Tf CD
O O Ό m H rt CM > ΓΊ co .— er- L.
p q(- ^ cococDcocrcMcv J ω Z 2 w ot _ < ^ cd
CM *_ Q) .S
CO n b m > — ω -S ^ 5: 2 E «5 cd ro
f § (— t- COr-T-v-T-i-T-^^.^ V E
fc O #τίϊ 2φ ®
Z Z O c ^ O -s JC
< 00 TO φ ·£ .E 3 u- ό Q) JS p ω J2 * to II 75 υ —S % UJ L CD -r- OOi-T-T-t-r-t-CDg.^ E (Dm ti sJ Stili o 2 ° s § ί ε 81 x -S S = .c .$ §-j S.
og. sSlra-gle
Jr tt Φ o. fe ra o O) Λ 2 c , , ΓΗ ΤΓ . «Μ T: i-5!?cji5^ tf ^ ^ S.gB-1 ε25ϊ§ ^ S®B-§gro§E =
T3UD5®r 3 3l· g £ Id ω α I " to I
c ^ S
=3 p o 2-9 E V £ ro j o j2 j1? uj ω I £ c e .i §oK0<2l<<l· 5 ^ ° co ° i (B 11 i I- < 2 i < o. S°u_i+ + 24 DK 174459 B1
De ovenstående resultater viser at ekspressionsproduktet af myb-genet kan reagere med antistoffer til at frembringe lyse med komplement. Det må således antages, at myb-proteinet er et overflademembranprotein som er til rådighed for binding til antistoffer. Ved at identificere proteiner, hvortil specifik-5 ke antistoffer vil binde, hvilke proteiner har diagnostisk værdi som indikative for malignitet, kan de maligne celler identificeres og behandles. I det her beskrevne arbejde er der ikke foretaget nogen bestemmelse mht. specificiteten eller krydsreaktiviteten af antistoffer. Da der kun blev anvendt et fragment til fremstilling af antistofferne, må man forvente, at antistoffer med større bin-10 dingsspecificitet og større bindingsevne kunne fremstilles med hele proteinet, især med hele proteinet i en membran. Antistofferne kan anvendes til at selektere for antistoffer der binder til det samme eller et andet determinant-site.
De angivne data demonstrerer at der kan fremstilles antistoffer som ikke påvirker normale B- og T-celler, men er cytotoxiske i kombination med komple-15 ment for et antal forskellige maligne celler. Derfor kan antistofferne anvendes til cancer-terapi uden risiko for i væsentlig grad at inaktivere immunsystemet.
Det er indlysende på basis af de ovennævnte resultater, at man kan påvise tilstedeværelsen af malignitet i humane værter ved at bestemme transkrip-tions- og/eller ekspressionsprodukterne af oncogenet. Man kan screene re-20 trovira eller en anden kilde til nucleinsyrer for transformering af hvirveldyr til malignitet. Man kan derpå anvende disse nucleinsyrer til at udlede peptidsammensætningen og screene maligne celler for transkripter eller peptider ved hybridisering i førstnævnte tilfælde og med passende receptorer i sidstnævnte tilfælde, idet der anvendes enhver af en lang række forskellige-25 diagnostiske assays. Der kan fremstilles antistoffer overfor peptiderne, hvilke antistoffer kan mærkes og derpå anvendes til diagnosticering af tilstedeværelsen af et peptid som er diagnostisk for malignitet. De oncogene proteiner har vist sig at være tilgængelige for binding til antistoffer som overflademem-branproteiner. Antistofferne kan tjene som diagnostiske reagenser til be-30 stemmelse af tilstedeværelsen af malignitet og bestemmelse af positionen af maligne celler. Antistofferne kan også tjene til behandling af tumorer in vivo ved anvendelse af radionuclider, toxiner, i kombination med værtens komplementsystem eller opsoniner, eller andet antistofafhængigt lytisk system eller lignende. Antistofferne finder anvendelse i præ- og postoperative sy- 25 DK 174459 B1 stemer, i de sidstnævnte til bestemmelse af om fuldstændig fjernelse er sket eller om der forekommer metastaser. Antistofferne kan anvendes postoperativt til at destruere alle rester af tumoren som eventuelt ikke er blevet udskåret.
5
Claims (1)
- DK 174459 B1 Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid indeholdende op til ca. 20 aminosyrerester og indeholdende en eller flere af de følgende ami-nosyresekvenser: 5 (a) pro-gln-glu-ser~ser-lys-ala-gly-pro-pro-ser-gly-thr-thr-gly, (b) met-ala-phe-ala-his-asn-pro-pro-ala-gly-pro-leu-pro-gly-ala, (c) pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro-glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala, (d) pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-thr-glu-tyr-arg-lys-met-his-gly-gly-ala-val, (e) pro-phe-his-lys-asp-gln-thr-phe-thr-glu-tyr-arg-lys-met, 10 (f) asp-asn-thr-arg-thr-ser-gly-asp-asn-ala-pro-val-ser-cys-leu-gly-glu, (g) pro-ser-pro-pro-val-asp-his-gly-cys-leu-pro-glu-glu-ser-ala-ser-pro-ala-arg, (h) arg-leu-ileu-glu-asp-asn-glu-tyr-thr-ala-arg-gln-gly-ala-lys-phe-pro, (i) asn-arg-glu-val-leu-asp-gln-val-glu-arg-gly-tyr-arg-met-pro, (j) arg-leu-lys-lys-ileu-ser-lys-glu-glu-lys-thr-pro-gly-cys-val-lys-ileu-lys-lys, 15 (k) asp-leu-pro-ser-arg-thr-val-asp-thr-lys-gln-ala-gln-glu-leu-ala-arg, (l) met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-gly-ala-ser-gly-val-gly-lys-ser-ala, (m) glu-asp-ileu-his-gln-tyr-arg-glu-gln-ileu*lys-arg-val-lys-asp-ser-asp-asp, (n) val-arg-glu-ileu-arg-gln-his-lys-leu-arg-lys-leu-asn-pro-pro-asp-glu-ser-gly- pro, 20 (o) met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-arg-gly-val-gly-lys-ser-ala, (p) met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-val-gly-val-gly-lys-ser-ala, (q) met-thr-glu-tyr-lys-leu-val-val-val-gly-ala-gly-gly-val-gly-lys-ser-ala, (r) val-asp-glu-tyr-asp-pro-thr-ileu-glu-asp-ser-tyr-arg-lys-gln-val, (s) arg-his-ser-thr-ser-ser-ser-glu-gln-glu-arg-glu-gly-gly-arg, 25 (t) ser-arg-glu-ala-ala-asp-gly, (u) asn-gln-thr-arg-glu-phe-vahglu-lys-gly-gly-arg, (v) pro-glu-val-gln-lys-pro-leu-his-glu-gln, (w) phe-leu-arg-thr-glu-gly-ala-ala-ala-asp-glu-asp-ala-ala-ala, DK 174459 B1 (x) phe-leu-arg-thr-glu-gly-ala-arg-leu-arg-met-lys-thr-leu-leu, (y) ser-ala-pro-arg-ser-ser-pro-ser-thr-ser-ser-trp-ser-ser, (z) asp-gln-gln-arg-leu-gly-arg-arg-thr-arg-arg-arg-val-arg-lys, (aa) glu-arg-gln-glu-ala-glu-arg-his-asn-val-leu-glu-arg-gln-arg-arg-asn-glu, 5 (bb) arg-leu-ileu-ala-glu-lys-glu-gln-leu-arg-arg-arg-arg-glu-gln, (cc) arg-lys-lys-asn-lys-lys-lys-ser-glu-glu-ileu-asp, (dd) pro-pro-thr-thr-ser-ser-asp-ser-glu-glu-glu-gin-glu, (ee) arg-thr-leu-asp-ser-glu-glu-asn-asp-lys-arg-arg, (ff) glu-arg-gln-arg-arg-asn-glu-leu-lys-leu-arg, ^ (99) glu-gln-leu-arg-arg-arg-arg-glu-gln-leu-lys, (hh) asn-asn-glu-lys-ala-pro-lys-val-val, (ii) arg-arg-glu-gln-leu-lys-his, (jj) lys-glu'lys-glu-tys-leu-glu-phe-ileu-leu, (kk) pro-glu-glu-glu-lys-arg-arg-ileu-arg-arg-glu-arg, 15 (||) leu-gln-glu-ser-ser-lys-ala-ser-gln-pro-ala-val-ala-thr-ser, (mm) asn-pro-glu-val-lys-lys-thr-ser-trp-thr-glu-glu-glu-asp-arg, (nn) try-arg-arg-asp-pro-glu-glu-arg-pro-thr, og (oo) ala-ser-pro-tyr-pro-asn-leu-ser-asn-gln-thr-arg, kendetegnet ved, at der syntetiseres en dobbeltstrenget DNA-sekvens, som 20 koder for oligopeptidets aminosyresekvens, at denne dobbelststrengede DNA indsættes i et passende site i et kloningsmedium eller en vektor til dannelse af et rekombinant DNA-molekyle, hvorefter en egnet værtsorganisme transformeres med det nævnte rekombinante DNA-molekyle til opnåelse af ekspression of oligopeptidet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK200100933A DK174459B1 (da) | 1983-05-19 | 2001-06-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid |
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49602783A | 1983-05-19 | 1983-05-19 | |
| US49602783 | 1983-05-19 | ||
| DK498083 | 1983-10-31 | ||
| DK498083A DK498083A (da) | 1982-11-04 | 1983-10-31 | Fremgangsmaade til bestemmelse eller isolering af maligne humane celler, antistof eller antigent oligopeptid og fremgangsmaade til fremstilling af samme |
| US43925283A | 1983-11-04 | 1983-11-04 | |
| US43925283 | 1983-11-04 | ||
| DK200100933A DK174459B1 (da) | 1983-05-19 | 2001-06-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid |
| DK200100933 | 2001-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK200100933A DK200100933A (da) | 2001-06-15 |
| DK174459B1 true DK174459B1 (da) | 2003-03-24 |
Family
ID=27222045
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK200100933A DK174459B1 (da) | 1983-05-19 | 2001-06-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid |
| DK200100931A DK200100931A (da) | 1983-05-19 | 2001-06-15 | Fremgangsmåde til isolering af humane celler |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK200100931A DK200100931A (da) | 1983-05-19 | 2001-06-15 | Fremgangsmåde til isolering af humane celler |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (2) | DK174459B1 (da) |
-
2001
- 2001-06-15 DK DK200100933A patent/DK174459B1/da not_active IP Right Cessation
- 2001-06-15 DK DK200100931A patent/DK200100931A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK200100931A (da) | 2001-06-15 |
| DK200100933A (da) | 2001-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI79411B (fi) | Foerfarande foer vaerdering av cellernas malignitet, vid foerfarandet anvaendbara antikroppar, antigener, deras framstaellning och anvaendning. | |
| US4699877A (en) | Methods and compositions for detecting human tumors | |
| AU2005245815B2 (en) | Methods of diagnosing or treating prostate cancer using the erg gene, alone or in combination with other over or under expressed genes in prostate cancer | |
| EP2300041B1 (en) | Method for determining risk of recurrence of prostate cancer | |
| USRE35491E (en) | Methods and compositions for detecting human tumors | |
| AU2003200731C1 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumor | |
| WO2005084116A2 (en) | Calcium channel variants | |
| WO2014014157A1 (ko) | 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도 | |
| DK174459B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid | |
| US20100330554A1 (en) | Diagnostic kit for solid cancer and medicament for solid cancer therapy | |
| DK174458B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et antigenisk oligopeptid | |
| WO2009066821A1 (en) | Characterization of esm-1 as a tumor associated marker of colorectal cancer | |
| KR101845590B1 (ko) | 유전자를 이용한 폐암 예후예측용 조성물 | |
| KR100861465B1 (ko) | 위암 유발 유전자 ＺＮＦ312ｂ와 이에 의해 코드되는단백질 및 이를 이용한 위암 진단 키트 | |
| KR100861464B1 (ko) | 발암/전이유전자 ｔｉｐ41과 이에 의해 코드되는 단백질 및이를 이용한 발암 및 전이 진단 키트 | |
| US20120100144A1 (en) | Biomarker and Treatment for Cancer | |
| WO2006131783A2 (en) | Polynucleotides, polypeptides, and diagnosing lung cancer | |
| US20070048808A1 (en) | Hepatocellular carcinoma screening | |
| WO2005072050A2 (en) | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of breast cancer | |
| CN111254200B (zh) | Gal3st3基因的新用途 | |
| WO2005072053A2 (en) | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of colon cancer | |
| AU2011213720B2 (en) | Methods of diagnosing or treating prostate cancer using the ERG gene, alone or in combination with other over or under expressed genes in prostate cancer | |
| WO2006021874A2 (en) | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of prostate cancer | |
| EP1732943A2 (en) | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of breast cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |