DK174706B1 - DNAsekvens, ekspressionsvektor, værtscelle, cDNA, fremgangsmåde til isolering og identificering af DNA samt anvendelse af DNA-sekvensen for et pollen allergen protein - Google Patents

Description

i DK 174706 B1

Den foreliggende opfindelse angår et vigtigt allergen protein Lol pi fra pollen af rajgræs, Lolium perenne L. samt derivater og homologer heraf, og allergene proteiner, der er immunologisk beslægtet dermed. Den foreliggende opfindelse angår nærmere bestemt en DNA-sekvens, der koder 5 for et allergent protein fra pollen fra familien Poaceae. Den foreliggende opfindelse angår også en ekspressionsvektor og cDNA omfattende DNA-skvens. Den foreliggende opfindelse angår yderligere en fremgangsmåde til isolering og identificering af DNA, der koder for et allergent protein fra græs samt anvendelse afen DNA-sekvens.

10

Allergener udgør de mest talrige proteiner i græspollen, som er den vigtigste årsag til allergene lidelser i tempererede klimaer (Marsh, 1975, Hili et al., 1979). De første beskrivelser af deres allergene proteiner viste, at de er immunokemisk forskellige og er kendt som grupperne I, II, III og IV (Johnson 15 og Marsh 1965, 1966). Under anvendelse af den af International Union og Immunological Societies' (IUIS) for nyligt foreslåede nomenclatur, benævnes disse allergener Lol Bl. Lol βΙΙ, Lo! plH og Lol pIV. Det vigtigste allergen Lol fil er et surt glycoprotein med molekylevægt på ca. 32 kD, og omfatter ftre isoallergene varianter. De andre mindre vigtige allergener, som isoleres fra 2 o rajgræspollen, har en molekylevægt på fra 10 til 76 kD (jf. oversigt ifølge Ford and Baldo, 1986). Allergenet Lol fil udgør ca. 5% af den totale mængde extraherede pollenproteiner, og er et glycoprotein (Howlett & Clarke, 1981) indeholdende en 5% kulhydratenhed. Undersøgelser med kulhydratspaltning har vist, at kulhydratet ikke bidrager til det allergiske svar. Allergenaktivitet 25 tabes efter proteolytisk fordøjelse (jf. redegørelsen ifølge Baldo, Sutton &

Wrigley, 1982), men kan modstå varmebehandling, f.eks. 100 °C i 30 min. ved neutralt pH (Marsh et al., 1966).

Lol fil defineres som et allergen p.g.a. dets evne til at binde specifikt til IgE i 30 sera fra rajgræsfølsomme patienter, til at virke som et antigen ved IgG-svar, og ved at udløse T-cellesvar. De allergene egenskaber er blevet fastlagt ved direkte hudafprøvning på græspollenfølsomme patienter. Resultaterne viste, at 84% var hudfølsomme overfor Lol fil (Freidhoff et al., 1986), hvilket viser dette proteins primære betydning som det vigtigste allergen. Endvidere DK 174706 B1 2 havde 95% af patienterne, som viste sig at være græspollenf øl somme, specifikt IgE-antistof, der bandt til Lol pi, hvilket blev vist ved immunoblotting (Ford & Baldo, 1986).

5 Væsentlig allergen krydsreaktivitet mellem græspollen er blevet vist under anvendelse af en IgE-bindingsanalyse, f.eks. radioailergo-sorbenttesten (Rast), som beskrevet af Marsh (1970) og Lowenstein (1978).

Det immunokemiske forhold mellem Lol pi og andre græspollenantigener er 10 blevet vist under anvendelse af både polyklonale og monoklonale antistoffer (jf. Smart og Knox, 1979; Singh & Knox, 1985), Der er blevet fremstillet antistoffer mod både oprensede proteiner og IgE-bindingskomponenter.

Disse resultater viste, at det vigtigste allergen, som er til stede i pollen fra nært beslægtede græsarter, immunokemisk svarer til Lol pi (Singh & Knox, 15 1985).

Yderligere baggrundsinformation angående græspollenallergener kan findes i følgende redegørelser: 2 0 Marsh (1975), Howlett & Knox (1984), Baldo, Sutton & Wrigley (1982) og Ford & Baldo (1986).

Nylige fremskridt indenfor biokemien og rekombinant DNA-teknologi har gjort det muligt at syntetisere specifikke proteiner, f.eks. enzymer, under styrede 25 betingelser uafhængig af den organisme, hvorfra de normalt isoleres. Disse biokemiske syntesemetoder benytter enzymer og subcellulære komponenter fra proteinsyntesesystemer i levende celler, enten in vitro i cellefri systemer eller in vivo i mikroorganismer. I begge tilfælde er det grundliggende element tilvejebringelsen af en deoxyribonukleinsyre (DNA) med specifik sekvens, 30 hvilken indeholder den information, der er krævet for at specificere den ønskede aminosyresekvens. En sådan specifik DNA-sekvens benævnes et gen. Kodeforholdet, hvormed en deoxyribonukleotidsekvens anvendes til at fastlægge et proteins aminosyresekvens, er velkendt og fungerer ifølge et sæt af fundamentale principper (jf· f.eks. Watson, 1976).

DK 174706 B1 3

Der kan anvendes et klonet gen til at fastlægge aminosyresekvenser af proteiner syntetiseret af in vitro systemer. DNA-dirigerede proteinsyntesesystemerer er velkendte indenfor fagområdet. Enkeltstrenget 5 DNA kan induceres til at virke som messenger RNA (mRNA) in vitro, hvilket medfører en meget korrekt translation af DNA-sekvensen.

Det er nu muligt at isolere specifikke gener eller dele heraf fra højere organismer, såsom planter, og at overføre generne eller DNA-fragmenter til 10 en passende vektor, såsom en lambda-gt 11-fag, til mikroorganismer såsom bakterier, f.eks. Escherichia coli. Det overførte gen replikeres og formeres når den transformerede mikroorganisme replikeres. Den transformerede mikroorganisme er følgelig udrustet med enven til at frembringe det ønskede protein eller gen, som f.eks. koder herfor, og enzym, og derpå overføre 15 denne evne til dets afkom, jf. f.eks. Cohen & Boyer, U S. Patent nr. 4.237.224 og 4.468.464. De bakterielle kloner indeholdende den rekombinante fag screenes for det bestemte genprodukt (protein) ved hjælp af specifikke antistoffer.

20 Ifølge den foreliggende opfindelse klones det gen der koder for Lol pi, og dermed muliggøres der fremstilling af recombinant allergen i stor skala.

I et første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en DNA-sekvens, der udviser mindst 60 % homologi med den i Figur 5 afbildede sekvens og 25 koder for et allergent protein fra pollen fra familien Poaceae. Nærmere bestemt tilhører græsarterne familien Poaceae (Gramineae). og mere fortrinsvis slægten Lolium. Endnu mere fortrinsvis er det allergene protein ejendommeligt ved at være immunologisk krydsreaktivt med antistof mod Lol pl-protein fra Lolium perenne-pollen. nemlig: 30

Pooide (festucoide)-græsser. Gruppe 1: Triticanae: Bromus inermis. glat hejre; Aaroovron repens, almindelig kvik; A.cristatum: Secale cereale. rug;

Triticum aestivum. hvede. Gruppe 2: Poanae: Dactvlis qlomerata.

hundegræs; Festuca elatior. eng-svingel; Lolium perenne almindelig DK 174706 B1 4 rajgræs; L.multiflorum. Italiensk rajgræs; Poa pratensis, engrapgræs; P.compressa. fladstrået rapgræs; Avena sativa. havre; Holcus lanatus. fløjlsgræs; Anthoxanthum odoratum. vellugtende gulaks; Arrhenatherum elatius, draphavre; Agrostis alba, krybhvene; Phleum pratense, timothé; 5 Phalaris arundinacea. rørgræs. Panicoide græsser, Paspalum notatum. Bahia-græs, Andropogonoide græsser: Sorghum halepensis. Johnson-græs.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere en DNA-sekvens, der udviser mindst 60 % homologi med den i Fig. 5 afbildede sekvens og koder for et allergent 10 protein fra et pollen fra græs, som er allergent krydsreaktivt med et allergent pollenprotein fra Lolium perenne. som påvist ved IgE-bindingsstudier.

I et andet aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en ekspressionsvektor omfattende en DNA-sekvens som ovenfor defineret.

15 Nærmere bestemt tilvejebringer opfindelsen et rekombinant DNA-moiekyle omfattende en eukaryotisk eller prokaryotisk replikationsorigin, en detekterbar markør, en DNA-sekvens som ovenfor defineret, og eventuelt en promotersekvens, som er i stand til at dirigere transkription af det allergene protein.

20 I et tredje aspekt tilvejebringer opfindelsen en værtscelle, der er transformeret til at udtrykke et protein eller et polypeptid, der kodes af en DNA-sekvens som ovenfor defineret. Værtscellen kan være E coli.

2 5 Den foreliggende opfindelse tillader derfor fremstilling af rekombinant AP, der er immunologisk reaktivt over for antistoffer mod Lol jdI, ved hvilken man dyrker en værtscelle indeholdende en vektor som ovenfor defineret, hvilken vektor indeholder en promoter, der er i stand til ekspression i værtscellen, den ovenfor definerede DNA-sekvens, som er anbragt nedenstrøms for og 30 transkriberes fra promoteren, en selekterbar markør og en DNA-vehikel indeholdende en prokaryotisk eller eukaryotisk replikationsorigin, under betingelser og i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opretholde det rekombinante DNA-molekyle stabilt og dirigere syntesen af AP.

DK 174706 B1 5 I et fjerde aspekt tilvejebringer opfindelsen et cDNA omfattende en DNA-sekvens som defineret i ethvert af kravene 1-3, og som kan opnås ved, at man: 5 ekstraherer RNA fra rajgræspollen og med affinitetschromatografi udvælger Poly (A+) mRNA, som skal anvendes som template ved syntese af enkeltstrenget cDNA; syntetiserer og isolerer dobbeltstrenget cDNA; 10 opretter et lambda-gt 11 cDNA-ekspressionsbibliotek; screener lambda-gt 11 cDNA-ekspressionsbiblioteket efter induktion med IPTG under anvendelse af monoklone antistoffer karakteriseret 15 ved Smart et al., Int Archives of Allergy and Appl Immunol., 72, 243-248 til at afsøge filterløft in duplo og identificere og isolere positive phag-plaques; udplader plaquene ved lav densitet og udfører filterløft in duplo af 20 plaquene; screener phag-plaquene indeholdende kloner, som producerer protein allergen ved at inkubere filterløftene med allergiske antisera eller med de Smart et al monoklone antistoffer og identificere de kloner, der er 25 positive, når de screenes med monoklone antistoffer og positive, når de screenes med allergiske antisera; genindvinder cDNA-indføjelsen fra de allergiske antisera og den antistof-positive phag og ved størrelsesanalyse identificerer indføjelser 30 på ca. 1200 basepar; indsætter indføjelserne i en plasmidvektor til sekventering og ekspression; DK 174706 B1 6 sekventerer cDNA'et; og sammenligner det sekventerede DNA's restriktionskort med det i Fig. 9 viste cDNA-restriktionskort og identificerer de kloner, der i det 5 væsentlige har samme restriktionskort som det i Fig, 9 viste.

Opfindelsen indbefatter endvidere en fremgangsmåde til isolering og identificering af DNA, der koder for et allergent protein fra pollen fra græs, ved hvilken man anvender et cDNA som ovenfor defineret som en heterolog 10 probe til isolering af de homologe cDNA-kloner af protein allergener fra pollen fra græs, I et femte aspekt angår opfindelsen anvendelse af en DNA-sekvens som defineret ovenfor ved fremstilling af et protein eller polypeptid, der kodes af 15 DNA-sekvensen.

I et sjette aspekt angår opfindelsen anvendelse af en DNA-sekvens som ovenfor defineret eller et cDNA som ovenfor defineret som en probe til isolering og identificering af nukleinsyre, der koder for det allergene protein 2 0 eller polypeptid.

Yderligere egenskaber ved den foreliggende opfindelse vil fremgå bedre af den efterfølgende detaljerede beskrivelse af foretrukne udførselsformer for opfindelsen i forbindelse med de tilhørende tegninger.

25 I nærværende beskrivelse anvendes biokemisk standardnomenklatur hvor nukleotidbaserne benævnes som adenin (A); Thymin (T); Guanin (G) og cytosin (C). Andre forkortelser omfatter 30 BSA Kvægserumalbumin.

DEPC Diethylpyrocabonat.

DNA Deoxyribonukleinsyre.

DK 174706 B1 7 DTT Dithiothreitol.

EDTA Dinatriumethylendiamintetra-acetat.

5 IPTG Isopropyl-thio-beta-D-galactopyranosid.

IB-MEDIUM Luria-Bertani-medium (1% (vægt/volumen)

Bactotrypton, 1% (vægt/volumen) NaCI & 0,5% 10 (vægt/volumen) Bacto-gærekstrakt i vand til pH 7,5).

LIGATIONSPUFFER (10 x opløsning) 0,66 M Tris Cl (pH 7,5) 50mM MgCI2, 50mM DTT, 10mM ATP.

15

LiCI Lithiumchlorid.

PEG Polyethylenglycol.

2 o pfu Plaquedannende enheder.

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid.

PRØVEPUFFER 50mM Tris-CI, pH 6,8, 1,5% (vægt/volumen) SDS, 25 50mM DTT, 4M Urinstof, 1m MPMSF.

SDS Natriumdodecyl sulfat.

SM PUFFER Fagopbevaringspuffer (0,1M NaCI, MgS047H20, 30 50mM Tris HCI pH 7,5, 2% (vægt/volumen) gelatine).

SSC 20 x opløsning af 3M NaCI, 0,3M Na3-citrate, pH 7,0.

SSPE (0,15M NaCI, 10mM natriumphosphat pH 7,7,1 mM

DK 174706 B1 8 EDTA Ethylendiamintetra-eddikesyre

TBS Tris-pufret saltopløsning (50mM Tris pH 7,5, 150mM

5 NaCI).

X-gal 5-Brom-4-chlor 3-indolyl-beta-D-galactopyranosid.

På den tilhørende tegninger viser figurene følgende: 10

Fig. 1 viser identification af Lgl pi som det væsentligste allergen fra rajgræspollen med SDS-PAGE og Western-Blotting.

Banerne 1-3. SDS-PAGE-analyse af totale rajgræspollenproteiner og isoleret 15 Lo] pl-allergen, farvet med Coomassie-blåt for proteiner. Bane 1, totale pollenproteiner; Bane 2, Lol pl-isoallergen; Bane 3, Lol pi.

Banerne 4-6. Western-blot af proteiner vist i banerne 1-3, hvilket viser specifik binding af monoklonal antistof FMC-AI til Lol pl-allergen. Dette 20 antistof blev anvendt til at screene cDNA-biblioteket for at udvælge Lot pl-allergenkloner. Bane 4, molekylvægtmarkører; Bane 5, isoallergen; Bane 6,

Lgl pi, 32 kD.

Fig. 2 viser screening af cDNA-biblioteket af rajgræspollen for at udvælge de 2 5 specifikke kloner som udtrykker Lol pl-protein i lambda-gt 11-vektor, (a.b): "Plaque-løft" af 10^-10^ rekombinante fager behandlet med specifikt antistof FMC-AI, med (a) cDNA-klon 6, (b) cDNA-klon 12; (c.d): Rescreening af cDNA-klon 12 med (c) monoklonalt antistof FMC-AI, (d) specifikt IgE fra rajgræspollenfølsomme patientsera. Rekombinant fag indeholdende den 30 specifikke allergen DNA-indføjelse påvises ved disse metoder. Antistofferne påviser alle kloner, som indeholder de antigene determinanter af Lol pi, medens IgE binder til kloner indeholdende de allergene determinanter af Lol pi. Alle klonerne var positive overfor monoklonalt antistof FMC-AI, idet dette er basis for screeningen, medens en del binder til IgE, som med klon 12 her.

DK 174706 B1 9

Fig. 3 viser analyse af E.- coli-fusionsprotein for identitet Lol gi.

Banerne 1-4: SDS-PAGE farvet med Coomassieblåt for proteiner; Bane 1, 5 ikke-rekombinant lysogen lambda-gt 11-ekstrakt; Bane 2, rekombinant lysogent lambda-12RL8-ekstrakt; Bane 3, beta-galactosidase rent E. coli-protein; Bane 4, molekylevægtmarkører, 96KD markøren er anført med en stjerne.

10 Banerne 5-7: Transblot på nitrocellulosemembran; Bane 5 og 8.

molekylevægtmarkører; Bane 6, rekombinant lysogent lambda-1 2RL8-ekstrakt, a indikerer et fusionsprotein identificeret ved binding med FMC-AI. molekylevægt a>c. Bane 7, rekombinant lysogent lambda-6RL2-ekstrakt, b antyder fusionsproteinet identificeret ved binding af FMC-AI, molekylevægt 15 b>c. Den større molekylevægt af a og b i forhold til c antyder indsættelse af cDNA i gt 11-genomet ved lacZ-stedet.

Fig. 4 viser analyse af vævs- og organspecificiteten af Lol pl-genet i rajgræs.

(a) Slot-blot. 2 pg totalt RNA hver isoleret fra pollen (p), blad (I), rødder (r) og 2 0 hydratiserede frø (s) blev slot-blottet på nitrocellulosemembran. Hybridisering med radioaktive prober for klonerne 6 og 12 (p6, p12) forekommer med pollen, men der er total mangel på hybridisering med det andet vævsRNA.

(b) Northern-blot. Totalt RNA isoleret fra disse rajgræsvæv blev adskilt elektroforetisk på en denaturerende agarose gel, overført til nitrocellulose- 25 membran og proberet med p6. Hybridisering forekommer alene med pollenprøven, andet vævsRNA viser mangel på hybridisering. Dette bevis viser, at Lol gl-genet kun udtrykkes i pollen.

Fig. 5 viser en DNA-sekvens på 1240 basepar, som repræsenterer cDNA-30 klonen 12R.

Fig. 6 viser reaktionen mellem rekombinant allergen pGEX-12R (Loj pi) med IgE fra sammenhældt "allergisk" sera. Kulturerne pGEX og pGEX-12R blev dyrket natten over og derpå fortyndet 1:10 i bouillon og dyrket i 2 timer ved DK 174706 B1 10 37 °C. De blev induceret med IPTG og dyrket i 1 time ved 37 °C. Bakterierne blev pelletteret og resuspenderet i PBS til 1/20 af dyrkningsmediets volumen. Bakterierne blev lyseret ved frysning, optøning og ultralydbehandling. Efter dette blev der tilsat et tilsvarende volumen SDS-gelprøvepuffer, og prøverne 5 kogte i 3 minutter før de blev sat på en 10-15% gradient SDS-PAGE. De fraskilte proteiner blev overført til nitrocellulosemembran og disse blots blev bearbejdet med henblik på identifikation af IgE-bindingsproteiner under anvendelse af sammemhældte sera fra allergiske patienter. Der blev anvendt "^i.mgerket anti-human IgE-antistoffer (Kallestad Labs USA) som probe.

10 Fig. 6 viser et typisk autoradiografi hvor bane 1 viser en vektorkontrol uden IgE-binding, medens banerne 2,3 og 4 viser ekspression af rekombinant Lol pi i bakteriekulturer inficeret med pGEX-12R.

Fig. 7 A,b og C viser antigen og allergenligheder for proteiner, der er 15 homologe med Lol pi, i et panel med 17 forskellige græsser. Proteiner blev opløst med SDS-PAGE fra moden pollen som følger: bane a: molekylevægtsmarkører; 1, Bromus inermis; 2, Agropyron cristatum: 3,

Secale cereale: 4; Dactvlus qlomerata: 5, Festuca elation 6, Lolium perenne: 7, L. multiflorum: 8, Poa compressa: 9, Avena sativa: 10, Holcus lanatus: 11, 20 Anthoxanthum odoratum: 12, Aqrostis alba: 13, Phleum pratense: 14,

Phalaris arundinacea: 15, Cvnodon dactvlon: 16, Sorghum halepensis: 17,

Zea mays. Fig. 7A viser proteiner i SDS-PAGE-gel farvet med Coomassieblåt. Fig, 7B viser Western-blot proberet med monoklonalt antistof FMC-AI specifikt for Lp! pi, og viser antigene ligheder mellem Lol pi og 25 homologe allergener i beslægtede græsser, med undtagelse af bane 15,

Cvnodon dactvlon. Fig. 7C viser Western-blot proberet med sammenblandet "allergisk" humansera og anti-lgE-antistoffer, og bekræfter, at Lol pi og dets homologe allergener i andre græsser er det immunodominerende allergen i græspollen.

30

Fig. 8A viser en sammenligning af allergenaktivitet for naturlig og rekombinant Lo! pl-protein. Sera fra 28 forskellige patienter, hvoraf nogle er allergiske overfor græspollen, blev anvendt til at sammenligne IgE-binding af naturlig og rekombinant Lol pl-protein. For naturligt Lp! pi blev en DK 174706 B1 11 referencestandardprøve købt fra The National Institutes of Health (NIAID),

Bethesda, USA. Denne prøve blev fortyndet i 1% (vægt/volumen) BSA-opløsning, og 0,5 Dg blev dot-blottet på nitrocellulosemembran, og blottene blev anvendt til IgE-bindingsanalyse, For afprøvning af IgE-binding til 5 rekombinant Lgl gl-protein blev klonen lambda-gt 11-12R udtrykt i E. coli -værtceller. Der blev anvendt "plaque-løft" på samme måde som dot-blot for afprøvning af IgE-binding. Både plaque-løft og dot-blots blev inkuberet natten over i en 1:10 fortynding af "allergisk" sera, og binding af IgE blev visualiseret under anvendelse af anti-human-kanin IgE (Dakopatts, København, io Danmark). Denne inkubation blev fulgt med peroxidasekonjugeret anti-kanin-ged-lgG, og derpå enzymsubstratet for at opnå en farvereaktion. Fig. 8B viser en korrelation mellem allergenaktivitet for naturlig og rekombinant Lol Bl.

15 Fig. 9 viser restriktionskort for cDNA-inføjelsen til lambda-gt 11-12R, og strategien ved nukleotidsekvensering.

Den oprindelige kilde til det genetiske materiale er frisk rajgræspollen fra Lolium perenne L, indsamlet på marker nær Melbourne, Australien, og 20 indsamlet pollen i store portioner fra en leverandør (Greer Laboratories,

Lenoir, NC). Disse pollenkilder har ikke til hensigt at begrænse opfindelsens omfang, idet de kun repræsenterer én passende pollenkilde. Den foreliggende opfindelse kan udøves under anvendelse af pollen fra ethvert sted. Fig. 1 viser identifikation af Lol gi som det væsentligste allergen i 25 rajgræspollen.

Udtrykket "gen" anvendes i dets bredeste betydning og refererer til enhver sammenhængende sekvens af nukleotider, hvis transkription fører til et mRNA-molekyle, hvadenten dette mRNA-molekyle kan translateres til et 30 polypeptid eller protein. Genet, der koder for Lol gi, betyder den nukleotidsekvens, der koder for hele polypeptidet eller derivater eller homologer af polypeptidet, hvilke kan indeholde aminosyreerstatninger, deletioner eller additioner. I forbindelse med kulhydratdelen af polypeptidet omfatter derivater ligeledes substitutioner, deletioner eller additioner til DK 174706 B1 12 carbohydratdelen. Ld pl-genet refererer også til et cDNA, som er komplementært med det mRNA, som svarer til hele længden eller en del af længden af Lol p l-polypeptidet.

5 For nogle aspekter af den foreliggende opfindelse er det ønskeligt at frembringe et fusionsprotein omfattende Ld gi og en aminosyresekvens fra et andet polypeptid eller protein, hvor eksempler på sidstnævnte er enzymer, såsom beta-galactosidase, phosphatase, urease o.lign.. Hovedparten af fusionsproteinerne dannes ved ekspression af et rekombinant gen, hvori 2 l o kodende sekvenser er blevet forenet, således at deres læserammer er i fase. Polypeptider kan alternativt binde in vitro med kemiske midler. Alle sådanne fusionsproteiner eller hybride genetiske derivater af Ld pi, eller dens kodende nukleotidsekvens er omfattet af den foreliggende opfindelse. Med homologet eller derivater af Lol pi menes endvidere syntetiske derivater 15 heraf. Den heri beskrevne nukleotidsekvens kan anvendes til at frembringe et hvilket som helst antal peptider eller polypeptider ved kemisk syntese, såsom fastfasesyntese, ved velkendte fremgangsmåder. Alle disse kemisk syntetiserede peptider er omfattet af den foreliggende opfindelse. Den foreliggende opfindelse omfatter således også ikke-naturligt Lol pi, fremstillet 20 ved hjælp af rekombinante metoder eller ved kemisk syntese. Den foreliggende opfindelse angår endvidere også proteiner, polypeptider eller peptider, der helt eller delvist svarer til den nukleotidkodende sekvens, der er anført i fig. 5.

25 Det ligger også indenfor den foreliggende opfindelses rækkevidde at indbefatte Lol pi immunologisk krydsreaktive med antistoffer mod Lp! pi.

Udtrykket "immunologisk krydsreaktiv" anvendes i dets bredeste betydning og refererer generelt til et protein, der er i stand til at påvise binding til et antistof, hvor sidstnævnte er specifikt for Lol pi. Et sådant immunologisk 30 beslægtet allergen omtales heri som en immunologisk slægtning til Lol pi.

Kloning af det cDNA, som koder for Lol pi, var baseret på genkendelsen af det protein, der udtrykkes af Escherichia coli transformeret med lambda-gt 11-fag, under anvendelse af både specifikke monoklonale antistoffer og DK 174706 B1 13 specifikt serum IgE fra græspollenfølsomme patienter. To sådanne kloner betegnes 6R og 12R. Der blev også isoleret cDNA-kloner på basis af differentieret antistofbinding. F.eks. blev cDNA-klon 6R isoleret på det grundlag, at det koder for et polypeptid, der er i stand til at binde til 5 monoklonale antistoffer, men ikke til IgE. Polypeptider af denne type mangler tilsyneladende den aminosyresekvens, der specificerer allergeneciteten, og disse cDNA-kioner må således mangle den DNA-sekvens, der koder for samme. De heri anvendte monoklonale antistoffer er FMC-A1, -A5 og -A7, som beskrevet af Knox & Singh (1985).

10

Med henblik på kloning af Lo) gl-genet eller derivater heraf blev mRNA først isoleret fra det modne rajgræspollen. Dette mRNA blev anvendt som en template ved syntese af dobbeltstrengede komplementære DNA’er.

15 Udfra dette cDNA-bibliotek af rajgræspollen blev der påvist en rekombinant fag indeholdende Lo! pl-indføjelsen ved at screene biblioteket med (1) specifikt monoklonalt antistof FMC-A1, (2) specifikt IgE fra sera fra rajgræsfølsomme patienter (fig. 2).

20 Derpå blev EcoRI-linkere fæstnet til begge sider af de valgte kloner af ds-cDNA, og derpå ligeret til EcoRI. lambda-gt 11-vektorarme (skåret og dephosphoryleret som indkøbt fra Promega). Det rekombinante lambda-gt 11-DNA indeholdende cDNA-indføjelserne blev indpakket i moden fag, og den rekombinante fag fik lov at inficere E. coli-værten.

25

Syntese af beta-galactosidase-rekombinant genfusionsprotein blev induceret ved at tilføje IPTG, Lal g l-beta-galactosida$efusionsproteinet blev derpå påvist under anvendelse af monoklonale antistoffer, som specifikt genkender epitoperne på Lol gl-proteinet.

30

Dette fusionsprotein blev isoleret i præparative mængder fra bakterielysogener, fraktioneret ved SDS-polyacrylamidgelelektrorese, og proteinerne blev overført til nitrocellulosemembraner med henblik på probering med monoklonale antistoffer (fig. 3). Disse antistoffer genkendte et DK 174706 B1 14 protein, som udviste en molekylevægt, der var større end den af E. coli-beta-galactosidase, hvilket forventes af et allergen-beta-gaiactosidase-fusionsprotein.

5 Den allergene natur af de foreliggende proteiner karakteriseres delvis ved deres binding af de reagine IgE-antistoffer, som er til stede i højt niveau i sera fra allergiske patienter. IgE-bindingen til epitoperne på allergiproteiner kan påvises ved en chromogen analyse, hvor allergener immobiliseret på fast bærer kan visualiseres ved skiftevis inkubation i (1) serum fra allergiske 10 patienter og (2) enzymmærkede anti-lgE-antistoffer.

Udvalgte cDNA-kloner blev anvendt til at probere total DNA isoleret fra andre rajgræsplanteorganer for at afprøve hvorvidt Lo] pl-allergenet er pollenspecifikt eller ej. Der blev benyttet slot-blotting og northern-analyser (fig. 4).

15 Der kunne ikke påvises hybridisering for total RNA fra blade, frø eller rodprøver. Disse resultater antyder, at Lol pi ikke udtrykkes i disse andre organer af rajgræsplanten.

Udvalgte cDNA-kloner blev ligeret i både M13- og Gamini-vektorer med 20 henblik på sekvensering. De DNA-restriktionsfragmenter, der skal sekvenseres, blev indsat i M13 mp14 (Messing & Vieira, 1982). M13-kloning og DNA-sekvensering ved dideoxykædeterminering blev udført som beskrevet af Bio-rad Laboratories (1980) og Messing (1983). Der blev anvendt en tilsvarende fremgangsmåde til kloning af allergene proteiner fra pollen fra 25 andre medlemmer af familien Poaceae (GramineaeV som er immunologisk krydsreaktive med antistoffer mod Lo| pi eller derivater eller homologer heraf. Sekvensen for cDNA-klon 12R på 1240 basepar er vist i fig. 5. Det er i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse at indbefatte degenererede former for sekvensen og/eller nukleotidsekvenser med i al 30 væsentligt, d.v.s. mindst 60% homologi hermed.

Med den viden kan en lang række ekspressionsvektorer konstrueres til produktion af Lol pi eller derivater heraf. Udtrykket "promoter" anvendes i dets bredeste betydning og betegner almindeligvis den nukleotidsekvens.

DK 174706 B1 15 som binder RNA-polymerase og dirigere samme til det korrekte transkriptionelle startsted, hvorpå et gen eller en anden nukleotidsekvens heraf transkriberes. I nærværende forbindelse siges et gen eller en nukleotidsekvens at stå i forbindelse med promoteren, hvilket betyder at 5 promoteren dirigerer transkription af genet eller nukleotidsekvensen.

Promotoren udvælges også på grundlag af dets evne til at virke i en bestemt vært. Den efterfølgende beskrivelse angår udvikling af prokaryote ekspressionsvektorer, som er i stand til at udtrykke Lol pl-genet eller et gen, som koder for et derivat, homolog eller immunologisk slægtning hertil.

10 Samme principper gælder for konstruktion af eukaryote vektorer. I nærværende beskrivelse indbefatter henvisning til Lol pl-genet også henvisning til gener, som koder for derivater, homologer eller immunologiske slægtninge til Lol pi.

15 Ved konstruktion af passende prokaryote ekspressionsvektorer er transkriptionstermineringssekvenser ønskelige for at forhindre potentiel gennemlæsning med RNA-polymerasen. For at undgå enhver interferering med transkriptionsterminatorerne kan fagfolk indenfor området eliminere det ikke-kodende 3'-område af Lol pl-genet. Samtidig kan man substituere andre 20 kendte transkriptionsterminatorer, f.eks. bakteriofag-lambda-terminatoren.

Den foreliggende opfindelse er således på ingen måde begrænset til anvendelse af en hvilken som helst prokaryotisk transkriptionsterminator.

Andre transkriptionsterminatorer omfatter f.eks. Ipp-terminatorer og fag SP01-terminatoren. Alle ovennævnte terminatorer er tidligere blevet 25 karakteriseret og er velkendte indenfor fagområdet og kan konstrueres enten syntetisk eller ud fra kendte plasmider.

Ekspession af Ld pl-aktivitet i E. coli er på ingen måde begrænset til anvendelse af en bestemt promoter, idet valget af en bestemt promoter ikke 30 er kritisk for virkeevnen af dette aspekt ved den foreliggende opfindelse. Promotere, som kan sættes i stedet for den tidligere eksemplificerede lambda-PL-promoter omfatter, men er ikke begrænset til, E. coli-lactose (]ac)-promoteren, E. coli-tryptophan (trp)-promoteren, E. coli-lipoprotein (IppV promoteren og bakteriofag-lambda P-promoteren. Endvidere kan en eller DK 174706 B1 16 flere promotere anvendes i tandem, såsom f.eks. tre- og lac-promoterne, eller der kan anvendes hybridpromotere, såsom tac-promotere, til at drive ekspressionen af Lol pl-genet. Alle ovennævnte promotere er tidligere blevet karakteriseret, er velkendte indenfor fagområdet og kan konstrueres enten 5 syntetisk eller ud fra kendte plasmider.

Den foreliggende opfindelse er ikke begrænset til anvendelse af noget bestemt prokaryotisk replicon. Der kendes mange repliconer, såsom de fra plasmider pBR322, pACYC184, pUC-plasmiderne o.lign., og er egnet til 10 konstruktion af rekombinante DNA-klonings-og-ekspressionsvektorer, der er udformet til at drive ekspression af Lol pl-kodende DNA-forbi ndel ser ifølge den foreliggende opfindelse. Den foreliggende opfindelse er heller ikke begrænset til de aktuelle selekterbare markører, der er tilstede på de eksemplificerede plasmider. Der eksisterer en lang række selekterbare 15 markører, både for eukaryote og prokaryote værtsceller, og disse er egnet til anvendelse på en rekombinant DNA-klonings-eller-ekspressionsvektor omfattende en DNA-forbindelse (eller sekvens) ifølge den foreliggende opfindelse.

20 Mange modifikationer og variationer af de foreliggende illustrative DNA-sekvenser og -plasmider er mulige. F.eks. tillader degenerering af den genetiske kode substituering af nukleotider i de polypeptidkodende områder, såvel som erstatning af

2 5 TAG

ATC

translationsstopsignalet med

30 TAA eller TGA

ATT ACT

DK 174706 B1 17 translationsstopsignalerne. Sådanne sekvenser kan afledes fra aminosyre-eller DNA-sekvensen af Lol jdI og kan konstrueres ved efterfølgende traditionelle synteseprocedurer.

5 Udøvelse af den foreliggende opfindelse under anvendelse af prokaryote ekspressionsvektorer samt fremgangsmåder beskrevet i nærværende opfindelse, kan anvendes i forbindelse med en lang række værtsorganismer, navnlig Gram-negative prokaryote organismer, såsom Escherichia coli. EL coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 HB101. E. coli K12 C600, E. coli K12 10 SF8, E. coli K12 RR1, E. coli K12 RR1 M15, E. coli K12 MM294, E. coli SG936, o.lign.. Escherichia coli SG936 er beskrevet af Bueli et al. (1985). To af de genetiske mutationer, der er indført i denne stamme, nemlig jon- og htpR -mutationerne, er kendt for at fremme ekspression af ønskede proteiner (jf. f.eks. Goff og Goldberg (1985)). Disse mutationer kan transduceres tit 15 andre stammer af E. coli ved P1-transduktion i overensstemmelse med beskrivelsen ifølge Miller (1972).

Alternativt kan der let anvendes andre prokaryote organismer, såsom Bacillus. Pseudomonas o.lign.. Det vil være nødvendigt med mindre 20 modifikationer i ekspressionsvektorer alt afhængig af den anvendte værtscelle, således at vektoren replikeres, promoteren virker og den selekterbare markør udtrykkes. Sådanne modifikationer er rutine for fagfolk indenfor området.

25 Lignende overvejelser gælder ved udvikling af eukaryote ekspressions-vektorer, og mange er opnåelige til anvendelse i pattedyrsceller, gær- og svampeceller og insektceller. En passende referenceguide for udvikling af eukaryote og prokaryote ekspressionsvektorer er beskrevet af Maniatis et al.

(1982).

30

Lol pl-promoterer kan isoleres fra genomt rajgræs-DNA ved hjælp af en række procedurer, herunder anvendelse af promoterprobevektorer, "kromosomvandring" og S1-nukleasekortlægning og sekvensering som DNA opstrøms for transkriptionsinitieringsstedet. Alle disse metoder er velkendte DK 174706 B1 18 for fagmanden. Under anvendelse af den cDNA-klon, som koder for Lo| gi eller et derivat heraf, som probe-DNA for hybridisering, klones et fragment af DNA, der er nærliggende til, eller omfatter hele eller en del af Lol gl-genet.

Derpå anvendes nukleotidsekvensen af Lol gi, som bestemt ifølge 5 foreliggende opfindelse, til at udvikle en nukleotidprimer ved den promoterproximale ende af Lo[ gl-genet. "Kromosomvandring", S1-endonukleasekortlægning, promoterprober vil let identificere promoteren.

Den foreliggende opfindelse angår følgelig et rekombinant DNA-molekyle 10 omfattende en rajgræspollenpromotersekvens og navnlig promoteren for Lol gl-genet, som er lokaliseret på molekylet, og yderligere med et eller flere restriktionsendonukleasesteder nedstrøms for promoteren, således at den nukleotidsekvens, der indsættes i et eller flere af disse steder, kan transkriberes i den rigtige læseramme. I nærværende beskrivelse har 15 udtrykket "den rigtige læseramme" samme betydning som "i fase".

Førnævnte DNA-molekyle vil fortrinsvis også omfatte en selekterbar markør, såsom et antibiotika- eller andet lægemiddelresistensgen, som f.eks. genet kodende for resistens overfor ampicillin, carbanicilin, tetracycline, streptomycin o. lign.. Det rekombinante molekyle vil yderligere omfatte midler 20 til stabil nedarvning i en prokaryot og/eller eukaryot celle. Dette kan opnås ved at det rekombinante molekyle bærer et eukaryotisk og/eller et prokaryotisk replikationsorigin, som beskrevet ovenfor i forbindelse med ekspressionsvektorer.

25 Det rekombinante molekyle vil alternativt bære et middel til integrering i et værtscellegenom hvorved der tillades replikation af det rekombinante molekyle, synkront med replikation af værtscellegenomet. Eksempler på foretrukne prokaryote værter omfatter bl. a. E. coli. Bacillus og Pseudomonas. Foretrukne eukaryote værter omfatter celler fra gær og 30 svampe, insekter, pattedyr og planter.

De monoklonale antistoffer, der ifølge den foreliggende opfindelse anvendes til at screene cDNA-biblioteket for Lol βΙ-kloner, udviste krydsreaktivitet med allergene proteiner fra pollen fra forskellige beslægtede græsarter. Dette DK 174706 B1 19 viser, at der er homologi mellem allergene proteiner frembragt af disse pollen og Lol pl-allergen, hvilket understøtter den foreliggende opfindelses anvendelighed til alle beslægtede græsarter. Denne homologi kan f.eks. udnyttes til at isolere DNA, som koder for andre allergene proteiner uden 5 behov for proteinmikrosekvensering og oligo-nukleotidprimere. Den foreliggende opfindelse angår også antistoffer mod rekombinant Lol pi.

Sådanne antistoffer er påtænkt at være anvendelige ved udvikling af påvisningsanalyser (immunoanalyser) for Lol pi, navnlig under overvågning af et terapeutisk eller diagnostisk regimen, og ved oprensning af LoJ pi.

10 Antistofferne kan være monoklonale eller polyklonale. Det ligger endvidere indenfor opfindelsens rækkevidde at indbefatte ethvert andet antistof (monoklonalt eller polyklonalt), der er rettet mod det ovenfor omtalte første antistof. Den foreliggende opfindelse angår endvidere anvendelse af disse første eller anden antistoffer i påvisningsanalyser og f.eks. ved overvågning 15 af virkninger af et diagnostisk eller administreret farmaceutisk præparat. Det ligger endvidere indenfor den foreliggende opfindelses rækkevidde at indbefatte antistoffer mod de glycosylerede områder af Lol pi (hvor de er til stede) og mod ethvert molekyle, der er kompleksbundet med Lol pi. Et antistof mod Lol pi omfatter følgelig antistoffet mod Lol pi eller antigene dele 20 heraf og mod ethvert associeret molekyle (f.eks. glycosylerede områder, lipidområder, bærermolekyler, sammensmeltede proteiner o.lign.).

Det heri betragtede Lol pi ©Her dele heraf oprenses og benyttes derpå ved antistoffremstilling. Der kan opnås både polyklonale og monoklonale 25 antistoffer ved immunisering med Lol pi og begge typer er anvendelige ved immunoanalyser. Fremgangsmåder til opnåelse af begge typer sera er velkendte indenfor fagområdet. Polyklonalt sera er mindre foretrukket, men fremstilles forholdsvis let ved at et passende laboratoriedyr injiceres med en effektiv mængde af det oprensede Lol pi eller antigene dele heraf, at serum 30 fra dyret indvindes og at specifikt sera isoleres ved en hvilken som helst af de kendte immunoadsorbentmetoder. Selvom antistoffer fremstillet ved denne fremgangsmåde kan anvendes ved næsten en hvilken som helst type immunoanalyse er de almindeligvis mindre favorable på grund af den potentielle heterogenitet af produktet.

0 DK 174706 B1 20

Anvendelse af monoklonale antistoffer ved immunoanalyse foretrækkes navnlig på grund af evnen til at producere dem i store mængder, samt på grund af homogeniteten af produktet. Fremstilling af hybridomacellelinier til 5 fremstilling af monoklonale antistoffer, hidrører ved at sammensmelte en udødeliggjort cellelinie og lymfocytter, der er sensibiliseret overfor det immunogene præparat, ved metoder, som er velkendt for fagfolk indenfor området (jf· f eks. Douillard og Hoffman (1981) og Kohier og Milstein (1975; 1976)).

10

Ulig fremstilling af polyklonalt sera afhænger valget af dyret på tilgængeligheden af passende udødeliggjorte linier, som er i stand til at sammensmelte med lymfocytter. Mus og rotte har været det valgte dyr ved hybridomateknologi og anvendes fortrinsvis. Mennesker kan også anvendes 15 som kilde til sensibiliserede lymfocytter, hvis der er passende udødeliggjort human (eller ikke-human)-cellelinier tilgængelige. I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan det valgte dyr injiceres med fra ca. 0,1 mg til ca.

20 mg af det rensede Lol gi eller dele heraf. Almindeligvis emulgeres injektionsmaterialet i Feund’s fuldstændige adjuvans. Det kan også være 2 0 påkrævet med "boosting'-injektioner. Påvisning af antistoffremstillingen kan udføres ved at teste antisera med passende mærket antigen. Der kan opnås lymfocytter ved at fjerne milten eller lymfekirtler fra sensibiliserede dyr på steril måde og udføre fusion. Alternativt kan lymfocytter stimuleres eller immuniseres in vitro, som f.eks. beskrevet af Reading (1982).

25

Der er blevet udviklet en række cellelinier, som er egnet til fusion, og valget af enhver bestemt linie til hybridiseringsprotokoller styres af et hvilket som helst af en række kriterier, såsom hastighed, ensartetheden af vækstbetingelser, mangel i metabolismen for en komponent i vækstmediet 30 og potentialet for god fusionsfrekvens.

Hybrider indenfor arter, navnlig mellem ens stammer, fungerer bedre end fusioner mellem arter. Der er flere cellelinier opnåelige, herunder mutanter, der er udvalgt for tab af evnen til at secernere myeloma immunoglobulin.

DK 174706 B1 21

Cellefusion kan induceres enten med virus, såsom Epstein-Barr- eller Sendai-virus, eller poiyethylenglycol. Polyethylenglycol (PEG) er det mest virksomme middel til fusion af somatiske pattedyrsceller. PEG kan være 5 toxisk for celler og der bør afprøves forskellige koncentrationer for deres virkning på levedygtigheden før fusionsforsøg. PEG molekylevægt kan ligge på fra 1000 til 6000. Det giver bedst resultater når det fortyndes til fra ca.

20% til ca. 70% (vægt/vægt) i saltopløsning eller serumfrit medium. I det foreliggende tilfælde foretrækkes udsættelse for PEG ved 37 °C i ca. 30 10 sekunder og anvendelse af museceller. Der undgåes ekstrem temperatur (d.v.s. ca. 45 °C) og det kan være nyttigt at præinkubere hver komponent i fusionssystemet ved 37 °C før fusion. Forholdet mellem lymfocytter og maligne celler optimeres for at undgå cellefusion mellem miltceller, og der anvendes sædvanligvis et forhold på fra ca. 1:1 til ca. 1:10.

15

De vellykkede sammensmeltede celler kan adskilles fra myelomalinien ved hjælp af enhver metode, der er kendt indenfor fagområdet. Den mest almindelige og foretrukne metode er at vælge en malign linie, som er hyposanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT)-deficient, hvilken 2 0 ikke vil vokse i et aminopterinholdigt medium, som kun tillader vækst af hybrider, og som i det væsentlige består af 1x10“4M hyposanthin, 1x10"5M aminopterin og 3x10'5M thymidin, hvilket almindeligvis er kendt som HAT-medium. Fusionsblandingen kan vokse i det HAT-holdige dyrkningsmedium umiddelbart efter fusionen 24 timer senere. Skemaer for supplering af mediet 25 fastsætter almindeligvis opretholdelse i HAT-medium i 2 uger og derpå fodring med enten regulært dyrkningsmedium eller hyposanthin, thymidinholdigt medium.

De voksende kolonier testes derpå for tilstedeværelsen af antistoffer, som 30 genkender det antigene præparat. Påvisning af hybridomaantistoffer kan udføres under anvendelse af en analyse, hvor antigenet er bundet til en fast bærer og får lov til at reagere på hybridomasupernatanter indeholdende formodede antistoffer. Tilstedeværelsen af antistoffer kan påvises med "sandwich'-metoder under anvendelse af en lang række indikatorer. De DK 174706 B1 22 fleste almindelig anvendte metoder er tilstrækkelig følsomme til anvendelse ved de omfang af antistofkoncentrationer, som secerneres under hybridvækst.

5 Kloning af hybrider kan udføres efter 21-23 dages cellevækst i udvalgt medium. Kloning kan udføres ved cellebegrænsende fortynding i væskeformig fase eller ved direkte udvalg af enkelte celler, som vokser i halvfast agarose. Ved begrænset fortynding fortyndes cellesuspensionerne serievis til opnåelse af en statistisk mulighed for kun en celle pr. brønd. Ved 10 agarosemetoden udsås hybrider i et halvfast øvre lag over et nedre lag indeholdende forsyningsceller. Kolonier fra det øverste lag kan opsamles, og eventuelt overføres til brønde.

Antistofsecernerende hybrider kan vokse i forskellige vævskulturkolber til 15 opnåelse af supernatanter med varierende koncentration af antistoffer. For at opnå højere koncentrationer kan hybrider overføres til dyr til opnåelse af inflammatorisk ascites. Antistofholdig ascites kan derpå høstes 8-12 dage efter indtraperitonealinjektion. Ascites indeholder en større koncentration af antistoffer, men omfatter både monoklonale antistoffer og immunoglobuliner 2 0 fra den inflammatoriske ascites. Derpå kan antistofoprensning opnås f.eks. ved affinitetschromatografi.

Tilstedeværelse af den foreliggende Lol gi eller antistoffer, der er specifikke for samme, i en patients serum, plante- eller dyrevæv eller vævsekstrakt kan 2 5 påvises ved at anvende antistoffer, der fremstilles som beskrevet ovenfor, enten monoklonale eller polyklonale ved faktisk enhver type immunanalyse.

En lang række immunoanalysemetoder er opnåelige som det fremgår af henvisningen til U.S. patentet nr. 4.016.043, nr. 4.424.279 og nr. 4.018.653.

Disse omfatter selvfølgelig både enkeltsteds- og tosteds- eller "sandwich"-30 analyser af den ikke-kompetitive type, således som de traditionelle kompetitive bindingsanalyser. Sandwichanalyser er blandt de mest anvendelige og almindeligt anvendte analyser, og favoriseres i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Der eksisterer en række variationer af sandwichanalysen, og alle er omfattet af den foreliggende opfindelse. Ved en DK 174706 B1 23 almindelig ligefrem analyse immobiliseres et umærket antistof kort fortalt på en fast bærer, og prøven, der skal testes, bringes i forbindelse med det bundne molekyle. Efter et passende inkubationstidspunkt, som er tilstrækkelig til at tillade dannelse af et sekundært antistof-antigenkompteks, 5 tilsættes et andet antistof, der er mærket med et rapportørmolekyle, som er i stand til at frembringe et påvisligt signal, og inkuberes derpå i tilstrækkelig tid til dannelse af et tertiært kompleks af antistof-antigen-mærket antistof, (d.v.s. antistof- Lol pl-antistof). Eventuelt uomsat materiale vaskes bort og tilstedeværelsen af antigenet bestemmes ved at observere et signal, der lo frembringes af rapportørmolekylet. Resultaterne kan enten være kvalitative ved simpel observation af det synlige signal, eller kvantificeres ved at sammenligne med en kontrolprøve, som indeholder en kendt mængde hapten. Variationer af den ligefremme analyse omfatter en samtidig analyse, hvor både prøve og mærket antistof sættes samtidig til det bundne antistof, 15 eller en omvendt analyse, hvor det mærkede antistof og prøve, der skal testes, først kombineres, inkuberes og derpå samtidig sættes til bundet antistof. Disse metoder er velkendte for fagfolk indenfor området, og omfatter enhver mindre variation, som er indlysende.

20 Selv om den efterfølgende beskrivelse angår påvisning af Lol pi er den ligeledes anvendelig til påvisning af antistoffer mod Lol pi, og har til hensigt at være en passende beskrivelse heraf. Ved den typiske ligefremme sandwichanalyse bindes et første antistof med specifitivitet for Lol pi eller antigene dele heraf ifølge den foreliggende opfindelse enten covalent eller 25 passivt til en fast overflade. Den faste overflade er typisk glas eller en polymer, hvor de hyppigst anvendte polymerer er cellulose, polyacrylamid, nylon, polystyren, polyvinylchlorid eller polypropylen. Den faste bærer kan have form af rør, kugler, mikropladeskiver eller enhver anden overflade der er egnet til at udføre en immunoanalyse. Bindingsprocesserne er velkendte 30 indenfor fagområdet og består almindeligvis i tværbinding, covalentbinding eller fysisk adsorbtion, hvor polymer-antistofkomplekset vaskes ved fremstilling af forsøgsprøven. En delprøve af den prøve, der skal undersøges, sættes derpå til det faste fasekompleks og inkuberes ved 25 °C i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at tillade binding af enhver underenhed, DK 174706 B1 24 som er tilstede i antistoffet. Inkubationstidsrummet vil variere, men vil almindeligves ligge på fra ca. 2 til 40 min. Efter inkubationstidsrummet vaskes antistofsubunitfastfasen og tørres og inkuberes med et andet antistof, der er specifikt for en del af haptenen, det andet antistof er bundet til et 5 rapportørmolekyle, som anvendes til at indikere binding af det andet antistof til haptenen.

Med udtrykket "rapportørmolekyle", som det anvendes i nærværende beskrivelse menes et molekyle, som p.g.a. dets kemiske natur tilvejebringer 10 et analytisk identifiserbart signal, som tillader påvisning af antigenbundet antistof. Påvisningen kan være enten kvalitativ eller kvantitativ. De hyppigst anvendte rapportørmolekyler ved denne type analyser er enten enzymer, fluorophorer eller radionuklid-indeholdende molekyler (d.v.s. radioisotoper). I forbindelse med en enzymimmunoanalyse er enzymet konjugeret til det 15 andet antistof, almindeligvis ved hjælp af glutaraldehyd eller periodat. Det vil imidlertid let forstås, at der eksisterer en lang række forskellige konjugationsmetoder, som er let opnåelige for fagfolk. Almindelig anvendte enzymer omfatter bl.a. peberrodsperoxidase, glucoseoxidase, beta-galactosidase og alkalisk phosphatase. De substrater, som skal anvendes 20 sammen med specifikke enzymer, udvælges almindeligvis med henblik på udvikling af en påviselig farveændring efter hydrolyse med det tilsvarende enzym. F.eks. er g-nitrophenylphosphat egnet til anvendelse sammen med alkaliske phosphatasekonjugater. Til peroxidasekonjugater anvendes der hyppigst 1,2-phenylendiamin, 5-aminosalicylsyre eller toluidin. Det er også 25 muligt at benytte fluorogene substrater, som giver et fluoriserende produkt, i stedet for de ovenfor anførte chromogene substrater. I alle tilfælde sættes det enzym mærkede antistof til det første antistof-haptenkompleks, får lov til at bindes, og derpå vaskes overskydende reagens bort. En opløsning indeholdende det passende substrat sættes derpå til det tertiære kompleks af 30 antistof-antigen-antistof. Substratet vil reagere med det enzym, der er bundet til det andet antistof, hvilket giver et kvalitativt visuelt signal, som kan yderligere kvantificeres, sædvanligvis spektrofotometisk til opnåelse af en indikation på den haptenmængde, som er til stede i prøven. Udtrykket DK 174706 B1 25 '’rapportørmolekyle" omfatter også anvendelse af celleagglutinering eller hæmning af agglutinering, såsom røde blodlegemer på latexkugler o.lign..

Alternativt kan en fluoriserende forbindelse, såsom floresein og rhodamin, 5 kobles til antistoffer uden at ændre deres bindingskapacitet. Ved aktivering ved belysning med lys med en bestemt bølgelængde adsorberer det fluorochrommærkede antistof lysenergien, hvilket inducerer en exciterbar tilstand i molekylet fulgt af emission af lyset ved en karakteristisk farve, der er visuel påviselig med et lysmikroskop. Som ved EIA får det 10 fluorescensmærkede antistof lov til at binde til det første antistof-haptenkompleks. Efter fravask af det ubundne reagens, udsættes det resterende tertiære kompleks for lys med passende bølgelængde, hvor observeret fluoreoscens indikerer tilstedeværelse af haptenen af interesse. Immunofluorescens- og ElA-metoder er begge meget etablerede indenfor 15 fagområdet og foretrækkes navnlig i forbindelse med den foreliggende fremgangsmåde. Der kan imidlertid også benyttes andre rapportørmolekyler, såsom radioisotop-, Chemiluminiscerende eller bioluminiscerende molekyler.

Det vil let fremgå for fagfolk indenfor området hvordan fremgangsmåden kan varieres for at passe til det krævede formål. Det vil også fremgå, at 20 ovennævnte kan anvendes til direkte eller indirekte (d.v.s. ved hjælp af antistoffer) påvisning af Lol pi ifølge opfindelsen.

P.g.a. tilstedeværelsen af allergener i miljøet fortsætter høfeber og sæsonbetonet astma med at have væsentlige morbiditet og socio-økonomisk 2 5 virkning i de vestlige lande, på trods af fremskridt indenfor deres farmacologi og immunology. Selvom det til rådighed værende spektrum af medikamenter, herunder anti-histaminer og steroider, har medført en betydelig forbedring i behandling af allergene lidelser er der stadig beklageligvis bivirkninger forbundet med langtidsanvendelse. P.g.a. disse problemer er der udvist 30 fornyet interesse for immunoterapi af allergiske lidelser. Immunoterapi involverer injektion af potente allergenekstrakter for at desensibilisere patienter mod allergiske reaktioner (Bousquet & Michel, 1989). Desværre er de pollenpræparater, der anvendes som allergener, polyvalente og af dårlig kvalitet. Følgelig er de anvendte koncentrationer ofte høje for at inducere DK 174706 B1 26

IgG-svar, men de kan være lethale p.g.a. udløsning af systemiske reaktioner, herunder anafylaksi. Det klonede genprodukt eller syntetiske peptider baseret på allergensekvensen tilvejebringer et ufarligt medie for terapi, idet det kan kvalitetskontrolleres, karakteriseres og standardiseres.

5

Dem nøjagtige mekanisme for symptomatisk lindring forbliver hypotetisk. Det er fastlagt, at desensibiliseringsterapi inducerer dannelse af allergenspecifik ikke-mastcellebindende IgG, som blokerer kombinationen af mastcellebundet IgE og allergen. Dette forhindrer mediatorfrigørelse og udløsning af det 10 allergiske svar. Nylige undersøgelser af følsomhed overfor ambrosiapollen viste, at der eksisterer en korrelation mellem allergenspecifikke IgG-niveauer og lindring for allergisymptomer (Lichtenstein et al., 1983). Anvendelse af reagenser, som kan udløse allergenspecifik IgG-produktion, kan øge det vellykkede omfang af denne behandling væsentligt.

15

Den for tiden værende immunterapi er en af de hyppigst anvendte behandlinger indenfor allergologien, og betragtes i USA som det første valg.

Fordele ved denne behandling for pollenrhinitis er, at behandlingen tager op til 3 år, medens pharmacoterapien må udføres under hele patientens levetid.

20 Patienter indgivet pollenekstrakter med henblik på immunoterapi udviste en klinisk fordel, som varede 4 år efter behandlingens afslutning (Grammer et al., 1984).

Følgelig er Lol gi, dets derivater, homologer eller immunologiske slægtninge 2 5 anvendelig til udvikling af en vaccine til desensibilisering af mennesker mod allergier forårsaget af græspollen.

De aktive bestanddele i en farmaceutisk sammensætning omfattende Lol gi e.lign.,skal udvise fremragende terapeutisk aktivitet, f.eks. med hensyn til 30 desensibilisering af mennesker, der er allergiske overfor græspollen, når det indgives i mængder, som afhænger af det bestemte tilfælde. F.eks kan fra 0,5 pg til ca. 20 mg pr. kg legemsvægt indgives pr. dag. Dosisregimer kan justeres med henblik på at tilvejebringe det optimale terapeutiske svar. Der kan f.eks. indgives flere inddelte doser dagligt, eller dosen kan reduceres DK 174706 B1 27 proportionalt som indikeret af den kritiske terapeutiske situation. Den aktive forbindelse kan indgives på traditionel måde, såsom oralt, intravenøst (når den er vandopløselig), intramuskulært, subcutant, intranasalt, intradermalt eller med suppositorie eller ved implantering (under anvendelse af langsomt 5 frigørende molekyler). Alt afhængig af administrationsvejen, kan de aktive bestanddele, som omfatter Lol pi e.lign., kræves at være belagt med et materiale for at beskytte bestanddelene mod virkningerne af syrer og andre naturlige betingelser, som kan inaktivere bestanddelene. F.eks. vil den lave lipofilicitet af j_ol βΙ e.lign. tillade at det ødelæges i tarmkanalen af enzymer, 10 som er i stand til at spalte peptidbindinger, og i maven ved syrehydrolyse.

For at indgive Loj βΙ e.lign. på anden måde end ved parenteral indgivelse kan det belægges med eller indgives med et materiale, som forhindrer dets inaktivering. F.eks. kan Lol pi e.lign. indgives i en adjuvans, indgives sammen med enzyminhibitorer eller i liposomer. Adjuvans anvendes i dets 15 bredeste betydning og omfatter enhver immunstimulerende forbindelse, såsom interferon. Adjuvanser til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter resorcinoler, ikke-ioniske surfaktanter, såsom polyoxyethylenoleyl ether og n-hexadecylpolyethylenether. Enzyminhibitorer omfatter pancreastrypsininhibitor, diisopropylfluorophosphat 20 (DEP) og trasylol. Liposomer omfatter vand-i-olie-i-vand CGF-emulsioner, såvel som traditionelle liposomer.

De aktive forbindelser kan også indgives parenteralt eller intraperitonealt.

Dispersioner kan også fremstillen i glycerol, væskeformige polyethylen-25 glycoler og blandinger heraf samt i olier. Under almindelige betingelser for opbevaring og anvendelse indeholder disse præperater et konserveringsmiddel for at forhindre vækst af mikroorganismer.

De farmaceutiske former, der er egnede til injicerbar anvendelse, omfatter 30 sterile vandige opløsninger (når de er vandopløselige) eller dispersioner og sterile pulvere til uventet fremstilling af sterile injicerbare opløsninger eller dispersioner. I alle tilfælde må formen være steril og være væskeformig i et sådant omfang, at der eksisterer let sprøjtbarhed. Det må være stabilt under betingelserne for fremstilling og opbevaring og må konserveres mod den i DK 174706 B1 28 kontaminerende virkning af mikroorganismer, såsom bakterier og svampe.

Bæreren kan være et opløsningsmiddel eller dispersionsmedium, der f.eks.indeholder vand, ethanol, polyol (f.eks. glycerol, propylenglycol, og væskeformig polyethylenglycol o.lign.), passende blandinger heraf og 5 vegetabilske olier. Den passende fluiditet kan opretholdes ved f.eks. at anvende en belægning, såsom licithin, ved opretholdelse af den krævede partikelstørrelse i tilfældet med dispersion og ved anvendelse af superfaktanter. Forebyggelsen af mikroorganismers virkning kan ske ved hjælp af forskellige antibakterielle og antisvampemidler, f.eks. parabener, 10 chlorbutanol, phenol, sorbinsyre, thirmerosal o.lign. I mange tilfælde vil det foretrækkes at indbefatte isotone midler, f.eks. sukkerarter eller natriumchlorid. Længerevarende absorbtion af de injicerbare sammensætninger kan ske ved i sammensætningen at anvende midler, der forsinker absorbtion, f.eks. aluminiummonostearat og gelatine.

15

Der fremstilles sterile injicerbare opløsninger ved at inkorporere de aktive forbindelser i den krævede mængde i det passende opløsningsmiddel sammen med forskellige af de andre ovenfor angivne bestanddele, som krævet, fulgt af filtersterilisering. Almindeligvis fremstilles dispersioner ved at 20 inkorporere de forskellige steriliserede aktive bestanddele i en steril vehikel, som indeholder det basale dispersionsmedium og de krævede andre bestanddele blandt de ovenfor anførte. I tilfældet med sterile pulver til fremstilling af sterile injicerbare opløsninger er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørring og frysetørring, som giver et pulvere af 2 5 den aktive bestanddel samt enhver yderligere ønsket bestanddel fra forudgående sterilfiltrerede opløsninger heraf.

Når Lol gi e.lign er passende beskyttet som beskrevet ovenfor, kan den aktive forbindelse indgives oralt, f.eks. med et inert fortyndingsmiddel, eller 30 med en fordøjelig spiselig bærer, eller den kan omsluttes af en hård eller blød gelatinekapsel eller komprimeres til tabletter, eller kan inkorporeres direkte i levnedsmidlet i kosten. Til oral terapeutisk indgivelse kan den aktive forbindelse inkorporeres med excipienser og anvendes i form af nedsvælgelige tabletter, buccale tabletter, pastiller, kapsler, eleksirer, DK 174706 B1 29 suspensioner, siruper, oblater o.lign. Sådanne sammensætninger og præparater bør indeholde mindst en vægtprocent af den aktive forbindelse. Procentdelen af sammensætningerne og præparaterne kan selvfølgelig varieres og kan passende ligge mellem fra ca. 5 til ca. 80 vægtprocent af 5 enheden. Mængden af aktive forbindelse i sådanne terapeutisk anvendelige sammensætninger er således, at der vil opnås en passende dosis. Foretrukne sammensætninger eller præparater ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles således, at en oral enhedsdosisform indeholder mellem ca. 10 pg og 2000 mg af den aktive forbindelse.

10

Tabletterne, pastillerne, pillerne, kapslerne o.lign. kan også indeholde følgende: Et bindemiddel, såsom gummigragacanth, acacia, majsstivelse eller gelatine; excipienser såsom dicalciumphosphat; et deintegrerings-middel, såsom majsstivelse, kartoffelstivelse, alginsyre o.lign.; et smøre-15 middel, såsom magnesiumstearate; og et sødemiddel såsom saccharose, lactose eller saccharin kan tilsættes eller et smagsmiddel, såsom pebermynte, vintergrøntolie eller kirsebærsmag. Når enhedsdosisformen er en kapsel kan den udover materialer af ovennævnte type indeholde en væskeformig bærer. Der kan være forskellige andre materialer tilstede som 20 belægninger eller til på anden måde at modificere dosisenhedens fysiske form. F.eks. kan tabletter, piller eller kapsler belægges med shellac, sukker eller begge dele. En sirup eller eleksir kan indeholde den aktive forbindelse, saccharose som et sødemiddel, methyl- og propylparabener som konserveringsmiddel, et farvestof og et smagsstof, såsom krisebær- eller 2 5 orangesmag. Selvfølgelig bør ethvert materiale, der anvendes til fremstilling af en hvilken som helst enhedsdosisform, være farmaceutisk ren og i alt væsentligt ikke-toxisk i de benyttede mængder. Endvidere kan den aktive forbindeles inkorporeres i præparater og formulationer med langvarig frigørelse.

30 I nærværende beskrivelse omfatter udtrykket "farmaceutisk acceptabel bærer" ethvert og alle opløsningsmidler, dispersionsmedier, belægninger, antibakterielle og antisvanpemidler, isotone og absorptionsforsinkende midler o.lign. Anvendelse af sådanne medier og midler til farmaceutisk aktive DK 174706 B1 30 forbindelser er velkendt indenfor fagområdet. Med undtagelse af for så vidt nogen af de traditionelle medier eller midler er inkompatible med den aktive bestandel, er anvendelse heraf i de terapeutiske sammensætninger omfattet.

Der kan også inkorporeres supplerende aktive bestanddele i sammen-5 sætningerne.

Det er navnlig fordelagtigt at formulere parenterale sammensætninger på enhedsdosisform for at lette indgivelsesmåden og dosens ensartethed. Udtrykket enhedsdosisform som det anvendes i nærværende beskrivelse, 10 henviser til fysisk adskilte enheder, som er egnede som enhedsdoser til pattedyrsindivider, som skal behandles. Hver enhed indeholder en forud bestemt mængde af aktivt materieale, der er beregnet til at frembringe den ønskede terapeutiske virkning i forbindelse med den krævede farmaceutiske bærer. Specifikationen af de nye enhedsdosisformer ifølge opfindelsen 15 dikteres af og er direkte afhængige af (a) det aktive materiales enestående egenskaber og den særlige terapeutiske virkning, som skal opnås, og (b) de begrænsninger der indenfor fagområder er forbundet med sammensætning af et sådant aktivt materiale til behandling af en lidelse i levende individer ved en sygdomstilstand, hvor legemets sundhed forringes, hvilket er beskrevet 20 detaljeret nedenfor.

Den vigtigste aktive bestanddel blandes med henblik på passende og effektiv indgivelse i virksomme mængder med en passende farmaceutisk acceptabel bærer på enhedsdosisform, som beskrevet ovenfor. En enhedsdosisform kan 25 f.eks. indeholde den vigtigste aktive forbindelse i mængder på fra 0,5 pg til ca. 200 mg. Udtrykt i andele er den aktive bestanddel almindeligvis til stede i fra ca 0,5 pg til ca. 2000 mg pr. ml bærer. I tilfældet med sammensætninger indeholdende yderligere aktive bestanddele fastlægges doserne under henvisning til den sædvanlige dosis og indgivelsesmåde for disse 30 bestanddele.

Den foreliggende opfindelse er yderligere illustreret ved nedenstående ikke-begrænsende eksempler.

DK 174706 B1 31 EKSEMPEL 1 Ekstrahering af RNA.

5 4 g frisk rajgræspollen (indvundet fra marker nær Melbourne og opbevaret under flydende N2) blev opslæmmet i 10 ml ekstraktionspuffer (50mM Trispuffer, pH9, 0,2M NaCI, 10mM Mg-acetat) indeholdende 10mM vanadyl-ribonukleosidkomplekser (Berger & Birkenmeier, 1979) og 0,1% DEPC. Pollenslammet blev malet i en mortor og stødt under flydende N2 i 10-20 min 10 for at tilvejebringe et homogenat, hvori alle pollenkorn var ødelagt. Opslæmningen blev overført til Nalgene-centrifugerør med 1% (vægt/volumen) SDS, 10mM EDTA og 0,5% (vægt/volumen) N-lauroylsarcosin. Et tilsvarende volumen varm pufret phenol af høj kvalitet (fra IBI) behandlet med 0,1% (vægt/volumen) hydroxyquinoline (Maniatis et al., 15 1982) blev tilsat, og blandingen blev rystet i 10 min. Et tilsvarende volumen af 24:1 dele chloroform:isoamylalkohol blev tilsat og rystningen blev fortsat.

Rørene blev centrifugeret ved 15.000 omdrejninger pr. min i 20 min ved 10 °C for at adskille faserne og fjerne uopløseligt materiale og cellerester. Den vandige fase blev reekstraheret med P:C:I 4 gange indtil phenolfasen forblev 2 0 klar ( med faseadskillelse ved 2.500 omdrejninger pr. min i 15 min ved stuetemperatur) og den vandige fase blev overført til Corex-centrifugerør, 2,5 volumen af 100% (volumen/volumen) ethanol blev tilsat og opløsningen blev blandet med pipette og fik lov til at præcipitere natten over ved -20 °C, og roteret ved 15.000 omdrejninger pr. min i 20 min ved 0 °C. Peletten blev 25 genopslæmmet i 10 ml EDTA for at fjerne vanadyl-ribonukleosidkomplekser, og der blev tilsat LiCI for at opnå en endelig koncentration på 2M. Opløsningen blev opretholdt ved 0 °C natten over og centrifugeret ved 15.000 omdrejninger pr. min i 30 min ved 4 °C. Pelletten blev vasket med koldt 2M LiCI hvor 5mM EDTA (pH 7,3), væsken blev hældt fra, og pelletten 30 blev genopslæmmet i 1 ml vand. Opløsningen blev opvarmet til 65 °C og der blev tilsat 0,1 ml 3M Na-acetat og 2,2 ml ethanol til præcipitation af totalt RNA ved -20 °C natten over. Pelletten blev vasket blidt med 70% (volumen/volumen) ethanol, vakuumtørret og genopslæmmet i 0,5 ml vand.

DK 174706 B1 32

Opslæmningen blev opbevaret ved -70 °C indtil den skulle anvendes til poly (A+) RNA-udvælgelse.

Et gram rajgræspollen indeholdte 1 mg totalt RNA. Poly (A+) mRNA blev 5 udvalgt ved affinitetschromatografi på Poly (U)-Sepharose (Pharmacial) i henhold til standardmetoder. Integriteten af poly (A+) mRNA blev undersøgt ved dets evne til at virke som en template for syntese af enkeltstrenget cDNA såvel som for dets translationelle aktivitet i kaninreticulocytsystemet.

10 EKSEMPEL 2

Fremstilling af cDNA-kloner.

Syntese af første cDNA-streng var ud fra 5 μg (poly A+) RNA i 50 μΙ 15 reaktionspuffer (50mM Tris-puffer, pH 8,3) indeholdende 40mM KCI, 10mM MgCI2, 5mM DTT, 1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dTTP og 1mM dCTP, 50 enheder human placental ribonukleaseinhibitor (HPRI), 5 pg oligodeoxy-thymidylsyreprimer, 80 pCi [Alpha-^ P] dCTP (3000Ci/mmol; Amersham) og 100 enheder reverstranskriptase. Blandingen blev inkuberet i 60 min ved 42 20 °C. Den anden cDNA-streng blev syntetiseret under anvendelse af mRNA/cDNA hybrider som substrat, 4 enheder E. coli DNA-ribonuklease H til frembringelse af indskæringer i mRNA-template, og 115 enheder E.coli DNA-polymerase 1 til katalysering af erstatningerne af mRNA-strengen med DNA. Reaktionsblandingen blev inkuberet sekvensvis ved 12 °C i 60 min og 25 derpå blev reaktionen standset ved at opvarme ved 70 °C i 10 min. Der blev tilsat 10 enheder T4 DNA-polymerase for at fjerne små 3’-fremspring fra den første cDNA- streng (Gubier & Hoffmann, 1983). Reaktionen blev standset ved at tilsætte en tiendedel volumen 20mM EDTA og 1% (vægt/volume) SDS. Dobbeltstrenget (ds) cDNA blev oprenset ved phenol/chloroform-30 ekstrahering fulgt af præcipitation med ethanol.

For at konstruere et lambda-gt 11 -cDNA-ekspressionsbibliotek blev 500 ng dobbeltstrenget cDNA inkuberet med 20 enheder EcoR1-methylase ved 37 °C i 60 min.

DK 174706 B1 33 1 μρ phosphoryleret EcoR1 linkere {5’d[pGGAATTCC]) blev ligeret til det dobbeltstrengede cDNA i en ligationspuffer med 5 enheder T4 DNA-ligase ved 15 °C natten over. Det med EcoR1 -linker forsynede cDNA blev fordøjet 5 med 100 enheder EcoRi linkere gennem en Sephacrylsøjle.

50 ng linkerforsynet cDNA blev ligeret til 1 Dg dephosphoryleret EcoR1-skåret lambda-gt 11-DNA(Promege) med 2,5 enheder T4 DNA-ligase i 20 timer ved 15 °C i et samlet volumen på 10 μΙ. Det ligerede lambda-gt 11-DNA

1 o blev præcipiteret med 30 mM Na-acetat og 2,7 volumen ethanol ved 70 °C i 2 timer. Lambda-gt 11 -DNA ligeret til cDNA blev indpakket in vitro ved 20 °C i 2 timer under anvendelse af 25 μΙ lambdaindpakningsblanding (Promega). cDNA-biblioteket blev titreret på E. coli-stamme Y1090r på plader indeholdende 1 mg/ml X-gal, og 0,4 mg/ml IPTG. cDNA blev forstærket som 15 pladelysate på E. coli-stamme Y1090r- ved en tæthed på 15.000 plaques pr.

150 mm plade.

EKSEMPEL 3 20 Screening af lambda-gt 11 cDNA-bibliotek under anvendelse af specifikke monoklonale antistofprober.

*

Rajgræspollenallergenspecifikke monoklonale antistoffer blev udviklet og karakteriseret af Smart et al. (1983). Sera fra patienter, der er allergiske 2 5 overfor rajgræspollen, blev venligst tilvejebragt fra Dr. David Hiil fra Royal

Children’s Hospital, Melbourne.

Nedenstående procedure til screening af lambda-gt 11-ekspressionsbiblioteket er en modification af en tidligere beskrevet metode 30 (Huynh, Young & Davis, 1985). En enklet koloni af E. coli Y1090r- blev dyrket ved 37 °C med god gennemluftning to OD600 på 0,7-0,9 i LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin og 0,4% (vægt/volumen) maltose. Cellerne blev pelleteret og genopslæmmet i 10 mM MgSC>4 i 40% af kulturvolumenet. E. coli Y1090r- cellerne (0,3 ml) blev derpå inficeret med DK 174706 B1 34 ca. 18.000-20.000 rekombinante fager ved 37 °C i 15 min, biev udpladet på 150mB BL-plader i 0,7% (volume/vægt) agarose og inkuberet ved 42 °C i 3 timer. Pladerne blev tildækket med tørre 132 mm nitrocellulosefiltre der forudgående var gennemvædet i lOmIPTG, blev derpå inkuberet i 6 timer 5 ved 37 °C og filtrene blev fjernet. Et andet IPTG-behandlet filter blev anbragt på bakterieplænen og pladerne blev inkuberet natten over ved 37 °C. Filterplaqueløft blev tørret ved stuetemperatur og vasket med TBS i 10 min.

TBS blev fjernet og der blev tilsat 10 ml TBS indeholdende 10% (vægt/volume) ikke-fedt mælkepulver, og filtrene blev rystet blidt i en time, 10 blev drænet, skyllet i 30 sekunder med TBS og derpå vasket i 10 min med TBS samt 0,1% (volumen/volumen) Tween-20 fulgt af yderligere 2 vask med TBS i hver 10 min. Filtrene blev inkuberet i 3 timer i TBS indeholdende 2% (vægt/volumen) BSA og monoklonale antistoffer (ascites) mod rajgræspollenallergener ved fortynding på 1:500 under blid rystning. Efter 15 vask i TBS/0,1% (volumen/volumen) Tween-20, blev filtrene inkuberet i 1,5 time i TBS indeholdende 2% (vægt/volumen) BSA og peroxidasekonjugeret affinitetsoprenset anti-mus-lgG ved fortynding på 1:500. Filtrene blev vasket og udviklet under anvendelse af frisk chromogent peroxidasesubstrat 4-chlor-l-naphtol, 60 mg opløst i 20 ml iskold methanol, og 80 ml TBS indeholdende 2 0 0,03% (volumen/volumen) H2O2· Til hvert filter blev der anvendt 10 ml udviklingsopløsning. Efter at purpurrøde pletter var fremkommet på filtrene blev udviklingsopløsningen fjernet og filtrene blev vasket med distilleret vand for at standse reaktionen.

25 Det udviklede filter blev anvendt til at lokalisere specifikke plaqueområder på pladen, svarende til et positivt signal. Positive fag-plaque blev løftet fra pladen som agarosepropper og den eluerede fag blev oprenset til individuelle antigenpositive lambda-gt 11-kloner ved at genscreene ved lav tæthed på 85 mm petriskåle med 82 mm nitrocellulosecirkler. Efter opnåelse af 30 plaqueoprensning blev hver af lambda-gt 11-klonerne, som bærer allergen cDNA, udpladet ved lav tæthed og der blev fremstillet filterløft in dubio. Det rekombinante allergens evne til at binde med antisera fra allergiske patienter blev bestemt under anvendelse af samme procedure som beskrevet ovenfor, med undtaglese af, at filterløft natten over blev inkuberet i den allergiske DK 174706 B1 35 antisera ved en fortynding på 1:10, hvorimod det første løft blev behandlet med monoklonale antistoffer.

EKSEMPEL 4 5

Fremstilling af rekombinante allergenproteiner ud fra lambda-gt 11-rekombinante lysogener og Westem-blot-analyse.

Bakterier fE. coli stamme Y1089), som skal lysogeniseres med den 10 rekombinante fag, blev dyrket til mættethed i LB-medium (pH 7,5) indeholdende 0,2% (vægt/volumen) maltose ved 37 °C. En ml celler blev indvundet ved centrifugering og genopslæmmet i 300 μΐ LB-medium, indeholdende 10mM MgC^- Cellerne (ca. 1 x 10® celler) blev inficeret med ca. 1 x 109 pfu lambda-gt 11-rekombinant fag indeholdende cDNA-15 indføjelser, der koder for de allergene proteiner, (f.eks. klon 12R og klon 6R), ved 32 °C i 20 min. De inficerede celler blev serievis fortyndet og udpladet ved en tæthed på 100-200 kolonier pr. plade, og inkuberet natten over ved 32 °C. Individuelle kolonier blev afsat som pletter på LB-kopiplader, hvoraf en blev inkuberet ved 42 °C og den anden ved 32 °C natten over.

20 Rekombinante lysogenkloner blev indikeret ved vækst ved 32 °C, men ikke ved 42 °C, og forekom med en hyppighed på 20% for klon 12R og 3-4% for klon 6R.

For at opnå en præparativ mængde af de rekombinante allergene proteiner, 25 blev en enkelt lysogen koloni af Y1089 inokuleret i 10 ml LB-medium og inkuberet ved 32 °C under god gennemluftning, indtil OD600 havde nået 0,5.

Kulturen blev hurtigt overført til et 42 °C varmt vandbad, og inkuberet i 20 min under rystning.

30 lac-operonrepressoren blev inaktiveret ved tilsætning af 100 μΙ 1M IPTG.

Kulturen blev derpå inkuberet ved 37 °C i 1 time, hvilket muliggør, at lac Z-genet udtrykkes, og de allergene proteiner syntetiseres som et fusionsprotein med beta-galactosidase. Celler blev høstet ved rotation ved 3000 omdrejninger pr. min i 10 min ved stuetemperatur, blev genopslæmmet i 150 DK 174706 B1 36 ml prøvepuffer, og umiddelbart frosset i flydende nitrogen. Cellerne blev lyseret ved optøning ved stuetemperatur. Til elektroforetisK analyse af proteiner blev 150 μΙ SDS-prøvepuffer indeholdende bromphenolblåt-sporfarvestof sat til frysning-optøningslysatet. Prøver blev kogt i 3 min, og 5 uopløseligt materiale blev fjernet ved mikrocentrifugering i 3 min.

Proteinerne blev genopløst ved 7-10% (vægt/volumen) SDS-polyacrylamid-gelelektroforese, og visualiseret ved farvning med Coomassieblåt med dobbelte prøver elektroblottet til nitrocellulosefilter under anvendelse af Βίοι 0 Rad Trans Blot- apparatet {0,15 amp natten over). Fusionsproteiner blev påvist med monoklonale antistoffer, og visualiseret under anvendelse af den tidligere beskrevne screeningsprocedure.

EKSEMPEL 5 15

Northern analyse.

Totalt RNA blev ekstraheret fra pollen, blade, hydratiserde frø og rodprøver som tidligere beskrevet for pollen, og 20 pg RNA/prøve blev elektroforetiseret 20 i formaldehyd/1,2% (vægt/volumen) agarosegeler (Maniatia et al., 1982), gennemløbet ved 70V i 4 timer i gennemløbspuffer indeholdende 20 mM morpholinopropansulfonsyre, 5 mM natriumacetat og 0,1 mM EDTA, til pH 7,0. RNA'erne blev overført til nitrocellulose (Hybond C)-filtre, og præekvilibreret i 2 timer ved 50 °C i hybridiseringspuffer indenholdende 50% 2 5 (volumen/volumen) deioniseret formamide, 2 x SSPE, 7% (vægt/volumen) SDS, 0,5% (vægt/volumen) ikke-fedt mælkepulver, 1% PEG 20.000, og 0,5 mg/ml ikke-homologt laksespermbærer-DNA. Frisk hybridiseringspuffer indeholdende den tilfældigt primede Lol pl-DNA-probe blev tilsat og inkuberet ved 50 °C natten over for at opnå hybridisering. Filtre blev vasket 30 omhyggeligt i 2 x SSC, 0,1% (vægt/volumen) SDS i 15 min ved RT, derpå 0,5 x SSC, 1% (vægt/volumen) SDS ved 50 °C i 15 min, fulgt af kort skylning i 0,5 x SSC, 0,1% (vægt/volumen) SDS, blottet let og indhyllet i Gladindpakning. Kodakfilm blev eksponeret i 18 timer ved -70 °C.

DK 174706 B1 37 EKSEMPEL 6

Ekspression af Lol pl-cDNA-produkter reageret med IgE fra allergisera.

5 cDNA-indføjelsen fra lambda-gt 11-12R, som koder for Lol pi, blev kloner til EcoR1 -stedet på plasmidekspressionsvektoren pGEX, hvor det kan udtrykkes som et fusionsprotein med glutathiontransferase. E. coli inficeret med dette plasmid pGEX-12R eller med den ikke-rekombinante vektor alene, blev dyrket i en kultur med logoritmisk fase, og bakterierne blev pelleteret ved 10 centrifugering. Disse bakterier blev lyseret, og de totale proteiner blev adskilt på SDS-PAGE gel, Et western-blot viste, at kun de bakterier, som indeholdt rekombinante plasmider, besad en proteinkomponent, der var reaktivt med specifikt IgE i sera fra donorer, der var allergiske overfor rajgræspollen. Resultaterne er vist i fig. 6.

15 EKSEMPEL 7

Krydsreaktivitet af Lol pi med homologe allergener fra andre græspollen.

20 Lol pi er et protein med molekylevægt på 34 kD, og SDS-PAGE viser, at andre almindelige græsser har et homologt protein med tilsvarnede molekylevægt. Resultaterne iføgle den foreliggende opfindelse viser, at disse proteiner deler en fælles antigen etitop (påvist med monoklonale antistoffer), og er allergener med hensyn til specifik IgE-binding. Resultaterne er vist i fig.

25 7. På grund af denne allergene lighed er Lol pi det immunodominerende allergen i græspollen. En konsekvens heraf er, at cDNA-klonen 12R kan anvendes som en heterolog probe til isolering af de homologe cDNA-kloner for allergener for andre græspollen.

DK 174706 B1 38

LITTERATURLISTE

Baldo, B.A., Sutton, R., og Wrigley, C.W. (1982), Grass allergens with particular reference to cereals. Prog. Allergy 30, 1-66. (Karger, Basel).

5

Berger, S.L., og Birkenmeier (1979). Inhibition of tractable nucleases with ribonucleoside-vanadyl complexes: isolation of messenger ribonucleic acid from resting lymphocytes. Biochemistry 18; 5143-5149.

10 Bousquet, J. & Michel, F.B. (1989). Specific Immunotherapy: A treatment of the Past? Allergy and Clinical Immunology News V. 7-10.

Buell et el. (1985). Nucleic Acids Research 13 1923-1958.

15 Douillard, J.Y. og Hoffman (1981). Basic facts about hybridomas in Compendium of Immunology, Vol II, red. af Schwartz.

Ford & Baldo B.A. (1986). A re-examination of Ryegrass (Lolium perenne) pollen Allergens. International Archives of Allergy and Applied Immunology 20 81; 193-203.

Friedhoff, L.R., Ehrlich-Kantzky, E.. Grant, J.H., Meyers, D.A., Marsh, D.G.

(1986). A study of the human immune response to Lolium perenne (Rye) pollen and its components, Lot gl and Lo[ pH (Rye I and Rye II). Journal of 25 Allergy and clinical immunology.

Goff og Goldberg (1985). Cell 41: 587.595.

Grammer et a!., 1984. Persistence of efficacy after a brief course of 30 polymerized ragweed allergens: A controlled study. J. Allergy Clin. Immunol. 73:484-489.

Gubier, V. og Hoffman, B.J. (1983). Gene 25. 263.

DK 174706 B1 39

Hill, D.J., Smart, I.J. og Knox, R.V. (1979). Childhood asthma and grass pollen aerobiology in Melbourne. Medical Journal of Australia 1, 426-429.

Howlett, B.J. og Clarke, A.E. (1981). Isolation and partial Characterization of 5 two antigenic glycoproteins from ryegrass (Lolium perenne) pollen. Biochemical Journal, 197, 695-706.

Howlett, B.J., & Knox, R.B. (1984). Allergic interactions; in Heslop-Harrison J, Linskens, H.F. (red.) Encyclopaedia of Plant Physiology 17, 655-674.

10 Springer, heidelberg.

Huynh, T.V., Young, R.A. og davis, R.W. (1985). Constructing and screening cDNA libraries in Lambda-gt 10 and lambda-gt 11. In Glover, D.M. (red.); DNA cloning; A practical approach Vol. 1. side 49-78. IRL Press, Oxford.

15

Johnsom, P. & Marsh. D.G. (1965). "Isoallergens" from ryegrass pollen.

Nature, 206. 935-.

Johnsom, P. & Marsh, D.G. (1966). Allergens from common ryegrass pollen 20 (Lolium perenne). I. Chemical composition and structure. Immunochemistry 3, 91-100.

Kohler, G. og Milstein, C. (1975). Nature 256: 495-49.

25 Kohler, G. og Milstein, C. (1976). European Journal of Immunology 6: 511-519.

Lichtenstein, L.M. et al. (1983). Int. Cong, of Allergology and Clin. Immunol.

J.W. Kerr ond A. Ganderson (red.).

Lowenstein, H. (1978). Quantitive immunoelectrophoretic methods as a tool for the analysis ad isolation of allergens. Prog, allergy, 25, 1-62. (Karger,

Basel).

30 DK 174706 B1 40

Maniatis, T., Fritsch, E.G. og Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

Marsh, D.G., Haddad, Z.H. og Campbell, D.H. (1970). A new method for 5 determining the distribution of allergenic fractions in biological materials: Its application to grass pollen extracts. J. Allergy, 46,107-121.

Marsh, D.G. (1975). Allergens and the genetics of allergy; in M. Sela (red.),

The Antigens, Vol. 3, side 271-359. (Academic Press Inc., London, New 10 York).

Marsh, D.G., Milner, F.M. og Johnson, P. (1966). The allergenic activity and stability of purified allergens from the pollen of common ryegrass. International Archives of Allergy 29, 52-.

15

Messing, J. (1983). New M13 Vectors for cloning. Methods in Enzymology -Recombinant DNA techniques 101, Part C. side 20-78.

Messing, J. & Vieira, J. (19829. A new pair of M13 vectors for selecting either 20 DNA strand of double-digest restriction fragments. Gene; 1_9, 269-276.

Miller, J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

25 Reading, J. (1982). Journal of Immunological Methods 53: 261-291.

Singh, M.B. & Knox, R.B. (1985). Grass pollen allergens: Antigenic relationships detected using monoclonal antibodies and dot blotting immunoassay. International Archives of Allergy and Applied Immunology 78, 30 300-304.

Smart, I.J., Heddie, R.J., Zola, M., Bradley, J. (1983). Development of monoclonal antibodies specific for allergenic components in ryegrass (Lolium DK 174706 B1 41 gerenne) pollen. International Archives of Allergy and Applied Immunology 72 243-248.

Smart, I.J. & Knox, R.B. (1979). Rapid batch fractionation of ryegrass pollen 5 allergens. International Archives of Allergy and Applied Immunology 62,173-187.

Watson, J. (1976). Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed. Benjamin-Cummings, Menlo Park, California.

10

Claims (10)

1. 42 DK 174706 B1
2. 1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den udviser mindst 60 % homologi med den i Fig. 5 afbildede sekvens og, at den koder for et allergent 5 protein fra pollen fra familien Poaceae.
3. 2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pollenet er pollen fra Lolium perenne.
4. 3. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den udviser mindst 60 % homologi med den i Fig. 5 afbildede sekvens og, at den koder for et allergent protein fra et pollen fra græs, som er allergent krydsreaktivt med et allergent pollenprotein fra Lolium perenne. som påvist ved IgE-bindingsstudier.
5. 4. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA- sekvens som defineret i ethvert af kravene 1-3.
6. 5. Værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret til at udtrykke et protein eller et polypeptid, der kodes af en DNA-sekvens som 2. defineret i ethvert af kravene 1 -3.
7. 6. Værtscelle ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den er E coli. 7. cDNA, kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens som 25 defineret i ethvert af kravene 1-3 og kan opnås ved, at man: ekstraheret RNA fra rajgræspollen og med affinitetschromatografi udvælger Poly(A+) mRNA, som skal anvendes som template ved syntese af enkeltstrenget cDNA; syntetiserer og isolerer dobbeltstrenget cDNA; opretter et lambda-gt 11 cDNA-ekspressionsbibliotek; 30 DK 174706 B1 43 screener lambda-gt 11 cDNA-ekspressionsbiblioteket efter induktion med IPTG under anvendelse af monoklone antistoffer karakteriseret ved Smart et al., Int Archives of Allergy and Appl Immunol., 72, 243-248 til at afsøge filterløft in duplo og identificere og isolere positive phag-5 plaques; udplader plaquene ved lav tæthed og udfører filterløft in duplo af plaquene; 10 screener phag-plaquene indeholdende kloner, som producerer protein allergen ved at inkubere filterløftene med allergiske antisera eller med de Smart et al monoklone antistoffer og identificere de kloner, der er positive, når de screenes med monoklone antistoffer og positive, når de screenes med allergiske antisera; 15 genindvinder cDNA-indføjelsen fra de allergiske antisera og den antistof-positive phag og ved størrelsesanalyse identificerer indføjelser på ca. 1200 basepar; 20 indsætter indføjelserne i en plasmidvektor til sekventering og ekspression; sekventerer cDNA'et; og 25 sammenligner det sekventerede DNA's restriktionskort med det i Fig. 9 viste cDNA-restriktionskort og identificerer de kloner, der i det væsentlige har samme restriktionskort som det i Fig, 9 viste.
8. 8. Fremgangsmåde til isolering og identificering af DNA, der koder for et 30 aliergent protein fra pollen fra græs, kendetegnet ved, at den indbefatter anvendelse af et cDNA ifølge krav 7 som en heterolog probe til isolering af de homologe cDNA-kloner af protein allergener fra pollen fra græs. DK 174706 B1 44
9. 9. Anvendelse af en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-3 ved fremstilling af et protein eller et polypeptid, der kodes af DNA-sekvensen.
10. 10. Anvendelse af en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-3 eller et 5 cDNA ifølge krav 7 som en probe til isolering og identificering af nukleinsyre, der koder for det allergene protein eller polypeptid.