DK174751B1 - Antibiotisk kedarcidin, fremgangsmåde til fremstilling deraf, farmaceutisk præparat indeholdende kedarcidin samt den kedarcidin-producerende mikroorganisme Streptoalloteichus sp. nov. stamme L585-6, ATCC 53650 - Google Patents

Description

DK 174751 B1

Den foreliggende opfindelse angår et antitumor-antibiotikum, heri benævnt kedarcidin, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt et farmaceutisk præparat indeholdende kedarcidin. Den foreliggende opfindelse angår også den kedarcidin-producerende mikroorganisme Streptoalloteichus 5 sp. nov. stamme L585-6, ATCC 53650.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes antitumor-antibiotisk kedarcidin, der karakteriseres som følger: (a) udseende: brungult faststof, 10 (b) molekylvægt: 12.400 dalton ved SDS-polyacrylamidgel-elektro- phoresemetoden, 17.000 ved gelfil trering/HPLC-metoden, (c) UV-spektrum: praktisk taget som vist i fig. 1, (d) isoelektrisk punkt: 3,65, og (e) omfatter et polypeptid med en aminosyresekvens som følger: 15 X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-20 ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg- arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-i leval-val -gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH, hvor X er valgt blandt H:ala-ser, H-ser og H.

25

Ovennævnte fysisk-kemiske karakteristika adskiller antibiotikumet ifølge den foreliggende opfindelse fra andre kendte peptidantibiotika med antitumor-aktivitet, såsom neocarzinostatin, macromomycin, largo-mycin, actinoxanthin og AN-7D.

30 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det antibiotiske kedarcidin, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af en kedarcidin-producerende stamme af Streptoalloteichus i et medium indeholdende assimilerbare kilder af carbon og nitrogen under submerse aerobe betingelser og udvinding af pro-35 teinet fra fermenteringsmediet.

Ifølge et yderligere aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes en kedarcidin-producerende stamme af Streptoalloteichus sp.

2 DK 174751 B1 nov. stammme L585-6, ATCC 53650.

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes et farmaceutisk præparat indeholdende en tumor-i nhi berende mængde af det antibiotiske kedarcidin samt en farmaceutisk acceptabel bærer.

5 Antibiotisk kedarcidin kan anvendes i en fremgangsmåde til inhibe- ring af tumorvækst i en mammal vært, hvilken fremgangsmåde omfatter administrering til den tumorbærende vært af en tumorinhi berende mængde af antibiotisk kedarcidin.

I fig. 1 vises et UV-spektrum for det antibiotiske kedarcidin.

10 I det foreliggende anvendes følgende forkortelser for aminosyrer: asx: asparaginsyre + asparagin thr: threonin ser: serin glx: glutaminsyre + glutamin 15 asp: asparaginsyre asn: asparagin glu: glutaminsyre gin: glutamin pro: prolin 20 gly: glycin ala: alanin val: val in met: methionin ile: isoleucin 25 leu: leucin tyr: tyrosin phe: phenylalanin his: histidin lys: lysin 30 arg: arginin cys: cystein trp: tryptophan

Stamme L585-6 i soleredes fra en jordprøve indsamlet i staten 35 Maharastra i Indien. Karakteristika for stamme L585-6 er beskrevet nedenfor i detaljer.

3 DK 174751 B1

Morfologi

Stamme L585-6 er en grampositiv, trådformet organisme, som danner substrat og luftmycelier. Myceliumsubstratet trænger gennem agaren og fragmenteres ikke. Der iagttages kugleformede, tætte aggregater af hyfer 5 med en diameter på 5-25 pm, sammen med sammenvoksede vegetative hyfer. Luftmyceliet er temmeligt forgrenet og udvikler uforgrenede drejende eller spiralformede lange hyfer, hvori sporer dannes i kontinuerlig eller diskontinuerlig kæde. Tætte klynger af forgrenede korte sporekæder dannedes overvejende i ISP-medium nr. 5. Begge typer sporer er ovale til 10 kort-cylindriske (0,4-0,6 pm gange 1,0-2,0 pm), er ubevægelige og har glat overflade.

Farveløse ballonlignende legemer (5-20 pm i diameter) iagttoges enkeltvis eller i samling på luftmyceliet efter inkubering i 5-10 dage.

Efter inkubering i 3 uger eller mere udvikles disse ballonlignende lege-15 mer til gulligt-brune, skierotiske korn (40-100 pm i diameter), som dæk-kes med yderligere forlængede lufthyfer.

Væksten er almindeligvis moderat, men er meget dårlig på Czapek's sakkarose-nitrat-agar, havremel-agar og mineralsalte-stivelse-agar. Luftmyceliet dannes på tyrosin-agar og glycerol-asparagin-agar, men ikke 20 på ISP-medier nr. 2, 3, 4 og 6 og Bennett's agar. Farven af luftmyceliet er gullig-hvid. Sorte melanoide pigmenter dannes i ISP-medier nr. 6 og 7. Andre tydelige pigmenter dannes ikke. Dyrkningsmæssige karakteristika ved stamme L585-6 er vist i tabel I.

Tabel I

Dyrkningsmæssige karakteristika ved stamme L585-6 4 DK 174751 B1

Medium Karakteristika ^ 5 Sakkarose-nitrat-agar ^ G: ingen eller ringe (Czapek-Dox agar) A: intet S: farveløst D: intet 10 Trypton-gærekstrakt- G: moderat, ikke grumset, flokket næringsmedium A: intet (ISP nr. 1) S: farveløst D: dybt gullig-brunt (75) ^ 15 Gærekstrakt-maltekstrakt- G: moderat agar (ISP nr. 2) A: intet S: mørkt gullig-brunt (78) D: dybt gullig-brunt (75) 20 Havremel-agar G: sparsom (ISP nr. 3) A: intet eller sparsomt, hvidt ved tilstedeværelse S: farveløst D: intet 25

Uorganiske salte- G: sparsom stivelse-agar A: intet eller sparsomt, hvidt ved (ISP nr. 4) tilstedeværelse S: farveløst 30 D: intet

Glycerol-asparagin-agar G: moderat (ISP nr. 5) A: moderat, gullig-hvidt (92) S: farveløst 35 D: intet

Tabel I <fortsat1

Dvrkninosmæssige karakteristika af stamme L585-6 5 DK 174751 B1

Medium Karakteristika ^ 5 Pepton-gærekstrakt- G: moderat jern-agar A: intet (ISP nr. 6) S: lysgråligt-gullig-brunt (79) D: brunlig sort (65) 10 Tyrosin-agar G: moderat (ISP nr. 7) A: kraftigt, gullig-hvidt (92) S: sort D: sort 15 Glucose-asparagin-agar G: ringe A: intet S: mørk orange-gult (72) D: intet 20 Bennett's agar G: moderat A: intet eller sparsomt, hvidt ved tilstedeværelse S: mørkegråligt-gullig-brunt (81) D: moderat gullig-brunt (77) 25 1) Iagttagelse efter inkubation ved 28°C i 3 uger.

2) G = vækst, A = luftmycelium, S = substratmycelium, D = diffunderbart pigment.

3) Farve og nummer i parentes følger ISCC-NBS-betegnelsen.

30

Fysiologiske karakteristika

Optimal vækst iagttages ved 30-35°C. Temperaturområdet for vækst er 18-39°C. Der forekommer ingen vækst ved 15 og 41°C og ingen vækst forekommer på medier suppleret med mere end 5% NaCl. Gelatine forflydiges, 35 men stivelse hydrolyseres ikke. Blandt 25 afprøvede sukkerarter anvendes kun D-ribose og D-glucose til vækst. De fysiologiske karakteristika og carbonhydratudnyttelsen er vist i tabel II og III.

Tabel II

Fysiologiske karakteristika ved stamme L585-6 6 DK 174751 B1

Hvdrolvse af: Anvendelse af: *2^ 5 L-rhamnose

Gelatine + D-glucose +

Stivelse: opløselig stivelse - D-galactose kartoffelstivelse - D-fructose Mælkekoagulering + D-mannose 10 Mælkepeptonisering + L-sorbose

Produktion af sakkarose nitratreduktase - eller lactose + (w) cellobiose

Tyrosinase + melibiose 15 Tolerance overfor: trehalose

Lysozym, 0,01% (vægt/vol umen) + raffi nose

NaCl, 1-4% (vægt/volumen) + D-melezitose 5% - opløselig stivelse pH 5,0-11,0 + cellulose 20 4,5 og 12 - dulcitol

Temperatur: inositol Vækstområde 18-39°C D-mannitol

Ingen vækst 15°C & 41°C D-sorbitol 25 Optimal vækst 30-35°C salicin glycerol D-arabinose L-arabinose D-xylose 30 D-ribose +

Negativ i Czapek's sakkarose-nitrat-næringsmedium og positiv i pepton-nitrat-næringsmedium.

35 Basismedium: Pridham-Gottlieb's medium (ISP nr. 9 medium)

Tabel III

Yderligere fysiologiske karakteristika* ved stammen L585-6 7 DK 174751 B1

Hvdrolvse af: Svre fra: 5 Adenin - glycerol

Casein + D-arabinose

Esculin + L-arabinose

Hippursyre + D-xylose

Hypoxanthin - L-rhamnose 10 Tyrosin + D-glucose +

Urinstof - D-mannose

Xanthin - lactose cellobiose

Overlevelse ved 50°C, 8 timer - mel i biose 15 trehalose

Udnyttelse af: raffinose

Benzoat - D-melezitose

Citrat - inositol 20 Mucat - D-mannitol

Succinat + D-sorbitol

Tartrat - erythritol adonitol methyl-o-glucosid 25 .....-.........-.......................................................

* Tests beskrevet af Gordon et al., J. Gen. Microb., 1978, 109:69-78.

Cellevægkemi

Cellevægindholdet hos stamme L585-6 undersøgtes i henhold til 30 metoderne beskrevet af Becker et al., i Appl. Microbiol. 13:236-243 (1965), af Yamaguchi i J. Bacteriol. 89:444-453 (1965) og af Lechevalier og Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11:78-92 (1976), Cellevæg-peptidoglycan indeholder meso-deaminopi-melinsyre. Hel celle-sukkerarter omfatter galactose, glucose og ribose.

35 Typen af cellevæg hører således til type III^.. Phospholipider er type P-II indeholdende phosphatidylethanolamin, phosphatidylglycerol og phosphatidyl inositol. Hovedmenaquinonerne er MK-9(H^) og MK-9(Hg).

8 DK 174751 B1

Glycolat-testen er negativ.

Taxonomi

Blandt slægten Actinomycetales med lange kæder af sporer afviger 5 Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Acti-nomadura, Glycomyces, Nocardiopsis og Amycolata klart fra stamme L585-6 med hensyn til cellekemien omfattende cellevægtypen, cellesukker-mønste-ret, phospholipid og menaquinon. Kibdelosporangium (beskrevet af Shearer et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 36:47-54, 1986), Kitasatosporia (be-10 skrevet af Takahashi et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 30:377-387, 1984) og Amycolatopsis (beskrevet af Lechevalier et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 36:29-37, 1986) er beslægtede med stamme L585-6 med hensyn til sammensætning af phospholipid og menaquinon, men Kibdelosporangium og Amycolatopsis afviger fra stammen med hensyn til nærvær af arabinose i 15 cellevægsukker, og Kitasatosporia med hensyn til nærvær af både LL- og meso-diaminopimelinsyre i cellevæggen. Derudover bærer Kibdelosporangium et hyfe-omsluttende sporangium-lignende legeme med rigtig membran, og Kitasatosporia danner submerse sporer. Disse enestående strukturer iagttages ikke i stamme L585-6. Kemotaxonomisk er Streptoalloteichus (be-20 skrvet af Tomita et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 37:211-213, 1987), Actinosynnema (beskrevet af Hasegawa et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 28:304-310, 1978) og Saccharothrix (beskrevet af Labeda et al., Int. J.

Syst. Bacteriol. 34:426-431, 1984) mest beslægtet med stamme L585-6. Actinosynnema danner en luftsporekæde fra spidsen af en synnema. Saccha-25 rothrix danner kæder af fragmenterede coccoide elementer i både vegetative mycelier og luftmycelier og danner ikke klynger af forgrenede korte sporekæder eller skierotiske korn. Morfologien af kæderne af coccoide elementer i Saccharothrix australiensis og S. aerocolonigenes (beskrevet af Labeda, Int. J. Syst. Bacteriol. 36:109-110, 1986) er beslægtede med 30 kæderne hos Nocardiopsis, men er ikke beslægtede med nogen art af Streptomyces. Stamme L585-6 tilhører derfor hverken Actino-synnema eller Saccharothrix.

Streptoalloteichus hindustanus bærer lange spiralformede spore-kæder af arthrosporer, forgrenede korte sporekæder og ski erotiske korn i 35 luftmyceliet og tætte kugleformede grupper af hyfer samt mindre sporangium-lignende legemer, der omslutter 1-4 sporer med flageller i det vegetative mycelium. Stamme L585-6 danner alle de små sporangium-1ig-nende 9 DK 174751 B1 vesikler. Ligesom Streptoalloteichus danner stamme L585-6 ballon-lignende legemer, som udvikles til ski erotiske korn. Denne struktur er blevet iagttaget hos mange arter af Streptomyces, såsom S. kanamyceticus (Shir-ling et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 22:265-394, 1972) og S. roseiscle-5 roticus (Chainia rubra) (Shirling et al., Int. J. Syst. Bacterial.

22:265-394, 1972).

Baseret på ovennævnte sammenligningsbetragtninger klassificeres stamme L585-6 som hørende til slægten Streptoalloteichus. Stamme L585-6 afviger fra Streptoalloteichus hindustanus ved mangel på evne til at 10 danne luftmycelium i ISP-medium nr. 2, 3 og 4 og Bennett's agar, ved at danne melanin, ved manglende stivelseshydrolyse, ved manglende vækst ved 41°C og ved evnen til kun at udnytte D-ribose og D-glucose blandt de 25 afprøvede sukkerarter. Stamme L585-6 betragtes således som en ny art af slægten Streptoalloteichus.

15 En biologisk ren kultur af stamme L585-6, bestemt som en ny art af slægten Streptoalloteichus, er blevet deponeret ved American Type Culture Collection (Rockville, MD) og er føjet til deponeringsmyndighedernes permanente samling af mikroorganismer under accessionsnummer ATCC 53650.

20

Antibiotisk produktion

Antitumor-antibiotikumet ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ved at dyrke stamme L585-6 eller en mutant deraf under submerse betingelser i et vandigt næringsmedium. Produktionsorganismen dyrkes i 25 et næringsmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde, f.eks. et as-similerbart carbohydrat. Eksempler på passende carbonkilder omfatter ce-relose og glycerol. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde, såsom fiskemel, gærekstrakt eller ammoniumsalte. Uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, magnesiumsulfat, cal-30 ciumcarbonat, phosphater, etc tilsættes om nødvendigt. Sporelementer, såsom kobber, mangan, jern, zink, etc., sættes om ønsket til mediet, eller de kan være tilstede som urenheder i andre af mediets bestandele. Inkubationstemperaturen kan være en vilkårlig temperatur ved hvilken den producerende stamme kan vokse, f.eks. 18-39°C, men det foretrækkes at 35 udføre fermenteringen ved 25-35°C, mest foretrukkent ved 27-32°C. Mediet har fortrinsvis neutral pH-værdi, og fremstillingen af antibiotikumet udføres almindeligvis i løbet af 4-8 dage. Optimal produktion opnås al- 10 DK 174751 B1 mindeligvis i løbet af 5-6 dage. Til fremstilling af relativt små mængder antibiotikum kan anvendes dyrkning i rystekolbe eller som overfladekulturer, hvorimod submers aerob dyrkning i sterile tanke foretrækkes til fremstilling i større skala. Ved udførelse af tankfermentering er 5 det ønskeligt at producere et vegetativt podestof i et næringsmedium ved at pode næringsmediekulturen med sporer fra organismen og, når et ungt, aktivt, vegetativt podestof er blevet opnået, overføre podestoffet aseptisk til fermenteringstanktmediet. Yderligere omrøring kan ske med et mekanisk røreværk. Antiskummidler, såsom lard oil eller siliconeolie, 10 kan om nødvendigt også tilsættes.

Fremstilling af det antibiotiske kedarcidin i fermenteringsmediet kan let følges under fermenteringsforløbet ved antimikrobielle assays under anvendelse af Bacillus subtilis som testorganisme eller ved cel 1e-cytotoksicitets-assay under anvendelse af murine (B16-F10) eller humane 15 (f.eks. HCT-116, KB) tumorcellelinier.

Det er tydeligt, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til anvendelse af den særligt foretrukne stamme L585-6 beskrevet ovenfor eller til organismer, der fuldtud svarer til ovennævte beskrivelse. Det er især åbenbart, at andre kedarcidin-producerende stammer eller mutan-20 ter af nævnte organisme, som kan fremstilles på konventionel måde, såsom ved røntgenstråling, ultravioletstråling, behandling med nitrogen-sennepsgasser, phag-eksponering og lignende falder ind under opfindelsens rammer.

25 Isolering og ooresning af antibiotikum

Antitumor-proteinet ifølge den foreliggende opfindelse kan isoleres fra fermenteringsmediet under anvendelse af konventionelle proteinseparationsmetoder, såsom dialyse, ultrafiltrering, gel fil trering, isoelek-trisk præcipitering, udsaltning, elektrophorese, ionbytningschromatogra-30 fi og affinitetschromatografi. En kombination af disse teknikker i rækkefølge anvendes almindeligvis til oprensning af proteinet til tilsyneladende homogenitet. Isolering- og oprensnings-metoden kan overvåges og ledes ved mikrobiologiske assays, såsom ved anvendelse af B. subtilis, in vitro cytotoksicitets-assays overfor murine eller humane cancercelle-35 linier, in vivo antitumor-assays, eller ved fysiske metoder, såsom livelier HPLC-teknik. I skema I afbildes en typisk isolerings-oprensnings-sekvens. Denne særlige sekvens er kun illustrativ og det vil være åben- 11 DK 174751 B1 bart for fagmanden, at forskellige sekvenser under anvendelse af andre metoder kan anvendes sålænge pro-teinet opnås med høj renhed og bibeholder de biologiske aktiviteter.

DK 174751 B1 12

Skema I

Isolering og oprensning af protein 5 Fermenteringsmedium ,-1-r

Mycelium Filtrat

Anionbytnings- 10 puffer puffer + 1 M NaCl

Eluerings- Eluerings- Eluerings- middel middel middel 15

Gel filtrering

Eluerings- 20 middel

Præparativ anionbyt- ning 25

Oprenset opløsning af protein 30

Lyofi lisering 35 Oprenset protein 13 DK 174751 B1

Til uddybelse af skema I fjernes den uopløselig masse fra fermenteringsmediet på konventionel måde, såsom ved centrifugering eller filtrering. Hvis næringsmediet skal filtreres kan med fordel anvendes et filterhjælpestof, såsom Dicalite®. Derefter underkastes filtratet anion-5 bytnings-chromatografi under eluering med en kationpuffer ved pH 7-8 efterfulgt af samme puffer indeholdende natriumchlorid. En passende kationpuffer med ovennævnte pH-værdi er f.eks. Tris-HCl. Fraktionen elueret med den NaCl-holdige puffer opsamles, koncentreres og oprenses yderligere ved gelfiltreringschromatografi under anvendelse af oven-nævnte kat-10 ionpuffer. Fraktioner opsamles og undersøges for tilstede-værelse af den aktive komponent. Et hensigtsmæssigt system til indled-ningsmæssig overvågning af eluatet er at udføre et assay under anven-delse af Bacillus subtil is. De fraktioner, der udviser inhiberingszoner, kombineres, koncentreres og oprenses yderligere ved anionbytnings-chromatografi under 15 indledningsvis eluering med en kationpuffer med pH 7-8 og der fortsættes med en lineært stigende ionstyrkegradient. Aktive fraktioner undersøges for homogenitet ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE), isoelektrisk fokusering og HPLC-teknikker. Fraktioner, der bedømmes som homogene, kombineres og lyophili seres til opnåelse af det 20 aktive protein.

Antibiotikum kedarcidin er et kraftigt antitumor-antibiotisk protein sammensat af et enkeltkædet polypeptid og en ikke-proteinholdig chromophor. Selv om prøver af antibotikumet underkastet fysisk-kemisk karakterisering og biologiske afprøvninger bedømtes som homogene ved 25 SDS-PAGE, isoelektrisk fokusering og HPLC, viste det sig under sekvensopdelingsforsøg, at antibiotikumet bestod af en hovedvariant og en eller to bivarianter. Varianterne afviger fra hinanden med hensyn til poly-peptidets indledningsvise N-terminale aminosyresekvens som beskrevet senere. Separation eller isolering af de individuelle varianter er ikke 30 nødvendig for opnåelse af antitumor-aktivitet.

Den foreliggende opfindelse omfatter også varianter af kedarcidin, hvor peptiddelen i antibiotikumet kan ændres ved i teknikken kendte metoder til fremstilling af fragmenter og derivater deraf, f.eks. ved deletion, addition eller substitution af bestemte aminosyrer i peptidets 35 primære struktur, uden i al væsentlighed at ændre antibiotikumets antitumor-aktivitet som beskrevet i det foreliggende.

14 DK 174751 B1

Aminosvresammensatninq

Ved anvendelse af i teknikken kendte standardmetoder bestemtes a-minosyresammensatningen af det oprensede protein, hvilken sammensatning er anført i tabel VI.

5 15 DK 174751 B1

Tabel VI

Aminosvresammensætning af kedarcidin

Udbytte Rester 5__nmol_mo1%_(a)_Cbj.

(6) asP 2,765 8,1 10,1 9,3 asn (3) thr 3,18 9,3 11,6 10,6 (11) 10 ser 3,163 9,3 11,5 10,6 (12) glu (4) gin ^928 5’7 7’° 6’5 (2) pro 1,615 4,7 5,9 5,4 (4) gly 5,529 16,2 20,1 18,5 (18) 15 ala 5,566 16,3 20,3 18,6 (18) val 3,731 11 13,6 12,5 (13) met 0,2873 0,8 1,1 1,0 (1) ile 0,8531 2,5 3,1 2,9 (3) leu 1,298 3,8 4,7 4,3 (4) 20 tyr 0,6274 1,8 2,3 2,1 (2) phe 1,565 4,6 5,7 5,2 (5) his 0,6235 1,8 2,3 2,1 (1) lys 0,3196 0,9 1,2 1,1 (0) arg 1,001 2,9 3,7 3,3 (3) 25 cys 0 0 0 0 (4) trp 0 0 0 0 (0) (a) Antal rester pr. peptid ved en antaget molekylvægt på 12.000 for 30 pepti det.

(b) Antal rester pr. peptid ved antagelse af, at det ialt indeholder 114 rester.

Værdier i parentes angiver antal rester pr. peptid bestemt ved 35 aminosyresekvensanalyse.

16 DK 174751 B1

Aminosvresekvens

Til aminoterminal sekvensanalyse reduceredes kedarcidin med 2-mer-captoethanol og oprensedes yderligere ved SDS-PAGE (15% acrylamid) og udvandtes fra gelerne ved elektroeluering eller elektroblotting.

5 Til de fleste enzymatiske spaltninger anvendtes kedarcidin uden yderligere oprensning. Kedarcidin reduceredes med 20 mM dithiotreitol i 100 μΙΗβΓ 0,4 M Tris-HCl-puffer, pH 8,5, indeholdende 6 M guanidin-HCl, 0,1% Na2 EDTA, i 2 timer ved 50°C og S-pyridylethyleredes derefter med 100 mM 4-vinylpyridin natten over ved stuetemperatur. Reaktionen stand-10 sedes ved tilsætning af 10 eliter 2-mercaptoethanol i 1 time ved 50°C. Reagenserne fjernedes ved dialyse imod 5% (vol/vol) eddikesyre i 24 timer og det modificerede kedarcidin tørredes derefter i en "Speedvac" cenrifugalkoncentrator (Savant Instruments).

Enzymatisk spaltning af S-pyridylethylereret kedarcidin med ASP-N 15 enzym eller S-aureus V8 protease udførtes i 40 μliter 0,1 M Tris-eddike-syrepuffer, pH 8,0, indeholdende 0,7 M urinstof ved 37°C natten over under anvendelse af et enzym:substrat-forhold på 1:100 (ASP-N) eller 1:10 (V8 protease). Trypsin-nedbrydning udførtes i 40 /iliter 0,1 M Tris-eddikesyrepuffer, pH 8,0, ved 37°C natten over ved et enzym:substrat-20 forhold på 1-20. De enzymatiske nedbrydningsblandinger forsuredes med tri fluoreddikesyre (TFA) til pH 2,0 og separeredes ved reversfase HPLC.

Peptidoprensning ved reversfase HPLC udførtes på et "Model 130A"-separationssystem (Applied Biosystems, Inc.) og foregik ved 40°C på en "RP-300"-søjle (2,1 x 100 mm, Applied Biosystems, Inc.). Lineære aceto-25 nitrilgradienter bestående af 0,1% TFA i vand som udgangspuffer og 60% acetonitril indeholdende 0,085% TFA som grænsepuffer anvendtes til elue-ring. Peptider opsamledes manuelt. Aminosyresekvens-bestemmelser udførtes på et automatisk aminosyresekvensbestemmelsesapparat ("Model 475 A", Applied Biosystems, Inc.) ved hjælp af standardmetoder.

30 Hovedvarianten af polypeptidet bestod af 114 aminosyrerester.

Aminosyresekvensen bestemtes til at være følgende: 35 17 DK 174751 B1 N-terminal ende H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-5 ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu- phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-10 gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH.

C-terminalende

To bivarianter identificeredes, hvor den ene manglede den første alaninrest i hovedvarianten, og den anden manglede de første to amino-15 syrerester, dvs. alanin og serin i hovedvarianten.

Bestemmelse af molekylvagt (a) Ved qelfiltrerino/HPLC-metode 20 Ved anvendelse af en "TSK-G2000 SW"-søjle (7,5 x 300 mm) (LKB Pro dukter AB, Sverige) udførtes gelfiltrering under anvendelse af 50 mM Tris-HCl-puffer indeholdende 0,5 M NaCl (pH 7,4) ved en strømningshastighed på 0,5 ml/minut. Alternativt kan en "1-125"- proteinanalysesøjle fra "Maters Associates" anvendes med 0,2 M Tris-acetat som elueringsmid-25 del ved en strømningshastighed på 1 ml/min. Molekylvægten vurderedes til 17000 daltons ud fra referencekurven opnået med standard-molekylvægtmarkører (Bio Rad Laboratories).

(b) Natri umdodecvlsul fat-polvacrvlamidoel-elektrophoresemetode 30 En prøve af proteinet og molekylvægtmarkørerne (opnået fra Diversified Biotech, Maine) blandedes med et tilsvarende volumen "Seprasol" (brugsfærdig proteinopløsende væske indeholdende sakkarose og et sporfarvestof) og opvarmedes i 3 minutter ved 90°C umiddelbart forud for elektrophorese. Elektrophorese udførtes ved 300 V i "Seprabuff" (Tris-35 glycine-SDS, pH 8,3), til sporfarvestoffet nåede bunden af gelen. Gelen nedsænkedes derefter i en farvende opløsning (1,25 g "Comassie BB R-250", 92 ml iseddikesyre i 908 ml vandig methanol) i mindst 10 timer, og 18 DK 174751 B1 nedsænkedes derefter i en affarvende opløsning (75 ml eddikesyre og 50 ml methanol i 875 ml vand) indtil gelens baggrund blev transparent. "Se-prasol" og "Seprabuff" opnåedes fra Integrated Separation System, Massachusetts. Molekylvægten bestemtes til 12.400 daltons ved denne metode.

5

Isoelektrisk fokusering

Gelen, der anvendtes til fokusering, fremstilledes ved at blande 29,1% acrylamid i vand 10 ml 0,9% N,N'-methylen-bis-acrylamid i vand 10 ml 10 glycerin 7 ml "1802 Ampholine", pH 2,5-4 3 ml vand q.s. til 60 ml

Den resulterende opløsning afgassedes i 10 minutter, og 1,5 ml 1% 15 ammoniumpersulfat i vand og 10 /zliter Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiamin tilsattes. Blandingen udhældtes i støbeforme og polymeriseredes. De anvendte elektrodeopløsninger var 1 M phosphorsyre ved anoden og 2% "1809 Ampholine" pH 6,8, ved katoden. Fokuseringsforsøget udførtes ved en konstant belastning på 25 watt i 2 timer. Procentangivelsen refererer 20 til vægt pr. volumen. Det isoelektriske punkt bestemtes til 3,65 og migreringsafstanden fra katoden var 6,25 cm.

Biologisk aktivitet

Antitumor-aktiviteten af proteinet vurderedes over for transpian-25 terbar murin P388 leukæmi. Til CDF,-mus implanteredes intraperitonealt (i.p.) eller intravenøst (i.v.) 10° P388 leukæmi cell er opnået fra DBA/2 donormus med denne transplanterbar murin leukæmi. Musene behandledes i.p. med enten saltvand (kontrolmus) eller doser af kedarcidin én gang dagligt i 5 på hinanden følgende dage begyndende 1 dag efter tumor-ino-30 kulering mod i.p. implanteret P388 leukæmi. Mod i.v.-implanteret P388 leukæmi modtog musene kedarcidin i.v. på dag 1, 3 og 5 efter inokule-ring. Disse dyr iagttoges dagligt og dødsfald noteredes. Ændringer i gennemsnitlig legemsvægt (fra dagen for leukæmiimplentering til dagen for sidste behandling) bestemtes for alle grupper for således at af-35 spejle lægemiddeltoksiciteten. Forekomsten af mus, der var i live i hver gruppe på dag 5 efter tumorimplentering registreredes for herved yderligere at kunne vurdere lægemiddel toksiciteten. Intet terapeutisk resul- 19 DK 174751 B1 tat ansås for betydningsfuldt, hvis mere end 1 mus pr. behandlingsgruppe var død på dag 5. Behandlingsgrupper bestod af enten 4 eller 6 mus, og kontrolgrupper bestod af 10 mus. Antallet af mus, der overlevede til dag 30 (sidste dag i forsøget) noteredes ligeledes. Ved afslutning af for-5 søget bestemtes den gennemsnitlige overlevelsestid (MST) for hver gruppe og anvendtes til beregning af %T/C, hvilket er forholdet mellem MST for en behandlet gruppe og MST for kontrolgruppen multipliceret med 100. En %T/C-vsrdi på 125 eller mere indikerer signifikant antitumor-aktivitet.

In vivo-data er anført i tabel IV og V.

10 20 DK 174751 B1

Tabel IV

Antitumor-aktivitet overfor i.D. implanteret P388 leukæmi Dosisa) Genmsnit.

5 fort. eller overlev. Gen. vægt- Antal mus

Prave mQ/ka/in.i tidfdagel %T/C ændrinq(ql i live oå dag 5 D16F411 fort. 1-40 7,0 74 -1,9 4/4 fort. 1-80 10,0 105 -1,2 4/4 fort. 1-160 12,5 132 -1,0 4/4 10 fort. 1-320 18,5 195 -1,9 4/4

Kontrol 9,5 0,2 10/10 D18F413 0,27 7,0 70 -1,9 4/6 0,09 15,0 150 -0,8 6/6 15 0,03 17,0 170 -1,7 6/6 0,01 15,0 150 -0,3 6/6 D18G414b* 0,09 9,5 95 -1,3 6/6 0,03 15,5 155 -1,2 6/6 20 0,01 14,5 145 -0,5 6/6 0,0033 14,0 140 -0,2 6/6

Kontrol 10,0 --- 0 10/10 25 ________ a ) ' Lægemiddel administeret i.p. én gang dagligt i 5 på hinanden følgende dage begyndede 1 dag efter tumor-inokulering.

30 Lyophiliseret and rekonstitueret præparat af den ved produktionsbetegnelse D18F413 angivne prøve.

21 DK 174751 B1

Tabel V

Antitumor-aktivitet overfor i.v. implanteret P388 leukæmi Dosis3) Genmsnit.

5 fort. eller overlev. Gen. vægt- Antal mus

Prøve ma/ka/ini tidfdaael % T/C ændrino(q) i live på dag_5 D18F413 0,32 6,0 75 -3,1 6/6 0,16 7,5 94 -3,2 6/6 10 0,08 11,0 138 -1,4 6/6 0,04 12,5 156 -0,6 6/6 0,02 10,0 125 0,1 6/6 0,01 8,0 100 1,2 6/6 15 D16F411 fort. 1-25 7,0 88 -2,9 6/6 fort 1-50 10,5 131 -1,6 6/6 fort. 1-100 13,0 163 -1,2 6/6 fort. 1-200 9,5 119 -0,2 6/6 fort. 1-400 9,0 113 0,5 6/6 20 fort. 1-800 8,0 100 0,8 6/6

Kontrol 8,0 --- --- 10/10 25 Lægemiddel administreret i.v. dag 1, 3 og 5 efter tumorimplantering.

22 DK 174751 B1

Kedarcidin vurderedes også overfor murin B16 melanoma implanteret intraperitonealt med 0,5 ml 10% tumorcel lesuspension. Til hvert dosisniveau anvendtes 10 mus. Lægemidlet administreredes intraperitonealt én gang dagligt i 9 på hinanden følgende dage begyndende én dag efter tu-5 morimplantation. Antallet af overlevende mus på dag 10 og ved afslutningen af forsøget, dvs. dag 60, registreredes. Testresultaterne er anført i tabel VI. Procentvise T/C-værdier på 125 eller mere angiver signifikant antitumor-aktivitet.

10 Tabel VI

Antitumor-aktivitet af kedarcidin overfor i.p. implanteret B16 melamona

Dosis MST Genm vægt- Antal overlevende (mg/kq/dosisl fdaqei %T/C ændr.(al_mus på dag 5 (601* 15 0.256 16.0 97 -2.7 9/10 0.128 24.5 148 -1.3 10/10 0.064 26.5 161 0.3 10/10 0.032 31.5 191 1.0 10/10 20 0.016 32.5 197 0.6 10/10 0.008 34.0 206 0.6 9/10 0.004 27.0 164 0.3 10/10(1) 0.002 21.5 130 0 10/10

Kontrol 16.5 - 1.3 25 * Antallet i parentes = antallet af overlevende mus på dag 60 efter tumorimplentering.

Testresultaterne angivet i tabel IV, V og VI viser, at antibiotisk 30 kedarcidin er et kraftigt middel, der udviser reproducerbar antitumoraktivitet in vivo overfor murin leukæmi P388 og B16 melanoma. Den iagttagede aktivitet manifesteredes ved forøgelser i levetid ved i.p. implanteret Θ16 melanoma, og både i.p. og i.v. implanteret P388, idet sidstnævte udgør en form af sygdommen, der er mere vanskelig at behandle 35 effektivt på grund af dens tendens til at disseminere. Kedarcidin er også blevet vurderet overfor subkutant implanteret B16 melanoma, murin M5076 lungetumor, og intracranialt implanteret P388 leukæmi, men viste 23 DK 174751 B1 ikke signifikant aktivitet i disse dyremodeller.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes farmaceutiske præparater indeholdende en virksom tumor-i nhi berende mængde af antibiotikumet ifølge opfindelsen sammen med en inert, farmaceutisk acceptabel 5 bærer eller et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel. Sådanne præparater kan også indeholdende andre aktive antitumor-midler, og kan være udformet på en vilkårlig farmaceutisk form, der er passende til den ønskede administreringsmåde. Eksempler på sådanne præparater omfatter faste præparater til oral administrering, såsom tabletter, kapsler, pil-10 ler, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administrering, såsom opløsninger, suspensioner, sirupper eller eliksirer, og præparater til parenteral administrering, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De kan også fremstilles i form af sterile, faste præparater, der kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvand eller et 15 andet sterilt injicerbart medium umiddelbart før anvendelse.

Ved anvendelse som et antitumor-middel kan optimale doser og ordineringer til en given mammal vært let konstateres af fagmanden. Det er åbenbart, at den faktiske dosis kan variere i overensstemmelse med det særlige, formulerede præparat, administreringsvejen og det særlige sted, 20 den særlige vært og sygdom, der skal behandles. Mange faktorer, der modificerer virkningen af lægemidlet skal tages i betragtning, herunder alder, vægt, køn, diæt, administreringstidspunkt, administreringsvej, udskillelseshastighed, patientens tilstand, lægemiddelkombinationer og sygdommens alvor.

25 Den foreliggende opfindelse belyses i det følgende ved eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af vegetativ kultur af Streptoalloteichus stamme L585-6 Streptoalloteichus sp. stamme L585-6 (ATCC 53650} opretholdtes og 30 overførtes til reagensglas på skråsubstrater af gær-maltekstraktagar bestående af dextrose 4,0 g gærekstrakt 4,0 g maltekstrakt 10,0 g 35 CaCOj 1,5 g agar 15,0 g destilleret vand q..s. til 1 liter 24 DK 174751 B1

Ved hver overførsel inkuberedes skråsubstratagaren ved 28°C i 2 u-ger. Vegetative kulturer fremstilledes ved at overføre overfladevæksten fra skråsubstratkulturen til en 500 ml Erlenmeyer kolbe indeholdende 100 ml af et sterilt medium bestående af ^ cerelose (majsprodukt) 30 g "Pharmamedia" (Traders Oil Mill Co.) 10 g "Nutrisoy" (Archer Daniels Midland Co.) 10 g CaCOg 3 g destilleret vand q.s. til 1 liter 10

Denne vegetative kultur inkuberedes ved 28°C i 72 timer på et roterende rysteapparat ved 250 omdrj./minut.

Eksempel 2 15 Fermentering i rvstekolber 5 ml af den vegetative kultur fra eksempel 1 inokuleredes i 500 ml Erlenmeyer kolber, der hver især indeholdt 100 ml af et produktionsmedium bestående af glycerol 30 g 20 "Pharmamedia" 10 g "Distiller's solubles" (Nutrition Product Co.) 15 g fiskemel (Menhaden) 10 g

CaCOg 6 g destilleret vand q.s. til 1 liter 25

Produktionskulturen inkuberedes ved 28°C på et roterende rysteapparat ved 250 omdrj./minut. Produktionen af det antibiotiske protein overvågedes ved mikrobielle assays under anvendelse af B. subtil is og cytotoksiske in vitro assays under anvendelse af murin melanoma celle-30 linie B16-F10 og humane tumorcellelinier. Optimal produktion opnåedes almindeligvis efter 144-168 timer.

Eksempel 3 Tankfermenterino 35 25 ml af den vegetative kultur fra eksempel 1 inokuleredes i en 2 liter "Vitro"-flaske indeholdende 500 ml af det samme vegetative medium. Podningskulturen på 2. trin inkuberedes yderligere ved 28°C i 72 timer 25 DK 174751 B1 på et roterende rysteapparat ved en rystehastighed på 250 omdrj./minut.

500 ml af podningskulturen på 2. trin inokuleredes i et "New Brunswick Microgen"-fermenteringsapparat (16 liter nominelt volumen) indeholdende 10 liter produktionsmedium med den i eksempel 2 anførte sammensætning.

5 Fermenteringen udførtes ved 28°C, gennem!uftning med 1 volumen/minut og omrystningen indstillet til 250 omdrj./minut. Produktionen af antibiotisk kedarcidin overvågedes med passende in vitro bioassays.

Eksempel 4 10 Isolering og oprensning af kedarcidin 10 ml råt fermenteringsmedium blandedes med 6 liter Dicalite® og den resulterende tynde opslæmning filtreredes på en Dicalite®-pude. De uopløselige materialer kastedes bort og filtratet pumpedes gennem en Zeta Prep® 250-QAE ionbytningspatron (LKB-Produkter AB, Sverige) ved en 15 hastighed på 30 ml/minut. Patronen var blevet præ-ækvilibreret med 2 liter 50 mM Tris-HCl puffer, pH 7,4. Gennemløbet opsamledes. Patronen vaskedes med 1 liter 50 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,4, og elueredes så med 500 ml 50 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,4, indeholdende 0,5 mol NaCl. Eluatet opsamledes og koncentreredes fra 500 ml til 100 ml under anvendelse af 20 en Amicon® standard ultrafiltreringscelle udstyret med en Amicon®-YM5 membran. Den koncentrerede opløsning overførtes ved perkolering til en gel fil treringskolonne (5 x 100 cm) pakket med 1400 ml U1trogel®-AcA54 (LKB-Produkter AB, Sverige) i et tilsvarende volumen 50 mM Tris-HCl puffer. Ultrogel®-lejet var blevet ækvilibreret med 5 liter 50 mM Tris-HCl-25 puffer, pH 7,4. Den fyldte kolonne elueredes med 2 liter 50 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,4, ved en hastighed på 60 ml/minut. Efter en første portion på 450 ml opsamledes fraktioner på 10 ml, og hver frak-tion afprøvedes under anvendelse af B. subtilis. De fraktioner, der gav inhiberingszoner (fraktioner 83-133) kombineredes og koncentreredes til 100 ml ved ultra-30 filtrering. Den koncentrerede opløsning overførtes ved perkolering til ionbytningskolonnen (2,5 x 15 cm) pakket med en op-slæmning af 70 ml "DEAE-Trisacryl" (LKB-Produkter AB, Sverige) i et tilsvarende volumen 50 mM Tris-HCl-puffer. “Trisacryl"-lejet var blevet ækvilibreret med 10 kolonnevolumener 50 mM Tris-HCl-puffer. Den fyldte kolonne elueredes først 35 med 10 kolonnevolumener 50 mM Tris-HCl-puffer, efterfulgt af en 300 ml lineær gradient (hældning = 0,1 M/time) af 100% 50 mM Tris-HCl-puffer til 100% 50 mM Tris-HCl-puffer indeholdende 0,5 M NaCl ved en strøm- 26 DK 174751 B1 ningshastighed på 60 ml/time. Ialt 47 5 ml fraktioner opsamledes og afprøvedes overfor B. subtilis. Aktive fraktioner 25-37 kombineredes og underkastedes analytisk gelfil trering/HPLC under elue-ring med "Waters Protein analysis"-kolonne 1-125, 0,2 M Tris-acetat, pH 7,0, ved en 5 strømningshastighed på 1 ml/minut, og UV-detektor ved 260 nm. Under disse betingelser viste chromatogrammet en enkelt top ved en retentionstid på 8,3 minutter. De kombinerede fraktioner bedømtes også som homogene ved isoelektrisk fokusering og SDS-PAGE under tidligere beskrevne betingelser. Koncentrationen af den aktive kompoment vurde-redes til 4,25 10 mg/ml ved lyophili sering af en 10 ml aliquot og korrek-tion for puffervagt.

Claims (7)

27 DK 174751 B1

1. Antibiotisk kedarcin, KENDETEGNET ved følgende karakteristika (a) udseende: brungult faststof, 5 (b) molekylvægt: 12.400 dalton ved SDS-polyacrylamidgel-elektro- forese-metoden, 17.000 ved gelfiltrering/HPLC-metoden, (c) UV-spektrum: praktisk taget som vist i fig. 1, (d) isoelektrisk punkt: 3,65, og (e) omfatter et polypeptid med en aminosyresekvens som følger: 10 X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp- gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr- ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala- asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-alaglu-phe-his-asp-phe- 15 ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg- arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val - val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-0, hvor X er valgt blandt H-ala-ser, H-ser og H. 20

2. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotisk kedarcidin ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man dyrker en kedarcidin-producerende stamme af Streptoalloteichus i et medium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder under submerse aerobe betingelser, og udvinder nævnte an- 25 tibiotikum fra dyrkningsmediet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den producerende stamme er stamme L585-6, ATCC 53650.

4. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptoalloteichus sp. nov., stamme L585-6, ATCC 53650.

5. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det omfatter en tumor-inhiberende mængde kedarcidin og en farmaceutisk acceptabel bærer. 35

6. Antibiotisk kedarcidin ifølge krav 1 fremstillet ved en fremgangsmåde, der er KENDETEGNET ved, at man 28 DK 174751 B1 a) dyrker en kedarcidin-producerende stamme af Streptoalloteichus i et medium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder under submerse aerobe betingelser, og b) udvinder nævnte antibiotikum fra dyrkningsmediet. 5

7, Antibiotisk kedarcidin fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at den producerende stamme er stamme L585-6, ATCC 53650. 10 15 20