DK174998B1 - Fermenteringsfremgangsmåde og anordning til udøvelse heraf - Google Patents

Description

DK 174998 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde ifølge krav 1 til løsning af cellekulturer fra mikrobærestoffer, ved hvilken en beholder med besatte bærestoffer tilføres en trypsinopløsning, og de løsnede celler føres ud af beholderen.

5 Fremgangsmåden tjener til isolering af cellekulturer ved deres formring på mikrobærestoffer. For at opnå cellekulturer i stør mængde r det nødvendigt at løsne kulturerne fra mikrobærestofferne og lytte dem over på ubesatte mikrobærestoffer.

Hidtil er der blevet arbejdet i stød (batchvis). Til en beholder med overflyttede mikrobærestoffer sættes trypsin, som får cellerne til at løsne sig. Der ventes med at fjerne 10 cellerne, dvs. en celleholdig cellesuspension, fra beholderen, til i det væsentlige alle cellerne er løsnet fra mikrobærestofferne. En høj procentvis andel af cellerne løsner sig temmeligt hurtigt og opholder sig derfor i lang tid i trypsinopløsningen. Dette har den ulempe, at trypsin har ugunstig indvirkning på cellerne. Især påvirkes deres vækst og deres måde at knyttes til nye mikrobærestoffer. Dette bliver især kritisk ved større 15 mængder, hvor kulturerne er inhomogene, og hvor der må regnes med meget forskellige løsningshastigheder.

Opfindelsen har derfor til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde af den ovenfor beskrevne art, ved hvilken trypsins påvirkningstid på de løsnede celler indskrænkes til 20 et minimum.

Problemet er løst ved en fremgangsmåde som er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

25 Løsnede celler fjernes derved fra beholderen i en gennemstrømningshastighed, der svarer til trypsinopløsningens hastighed, og den skadelige indvirkning undgås således. Trypsinopløsningens gennemstrømning kan fortsættes så længe, som det er nødvendigt for at skille også de sidste cellekulturer fra mikrobærestofferne. Trypsinets indvirkningstid på løsnede celler er i hvert stadium omtrentlig lige kort.

30

Gennemstrømningen af trypsinopløsningen ifølge krav 2 har den fordel, at ingen løsnede celler kan sætte sig fast på beholderens bund og som følge af strømningsretningen også blive ført væk fra mikrobærestoffernes område.

35 Det kendetegnende i krav 3 angiver en fordelagtig udførelsesform, ved hvilken mikrobærestofferne skylles på alle sider af den gennemstrømmende opløsning, og at løsningen fremskyndes.

5 DK 174998 B1 2

Udførelsesformen ifølge krav 4 har den fordel, at trypsinopløsningen fordeler sig jævnt og rammer mikrobærestofferne og deres cellekulturer med homogen hastigheds-fordeling.

Ifølge krav 5 videreføres de løsnede celler fordelagtigt til en anden beholder, som indeholder ubesatte mi krobærestoffer, hvor den videre formering straks kan starte.

Opfindelsen angår også en anordning ifølge krav 7 til udførelse af fremgangsmåden, 10 ved hvilken anordning trypsinopløsningens gennemstrømning muliggøres. Anordningen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 7 angivne.

En fordelagtig udførelsesform ifølge krav 8 muliggør gennemstrømning af en vaskepuffervæske fra oven og nedefter gennem beholderen før trypsintilførslen.

15

Udformningen af den benyttede beholder og de anvendte mikrobærestoffer til den forbedrede anvendelse lettes fordelagtigt ved det, der er angivet i den kendetegnende del af krav 9.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nedenfor ved en skematisk illustreret anordning (eneste figur).

I en lukket beholder 1 sidder der i afstand over dens bund la en permeabel indsats 2, fx en si eller en porøs plade. Under indsatsen 2 udmunder der i beholderen en 25 tilførselsledning 3 til indføringen afen trypsinopløsning. I beholderens randområde mellem bunden la og indsatsen 2 sidder der ligeledes en aflukkelig udstrømningsåbning 4 til udstrømning af en vaskepuffervæske. Over den permeable indsats 2 udmunder i beholderen 1 et tilløbsrør 5 for en vaskepuffervæske og et tilledningsrør 6 for et medium kulturvækst. Endvidere stikker en udtagsledning 7 for en suspension 30 indeholdende løsnede celler og et afløbsrør 8 fra oven og ned i beholderen, idet indgangsåbningen for det sidstnævnte afløbsrør 8 sidder tæt over indsatsen 2. I udtagsledningen 7 udmunder der uden for beholderen en tilløbsledning 9. Endvidere er der i udtagsledningen 7 anbragt en (ikke vist) udsugningspumpe.

35 Endvidere er der fra oven og nedefter i beholderen anbragt et røreorgan 10, som på ikke vist måde uden for beholderen kan drives rundt.

DK 174998 B1 3

Ovenfor den permeable indsats 2 er der et højt iag af mikrobaerestoffer i i, der er antydet vilkårligt med prikker. Før starten af den fremgangsmåde, der skal illustreres, har cellekulturer bundet sig dertil og formeret sig, indtil mikrobærestofferne 11 er fuldstændig dækket. Dette stadium kan konstateres ved en prøveudtagning ved et 5 udtapningssted 12 ovenfor indsatsen 2. Derpå tilledes der i gennemstrømnings-fremgangsmåden først en vaskepufferopløsning gennem beholderindholdet, hvilken vaskepufferopløsning ledes ind gennem tilløbsrøret 5 og strømmer ud gennem den samtidigt åbnede udstrømningsåbning 4. Efter at udstrømningsåbningen 4 er lukket, pumpes en trypsinopløsning ind i beholderen gennem tilførselsledningen 3. Trypsin-10 opløsningen fordeles gennem den permeable indsats 2 og rettes med let, regelmæssigt strømningstryk mod mikrobærestofferne 11, hvorved disse holdes svævende. Under indvirkning af trypsinet løsner cellekulturerne sig fra mikrobære-stofferne. I gennemstrømningsfremgangsmåden føres trypsinopløsningen ud af beholderen via udtagsledningen 7 ved hjælp afen udsugningspumpe. Løsnede celler tages på denne måde 15 straks med og fjernes fra beholderen. Gennem tilløbsledningen 9 føres samtidigt et medium ind i afløbsroret 8, hvilket medium inaktiverer og/eller udskiller trypsin.

Derved befries de udvaskede celler for yderligere indvirkning af trypsinet. De kan da føres direkte ind i en anden beholder med ubesatte mikrobærestoffer.

20 Gennemstrømningen af trypsinopløsningen opretholdes så længe, at i det væsentlige alle cellekulturer er løsnede og ført ud af beholderen.

Gennemstrømningshastigheden for trypsinopløsningen afpasses derved på en sådan måde, at mikrobærestofferne 11 forbliver svævende, hvorved de er tilgængelige fra 25 alle sider for trypsinopløsningen, og løsnede celler hurtigt transporteres væk.

Efter endt fjernelse af cellekulturerne fjernes de i det væsentlige besatte mikrobærestoffer via afløbsroret 8 fra beholderen. De forberedes derpå til en nybesættelse, hvilket også gør sig gældende for 30 beholderen 6.

Røreorganet 10 kan anvendes for hurtigere gennemblanding af mikrobærestofferne med vaskepufferopløsningen efter behov.

35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til løsning af cellekulturer fra mikrobærestoffer, ved hvilken en beholder med besatte bærestoffer tilføres en trypsinopløsning, og de løsnede celler 5 føres ud af beholderen, kendetegnet ved, at trypsinopløsn ingen ved gennemstrømningsfremgangsmåden føres gennem beholderen og således gennem mikro-bærestofferne, og løsnede celler således straks udvaskes af beholderen, hvorved trypsinopløsningen inaktiveres og/eller udskilles, efter den er kommet ud af 10 beholderen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trypsinopløsningen pumpes nedefra og op gennem beholderen. 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at gennemstrømningshastigheden for trypsinopløsningen reguleres således, at mikrobærestofferne holdes svævende.

4. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-3, kendetegnet ved, at trypsinopløsningen tilføres det område af beholderen, som indeholder mikrobærestofferne, fra neden gennem en permeabel indsats.

5. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-4, 25 kendetegnet ved, at de løsnede cellekulturer føres videre til en beholder, der indeholder ubesatte mikrobærestoffer.

6. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der før indføringen af trypsinopløsningen i 30 gennemstrømningsfremgangsmåden ledes en vaskepuffervæske gennem beholderen med besatte mikrobærestoffer.

7. Anordning til udførelse af fremgangsmåden ifølge mindst ét af kravene 1-6, kendetegnet ved, at beholderen (1) i en afstand fra bunden (la) har en 35 permeabel indsats (2), og at tilførselsledningen (3) for trypsinopløsningen munder ud under indsatsen (2), og at udtagsledningen (7) i beholderen begynder ovenfor den permeable indsats (2), og at der i udtagsledningen (7) uden for beholderen (1) DK 174998 B1 2 udmunder en tiiiøbsiedning (9) for et medium, som inaktiverer trypsinopiøsningen og/eller udskiller trypsin.

8. Anordning ifølge krav 7, 5 kendetegnet ved, at der i det øvre beholderområde udmunder et tilløbsrør (5) for en vaskepuffervæske, og der i bundområdet under den permeable indsats (2) er anbragt en aflukkelig udstrømningsåbning (4).

9. Anordning ifølge krav 7 eller krav 8, kendetegnet ved, at et afløbsror (8) til fjernelse af mikrobærestofferne (11) fra 10 beholderen (1) strækker sig fra tæt over indsatsen (2) til ovenud af beholderen (1).

10. Anordning ifølge mindst ét af kravene 7-9, kendetegnet ved, at beholderen (1) ovenfor den permeable indsats (2) er forsynet med et udtapningssted (12) til udtagelse af en prøve af mikrobærestoffer.