DK175111B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af peptidamider ved fastfasedyntese, samt anvendelse af diphenylmethanderivater ved syntesen - Google Patents

Description

DK 175111 B1 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af peptidamider ved en fastfasesyntese samt anvendelsen af diphenylmethanderivater ved syntesen som afstandsgivere (spacere).

5 Til fremstillingen af peptidamider ved fastfasesyntese anvendes i almindelighed benzhydrylamin- eller methylbenzhy-drylaminharpikser, såsom de, der f.eks. er beskrevet af J.P. Tam et al., Tetrahedron Lett. 22.» 2851 (1981). En yderligere metode består i ammonolyse af bærestofbundne peptid-10 benzylestere (C. Ressler et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 3107 (1951)). Begge metoder er karakteriseret ved den til fra-spaltning af spaceren nødvendige stærke syre (flydende hydrogenfluorid eller trifluormethansulfonsyre), bireaktioner eller ufuldstændig fraspaltning.

15 Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en frem gangsmåde til fremstilling af peptidamider ved anvendelse af afstandsgivere, der muliggør en mildere og bedre fraspaltning af peptidamider fra bsreharpiksen.

Dette er ifølge opfindelsen opnået ved som afstands-20 givere at anvende diphenylmethanderivater med den almene formel I

R2 r3 25 YB γ9 γΐ γ2 (i) γ7 γ6 γ5 γ4 i hvilken 30 R1 betyder C^-g-alkyl eller eventuelt substitueret C6.14-aryl, R2 betyder en aminosyrerest, der er beskyttet med en svagt surt eller basisk fraspaltelig aminobeskyttelsesgruppe, R3 betyder hydrogen eller C1_4-alkyl, 35 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, C1_4-alkyl, C1«4-alkoxy eller -O-(CH2)n-COOH, hvor grupperne 2 DK 175111 B1 kan være ens eller forskellige, idet én gruppe dog er -0-(CH2)n-COOH, og n betyder et helt tal fra 1 til 6.

Opfindelsen angår i overensstemmelse hermed anvendel-5 sen af et diphenylmethanderivat med formlen I ved fastfase-syntese af peptidamider med formlen XI

P-R2-NH-R3 (XI) 10 i hvilken P betyder en peptidrest af q S p+1 a-aminosyrer, og R2 og R3 er som defineret ovenfor.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af et peptid med formlen XI, i hvilken P, R2 og R3 er som ovenfor defineret, ved en fastfasesyntese, hvilken 15 fremgangsmåde er ejendommelig ved, man med i peptidkemien gængse koblingsreagenser kobler et diphenylmethanderivat med formlen I til en harpiks via -O- (CH2) n-COOH-grupper ingen, fraspalter beskyttelsesgruppen for aminosyren R2, trinvis tilkobler q-p α-aminosyrer, soro er midlertidigt beskyttet 20 med baselabile eller mod svage syrer labile aminobeskyttel-sesgrupper, eventuelt i form af deres aktiverede derivater, og efter endt opbygning frigør peptidet med formlen XI fra harpiksen ved behandling med en middelstærk syre, idet man samtidig eller derefter ved hjælp af egnede foranstaltninger 25 igen fraspalter midlertidigt indførte sidekædebeskyttelses-grupper.

Såfremt det er nødvendigt til hindring af sidereaktioner eller til syntesen af specielle peptider, er de funktionelle grupper i aminosyrernes sidekæde yderligere beskyt-30 tet med egnede beskyttelsesgrupper (jf. f.eks. T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", New York, John Wiley & Sons, 1981), hvorved der først og fremmest anvendes Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), 35 His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But).

3 DK 175111 B1

Foretrukne er forbindelser ned den alnene formel I, 1 hvilken R1 betyder methyl, og n betyder et helt tal på 1, 2 eller 3.

Ligeledes foretrukne er forbindelser med denne almene 5 formel I, i hvilken R2 betyder en aminosyrerest, der er beskyttet med en urethanbeskyttelsesgruppe, især FmoC, og R3 betyder hydrogen.

Endvidere betyder grupperne Υ3-Υ9 især methyl eller methoxy, idet dog én gruppe betyder -O-(CH2)n-COOH, og mindst 10 4 af disse grupper betyder hydrogen.

Fortrinsvis betyder Y1, Y3, Y5, Y7 eller Y8 gruppen -0-(CH2)n-C00H.

Alkyl og alkoxy kan være ligekædet eller forgrenet. Cg_i4-Aryl er f.eks. phenyl, naphthyl, biphenylyl 15 eller fluorenyl; fortrinsvis phenyl.

R2 betyder resten af en aminosyre, fortrinsvis en a-aminosyre, der, såfremt den er chiral, kan foreligge i D-eller L-formen. Foretrukne er rester af naturligt forekommende aminosyrer og drees enantiomere, homologe, derivater 20 og enkle metaboliter (jf. f.eks. Wunsch et al., Houben-Weyl 15/1 og 2, Stuttgart, Thieme 1974). I betragtning kommer således f.eks.:

Aad, Abu, Tf Abu, ABz, 2ABz, eAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, /3Aib, Ala, /3Ala, AAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, 25 Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta,

Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gin,

Glu, Gly, Guv, hCys, His, hSer, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise,

Iva, Kyn, Lånt, Len, Leu, Lsg, Lys, ØLys, ALys, Met, Mim, ' Min, nArg, Nle, Nva, Oly, Om, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, 30 Pic, Pro, APro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, See,

Sem, Ser, Thi, ØThi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp,

Trta, Tyr, Val samt resterne af de tilsvarende enantiomere D-aminosyrer.

Funktionelle grupper i de nævnte aminosyreresters 35 sidekæder kan være beskyttede. Egnede beskyttelsesgrupper er beskrevet af Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979. nr. 3, side 4 DK 175111 B1 14-23, og Bullesbach, Kontakte (Merck), 1980. nr. 1, side 23-35.

Baselabile eller mod svage syrer labile beskyttelsesgrupper er især urethanbeskyttelsesgrupper, såsom Fmoc, 5 Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse og Tse, fortrinsvis Fmoc (jf. f.eks. Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979. nr. 3, side 14-23).

De ved den her omhandlede fremgangsmåde anvendte diphenylmethanderivater fremstilles ved, at

a) en benzhydrol med formlen II

10 YB γ9 γ1 γ2

γ7 γ6 γ5 γ A

15 i hvilken R1, Y1, Y2, Υ3, Υ4, Υ5, Υ6, Υ7, Υ8 og Υ9 har den ovenfor angivne betydning,

omsættes med en forbindelse med formlen III

20 R2 R3 \ / N (III)

25 I

H

i hvilken R2 betyder hydrogen eller en aminosyrerest, der er beskyttet 30 med en svagt surt eller basisk fraspaltelig aminobeskyttel-sesgruppe, og R3 betyder hydrogen eller C1_4-alkyl, eller

b) en benzophenon med formlen IV

35 γΒ γ90 γΐ γ2 γ7 γ6 γδ γ4 (IV) 5 DK 175111 B1

omsættes med hydroxylamin til en forbindelse med formlen V

OH

YB γ9 I γΐ γ2 5 R1 Y7 γ6 γ5 γ4 i hvilken R1, Υ1, Υ2, Υ3, Υ4, Υ5, Υ6, Υ7, Υ8 og Υ9 er defineret som ovenfor, 10 hvorefter oximen reduceres til en amin, fortrinsvis med zink i iseddikesyre (S. Gaehde, G. Matsueda, Int. J. Peptide Protein Res. 18, 451 (1981)), og aminen eventuelt omdannes til derivater heraf.

Hidtil ukendte diphenylmethanderivater med formlen 15 I, hvor R2 foruden at have den ovenfor angivne betydning også kan betyde hydrogen, fremgangsmåden til deres fremstilling og de hidtil ukendte benzhydrolderivater med formlen II er genstand for patentkrav i stamansøgningen, DK nr. 1893/88-A, hvor fremgangsmåden også er belyst mere detal-20 jeret.

De som bæremateriale anvendte harpikser kan fås kommercielt eller er separat fremstillet, såsom alkoxybenzylal-koholharpikser, aroinomethylharpikser eller benzhydrylamino-harpikser. Foretrukne er benzhydrylamino- (BHA) og methyl-25 benzhydrylamino-harpikser (MBHA). Belastningen bestemmes ved aminosyreanalyse og/eller elementaranalyse.

Som koblingsreagens for diphenylmethanderivatet med formlen I og for de yderligere aminosyrederivater kan der anvendes alle mulige i peptidsyntesen anvendte aktiverings-30 reagenser, jf. f.eks. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, bind 15/2, især dog carbodiimider, såsom Ν,Μ'-dicy-clohexylcarbodiimid, N,N'-diisopropylcarbodiimid eller N--ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Koblingen til harpiksen kan derved gennemføres direkte ved addition af et 35 aminosyrederivat med et aktiveringsreagens, og eventuelt med en tilsætning, der undertrykker racemisering, f.eks. 4- 6 DK 175111 B1 dimethylaminopyridin, 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chein. Ber. 103. 708 (1970)) eller 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin (HOObt) (W. Konig, R. Geiger,

Chen. Ber. 103. 2054 (1970)), eller også kan foraktiveringen 5 af aminosyrederivatet son synnetrisk anhydrid eller HOBt-eller HOObt-ester udfores separat, og opløsningen af de aktiverede naterialer i et egnet opløsningsmiddel sættes til en koblingsdygtig peptidharpiks.

Koblingen eller aktiveringen af en forbindelse ned 10 formlen I og af aminosyrederivaterne ned et af de ovenfor nævnte aktiveringsreagenser kan gennemføres i dimethylform-amid eller methylenchlorid eller en blanding af begge. Det aktiverede aninosyrederivat anvendes i almindelighed i et 1,5 til 4-dobbelt overskud. I de tilfælde, hvor der optræder 15 en ufuldstændig kobling, gentages koblingsreaktionen uden først at gennemføre den til koblingen af den efterfølgende aminosyre nødvendige afblokering af peptidharpiksens a-amino-syregruppe.

Det vellykkede forløb af koblingsreaktionen kan under-20 søges ved hjælp af ninhydrin-reaktionen, f.eks. som beskrevet af E. Kaiser et al., Anal. Biochem. Μ» 595 (1970). Syntesen kan også gennemføres automatisk, f.eks. med en peptidsynte-tisator model 430A fra Applied Biosystems, hvorved der enten kan anvendes de fra apparatfremstilleren fastlagte syntese-25 programmer eller også af brugeren selv fremstillede synteseprogrammer. Sidstnævnte anvendes især ved anvendelse af med Fmoc-gruppen beskyttede aminosyrederivater.

Fraspaltningen af peptidamiderne fra harpiksen sker ved behandling med i peptidsyntesen gængs anvendte, mid-30 delstærke syrer (f.eks. trifluoreddikesyre), hvorved der som kationbinder anvendes sådanne substanser som phenol, cresol, thiocresol, anisol, thioanisol, ethandithiol, dime-thylsulfid, ethylmethylsulfid eller lignende, i fastfasesyn-tesen gængse kationbindere, idet disse anvendes enkeltvis 35 eller som en blanding af to eller flere af disse hjælpestoffer. Trifluoreddikesyren kan også anvendes fortyndet med 7 DK 175111 B1 egnede opløsningsmidler, såsom methylenchlorid.

Ved fraspaltningen af spaceren fra harpiksen udføres fraspaltningen af sidekædebeskyttelsesgrupperne samtidig.

Oprensningen af de således opnåede råpeptider udføres 5 ved hjælp af chromatografi på nSephadex®"-ionbytterharpikser eller ved HPLC.

Nedenstående eksempler tjener til illustration af den ovenfor beskrevne opfindelse.

10 Eksempel 1 4-(4·-Methoxybenzoyl)-phenoxyeddikesyrernethylester.

64 g aluminiumchlorid (vandfrit) opløses i 160 ml 1,2-dichlorethan, og hertil sættes 71,6 g 4-methoxybenzoyl-chlorid. Hertil dryppes 57,6 ml phenoxyeddikesyremethylester 15 langsomt under omrøring, og reaktionsblandingen opvarmes i 4 timer til 50*C. Blandingen dryppes til isvand, hvorved der udskilles en olie. Vandfasen skilles fra, og remanensen udrøres tre gange med vand, og der krystalliseres med methanol. Udfældningen frafiltreres, og der omkrystalliseres fra 20 ethylacetat.

Udbytte: 54,9 g (53% af teorien).

Smeltepunkt: 146'C (148*C, ethylacetat).

Eksempel 2 25 4-(4'-Methoxybenzoyl)-phenoxyeddikesyre.

9,0 g af methylesteren fra eksempel 1 opløses i 120 ml 1,2-dimethoxyethan/vand (4:1, vol:vol), og hertil sættes 15 ml 2N NaOH. Blandingen omrøres i 3 timer, hvorefter pH indstilles på 3 med 3 N HC1. Det organiske opløsningsmiddel 30 afdampes under vakuum, og det udfældede produkt frafiltreres, hvorefter det vaskes med vand og tørres under højvakuum.

Udbytte: 8,4 g (98% af teorien).

Smeltepunkt: 181-182*C.

8 DK 175111 B1

Eksempel 3 (4-Carboxymethoxyphenyl)-4'-methoxyphenylcarbinol.

11,2 g 4-(4'-methoxybenzoyl)-phenoxyeddikesyre opløses i 600 ml 80%'s methanol (tilbagesvaling), og hertil sættes 5 4,4 ml N-methylmorpholin. Til blandingen sættes portionsvis i løbet af 2 timer 6 g natriumborhydrid, og reaktionen videreføres i 3 timer under tilbagesvalingsbetingelser. Blandingen afkøles til stuetemperatur, og den gøres sur med 3 N HC1 til pH 2,5. Methanolet afdestilleres, og den vandige 10 fase ekstraheres med ethylacetat, hvorefter der vaskes med en kogsaltopløsning, og der tørres over natriumsulfat. Efter afdestillering af ethylacetatet bliver et hvidt, amorft pulver tilbage. Produktet anvendes direkte til den næste reaktion. Udbytte: 9,3 g (83% af teorien).

15

Eksempel 4 2-Methylphenoxyeddikesyremethylester.

108 g 2-methylphenol opløses i 500 ml tør acetone, og hertil sættes 165,8 g pulveriseret kaliumcarbonat. Til 20 den omrørte suspension sættes 113 ml bromeddikesyreroethyles-ter, og blandingen videreomrøres ved stuetemperatur under udelukkelse af fugtighed. Efter afsluttet reaktion frafiltre-res saltet ved sugning, og der eftervaskes med acetone, og filtratet koncentreres. Der optages i ethylacetat, hvorefter 25 der vaskes med vand, og den organiske fase tørres over magnesiumsulfat, og den koncentreres.

Udbytte: 180 g af en olieagtig væske, der direkte videreom-sættes. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 5 2 4-(4'-Methoxybenzoyl)-2-methylphenoxyeddikesyremethylester.

3 146,6 g vandfrit aluminiumtrichlorid opløses i 500 4 ml 1,2-dichlorethan. Ved 0*C dryppes hertil efter hinanden 5 187 g 4-methoxybenzoylchlorid og 180 g 2-methylphenoxyed- 6 dikesyremethylester. Til fuldstændiggørelse af reaktionen opvarmes der til 50*C. Blandingen hældes på is, og pH ind- 9 DK 175111 B1 stilles på 2 med 2 N HCl. Det udfældede produkt frafiltreres ved sugning, og det vaskes med vand og noget ether. Udfældningen opløses under varme i ethylacetat under tilsætning af noget aktivt kul, hvorefter der filtreres, og der krystal-5 liseres ved -10*C. Produktet frafiltreres ved sugning, hvorefter det vaskes med ether, og der tørres under højvakuum. Udbytte: 172,8 g (55% af teorien).

Smeltepunkt: 92-95*C.

10 Eksempel 6 4-(4'-Methoxybenzoyl)-2-methylphenoxyeddikesyremethylester.

50 g 4-hydroxy-3-methyl-4'-methoxybenzophenon (R.

Martin et al., Monatsh. Chemie 110. 1057-1066 (1979)) opløses i 200 ml tørt DMF, og hertil sættes under N2 forsigtigt 9 g 15 af en 55%'s dispersion af natriumhydrid i mineralolie. Til blandingen dryppes herefter under omrøring 19,5 ml bromeddi-kesyremethylester, og blandingen tillades at henstå natten over ved stuetemperatur. Det udfældede salt frafiltreres ved sugning, og filtratet koncentreres under vakuum. Remanen-20 sen optages i ethylacetat, og der vaskes med en natrium-hydrogencarbonatopløsning og vand. Den organiske fase tørres over magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet fjernes. Remanensen udrives med ether, hvorefter der frafiltreres ved sugning, og der tørres.

25 Udbytte: 38,9 g (60% af teorien).

Smeltepunkt: 96-98*C.

Eksempel 7 4-(4'-Methoxybenzoyl)-phenoxyeddikesyremethylester.

30 29,1 g 4-hydroxy-4'-methoxybenzophenon (R. Martin et al., Monatsh. Chemie 110. 1057-1066 (1979)) opløses i 400 ml tør acetone. Herefter sætter man under omrøring 19,3 g finpulveriseret K2CO3 og 16 ml bromeddikesyremethylester til blandingen, og den omrøres ved stuetemperatur. Efter 2 35 dage er reaktionen afsluttet. Den udfældede salt-substans-blanding frafiltreres ved sugning, hvorefter filtratet kon- 10 DK 175111 B1 centreres. Begge remanenser suspenderes i vand, og pH indstilles på 3 med 2 N HC1. Der frafiltreres ved sugning, hvorefter der vaskes med vand, og der tørres i exsikkator under højvakuum.

5 Udbytte: 35,7 g (98% af teorien).

Smeltepunkt: 143-145*C.

Eksempel 8 4-(4'-Methoxybenzoyl)-2-methylphenoxyeddikesyre.

10 35,8 g 4-(4 '-methoxybenzoyl)-2-methylphenoxyeddikesy- remethylester omrøres med en blanding af 240 ml dioxan og 240 ml 0,5 N NaOH ved stuetemperatur. Efter end reaktion fjernes det organiske opløsningsmiddel, og den vandige fase indstilles på pH 3 med 2 N HC1, hvorefter der ekstraheres 15 med ethylacetat. Der vaskes med vand, hvorefter der tørres over magnesiumsulfat, og der koncentreres. Tilbage bliver der bleggule krystaller.

Udbytte: 30,2 g (83% af teorien).

Smeltepunkt: 149-151*C.

20

Eksempel 9 (4-Carboxymethoxy-3-methylphenyl)-4'-methoxyphenylcarbinol.

22,5 g 4- (4 1 -methoxybenzoyl) -2-methylphenoxyeddikesyre opløses i en blanding af 100 ml dioxan og 200 ml vand under 25 tilsætning af 1 N NaOH til pH 9. Til den omrørte opløsning sættes portionsvis 2,8 g natriumborhydrid, og blandingen tillades at henstå natten over. Derefter fjernes dioxanet, og vandfasen indstilles på pH 3 med 2 N HC1, og der ekstraheres med ethylacetat. Den organiske fase tørres over magne-30 siumsulfat, og der koncentreres. Tilbage bliver et farveløst skum, der udrives med n-hexan til et amorft pulver, hvorefter der frafiltreres ved sugning. Produktet anvendes direkte i den næste reaktion.

Udbytte: 19,2 g (84% af teorien).

35 11 DK 175111 B1

Eksempel 10 2.6- Dime thylphenoxyeddikesyremethylester.

65 g 2,6-dimethylphenol opløses i 200 ml tørt DMF, og under N2 sættes portionsvis 23,2 g af en 55%'s suspension 5 af natriumhydrid i mineralolie til blandingen. Herefter dryppes 50,4 ml bromeddikesyremethylester under omrøring til blandingen, og den tillades at henstå natten over. Det udfældede salt frafiltreres ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen optages i ethylacetat, og der ekstra-10 heres med vand. Den organiske fase tørres over magnesiumsulfat, og den koncentreres. Tilbage bliver en olieagtig væske, der anvendes direkte i den følgende reaktion.

Udbytte: 95,8 g (92% af teorien).

15 Eksempel 11 2.6- Dimethyl-4-(4·-methoxybenzoyl)-phenoxyeddikesyremethyl-ester.

Syntesen udføres analogt med eksempel 5 med 19,4 g 2.6- dimethylphenoxyeddikesyremethylester.

20 Udbytte: 17,4 g (53% af teorien).

Eksempel 12 (4-Carboxymethoxy-3,5-dimethylphenyl) -4' -methoxyphenylcar-binol.

25 16,4 g 2,6-dimethyl-4-(4 ·-methoxybenzoyl)-phenoxyeddi- kesyremethylester omrøres i en blanding af 100 ml 0,5 N NaOH og 100 ml dioxan ved stuetemperatur. Efter afsluttet forsæbning af methylesteren sættes 1,89 g natriumborhydrid til blandingen, og den tillades at reagere natten over.

30 Herefter frafiltreres noget uopløst materiale, hvorefter filtratet koncentreres, og den tilbageblevne, vandige opløsning gøres sur med l N HC1. Der ekstraheres med ethylacetat, hvorefter den organiske fase vaskes med vand, og der tørres over magnesiumsulfat, hvorefter blandingen koncentreres.

35 Tilbage bliver der et amorft pulver, der anvendes direkte til den efterfølgende omsætning.

12 DK 175111 B1

Udbytte: 11,3 g (71% af teorien).

Almen forskrift til fremstilling af Na-Fmoc-amino-syre- (4-carboxymethoxy-phenyl-4' -methoxyphenyl) -methylamider samt Ncr-Fmoc-aminosyre-(4-carboxymethoxy-3-methylphenyl-4 5 methoxyphenyl)-methylamider og Na-Fmoc-aminosyre-(4-car-boxymethoxy-3,5-dimethylpheny1-4'-methoxyphenyl)-methylamider.

10 mmol Να-Fmoc-aminosyreamid og 10 mmol af den tilsvarende carbinol opløses i den nødvendige msngde vandfri 10 iseddikesyre, og hertil sættes 5-10 dråber koncentreret svovlsyre. Til blandingen sættes endnu 2 g molekylsigte, og blandingen tillades at henstå natten over. Herefter frafil-treres molekylsigten ved sugning, og filtratet fortyndes med meget vand, hvorved produktet delvis udfælder. Den van-15 dige fase ekstraheres med ethylacetat, hvorefter den organiske fase udrystes med vand. Den substans, der bliver tilbage efter tørring over natriumsulfat og koncentrering, omkrystalliseres.

Efter overstående gængse forskrift fremstilles følgen-20 de forbindelser:

Eksempel 13

He-Pmoc-Glycin- (4-carboxymethoxyphenyl-4' -methoxyphenyl) me-thylamid.

25 Udbytte: 65%.

Smeltepunkt: 136-138*C.

Eksempel 14 Νβ-Fmoc-Phenylalanin- (4-carboxymethoxyphenyl-4' -methoxyphe-30 nyl)methylamid.

Udbytte: 65%.

Smeltepunkt: 159-162*C.

13 DK 175111 B1

Eksempel 15 Να-Fmoc-Glycin-(4-carboxymethoxy-3-methylphenyl-4'-methoxy-phenyl)methylamid.

Udbytte: 60%.

5 Smeltepunkt: 135-140*C.

Eksempel 16

Ne-Fmoc-Valin- (4-carboxymethoxy-3-methylphenyl-4' -methoxyphe-ny1)methylamid.

10 Udbytte: 81%.

Smeltepunkt: 172-175*C.

Eksempel 17 Να-Fmoc-Glycin- (4-carboxymethoxy-3,5-dimethylphenyl-4' -me-15 thoxyphenyl)methylamid.

Udbytte: 70%.

Smeltepunkt: 122-126*0.

Eksempel 18 20 Syntese af oxytocin H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-CYs-Pro-Leu-Gly-NHg under anvendelse af det i eksmepel 13 beskrevne anker. Syntesen udføres i et organ til peptidsyntese fra Fa. Labotec.

25 Fra 1,5 g Boc-Val-harpiks (belastning 0,76 mmol/g) fjernes først beskyttelsesgruppen med trifluoreddikesyre i methylenchlorid. Efter vask med dichlormethan og ethyldiiso-propylamin og igen med dichlormethan tørres harpiksen. Herefter sættes 2,1 mmol af det i eksempel 13 fremstillede 30 anker sammen med 3,15 mmol HOBt opløst i 20 ml tørt DMF til harpiksen, og der tilsættes 2,3 mmol diisopropylcarbodiimid.

Under langsom gennemblånding tillades blandingen at reagere natten over ved stuetemperatur. Reaktionens fuldstændighed undersøges ved hjælp af ninhydrin-reaktionen (Kaiser-test).

35 Herefter frafiltreres harpiksen ved sugning, og der vaskes med DMF, hvorefter peptidet opbygges på harpiksen, hvorved man cyclisk gennemløber følgende trin: 14 DK 175111 B1 - Fmoc-beskyttelsesgruppen fraspaltes ned 20% plperidln i DMF, - harpiksen vaskes ned DMF, - Fnoc-aninosyren tilkobles under in situ-aktivering son 5 HOBt-ester under anvendelse af diisopropylcarbodiinid son aktiveringsreagens (2,1 mnol aninosyre, 3,15 mnol HOBt, 2,3 nnol diisopropylcarbodiinid), - harpiksen vaskes ned DMF.

Såfremt koblingen er ufuldstændig (Kaiser-test), 10 gentages koblingstrinnet.

Son sidekædebeskyttelsesgrupper anvendes tert.butyl for tyrosin og tert.butylthio for cystein.

Efter afsluttet syntese fraspaltes først Fmoc-beskyt-telsesgruppen, og herefter vaskes harpiksen ned i rækkefølge 15 DMF, dichlormethan, isopropanol, dichlornethan og tert.butyl--methylether, hvorefter der tørres under højvakuun. Der fås 2,4 g peptidharpiks. Fraspaltningen udføres ved stuetempera-tur med en blanding af trifluoreddikesyre/thioanisol/ethandi-thiol (80/15/5). Efter 2 timer frafiltreres der ved sugning 20 i tert.butyl-methylether, og det udfældede råpeptid fracentrifugeres, og det vaskes tre gange med tert.butyl-methylether. Fraspaltningen af tert.butylthio-beskyttelsesgruppen udføres ved hjælp af tributylphosphin i trifluorethanol/vand ved pH 7,3. S-H-peptidet ringsluttes med iod i en 60%'s 25 vandig eddikesyre, og peptidet oprenses ved hjælp af chroma-tografi på "Sephadex® LH 20" i methanol.

Oxytocin-udbyttet er på 33%, hvor oxytocin er identisk ned en autentisk sammenligningsprøve. 1 35 '

Claims (4)

1. Anvendelse af et diphenylroethanderivat med formlen I R2 R3

5 XN/ γΒ γ9 γΐ γ2 r1“°"^^“ch“^^“y3 (I) γ7 γ6 γ5 γ4 10 i hvilken R1 betyder C^-g-alkyl eller eventuelt substitueret Cg«i4-aryl,

15 R2 betyder en aminosyrerest, der er beskyttet med en svagt surt eller basisk fraspaltelig aminobeskyttelsesgruppe, R3 betyder hydrogen eller Ci„4-alkyl, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, C1.4-alkyl, C1_4-alkoxy eller -0-(CH2>n“C00H, hvor grupperne 20 kan være ens eller forskellige, idet én gruppe dog er -0-(CH2)n-COOH, og n betyder et helt tal fra 1 til 6, ved fastfasesyntese af peptidamider med formlen XI

25 P-R2-NH-R3 (XI) , i hvilken P betyder en peptidrest af g < p+1 a-aminosyrer, og R2 og R3 er som defineret ovenfor. • 2. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptidamid 30 med formlen XI, i hvlken P, R2 og R3 er defineret som i krav 1, ved en fastfasesyntese, kendetegnet ved, at man kobler et diphenylmethanderivat med formlen I ifølge krav 1, til en harpiks, fraspalter beskyttelsesgruppen for aminosyren R2, trinvis tilkobler q-p α-aminosyrer, soro er 35 midlertidigt beskyttet med baselabile eller mod svage syrer labile aminobeskyttelsesgrupper, eventuelt i form af deres DK 175111 B1 aktiverede derivater, og efter endt opbygning frigor peptidet ned formlen XI fra harpiksen ved behandling med en middel-stærk syre, idet man samtidig eller derefter ved hjælp af egnede foranstaltninger igen fraspalter midlertidigt indførte 5 sidekædebeskyttelsesgrupper. *