DK175131B1 - 4-(9H-Purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinoler, farmaceutiske præparater indeholdende forbindelserne samt mellemprodukter derfor - Google Patents

Description

i DK 175131 B1

Den foreliggende opfindelse angår dideoxycarbocykliske nudeosidanaTo'gé. Mere specifikt angår opfindelsen carbocykliske Z'^'-dideoxy-Z’jB’-didehydropurin-nudeosidanaloge og disses anvendelse inden for terapi, især som antivirale . 5 midler.

* I lyset af ligheden mellem virale og værtscellulære funktioner er det vanskeligt selektivt at angribe et virus og samtidig efterlade værtscellen intakt. Der findes således relativt få midler, som er virksomme mod viruser perse, og det er van-10 skeligt at finde antivirale midler med et acceptabelt terapeutisk indeks, dvs. midler, som har en meningsfuld antiviral virkning ved et dosisniveau, ved hvilket midlet har en acceptabel toxicitet- eller bivirkningsprofil.

En gruppe viruser, som for nylig har fået væsentlig betydning, er de retroviruser, 15 som er ansvarlige for det humane erhvervede immunodeficiens-syndrom (AIDS).

Sådanne viruser har tidligere været angivet ved forskellige terminologier men betegnes nu generelt som humane immunodeficiensviruser (HIV'er); to sådanne viruser, HIV-I og HIV-II, er reproducerbart blevet isoleret fra patienter, der lider af AIDS og beslægtede tilstande såsom AIDS-relateret kompleks (ARC) og ved-20 varende generaliseret lymfadenopathi.

Selv om et antal nudeosider er blevet beskrevet som værende nyttige ved behandling af tilstande associeret med HIV-infektioner, har kun azidovudin (AZT,

Retrovir) modtaget reguleringsgodkendelse for behandling af sådanne tilstande.

25 Det er imidlertid kendt, at zidovudin har alvorlige bivirkninger, idet det forårsager undertrykkelse af knoglemarven, hvilket fører til et fald i tællingen af hvide blodlegemer med deraf følgende udtalt anæmi, og der er derfor et behov for effektive midler, som er mindre cytotoxiske. 1

Der er nu blevet fundet en hidtil ukendt klasse nudeosidanaloge med antiviral virkning. Et første aspekt af opfindelsen angår følgelig 4-(9H-purin-9-yl)-2-cydo-pentenylcarbinoler med formlen I

DK 175131 B1

Av Λ\Λ/

5 Z N N

HO-CH, I

\_/ hvor ·-· X er hydrogen, NRR1, SR, OR eller halogen; 10 Z er hydrogen, OR2 eller NRR1; - R, R1 og R2 kan være ens eller forskellige og er valgt blandt hydrogen, Cj-^-alkyl og aryl; og farmaceutisk acceptable derivater deraf, eller farmaceutisk acceptable estere deraf valgt blandt 15 carboxysyreestere, i hvilke ikke-carbonyldelen af estergruppen er hydro gen, Ct-ig-alkyl, Cj-ie-alkoxy-C^je-alkyl, aryl-C^-alkyl, aryloxy-Cj-4-alkyl eller eventuelt med halogen, Cj.4-alkyl eller Cj-4-alkoxy substitueret aryl; Ci-18-alkyl- eller aryl-Ci-4-alkylsulfonylestere; aminosyreestere eller tri-phosphatestere, 20 eller farmaceutisk acceptable salte af sådanne estere.

Fra EP-A-236935 kendes 2,3-dideoxynucleosider, som udviser anti-HIV-aktivitet.

Det har imidlertid overraskende vist sig, at de foreliggende forbindelser udviser en væsentlig højere aktivitet, ligesom de også udviser et væsentligt højere terapeu-25 tisk indeks.

Det vil være klart for fagfolk, at forbindelserne med formlen I er cis-forbindelser, samt endvidere at cyclopentenringen i forbindelserne med formlen 1 indeholder to chirale centre (vist i formlen I ved *) og derfor kan eksistere i form af to optiske 30 isomerer (dvs. enantiomerer) og blandinger deraf, inklusive racemiske blandinger.

Alle sådanne isomerer og blandinger deraf inklusive racemiske blandinger er omfattet af opfindelsens omfang. I forbindelserne med formlen I er således enten det chirale centrum, til hvilket basen er bundet, i R-konfiguration, og det chirale centrum, til hvilket CH2OH-delen er bundet, er i S-konfiguration (herefter kaldet 35 D-isomeren), eller det chirale centrum, til hvilket basen er bundet er i Λ 3 DK 175131 B1 S*konfiguration, og det centrum, til hvilket CH2OH-delen er bundet, er i R-konfiguration (herefter kaldet L-isomeren). Forbindelserne er hensigtsmæssigt i form af enten en racemisk blanding eller i det væsentlige som den rene D-isomer. D-isomererne kan angives ved formlen la 5

X

/Λ Λ T i \ Ia / w / \ /

10 2 N N

H01>xl

\ _J

15 hvor X og Z er som defineret for formlen I. Henvisning i det følgende til forbindelser med formlen I omfatter forbindelser med formlen Ia.

Det vil også være klart for fagfolk, at visse af forbindelserne med formlen I kan eksistere som et antal tautomere former, og alle sådanne tautomerer er omfattet 20 af opfindelsens omfang.

Som anvendt i nærværende beskrivelse betegner udtrykket halogen fluor, chlor, brom og iod; hvis X er halogen er det fortrinsvis chlor.

25 Som anvendt i nærværende beskrivelse betegner Ci-4-alkyl en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, fx methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl og t-butyl. Ci-4-alkyl er fortrinsvis methyl.

Som anvendt i nærværende beskrivelse betegner aryl en hvilken som helst mono-30 eller polycyklisk aromatisk molekyldel og omfatter usubstitueret og substitueret aryl (såsom phenyl, tolyl, xylyl, anisyl) og usubstitueret og substitueret aralkyl, deriblandt ar(Ci-4)alkyl såsom pheniC^Jalkyl, fx benzyl eller phenethyl. 1 35 forbindelserne med formlen I er Z fortrinsvis amino.

4 DK 175131 B1 I én foretrukken klasse af forbindelser med formlen I betegner X OR, især OH.

1 en yderligere foretrukken klasse af forbindelser med formlen I er X NRR1, især NH2, eller hydrogen.

5 Særligt foretrukne forbindelser med formlen I er dem, i hvilke Z er NH2, og X er H, NH2 eller, især, OH. Især sådanne forbindelser har særligt ønskelige terapeutiske indekser som antivirale midler.

10 Med udtrykket "farmaceutisk acceptabelt" i forbindelse med de ovenfor definerede salte, estere eller salte af sådanne estere af en forbindelse med formlen I menes en forbindelse, som ved administration til modtageren er i stand til at tilvejebringe (direkte eller indirekte) en forbindelse med formlen I eller en antiviralt aktiv metabolit eller remanens deraf.

15

Estere af forbindelser med formlen I udgøres, som nævnt ovenfor, af carboxyl-syreestere, i hvilke ikke-carbonyldelen af estergruppen er valgt blandt hydrogen, ligekædet eller forgrenet alkyl (fx methyl, ethyl, n-propyl, t-butyl, n-butyl), alkoxyalkyl (fx methoxymethyl), aralkyl (fx benzyl), aryloxyalkyl (fx phenoxy-20 methyl), aryl (fx phenyl, der eventuelt er substitueret med halogen, Ci-4-alkyl eller Ci.,,-alkoxy); sulfonatestere såsom alkyl- eller aralkylsulfonyl (fx methan-sulfonyl); aminosyreestere (fx L-valyl eller L-isoleucyl) og mono-, di- eller triphosphatestere.

25 Med hensyn til de ovenfor beskrevne estere indeholder en hvilken som helst tilstedeværende alkyldel fortrinsvis 1-4 carbonatomer. En hvilken som helst aryldel, som er til stede i sådanne estere, omfatter med fordel en phenylgruppe.

Farmaceutisk acceptable salte af forbindelserne med formlen I omfatter dem, som 30 er afledt af farmaceutisk acceptable uorganiske og organiske syrer og baser. Eksempler på egnede syrer omfatter saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, salpetersyre, perchlorsyre, fumarsyre, maleinsyre, phosphorsyre, glykolsyre, mælkesyre, salicylsyre, ravsyre, toluen-p-sulfonsyre, vinsyre, eddikesyre, citronsyre, methansulfonsyre, myresyre, benzoesyre, malonsyre, nahpthalen-2-sulfonsyre og 35 benzensulfonsyre. Andre syrer såsom oxalsyre, selv om de ikke i sig selv er 5 DK 175131 B1 farmaceutisk acceptable, kan være nyttige ved fremstilling af salte, som er nyttige som mellemprodukter til fremstilling af forbindelserne ifølge opfindelsen og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte.

5 Salte afledt af passende baser omfatter alkalimetalsalte (fx natriumsalte), jordal-kalimetalsalte (fx magnesiumsalte), ammoniumsalte og NR^-salte (hvor R er Ci.4-alkyl).

Henvisninger i det følgende til en forbindelse ifølge opfindelsen omfatter både for-10 bindeiser med formlen I og disses farmaceutisk acceptable derivater.

Specifikke forbindelser med formlen I omfatter: (la,4a)-4-(6-Chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; 15 (la,4a)-4-(6-Hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(6-Mercapto-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(2-Amino*6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; 20 (la,4a)-4-(2,6-Diamino*9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; i form af en racemisk blanding eller en enkelt enantiomer.

Forbindelserne ifølge opfindelsen har enten i sig selv antiviral aktivitet og/eller kan metaboliseres til sådanne forbindelser. Disse forbindelser er især virksomme 25 ved inhibering af replikeringen af retroviruser, deriblandt humane retroviruser såsom humane immunodeficiensviruser (HIV’er), som forårsager AIDS.

Visse forbindelser ifølge opfindelsen, især dem, i hvilke Z er H, har også antican-cervirkning.

30

Et yderligere aspekt af opfindelsen er følgelig en forbindelse med formlen I til anvendelse som aktivt terapeutisk middel, især som et antiviralt middel, fx ved behandling af retrovirale infektioner, eller som et anticancermiddel.

6 DK 175131 B1

Opfindelsen muliggør således en fremgangsmåde til behandling af en viral infektion, især en infektion forårsaget af en retrovirus såsom HIV, i et pattedyr, deriblandt mennesker, ved hvilken fremgangsmåde der administreres en virksom mængde af en antiviral forbindelse ifølge opfindelsen.

5 I et yderligere eller alternativt aspekt angår opfindelsen også anvendelse af forbindelse ifølge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til behandling af en viral infektion eller anvendelse som et anticancermiddel.

10 Forbindelser ifølge opfindelsen med antiviral aktivitet er også nyttige ved behandling af AIDS-relaterede tilstande såsom AIDS-relateret kompleks (ARC), progressiv generaliseret lymfadenopathi (PGL), AIDS-relaterede neurologiske tilstande (såsom dementia eller tropisk paraparese), anti-HIV-antistofpositive og HIV-posi-tive tilstande, Kaposi's sarkom og thrombocytopenia purpura.

15

De antivirale forbindelser ifølge opfindelsen er også nyttige ved forhindring af progression indtil klinisk sygdom i individer, som er anti-HIV-antistof- eller HIV-anti-gen-positive og ved profylakse efter udsættelse for HIV.

20 De antivirale forbindelser med formlen I kan også anvendes til forhindring af viral kontaminering af fysiologiske væsker såsom blod eller sæd in vitro.

Visse af forbindelserne med formlen I er også nyttige som mellemprodukter ved fremstilling af andre forbindelser ifølge opfindelsen.

25

Det vil være klart for fagfolk, at henvisning i nærværende beskrivelse til behandling udstrækker sig til profylakse såvel som til behandling af etablerede infektioner eller symptomer. 1 2 3 4 5 6

Det vil endvidere være klart, at den mængde af en forbindelse ifølge opfindelsen, 2 som er nødvendig til anvendelse ved behandling, vil variere ikke blot alt efter den 3 specifikt udvalgte forbindelse, men også alt efter administrationsvejen, arten af 4 den tilstand, som behandles, og patientens alder og tilstand og vil i sidste ende 5 blive afgjort af den tilstedeværende læge eller veterinær. I almindelighed 6 vil en egnet dosis imidlertid være i området fra ca. 1 til ca. 750 mg/kg, e.g. fra 7 DK 175131 B1 ca. 10 til ca. 750 mg/kg legemsvægt pr. dag såsom fra 3 til ca. 120 mg/kg legemsvægt af modtageren pr. dag, fortrinsvis i området 6-90 mg/kg/dag, især i området 15-60 mg/kg/dag.

5 Den ønskede dosis kan hensigtsmæssigt præsenteres som en enkeltdosis eller som delte doser administreret med passende mellemrum, fx som 2, 3, 4 eller flere underdoser pr. dag.

Forbindelsen administreres hensigtsmæssigt i enhedsdosisform; fx indeholdende 10 10-1500 mg, hensigtsmæssigt 20-1000 mg, især 50-700 mg aktiv bestanddel pr. enhedsdosisform.

Ideelt bør den aktive bestanddel administreres således, at der opnås plasmaspidskoncentrationer af den aktive bestanddel på fra ca. 1 til ca. 75 μΜ, fortrinsvis 15 ca. 2-50 μΜ, især fra ca. 3 til ca. 30 μΜ. Dette kan fx opnås ved intravenøs injektion af en 0,1-5% opløsning af den aktive bestanddel, eventuelt i saltvand, eller administreret oralt som en bolus indeholdende fra ca. 1 til ca. 100 mg af den aktive bestanddel, ønskede blodniveauer kan vedligeholdes ved kontinuel infusion til at give fra ca. 0,01 til ca. 5,0 mg/kg/tirne eller ved afbrudte infusioner indehol-20 dende fra ca. 0,4 til ca. 15 mg/kg af den aktive bestanddel.

Selv om det til anvendelse ved terapi er muligt, at en forbindelse ifølge opfindelsen kan administreres som det rå kemikalie, foretrækkes det at præsentere den aktive bestanddel som et farmaceutisk præparat.

25

Opfindelsen angår således endvidere et farmaceutisk præparat, der omfatter en forbindelse med formlen I sammen med én eller flere farmaceutisk acceptable bærere derfor og, eventuelt, andre terapeutiske og/eller profylaktiske ingredienser. Bæreren/bærerne skal være "acceptable" i den forstand, at de er 30 kompatible med de andre af præparatets bestanddele og ikke er skadelige for modtageren.

Farmaceutiske præparater omfatter dem, som er egnede til oral, rektal, nasal, topisk (deriblandt buccal og sublingual), vaginal eller parenteral (deriblandt in-35 tramuskulær, subkutan og intravenøs) administration eller i en form, som er eg- 8 DK 175131 B1 net til administration ved inhalering eller insufflering. Præparaterne kan, hvor det er relevant, hensigtsmæssigt præsenteres i adskilte dosisenheder og kan være fremstillet ved en hvilken som helst af de metoder, som er velkendte inden for farmacien. Alle metoder omfatter det trin, at den aktive forbindelse bringes i 5 forbindelse med flydende bærere eller fint fordelte faste bærere eller begge dele og derefter, om nødvendigt, produktet formes til det ønskede præparat.

Farmaceutiske præparater, som er egnede til oral administration, kan hensigtsmæssigt præsenteres som adskilte enheder såsom kapsler, breve eller tabletter, 10 der hver indeholder en forudbestemt mængde af den aktive bestanddel; som et pulver eller som granuler; som en opløsning, en suspension eller som en emulsion. Den aktive bestanddel kan også præsenteres som en bolus, et latværge eller en pasta. Tabletter og kapsler til oral administration kan indeholde konventionelle excipienser såsom bindemidler, fyldstoffer, smøremidler, sprængmidler eller 15 befugtningsmidler. Tabletterne kan være overtrukne i overensstemmelse med metoder, som er velkendte inden for teknikken. Orale flydende præparater kan være i form af fx vandige eller olieagtige suspensioner, opløsninger, emulsioner, sirupper eller eliksirer eller kan præsenteres som et tørt produkt til konstituering med vand eller en anden egnet bærer før anvendelse. Sådanne flydende 20 præparater kan indeholde konventionelle additiver såsom suspenderingsmidler, emulgeringsmidler, ikke-vandige bærere (som kan omfatte spiseolier) eller konserveringsmidler.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også formuleres til parenteral administration 25 (fx ved injektion, fx bolusinjektion eller kontinuerlig infusion) og kan præsenteres i enhedsdosisform i ampuller, præfyldte sprøjter, småvolumeninfusion eller i mul-tidosisbeholdere med et tilsat konserveringsmiddel. Kompositionerne kan antage sådanne former som suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olieagtige eller vandige bærere og kan indeholde formuleringsmidler såsom suspenderings-, sta-30 biliserings- og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan den aktive bestanddel være i pulverform opnået ved aseptisk isolering af sterilt fast stof eller ved lyofili-sering fra opløsning, til konstituering med en egnet bærer, fx sterilt pyrogenfrit vand, inden anvendelse.

9 DK 175131 B1

Til topisk administration til epidermis kan forbindelserne ifølge opfindelsen være formuleret som salver, cremer eller lotions eller som et transdermalt plaster. Salver og cremer kan fx være formuleret med en vandig eller olieagtig basis med tilsætning af egnede for-tyknings- og/eller geleringsmidler. Lotions kan være for-5 muleret med en vandig eller olieagtig basis og vil i almindelighed også indeholde ét eller flere emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspenderingsmidler, fortykkelsesmidler eller farvemidler.

Formuleringer, som er egnede til topisk administration i munden, inkluderer pa-10 stiller, der omfatter aktiv bestanddel i en tilsmagt basis, sædvanligvis saccharose og akacie eller tragant; pastiller omfattende den aktive bestanddel i en inert basis såsom gelatine og glycerin eller saccharose og akacie; og mundskyllemidler, der omfatter den aktive bestanddel i en passende flydende bærer.

15 Farmaceutiske præparater, som er egnede til rektal administration, hvor bæreren er et fast stof, præsenteres fortrinsvis som enhedsdosissuppositorier. Egnede bærere omfatter kakaosmør og andre materialer, som sædvanligvis anvendes inden for teknikken, og suppositorierne kan hensigtsmæssigt dannes ved blanding af den aktive forbindelse med den eller de blødgjorte eller smeltede bærer eller 20 bærere efterfulgt af afkøling og formning i forme.

Formuleringer, som er egnede til vaginal administration kan foreligge som pessarer, tamponer, cremer, geler, pastaer, skum eller sprays indeholdende, udover den aktive bestanddel, sådanne bærere, som inden for teknikken er kendte som 25 relevante.

Til intranasal administration kan forbindelserne ifølge opfindelsen anvendes som en flydende spray eller i form af dråber.

30 Dråber kan formuleres med en vandig eller ikke-vandig basis samt omfattende én eller flere dispergeringsmidler, solubiliseringsmidler eller suspenderingsmidler.

Flydende sprays afgives hensigtsmæssigt fra trykpakninger.

Til administration ved inhalering afgives forbindelserne ifølge opfindelsen hen-35 sigtsmæssigt fra en insufflator, forstøver eller en trykpakning eller andre hen- 10 DK 175131 B1 sigtsmæssige midler til afgivning af en aerosolspray. Trykpakninger kan omfatte et egnet drivmiddel såsom dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlorte-trafluorethan, carbondioxid eller en anden egnet gas. I tilfælde af en trykaerosol kan dosisenheden bestemmes ved at tilvejebringe en ventil, som afgiver en ud-5 målt mængde.

Til administration ved inhalering eller insufflering kan forbindelserne ifølge opfindelsen alternativt være i form af et tørt pulver-præparat, fx en pulverblanding af opfindelsen og en egnet pulverbase såsom lactose eller stivelse. Pulverkompositi-10 onen kan præsenteres i enhedsdosisform i fx kapsler eller patroner eller fx gelatine- eller blisterpakninger, fra hvilke pulveret kan administreres ved hjælp af en inhalator eller insufflator.

Hvis det ønskes kan der anvendes de ovenfor beskrevne præparater tilpasset til at 15 give forlænget afgivelse af den aktive bestanddel.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan også indeholde andre aktive bestanddele såsom antimikrobielle midler eller konserveringsmidler.

2b Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også anvendes i kombination med andre terapeutiske midler, fx andre antiinfektive midler. Især kan forbindelserne ifølge opfindelsen anvendes sammen med kendte antivirale midler.

Den foreliggende opfindelse angår således i et yderligere aspekt en kombination, 25 som omfatter en forbindelse med formlen I sammen med et andet terapeutisk aktivt middel, især et antiviralt middel.

De kombinationer, hvortil der henvises ovenfor, kan hensigtsmæssigt præsenteres til anvendelse i form af et farmaceutisk præparat, og farmaceutiske præparater, 30 som omfatter en kombination som defineret ovenfor sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer derfor, udgør således et yderligere aspekt af opfindelsen.

Egnede terapeutiske midler til anvendelse i sådanne kombinationer omfatter 35 acykliske nucleosider såsom aciclovir, interferoner såsom α-interferon, renale 11 DK 175131 B1 ekskretionsinhibitorer såsom probenicid, nucleo-sidtransportinhibitorer såsom dipyridamol, 2’,3'-dideoxynucleosider såsom 2',3'-dideoxycytidin, 2’,3'-dide-oxyadenosin, 2',3’-dideoxyino-sin, 2,,3'-dideoxythymidin og 2',3’-dideoxy-2,,3'-didehydrothymidin og immunmodulatorer såsom interleukin II (IL2) og granulo-5 cytmakrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), erythropoetin og ampligen.

De individuelle komponenter i sådanne kombinationer kan administreres enten sekventielt eller samtidigt i separate eller kombinerede farmaceutiske præparater.

10

Hvis forbindelsen med formlen I eller et farmaceutisk acceptabelt derivat deraf anvendes i kombination med et andet terapeutisk middel, som er aktivt mod det samme virus, kan dosen af hver forbindelse være forskellig fra dosen, når forbindelsen anvendes alene. Passende doser vil let kunne fastslås af fagfolk.

15

Forbindelserne med formlen I og disses farmaceutisk acceptable derivater kan fremstilles ved en hvilken som helst metode, som er kendt inden for teknikken til fremstilling af forbindelser med analog struktur. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Egnede metoder til fremstilling af forbindelser med formlen I og deres farmaceu 2 tisk acceptable derivater er beskrevet nedenfor; grupperne X og Z er som define 3 ret ovenfor, medmindre andet er angivet. Det vil være klart, at de nedenstående 4 reaktioner kan kræve anvendelse af eller hensigtsmæssigt kan anvendes på ud 5 gangsmaterialer med beskyttede funktionelle grupper, og afbeskyttelse kan såle- 6 des være nødvendig som et mellemliggende eller endeligt trin til at give den øn 7 skede forbindelse. Beskyttelse og afbeskyttelse af funktionelle grupper kan udfø 8 res under anvendelse af konventionelle teknikker. Således kan fx aminogrupper 9 beskyttes med en gruppe valgt blandt aralkyl (fx benzyl), acyl eller aryl (fx 2,4- 10 dinitrophenyl); idet efterfølgende fjernelse af beskyttelsesgruppen udføres når det 11 ønskes ved hydrolyse eller hydrogenolyse, alt efter hvad der er passende, under 12 anvendelse af standardbetingelser. Hydroxygrupper kan beskyttes under 13 anvendelse af en hvilken som helst konventionel hydroxybeskyttelsesgruppe, fx 14 som beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", Ed. J.F.W. McOmie 15 (Plenum Press, 1973) eller "Protective Groups in Organic Synthesis" af Theodora 16 W. Greene (John Wiley and Sons, 1981). Eksempler på egnede hydroxybeskyttel- 12 DK 175131 B1 sesgrupper omfatter grupper valgt blandt alkyl (fx methyl, t-butyl eller methoxymethyl), aralkyl (fx benzyl, diphenylmethyl eller triphenylmethyl), heterocykliske grupper såsom tetrahydropyranyl, acyl (fx acetyl eller benzoyl) og silylgrupper såsom trialkylsilyl (fx t-butyldimethylsilyl). Hydroxybeskyttelses-5 grupperne kan fjernes ved konventionelle teknikker. Således kan fx alkyl-, silyl-, acylgrupper og heterocykliske grupper fjernes ved solvolyse, fx ved hydrolyse under sure eller basiske betingelser. Aralkylgrupper såsom triphenylmethyl kan på lignende måde fjernes ved solvolyse, fx ved hydrolyse under sure betingelser. Aralkylgrupper såsom benzyl kan fjernes ved hydrogenolyse i nærværelse af en 10 ædelmetalkatalysator såsom palladium på trækul. Silylgrupper kan også hensigtsmæssigt fjernes under anvendelse af en fluorionkilde såsom tetra-n-butylammoniumfluorid.

Ved en første proces (A) kan forbindelser med formlen I og farmaceutisk accepta-15 ble derivater deraf fremstilles ved, at en forbindelse med formlen II

Ϊ A Λ N · I i 20 /\\/\ 2 N NH ,| Λ • ·

1_I

25 (hvor X og Z er substituenter med den i formel I angivne betydning eller er beskyttede former deraf, og Y er OH eller en beskyttet form deraf) eller et farmaceutisk acceptabelt derivat deraf omsættes med et reagens valgt blandt myresyre og reaktive derivater deraf, om nødvendigt efterfulgt af fjernelse af uønskede 30 grupper, der er indført af nævnte reagens, og/eller ved fjernelse af eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

Eksempler på egnede derivater af myresyre, som kan anvendes ved proces (A) ovenfor, omfatter orthoformiater (fx triethylorthoformiat), dialkoxymethylacetater 13 DK 175131 B1 (fx diethoxymethylacetat), dithiomyresyre, formamid, s-triazin eller formami-dinacetat.

Uønskede grupper indført af myresyre eller et reaktivt derivat deraf kan hen-5 sigtsmæssigt fjernes ved mild hydrolyse, fx under anvendelse af en uorganisk syre såsom vandig saltsyre.

Hvis der anvendes et trialkylorthoformiat såsom triethylorthoformiat, er dette hensigtsmæssigt også opløsningsmiddel for reaktionen. Andre opløsningsmidler, 10 som kan anvendes, omfatter amider (fx dimethylformamid eller dimethylaceta-mid), chlorerede carbonhydrider (fx dichlormethan), ethere (fx tetrahydrofuran) eller nitriler (fx acetonitril).

I visse tilfælde (fx hvis der anvendes et trialkylorthoformiat såsom triethyl-15 orthoformiat), kan reaktionen hensigtsmæssigt udføres i nærværelse af en katalysator såsom en stærk syre (fx koncentreret saltsyre, saltpetersyre eller svovlsyre). Reaktionen kan udføres ved en temperatur i området fra -25°C til + 150°C, fx 0-100°C og hensigtsmæssigt ved omgivelsestemperatur.

20 Ved en anden proces (B) underkastes forbindelser med formlen I og farmaceutisk acceptable derivater deraf eller en beskyttet form deraf en interomdannelses-reaktion, hvorved substituenten X, som er til stede indledningsvis, erstattes med en anden substituent X, og/eller den gruppe Z, som indledningsvis er til stede, erstattes med en anden gruppe Z, om nødvendigt efterfulgt af fjernelse af 25 eventuelle tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

14 DK 175131 B1 betingelser til omdannelse af halogenider til sekundære og tertiære aminer er også beskrevet af I.T. Harrison et. al., Compendium of Organic Synthetic Methods, Wiley-Interscience, New York (1971) på siderne 250-252.

5 I en anden udførelsesform af proces (B) kan forbindelser med formlen I, i hvilke X er en gruppe OR (hvor R er som defineret ovenfor), fremstilles ved fortrængning af halogenatomet (fx chlor) med en passende anion RO". Hvis R er et hydrogenatom, kan fortrængnings-reaktionen udføres ved hydrolyse, som kan foretages i vand eller i en blanding af vand og et med vand blandbart opløsningsmiddel så-10 som en alkohol (fx methanol eller ethanol), en ether (fx dioxan eller tetrahydro-furan), en keton (fx acetone), et amid (fx dimethylformamid) eller et sulfoxid (fx dimethylsulfoxid), hensigtsmæssigt i nærværelse af en syre eller base. Egnede syrer omfatter organiske syrer såsom p-toluensulfonsyre og uorganiske syrer såsom saltsyre, saltpetersyre eller svovlsyre. Egnede baser omfatter uorganiske 15 baser såsom alkalimetalhydroxider eller -carbonater (fx natrium- eller kaliumhydroxid eller -carbonat). Vandig syre eller base kan også anvendes som reaktionsopløsningsmiddel. Hydrolysen kan hensigtsmæssigt udføres ved en temperatur i området fra -10°C til +150°C, fx ved tilbagesvaling. Hvis R er en Ci-4-alkyl- eller arylgruppe, dannes anionen RO* hensigtsmæssigt ud fra en til-20 svarende alkohol ROH under anvendelse af en uorganisk base såsom et alkalimetal (fx natriummetal) eller et alkalimetalhydrid (fx natriumhydrid). Reaktionen med den in situ dannede anion kan hensigtsmæssigt udføres ved omgivelsestemperatur. 1 2 3 4 5 6 I en yderligere udførelsesform af proces (B) kan forbindelser med formlen I, hvor 2 X er en gruppe SH, fremstilles ved, at halogenforbindelsen med formlen I om 3 sættes med thiourinstof i et egnet opløsningsmiddel såsom som en alkohol (fx n- 4 propanol) ved forhøjet temperatur (fx tilbagesvaling) efterfulgt af alkalisk hydro 5 lyse. Egnede baser, som kan anvendes, omfatter alkalimetalhydroxider (fx natri- 6 umhydroxid). Reaktionen kan hensigtsmæssigt udføres i overensstemmelse med metoden beskrevet af G.G. Urquart et. al., Org. Syn. Coll. Vol. 3, 363(1953), fx ved at tilbagesvale mellemproduktet med vandig NaOH i fra ca. 0,25 til ca.

5 timer.

15 DK 175131 B1 I endnu en udførelsesform af proces (B) kan forbindelser med formlen I, hvilke X er et hydrogenatom, fremstilles ved at reducere halogenforbindelsen med formlen I under anvendelse af et reducerende system, som ikke vil påvirke resten af molekylet. Egnede reduktionsmidler, som kan anvendes til at foretage den ønskede 5 dehalogeneringsreaktion, omfatter zinkmetal/vand under anvendelse af metoden beskrevet af J.R. Marshall et. al., J. Chem. Soc., 1004 (1951). Alternativt kan reaktionen udføres ved fotolyse i et egnet opløsningsmiddel såsom tetrahydrofuran indeholdende 10% triethylamin og hensigtsmæssigt i en Raoynet fotokemisk reaktor (2537A) ifølge metoden beskrevet af V. Nair et. al., J. Org. Chem., 52, 10 1344 (1987).

I endnu en yderligere udførelsesform af proces (B) kan forbindelser med formlen I, hvor X er halogen, fremstilles ud fra en anden halogenforbindelse med formlen I ved konventionelle halogenid-halogenidudskiftningsmetoder. Hvis X er chlor, kan 15 denne substituent alternativt erstattes med andre halogenatomer ved at anvende forskellige p-(halogen)benzendiazoniumchiorider i overensstemmelse med velkendte procedurer.

Forbindelser med formlen I, i hvilke X er en gruppe SR, hvor R er C^-alkyl eller 20 aryl, kan fremstilles ud fra de tilsvarende thioler under anvendelse af standardal-kylerings- eller aryleringsmetoder, fx som beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.383.114.

Forbindelser med formlen I, hvor Z er en hydroxygruppe, kan hensigtsmæssigt 25 fremstilles ud fra en tilsvarende forbindelse med formlen I, i hvilken Z er NH2/ ved omsætning med saltpetersyre, fx under an-vendelse af proceduren beskrevet af J.

Davoll, J. Amer. Chem. Soc., 73, 3174 (1951).

Mange af de ovenfor beskrevne reaktioner har i omfattende grad været rapporte-30 ret i sammenhæng med purinnucleosidsyntese, fx i Nucleoside Analogs -Chemistry, Biology and Medical Applications, redigeret af R.T. Walker et. al,

Plenum Pless, New York (1979) på siderne 193-223, hvortil der henvises.

Farmaceutisk acceptable salte af forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles 35 som beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.383.114, hvortil der henvises. Hvis det 16 DK 175131 B1 siledes fx ønskes at fremstille et syreadditionssalt af en forbindelse med formlen I, kan produktet fra en hvilken som helst af de ovenstående processer omdannes til et salt ved behandling af den resulterende frie base med en egnet syre under anvendelse af konventionelle metoder. Farmaceutisk acceptable syreadditionssalte 5 kan fremstilles ved at omsætte den frie base med en passende syre, eventuelt i nærværelse af et egnet opløsningsmiddel såsom en ester (fx ethylacetat) eller en alkohol (fx methanol, ethanol eller isopropanol). Uorganiske basiske salte kan fremstilles ved at omsætte den frie base med en passende base såsom et alkoxid (fx natriumhydroxid), eventuelt i nærværelse af et opløsningsmiddel såsom en al-10 kohol (fx methanol). Farmaceutisk acceptable salte kan også fremstilles ud fra andre salte, deriblandt andre farmaceutisk acceptable salte, af forbindelserne med formlen I under anvendelse af konventionelle metoder.

En forbindelse med formlen I kan, alt efter hvad der er passende, omdannes til et 15 farmaceutisk acceptabelt phosphat eller en anden ester ved omsætning med et phosphoryleringsmiddel såsom POCI3 eller et egnet esterificeringsmiddel såsom et syrehalogenid eller -anhydrid. En ester eller et salt af en forbindelse med formlen I kan omdannes til stamforbindelsen ved fx hydrolyse.

20 Forbindelser med formlen II og salte deraf er hidtil ukendte forbindelser og udgør et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse.

Forbindelserne med formlen II, i hvilke Z er hydrogen eller hydroxy, kan fremstilles direkte ud fra forbindelsen 2a 25 -ΤΛΡ # o I_I 2a 30 * *

ved omsætning med et overskud af en pyrimidin med formlen III

35 17 DK 175131 B1

X

i NH 111 N · I I * · ς / \\ / \

5 Z N Y

hvor Y er halogen, fx chlor, og Z er hydrogen eller hydroxy, i nærværelse af en aminbase såsom triethylamin og i et alkoholisk opløsningsmiddel (fx n-butanol), hensigtsmæssigt ved tilbagesvaling.

10

Forbindelser med formlen II, i hvilke Z er NH2, kan fremstilles under anvendelse af forbindelsen med formlen 2a ved omsætning med et overskud af en pyrimidin med formlen IV

15

X

! /% T i iv • e /w/ \

20 H2N N Y

hvor Y er som defineret i formel III ovenfor, under lignende betingelser som dem, der er beskrevet netop ovenfor til fremstilling af forbindelser med formlen II, i 25 hvilke Z er hydrogen eller hydroxy, til dannelse af en forbindelse med formlen V

X

0 // \ N · \ I o > 30 Λ Λ H2N N NH v

Htw% Λ • ·

1 _I

35 18 DK 175131 B1

som kan diazoteres under anvendelse af et diazoniumsalt ArN2+E‘ (hvor Ar er en aromatisk gruppe, fx p-chlorphenyl, og E‘ er en anion, fx et halogenid såsom chlorid) i et opløsningsmiddel såsom vand, en organisk syre såsom eddikesyre eller en blanding deraf, hensigtsmæssigt ved omkring omgivelsestemperatur, til 5 dannelse af en forbindelse med formlen VI

X

i N=N-Ar //\ / ΐ ; • · 10 H2f/ V \h

ho-ch2x 7·χ VI

I_ hvor Ar er som defineret netop ovenfor, som kan omdannes til den ønskede for-15 bindelse med formlen II ved reduktion under anvendelse af fx et reducerende metal såsom zink i nærværelse af en syre, fx eddikesyre. Det vil være klart, at valget af reduktionsmidlet vil afhænge af arten af gruppen X.

Forbindelsen 2a kan fremstilles ud fra den bredt anvendelige precursor la-acetyl-20 amino-3a-acetoxy-methylcyclopent-2-en (la) ved hydrolyse i nærværelse afen mild base såsom et jordalkalimetalhydroxid.

En særlig bekvem syntese af forbindelser med formlen I via 6-chlorforbindelser med formlen II er skitseret nedenfor.

DK 175131 B1 19 |51 Λ /NH* N ·

! B

Λ Λ

1 H HH

NHAc NH-

• “">%] “^λΙ --IA

1—1 -> I I -i-> I \ la 2e i ‘ir f1 ^ fwo;- tV a\

A —* “/v\ _> /vV

Tf Tv τΐ 15 LJ i=. Li 5a A 6β (I) t f1

A

2° ΐ ί Λ Λ π2ν Ν \ Μ0-ΐΛ.

I_ 25 *4β

Forbindelsen 2a og forbindelser med formlerne V og VI er hidtil ukendte mellemprodukter og udgør yderligere aspekter i den foreliggende opfindelse.

Forbindelsen la er en kendt forbindelse beskrevet i USA-patentskrift 30 nr. 4.138.562.

Hvis forbindelsen med formlen I ønskes som en enkelt isomer, kan den opnås enten ved opspaltning af slutproduktet eller ved stereospecifik syntese ud fra iso-merisk rent udgangsmateriale eller et hvilket som helst bekvemt mellemprodukt.

20 DK 175131 B1

Opspaltning af slutproduktet eller et mellemprodukt eller udgangsmateriale derfor kan udføres ved en hvilken som helst egnet metode, som er kendt inden for teknikken: se fx "Stereochemistry of Carbon Compounds" af E.L. Eliel (McGraw Hiil, 1962) og "Tables of Resolving Agents" af S.H. Wilen.

5

En hensigtsmæssig metode til at opnå chiralt rene forbindelser med formlen I er ved enzymatisk omdannelse af en racemisk blanding af forbindelsen eller en precursor derfor. Ved en sådan metode kan både (+)- og (-)-forbindelser med formlen I opnås i optisk ren form. Egnede enzymer omfatter deaminaser såsom aden-10 osindeaminase.

Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til nedenstående detaljerede eksempler, hvor elementaranalyser blev foretaget af N-H-W Laboratories,

Phoenix, Arizona, USA. Smeltepunkter blev bestemt på et Mel-Temp-apparat og er 15 korrigerede. Kernemagnetiske resonansspektre blev optaget på Jeol FX 90QFT eller Nicollet NT300 spektrometre og blev optaget i DMSO-D6. Chemical shift-værdier er udtrykt i ppm downfield i forhold til Me4Si. IR-spektre blev bestemt som KBr-pellets med et Nicollet 50XC FT-IR spektrometer, og UV spektre blev bestemt på et Beckmann DU-8 spektrofotometer. Massespektre blev optaget ved 20 hjælp af et AEI Scientific Apparatus Limited MS-30 massespektrometer.

Tyndtlagskromatografi (TLC) blev udført på 0,25 mm lag af Merck silicagel (0,063-0,037 mm, 230-400 mesh). Alle kemikalier og opløsningsmidler er af reagenskvalitet medmindre andet er angivet. Udtrykket "aktiv bestanddel" som anvendt i eksemplerne betegner en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk 25 acceptabelt derivat deraf.

EKSEMPEL 1 30 (±)-(la,4a)-4-[(5-Amino-6-chlor-4-pyrimidinyl)-amino]-2-cyclopentenylcarbinol (3a)

En blanding af la-acetylamino-3-a-acetoxymethyl-cydopent-2-en (la) (3,0 g, 15 mmol) og vandigt bariumhydroxid (0,5N, 300 ml) blev tilbage-35 svalet natten over. Efter afkøling blev blandingen neutraliseret med tøris. Bund- 21 DK 175131 B1 faldet blev filtreret fra, og den vandige opløsning blev koncentreret til tørhed. Remanensen blev ekstraheret med absolut ethanol og koncentreret igen, hvilket gav 2a som en farveløs sirup, 1,6 g (14 mmol).

5 Til denne sirup blev der sat 5-amino-4,6-dichlorpyrimidin (4,59 g 28 mmol), tri-ethylamin (4,2 g, 42 mmol) og n-butanol (50 ml), og blandingen blev tilbagesva-let i 24 timer. De flygtige opløsningsmidler blev fjernet, og remanensen blev absorberet på silicagel (7 g), pakket i en flash-søjle (4,0 x 12 cm) og elueret med CHCh-MeOH (20:1), hvilket gav 2,69 g (74%) af forbindelse 3a; smeltepunkt 10 130-132°C. En analytisk prøve blev opnået ved omkrystallisation af ethylacetat (EtOAc), smeltepunkt 134-135°C, MS (30 ev, 200°C); m/e 240 og 242 (M+ og M++2), 209 (M+* 31), 144 (B+); IR: 3600-2600 (OH), 1620, 1580 (C=C, C=N); analyse (C10H13CIN4O) C, Η, N.

15 EKSEMPEL 2 (±)-(la,4a)-4-[(2-Amino-6-chlor-4-pyrimidinyl)-amino]-2-cydopentenylcarbinol 20 (4a)

Til 14 mmol rå 2a (eksempel 1) blev der sat 2-amino-4,6-dichlorpyrimidin (3,74 g, 22,8 mmol), triethylamin (15 ml) og n-butanol (75 ml), og blandingen blev tilbagesvalet i 48 timer. De letflygtige opløsningsmidler blev fjernet, og 25 remanensen blev behandlet med methanol for at fraskille det uopløste biprodukt (dobbelpyrimidin-nudeosidet). Methanolopløsningen blev absorberet på silicagel (8 g), pakket i en kolonne (4,0 x 14 cm) og elueret med CHCl3-MeOH (40:1), hvilket gav 1,52 g (42%) råt 4a. Produktet blev omkrystalliseret af ethylacetat, hvilket gav 4a; smeltepunkt 132-134°C, MS (30 ev, 200°C); m/e 30 240 og 242 (M+ og M++2), 209, (M+ '31), 144 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH), 1620, 1580 (C=C, C=N); analyse (Ci0Hi3CIN4) C, Η, N.

(±)-(la,4a)-4-[(2-Amino-6-chlor-5(4-chlorphenyl)-azo]-4-pyrimidinylamino)-2- cydopentenylcarbinol (5a) EKSEMPEL 3 22 DK 175131 B1 5

En kold diazoniumsaltopløsning blev fremstillet ud fra p-chloranilin (1,47 g, 11,5 mmol) i 3N HCI (25 ml) og natriumnitrit (870 mg 12,5 mmol) i vand (10 ml).

Denne opløsning blev sat til en blanding af 4a (2,40 g, 10 mmol), eddikesyre (50 ml), vand (50 ml) og natrium-acetattrihydrat (20 g). Reaktionsblandingen blev io omrørt natten over ved stuetemperatur. Det gule bundfald blev filtreret fra og vasket med koldt vand indtil en neutral reaktion, hvorefter det blev lufttørret i stinkskab, hvilket gav 3,60 g (94%) 5a, smeltepunkt 229eC (sønderdeling). Den analytiske prøve blev opnået fra acetone-methanol (1:2), smeltepunkt 241-243°C (sønderdeling). MS (30 ev, 260eC): m/e 15 378 og 380 (M+ og M++2), 282 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH), 1620, 1580 (C=C, C=N); analyse (C16H16CI2N60) C, Η, N.

20 EKSEMPEL 4 (±)-(la,4a)-4-[(2,5-Diamino-6-chlor-4-pyrimidinyl)-amino]-2-cyclo-pentenylcarbinol (6a) 1 2 3 4 5 6 35

En blanding af 5a (379 mg, 1 mmol), zinkstøv (0,65 g, 10 mmol), eddikesyre 2 (0,32 ml), vand (15 ml) og ethanol (15 ml) blev tilbagesvalet under nitrogen i 3 3 timer. Zinket blev fjernet, og opløsningsmidlerne blev afdampet. Remanensen 4 blev absorberet på silicagel (2 g), pakket i en søjle (2,0 x 18 cm) og elueret med 5 CHCI3-MeOH (15:1). Der blev opnået en lyserød sirup. Yderligere oprensning fra 6 methanol-ether gav 6a som lyserøde krystaller, 170 mg (66%), smeltepunkt, 168-170°C, MS (30 ev, 220°C); m/e 255 og 257 (M+ og M++2), 224 (M+'31), 159 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH) 1620, 1580 (C=C, C=N); analyse (C10HhCIN5) C, Η, N.

(±)-(la,4a)-4-[(6-Chlor-9H-pur»n-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol (7a) EKSEMPEL 5 23 DK 175131 B1 5 En blanding af 3a (1,30 g, 5,4 mmol), triethylorthoformiat (30 ml) og saltsyre (12N, 0,50 ml) blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet blev fjernet ved 35°C i vakuum. Til remanensen blev der sat saltsyre (0,5 N, 30 ml), og blandingen blev omrørt i 1 time, hvorefter blandingen blev neutraliseret til pH 7-8 med IN natriumhydroxid og absorberet på silicagel (8 g), pakket 10 i en søjle (4,0 x 8 cm) og elueret med CHCI3-MeOH (20:1), hvilket gav hvide krystaller af 7a, 1,12 g (82%). Det rå produkt blev omkrystalliseret af ethylacetat, hvilket gav 7a, smeltepunkt 108-110°C, MS (30 ev, 200°C); m/e 250 og 252 (M+-2), 219 (M+'31), 154 (B+); IR; 3600-2800 (OH), 1600 (C=C, C=N); 15 analyse (CnHuCI^O) C, Η, N.

EKSEMPEL 6 20 (±)-(la,4a)-4-[(6-Hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol (8a)

En blanding af 7a (251 mg, 1 mmol) og vandig natriumhydroxid (0,2N, 10 ml) blev tilbagesvalet i 3 timer. Efter afkøling blev reaktionsblandingen justeret til pH

5-6 med eddikesyre. Reaktions-blandingen blev absorberet på silicagel (2 g), pak-25 ket i en søjle (2,0 x 11 cm) og elueret med CHCI3-MeOH (10:1), hvilket gav 105 mg (45%) af 8a. Det rå hvide produkt blev omkrystalliseret af vand-methanol (3:1), hvilket gav 8a, smeltepunkt 248-250°C (sønderdeling), MS (30 ev, 300°C); m/e 232 (M+), 214 (M+18), 136 (B+); IR; 3600-2600 (OH), 1680, 1600 (C=0, C=C, C=N); 30 analyse (C11H12N4O2) C, Η, N.

EKSEMPEL 7 (±Hla,4a)-4-[(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol (9a) 24 DK 175131 B1 5 Flydende ammoniak blev ført ind i en bombe indeholdende en opløsning af 7a (250 mg, 1 mmol) i methanol (5 ml) ved -80°C. Bomben blev forseglet og opvarmet ved 60°C i 24 timer. Ammoniak og methanol blev dampet af, og remanensen blev omkrystalliseret af vand, hvilket gav off-white krystaller af 9a, 187 mg (81%), smeltepunkt 198-200°C, MS 10 (30 ev, 210°C): m/e 231 (M+), 213 (M+ 18), 135 (B+); IR: 3600-2600 (NH2, OH), 1700, 1600 (C=C, C=N); analyse (CnH13NsO) C, Η, N.

15 EKSEMPEL 8 (±)-(la,4a)-4-[(6-Mercapto-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol (10a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

En blanding af 7a (125 mg, 0,5 mmol), thiourinstof (40 mg, 0,64 mmol) 2 og n-propanol (5 ml) blev tilbagesvalet i 2 timer. Efter afkøling Blev bundfaldet 3 isoleret ved filtrering, vasket med n-propanol og opløst i natriumhydroxid (IN, 5 4 ml). Opløsningen blev justeret til pH 5 ved hjælp af eddikesyre. Den ri forbindelse 5 10a (90 mg, 73%) blev isoleret igen, smeltepunkt 260-262°C (sønderdeling) og 6 blev omkrystalliseret af Ν,Ν-dimethylformamid, hvilket gav 10a, smeltepunkt 7 263-265°C (sønderdeling), MS (30 ev, 290°C): m/e 248 (M+), 230 8 (M+ 18), 152 (B+); IR: 3600-3200 (OH), 3100, 2400 (SH), 1600 (C=C, 9 C=N); 10 analyse (C11H12N4OS) C, Η, N.

11 (±)-(la,4a)-4-[(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol (13a) EKSEMPEL 9 25 DK 175131 B1 5 En blanding af 6a (1,41 g, 5,5 mmol), triethylorthoformiat (30 ml) og saltsyre (12N, 1,40 ml) blev omrørt natten over. Suspensionen blev tørret i vakuum. Fortyndet saltsyre (0,5N, 40 ml) blev tilsat, og blandingen blev reageret ved stuetemperatur i 1 time. Blandingen blev neutraliseret til pH 8 ved hjælp af IN natriumhydroxid og absorberet pi silicagel (7,5 g), pakket i en søjle (4,0 x 10 cm) og 10 elueret med CHCI3-MeOH (20:1), hvilket gav off-white krystaller af forbindelsen 13a, 1,18 g (80%). Det rå produkt blev omkrystalliseret af ethanol, hvilket gav 13a, smeltepunkt 145-147°C, MS (30 ev, 220°C): m/e 265 og 267 (M+ og M++2), 235 (M+ *30), 169 (B+); IR: 3600-2600 (NH2, OH), 620-1580 (C=C, C=N); 15 analyse (ΟπΗ,2Ν5οα.3/4 H20) C, Η, N.

EKSEMPEL 10 20 (±)-(la,4a)-4-[(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol (14a)

En blanding af 13a (266 mg, 1 mmol) og vandig natriumhydroxid (0,33N) blev til-bagesvalet i 5 timer, absorberet på silicagel (2 g), pakket i en søjle (2,0 x 7,5 cm) og elueret med CHCl3-MeOH (5:1). Det rå produkt blev omkrystalliseret af metha-25 nol-vand (1:4), hvilket gav hvide krystaller af forbindelsen 14a, 152 mg (61%), smeltepunkt 254-256°C (sønderdeling), MS (30 ev, 200°C): m/e 247 (M+), 217 (M+ '30), 151 (B+); IR: 3600-2600 (NH2,OH), 1700, 1600 (C=0, C=C, C=N); analyse (0„Η,3Ν502.3/4 H20) C, Η, N. 1 (±)-(la,4a)-4-[(2,6-Diamino-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol (15a) EKSEMPEL 11 26 DK 175131 B1 5 Flydende ammoniak blev ført ind i en opløsning af 13a (265 mg, 1 mmol) i methanol (10 ml) ved -80°C i en bombe. Bomben blev forseglet og opvarmet ved 75eC i 48 timer. Ammoniak og methanol blev dampet af. Remanensen blev absorberet på silicagel (2 g), pakket i en søjle (2,0 x 10 cm) og elueret med CHCI3-MeOH (15:1). Det rå produkt blev omkrystalliseret af ethanol, hvilket gav 196 mg 10 (80%) af 15a, smeltepunkt 152-155°C, MS (30 ev, 200°C): m/e 246 (M+), 229 (M+'17), 216 (M+ ’30), 150 (B+); IR: 3600-3000 (NH2, OH), 1700, 1650, 1600 (C=0, C=C, C=N); analyse (CnHHN60) C, Η, N.

15 EKSEMPEL 12 (lS,4R)-4(2,6-Diamino-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol [(lS,4R)-4-(2,6-Diamino-9H-purin-9-y!)-2-cyclopentenmethanol] 20 (a) Mellemprodukt 1: (lR,2S,3R,5R)-3-[6-Amino-9H-purin-9-ylJ-5-[((l,l-di-methylethyl)-dimethylsilyloxy)methyl)-l,2-cyclopentandiol (-) Aristeromycin1 (12,505 g), tert-butyldimethylsilylchlorid (7,8 g) og imidazol 25 (12,96 g) i tørt dimethylformamid (85 ml) blev omrørt ved omgivelsestemperatur i 2 1/2 time. Den resulterende opløsning blev fortyndet med ethylacetat (500 ml) og derefter vasket med vand (3 x 100 ml) og saltvand (50 ml) inden et hvidt fast stof krystalliserede ud. Dette blev opsamlet ved filtrering, vasket med ethylacetat og derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelproduktet (3,92 g); *H 30 n.m.r. (DMSO-d6) 8,15 (IH), 8,09 (IH), 7,19 (2H), 5,00 (IH), 4,72 (IH), 4,69 (IH), 4,36 (IH), 3,85 (IH), 3,67 (2H), 2,23 (IH), 2,09 (IH), 1,79 (IH), 0,89 (9H), 0,07 (6H).

35

Journal of the American Chemical Society 1983, vol. 105, 4049-4055.

27 DK 175131 B1 (b) Mellemprodukt 2: (4R,3aS,6R,6aR)-4-[6-Amino-9H-purin-9-yl]-6-[((l,l-di-methylethyl)-dimethylsilyloxy)methyl]-3a,5,6,6a-tetrahydro.4H-cyclopenta-l,3-dioxol-2-thion 5 En omrørt suspension af mellemprodukt 1 (3,45 g) i tør dimethylformamid (56 ml) blev behandlet med Ι,Ι'-thiocarbonyldiimidazol (3,3 g), hvilket gav en gul opløsning. Efter 15 1/2 time ved omgivelsestemperatur blev den resulterende opløsning forenet med den tilsvaren-de opløsning fra et tidligere eksperiment (skala 6%), og opløsningsmidlet blev fjernet ved inddampning. Den tilbageværende olie 10 blev fortyndet med ethylacetat (100 ml), derefter vasket med vand (2 x 20 ml) og saltvand (2 x 20 ml), tørret (MgSO„) og inddampet til et gult fast stof. Dette blev vasket med diethylether (25 ml) opsamlet ved filtrering, vasket yderligere med ether (25 ml) og derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelforbindelsen som et lyst cremefarvet fast stof (3,61 g); Xmax (ethanol) 240,Onm (E1%lcm 459); IH n.m.r.

15 (DMSO-d6) 8,27 (IH), 8,13 (IH), 7,33 (2H), 5,81 (IH), 5,37 (IH), 5,28 (IH), ,78 (2H), 2,60 (IH), 2,28 (2H), 0,90 (9H), 0,09 (6H).

(c) Mellemprodukt 3: (rR,4’S)-9-[4-(((l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyloxy)-methyl)-2-cyclopenten-l-yl]-9H-purin-6-amin 20

En opløsning af mellemprodukt 2 (3,57 g) i tør tetrahydrofuran (25 ml) blev behandlet med en opløsning af l,3-dimethyl-2-phenyl-l,3,2-diazaphospholidin (4,94 g) i tør tetrahydrofuran (10 ml) og derefter omrørt ved omgivelsestemperatur i 8 3/4 time. Opløsningsmidlet blev fjernet ved inddampning. Den tilbageværende 25 olie blev forenet med den tilsvarende olie fra et tidligere eksperiment (skala 40%) og derefter underkastet søjlekromatografi pi silicagel (200 g, Merck 7734) elueret med chloroform og derefter chloroform-ethanol-blandinger, hvilket gav et hvidt fast stof. Dette faste stof blev vasket med diethylether (25 ml) og derefter opsamlet ved filtrering. Det faste stof blev vasket yderligere med ether (10 ml) og 30 derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelproduktet (1,47 g); Xmax (ethanol) 261,4nm (E1%lcm 443); IH n.m.r. (DMSO-d6) 8,14 (IH), 8,00 (IH), 7 20 (2H), 6,12 (IH), 5,95 (IH), 5,60 (IH), 3,66 (2H), 2,96 (IH), 2,69 (IH), 1,65 (IH), 0,74 (9H), 0,02 (6H).

28 DK 175131 B1 (d) Mellemprodukt 4: (rR,4'S)-9-[4-(((l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyloxy)-methyl)-2-cyclopenten-l-yl]-9H-purin-6-amin,l-oxid

En opløsning af mellemprodukt 3 (1,37 g) i chloroform (30 ml) blev behandlet 5 med 80-90% m-chlorperoxybenzoesyre (1,29 g) og derefter omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 timer. Opløsningsmiddel blev fjernet ved inddampning, og den tilbageværende gummi blev opløst i ethylacetat (10 ml). Et hvidt stof krystalliserede ud. Dette faste stof og materiale udvundet ved inddampning af filtratet blev opløst i chloroform (100 ml) og derefter vasket med mættet vandig natriumhydro-10 gencarbonatopløsning (3 x 10 ml) og saltvand (2 x 10 ml). De vandige vaskefaser blev tilbageekstraheret med chloroform (50 ml). De forenede organiske opløsninger blev tørret (MgS04) og derefter inddampet til et fast stof. Dette faste stof blev vasket med diethyl-ether (25 ml) og derefter opsamlet ved filtrering. Det hvide faste stof blev yderligere vasket med ether (10 ml) og derefter tørret i 15 vakuum, hvilket gav titelproduktet (1,16 g); lmax (ethanol) 235,4nm (E1%iCm 1324), 263,2nm (E1%lcm 248), 300,2nm (E1%Km 75); lH n.m.r. (CDCI3) 8,72 (IH), 8,02 (IH), 7,16 (2H), 6,21 (IH), 5,87 (IH), 5,72 (IH), 3,68 (2H), 3,04 (IH), 2,82 (IH), 1,74 (IH), 0,89 (9H), 0,06 (6H).

20 (e) Mellemprodukt 5: (l'R,4’S)-7-[4-(((l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyloxy)-methyl)-2-cydopenten-l-yl]-2-imino-l,2-dihydro[l,2,4]oxadiazol[3,2-i]-9H-purin-hydrobromid

En omrørt isafkølet suspension af mellemprodukt 4 (1,08 g) i methanol (20 ml)

25 blev behandlet med en opløsning af cyanogenbromid (0,34 g) i methanol (20 ml) tilsat i løbet af 5 minutter. Efter 15 minutter fik suspensionen lov at varme op til omgivelsestemperatur, hvilket gav en opløsning. Efter 90 minutter blev opløsningsmidlet fjernet ved inddampning. Remanensen blev vasket med diethylether (25 ml) og derefter opsamlet ved filtrering. Det faste stof blev yderligere vasket 30 med ether (25 ml) og derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelproduktet (1,37 g); λ„*χ (ethanol) 228,2nm (E,%lcm 530), 285,2nm (Em1Cm 445); *H

n.m.r. (CDCI3) 10,20 (IH), 10,02 (IH), 8,37 (IH), 6,25 (IH), 6,01 (IH), 5,90 (IH), 3,69 (2H), 3,05 (IH), 2,86 (IH), 1,73 (IH), 0,86 (9H), 0,03 (6H).

29 DK 175131 B1 (f) Mellemprodukt 6: (rR,4'S)-9-[4-((( 1,l-Dimethylethyl)dimethylsilyloxy)meth-yl)-2-cyclopenten-l-yl]-6-cyanoimino-l,6-dihydro-l-methoxy-9H-purin

En opløsning af mellemprodukt 5 (1,36 g) i dimethylformamid (10 ml) blev omrørt 5 ved omgivelsestemperatur og derefter behandlet med triethylamin (1,2 ml). Efter 40 minutter blev der tilsat iodmethan (0,54 ml), hvilket gav en gul opløsning.

Efter 3 3/4 time blev opløsningsmidlet fjernet ved inddampning. Remanensen blev delt mellem ethylacetat (100 ml) og vand (20 ml). Den organiske opløsning blev yderligere vasket med vand (2 x 20 ml) og saltvand (20 ml), tørret (MgSO«) og 10 inddampet til et fast stof. Dette faste stof blev vasket med diethylether (25 ml) og derefter opsamlet ved filtrering. Dette hvide faste stof blev yderligere vasket med ether (10 ml) og derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelproduktet (0,865 g);

Xmax (ethanol) 227,2nm (E1%icm m 449), 287,Onm (E1%iCm m 544); *H n.m.r. 8,23 (IH), 7,96 (IH), 6,24 15 (IH), 5,85 (IH), 5,65 (IH), 4,21 (3H), 3,66 (2H), 3,04 (IH), 2,77 (IH), 1,68 (IH), 0,88 (9H), 0,05 (6H).

(g) Mellemprodukt 7: (l'R,4’S)-9-[4-(((l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyloxy)-methyl-2*cyclopenten-l-yl]-6-methoxyamino-9H-purin-2-amin 20

En opløsning af mellemprodukt 6 (802 mg) og l,8-diazabicydo[5,4,0]undec-7-en (0,45 ml) i ethanol (80 ml) blev omrørt og opvarmet ved tilbagesvaling. Opvarmning blev standset efter 9 timer, og opløsningen blev henstillet ved omgivelsestemperatur natten over. Opløsningsmiddel blev fjernet ved inddampning. Den til-25 bageværende olie blev forenet med olien fra et tidligere eksperiment (skala 4%) og derefter underkastet søjlekromatografi på silicagel (40 g, Merck 9385) elueret med chloroform og derefter chloroform-ethanol-blandinger, hvilket gav et skum.

Dette skum blev tritureret med diethylether (10 ml), og det resulterende faste stof blev opsamlet ved filtrering. Det faste stof blev yderligere vasket med ether 30 (5 ml) og derefter tørret i vakuum, hvilket gav titelproduktet (594 mg);

Xmax (ethanol) 282,2nm (EI%lcm 409); 'H-n.m.r. (DMSO-d6) 9,76 (IH), 7,32 (IH), 6,53 (2H), 6,08 (IH), 5,88 (IH), 5,26 (IH), 3,72 (3H), 3,61 (2H), 2,90 (IH), 2,50 (IH), 1,52 (IH), 0,83 (9H), 0,02 (6H).

30 DK 175131 B1 (h) Mellemprodukt 8: (lS,4R)-4-[2-Amino-6-methoxyamino-9H-purin-9-yl]-2-cy-dopenten-methanol

En opløsning af mellemprodukt 7 (356 mg) i tetrahydrofuran (35 ml) blev omrørt 5 ved omgivelsestemperatur og derefter behandlet med tetra-butylammonium-fluorid (1,0M opløsning i tetrahydrofuran, 1,4 ml). Efter 90 minutter blev reaktionen standset ved hjælp af vand (1 ml), hvorefter opløsningsmidlerne blev fjernet ved inddampning. Den tilbageværende olie blev underkastet søjlekromatografi pi silicagel (20 g, Merck 7734) elueret med chloroform og derefter chloro-10 form-ethanol.blandinger, hvilket gav titelproduktet som et fast stof (243 mg);

Xmax (pH 6 buffer) 280,2nm (E,%lcm 534); lH n.m.r. (DMS0-d6) 9,75 (IH), 7,39 (IH), 6,52 (2H), 6,10 (IH), 5,84 (IH), 5,27 (IH), 4,73 (IH), 3,40 (2H), 2,83 (IH), 2,55 (IH), 1,52 (IH).

15 (lS,4R)-4-[2,6-Diamino-9H-purin-9-yl]-2-cyclopentencarbinol

En omrørt isafkølet opløsning af mellemprodukt 8 (210 mg) i vand (10 ml) og tetrahydrofuran (50 ml) blev behandlet med aluminiumamalgam [ud fra aluminium (237 mg) og 0,5% vandig mercurichloridopløsning] tilsat i små stykker i 20 løbet af 15 minutter. Efter 40 minutter fik den omrørte blanding lov at varme op til omgivelsestemperatur. Efter 15 timer blev den resulterende blanding filtreret gennem kisel-gur for at fjerne uopløselige andele. Disse blev vasket med vand/-tetrahydrofuran (1:5, 60 ml). De forenede filtrater blev inddampet. Remanensen blev underkastet søjlekromatografi pi silicagel (10 g, Merck 9385) og elueret med 25 chloroform-ethanol-blandinger, hvilket gav titelproduktet som et skum (159 mg); [a]D -81° (c 1,04, methanol);

λπ,βχ (PH 6 buffer) 255,0 nm (E1%lcm m 302), 280,8 nm (E1%lcm 381), *H

n.m.r. (DMSO-d6) 7,61 (IH), 6,66 (2H), 6,10 (IH), 5,87 (IH), 5,76 (2H), 5,38 (IH), 4,76 (IH), 3,45 (2H), 2,87 (IH), 2,60 (IH), 1,60 (IH).

30 EKSEMPEL 13 31 DK 175131 B1 (lS,4R)-4-(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol (l,Ri4,S)-2-Amino-l>9-dihydro-9-[4-hydroxymethyl-2-cyclopenten-l-yl].6H-pyrin-5 6-on

En uklar opløsning af titelforbindelsen fra eksempel 12 (144 mg) i 0,1 M pH 6 buffer (10 ml) (ud fra 28,4 g dinatriumortophosphat i 2 liter vand, justeret med or-tophosphorsyre) blev behandlet med en opløsning af adenosindeaminase (0,5 ml, 10 778 enheder), i 50% glycerol/0,01M kaliumphosphat, pH 6,0, og derefter omrørt og opvarmet til 37°C. Efter 18 1/2 time blev den resulterende suspension afkølet i køleskab. Det opsamlede faste stof blev omkrystalliseret af vand, hvilket gav titelproduktet som et hvidt fast stof (86 mg); [a)D-49° (c 0,5, dimethylsulfoxid); λΦβχ (pH 6 buffer) 252,6 nm (Ε1%Κφ 531), *H 15 n.m.r. (DMSO-d6) 10,60 (IH), 7,60 (IH), 6,47 (2H), 6,10 (IH), 5,86 (IH), 5,33 (IH), 4,72 (IH), 3,45 (2H), 2,59 (IH), 1,58 (IH).

EKSEMPEL 14 20

Fremstilling af enantiomerer af (la,4a)-4-(2-amino-6-hydroxy-9H.purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol (a) (lS,4R)-4-(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol 25

Diaminoanalogen (100 mg) (eksempel 11) blev opløst i 3 ml 0,05M K2P04-buffer (pH 7,4) under opvarmning (50°C). Opløsningen blev afkølet til stuetemperatur, og der blev tilsat 40 enheder adenosindeaminase (Sigma, type VI, kalvetarms-mucosa). Efter 3 dages inkubation ved stuetemperatur dannede der sig bundfald, 30 som blev fjernet ved filtrering, udbytte 18,2 mg. Filtratet blev koncentreret til 1,5 ml og afkølet i køleskab i 2 dage. Et yderligere fast stof blev vundet ved filtrering, udbytte 26,8 mg. De to faste fraktioner blev omkrystalliseret af vand, hvilket gav det rene titelprodukt, smeltepunkt 269-272°C, [a]M0 - 62,1° (c 0,3 MeOH).

35 32 DK 175131 B1 (b) (lR,4S)-4-(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol

Filtraterne fra fremstillingen af lS,4R-isomeren (eksempel 14a) blev forenet og inddampet til tørhed. Det uforandrede diaminoudgangsmateriale blev skilt fra på 5 en silicagel-flashsøjle under anvendelse af 10% methanol/chloroform. Diamino-forbindelsen blev opløst i 0,05 M K2P04 buffer, pH 7,4 (15 ml) og 800 enheder adenosindeaminase blev tilsat. Opløsningen blev inkuberet i 96 timer ved 37°C.

TLC indikerede noget tilbageværende uomsat produkt. Opløsningen blev opvarmet i kogende vand i 3 minutter og filtreret for at fjerne denatureret protein. Der blev 10 tilsat yderligere 800 enheder adenosindeaminase, og processen blev gentaget.

Den deproteinerede opløsning blev inddampet til tørhed, og produktet blev krystalliseret fra vand. Titelproduktet som et hvidt fast stof blev opsamlet ved filtrering fra vand, smeltepunkt 265-247°C. [a]24D + 61,1° (c 0,3 MeOH).

15 EKSEMPEL 15 (±)-la,4a)-4-[(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenyl.acetoxycarbi- nol 20

Til en suspension af produktet fra eksempel 10 (130 mg, 0,50 mmol) og 4-dime-thylaminopyridin (5 mg, 0,04 mmol) i en blanding af acetonitril (6 ml) og tri-ethylamin (0,09 ml, 0,66 mmol) blev der sat eddikesyreanhydrid (0,06 ml, 0,6 mmol). Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 3 timer. Der blev tilsat 25 methanol (1 ml) for at standse reaktionen. Opløsningen blev koncentreret og absorberet på silicagel (1,5 g), pakket på en søjle (2,0 x 12 cm) og elueret med CHCI3-MeOH (20:1). Produktfraktionerne blev opsamlet og koncentreret, hvilket gav et hvidt fast stof. Det faste produkt blev vasket med MeOH-AcOEt: Udbytte 123 mg (85%). Yderligere oprensning fra ethanol gav titel produktet som nåle-30 lignende krystaller, smeltepunkt 237-239°C, analyse (Ci3H15N503) C, Η, N.

EKSEMPEL 16 33 DK 175131 B1 (lS,4R)-4-[2-Amino-9H-purin-9-yl]-2-cyclopentenylcarbinol 5 En omrørt isafkølet opløsning af (lS,4R)-4-[2-amino-6-methoxyamino-9H-purin- 9-yl]-2-cyclopenten-methanol (mellemprodukt 8, eksempel 12) (1,202 g) i tetra-hydrofuran (250 ml) og vand (50 ml) blev behandlet med aluminiumamalgam (ud fra aluminium (1,761 g) og 0,5% vandig mercurichlordidopløsning) tilsat i små stykker i løbet af 1 time og 47 minutter. Efter 35 minutter fik den omrørte blan-10 ding lov at varme op til omgivelsestemperatur. Efter 16 timer og 50 minutter blev mere aluminiumamalgam (ud fra 235 mg aluminium) tilsat i løbet af 14 minutter.

Efter yderligere 4 timer og 10 minutter blev den resulterende blanding filtreret igennem kiselgur for at fjerne opløselige andele. Disse blev vasket med tetrahy-drofuran/vand (5:1, 300 ml). De forenede filtrater blev inddampet, hvilket 15 efterlod et gult skum. Skummet blev underkastet søjlekromatografi på silicagel (33,8 Merck 7734) fremstillet i chloroform og elueret med chloroform-ethanol-biandinger, hvilket gav adskillige fraktioner (578 mg, 420 mg og 40 mg). De to største fraktioner blev krystalliseret separat ud fra isopropanol. Filtraterne blev forenet med den mindste søjlefraktion og underkastet præparativ tyndtlags-20 kromatografi (Merck 5717) fremkaldt tre gange i 10:1 chloroform/methanol.

Pladerne blev elueret med ethylacetat og ethylacetat-ethanol (1:1), hvilket gav et brunt fast stof (45 mg). Det faste stof blev underkastet søjlekromatografi på silicagel (2,7 g Merck 7734) fremstillet i chloroform og elueret med chloroform-methanol-triethylamin-blandinger, hvilket gav en gummi (17 mg). Efter krystal-25 lisation uden held ud fra isopropanol og behandling med trækul i methanol blev en vandig opløsning af det udvundne materiale frysetørret, hvilket gav titelforbindelsen (15 mg). *H n.m.r (DMSO-d6) 1,62 (IH), 2,63 (IH), 2,89 (IH), 3,45 (2H), 4,73 (IH), 5,48 (IH), 5,91 (IH), 6,14 (IH), 6,50 (2H), 7,98 (IH), 8,57 (IH). Massespektum [MH]+232.

30 34 DK 175131 B1 EKSEMPEL 17 Tabletpræparater 5 A. Følgende præparat fremstilles ved vådgranulering af bestanddele med en opløsning af povidon i vand, tørring og sigtning efterfulgt af tilsætning af magnesiumstearat og presning.

mg/tablet 10 _ (a) Aktiv bestanddel 250 (b) Lactose B.P. 210 (c) Povidon B.P. 15 (d) Natriumstivelsesglycollat 20 15 (e) Magnesiumstearat 5 500 B. Følgende præparat fremstilles ved direkte presning; lactosen er af 20 den direkte komprimerbare type.

mg/tablet

Aktiv bestanddel 250 25 Lactose 145

Avicel 100

Magnesiumstearat 5 1 30 C. (Retardpræparat) Præparatet fremstilles ved vådgranulering af bestanddelene (nedenfor) med en opløsning af povidon i vand, tørring og sigtning efterfulgt af tilsætning af magnesiumstearat og presning.

35 DK 175131 B1 mg/tablet (a) Aktiv bestanddel 500 (b) Hydropropylmethylcellulose 112 5 (Methocel K4M Premium) (c) Lactose B.P. 53 (d) Povidon B.P. 28 (e) Magnesiumstearat 7 10 700 EKSEMPEL 18 15 Kapselpræparat

Et kapselpræparat fremstilles ved at blande bestanddelene nedenfor og fylde dem i en to-delt hård gelatinekapsel.

20 mg/kapsel

Aktiv bestanddel 125

Lactose 72,5

Avicel 50 25 Magnesiumstearat 2,5 250 EKSEMPEL 19 30

Injicerbart præparat Aktiv bestanddel 0,200 g

Natriumhydroxidopløsning 0,1M q.s. til en pH-værdi pi ca. 11 35 Sterilt vand q.s. til 10 ml 36 DK 175131 B1

Den aktive bestanddel suspenderes i noget af vandet (som kan være varmet), og pH-værdien justeres til ca. 11 med en opløsning af natriumhydroxid. Portionen fyldes derefter op til volumen og filtreres gennem et membranfilter af sterilise-5 ringskvalitet ned i en steril 10 ml glasampul og forsegles med sterile lukker og topsegl.

EKSEMPEL 20 10

Suppositorie mg/suppositorie 15 Aktiv bestanddel (63pm) 250

Hirdt fedt, BP 1770 2002 20 En femtedel af det hårde fedt smeltes i en dampkappegryde ved højst 45°C. Den aktive bestanddel sigtes gennem en 200 μπι sigte og sættes til den smeltede basis under blanding under anvendelse af en højforskydningsomrører indtil der opnås en jævn dispersion. Idet blandingen holdes ved 45°C tilsættes det resterende hårde fedt til suspensionen og omrøres til at sikre en homogen blanding. Hele 25 suspensionen passeres gennem et 250 μίτ» rustfrit stålnet og får under kontinuerlig omrøring lov til at afkøle til 40°C. Ved en temperatur på 38-40°C fyldes 2,02 g af blandingen i passende 2 ml plastforme. Suppositorierne får lov at køle af til stuetemperatur. 1 37 DK 175131 B1 EKSEMPEL 21 - Antiviral aktivitet (A) Anti-HIV-assay 5 Forbindelser med formlen I blev screenet for anti-HIV-aktivitet ved National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland (FCRF), USA. Nedenstående er de for tiden eksi-sterende operationelle screeningsprocedurer, som anvendes ved FCRF. Protokollen består af 3 områder, nemlig (I) fremstilling af inficerede celler og fordeling til testpladerne, (II) fremstilling af stoffortyndings-10 plader og fordeling til testpladerne og (III) XTT-assay-procedure. Se D.A. Scudi-ero et al., "A New Simplified Tetrazolium Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture," Cancer Res., 48, 4827 (1988).

I. Infektion og distribution af ATH8-celler til mikrotiterbakker 15

Celler, som skal inficeres, (en normal lymfoblastoid cellelinie, som udtrykker CD4) anbringes i 50 ml koniske centrifugerør og behandles i 1 time med 1-2 pg/ml polybren ved 37°C. Cellerne pelleteres derefter i 8 minutter ved 1200 omdrejninger pr. minut. HIV-virus, fortyndet 1:10 i medier (RMP1-1640, 10% humant 20 serum eller 15% føtalt kalveserum (FCS) med IL-2 og antibiotika) tilsættes til at give en MOI på 0,001. Medium alene sættes til virusfri kontrolceller. Idet der antages en infektiøs virustiter på 10'4, repræsenterer en MOI på 0,001 8 infek-tiøse viruspartikler pr. 10.000 celler. Ca. 500.000 celler/rør udsættes for 400 μΙ af virusfortyndingen. Den resulterende blanding inkuberes i 1 time ved 37°C i luft-25 C02. De inficerede eller uinficerede celler fortyndes til at give 1 x 10'4 (med humant serum) eller 2 x 10'4 (med føtalt kalveserum) celler/100 μΙ.

Inficerede eller uinficerede celler (100 μΙ) fordeles til passende brønde i en mikrotiterplade med 96 U-bundede brønde. Hver forbindelsesfortynding afprøves i 30 dobbelbestemmelse med inficerede celler. Uinficerede celler undersøges for stof-følsomhed i en enkelt brønd for hver fortynding af forbindelse. Stoffri kontrolceller, inficerede og uinficerede, køres i tredobbelt bestemmelse. Brøndene B2-G2 tjente som reagenskontroller og modtog kun medium. Pladerne inkuberes ved 3°C i luft-CC>2 indtil stoffet tilsættes.

35 38 DK 175131 B1 II. Stoffortynding og -tilsætning

Fortyndingsplader (mikrotiterplader med 96 fladbundede brønde) behandles natten over med phosphatbufret saltvand (PBS) eller medium indeholdende mindst 5 1% FCS eller 1% humant serum (afhængigt af det ved testen anvendte medium) og begyndende dagen før assayet. Denne "blokerings”-procedure anvendes til at begrænse adsorptionen af lægemiddelstof til mikrotiterbakken under fortyndingsprocessen.

10 Brøndene fyldes fuldstændigt med blokeringsopløsningen og får lov at henstå ved stuetemperatur i et befugtet kammer i et stinkskab.

Fortyndingsprocessen begyndes med først at fortynde testforbindelsen 1:20. Blokerede fortyndingsplader præpareres ved at slå blokeringsopløsningen ud og 15 duppe tør på steril gaze. Alle brønde på hver plade fyldes derefter med 225 μΙ af det relevante medium under anvendelse af et Cetus væskehåndteringssystem.

25 mikroliter (25 μΙ) af hver 1:20 fortyndet forbindelse sættes derefter manuelt til række A på en blokeret og fyldt fortyndingsplade. Fire forbindelser, tilstrækkeligt til at forsyne to testplader, tilsættes pr. fortyndingsplade. De fire forbindelser 20 fortyndes derefter serielt 10 gange fra række A til og med række H under anvendelse af Cetus væskehåndteringssystemet. Udgangsfortyndingen for hver forbindelse i række A er på dette tidspunkt 1:200. Fortyndingspladerne opbevares på is indtil der er brug for dem. 1 2 3 4 5 6 35

Under anvendelse af en multikanals pipetrør med 6 mikrotips overføres 100 μΙ af 2 hver stoffortynding til testpladen, som allerede indeholder 100 μΙ mediumpluscel- 3 ler. Den endelige fortynding, i testpladen, begynder ved 1:400 (brønde B4 til og 4 med G4). Denne fortynding (til 0,25% DMSO) forhindrer DMSO-bæreren i at for 5 styrre cellevæksten. Stoffrie inficerede eller uinficerede celler (brønde B3 til og 6 med G3) og reagenskontroller (B2 til og med G2) modtager medium alene. De sidste to forbindelser overføres derefter fra brøndene H7 til og med H12 til en anden testplade under anvendelse af samme procedure. Testpladerne inkuberes ved 37°C i luft-CC>2 i 7-14 dage eller indtil viruskontroller er lyserede som bestemt makroskopisk.

39 DK 175131 B1 III. Kvantificering af viral cytopathogenitet og stofaktivitet A. Materialer 5 1. En opløsning af 2i3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5.[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid. (XTT) - 1 mg/ml opløsning i medium uden FCS. Opbevar ved 4°C. Fremstilles hver uge.

Phenazinmethosulfonat (PMS) stamopløsning - denne kan fremstilles og opbeva-10 res frossen ved -20°C indtil brug. Den bør fremstilles i PBS til en koncentration pi 15,3 mg/ml.

B. Mikrokultur- tetrazoliumassay (MTA) 15 1. Fremstilling af XTT-PMS-opløsning - XTT-PMS fremstilles umiddelbart før tilsætning til brøndene i dyrkningsbakken. PMS-stamopløs-ningen fortyndes 1:100 (0,153 mg/ml). Der sættes tilstrækkelig fortyndet PMS til hver ml XTT til at give en endelig PMS-koncentration pi 0,02 mM. En 50 μΙ portion af XTT-PMS-blandin-gen sættes til hver af de relevante brønde, og pladen inkuberes i 4 timer ved 20 37°C. Pladelågene fjernes og erstattes med selvklæbende pladeforseglere (Dyna-tech cat 001-010-3501). Den forseglede plade rystes på en mikrokulturpladery-ster, og absorbansen bestemmes ved 450 nm.

IV: Resultater 25

De opnåede data blev plottet som en procentandel af testceller over inficerede celler (%) for både inficerede og uinficerede celler som en funktion af den stigende koncentration af testforbindelsen. Sådanne plots tillader beregnet af en effektiv koncentration (EC50) hvad angår inficerede celler, en inhiberende koncentration 30 (IC50) med hensyn til normalt celler og et terapeutisk indeks (TI50).

De inhiberende koncentrationer (i Mg/ml) over for HIV bestemt som beskrevet ovenfor for forbindelserne fra eksemplerne 7, 9 10, 11 og 14(b) er vist i tabel 1.

40 DK 175131 B1

Tabel 1

Forbindelse Eksempel Cellelinie ED50 ID50 TI50 5 9a 7 MT-2 2,3 50 21,4 13a 9 MT-2 0,41 6,97 17,3 14a 10 MT-2 0,15 100 667 15a 11 MT-2 2,9 > 125 > 42,7 (-) 14a 14 (b) CEM 0,66 189 284 10 __

Forbindelserne fra eksempel 5 og 8 udviste også antiviral aktivitet ved denne screening.

15 Et tidligere assay udført på forbindelsen fra eksempel 10 ved Southern Research Institute gav en TI50 pi ca. 200, når MT-2-celler blev dyrket med H9/HILV-IIIB.

(B) Aktivitet mod katteleukæmivirus 20 Antiviral screening for aktivitet mod FeLV-FAIDS blev udført i 96-brøndes plader (Corning) under anvendelse af 81C-indikatorceller i Iscove’s modificerede Dulbec-co's medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS). 20 timer inden assayet blev pladerne podet med 81C-cellerne ved 5 x 103 celler/-brønd. På dagen for assayet blev cellerne forbehandlet i 30 minutter ved 37°C 25 med DEAE-dextran (25 ng/ml) i 0,1 ml Hanks balancerede saltopløsning. Denne blev fjernet, hvorefter der til hver brønd blev sat 0,1 ml vækstmedium indeholdende 32 TCID50 FeLV-FAIDS eller 0,1 ml vækstmedium alene. Viruset fik lov at absorbere i 1 time, hvorefter 0,1 ml test- eller positiv kontrolforbindelse (2',3’-dideoxycytidin; ddC) eller vækstmedium blev tilsat. Plader blev inkuberet ved 30 37eC. Celler fik tilført frisk vækstmedium indeholdende forbindelse på dag 4 efter infektion. Dyrkningsmedium blev udskiftet fuldstændigt og erstattet med frisk medium indeholdende forbindelse på dag 7 efter infektion. På dag 10 efter infektion blev cellerne fikseret med formalin, farvet med 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 og observeret mikroskopisk med hensyn til CPE og stofcytotoxicitet.

35 41 DK 175131 B1

Forbindelsen fra eksempel 10 havde en ED50 på 1,9 pg/ml.

(C) Aktivitet mod murin AIDS

5 Falcon 6-brøndes vævskulturplader blev podet med 1,75 x 105 celler pr. brønd i et totalt volumen pi 2,5 ml EMEM indeholdende 5% varmein-aktiveret FBS. 20 timer efter podning med cellerne blev mediet dekanteret fra, og 2,5 ml DEAE-dextran (25 ng/ml i phosphatbufret saltvand) blev sat til hver brønd. Kulturerne blev inkuberet ved 37°C i 1 time, hvorefter DEAE-dextranopløsningen blev dekanteret fra, 10 og cellelagene blev vasket én gang med 2,5 ml PBS. Normale cellekontrol-ler blev genfodret med 2,5 ml medium alene (ingen virus eller stof). Stofkon-trolkulturer modtog 2,5 ml medium indeholdende stof men ingen virus. Virusinficerede kontrolkulturer modtog 0,5 ml af den relevante fortynding af CAS-BR-M-stamkultur til at give tællelige plaques plus 2,0 ml medium. Testprøverne modtog 0,5 ml af den 15 relevante virusfortynding plus 2,0 ml medium af stoffortyndingen. Seks koncentrationer af testforbindelsen fortyndet i serielle halv-logio-fortyndinger blev afprøvet. Tre koncentrationer af det positive kontrolstof, ddC blev afprøvet. Tredobbelte brønde for hver koncentration af testforbindelse og 6 virus- og 6 cellekon-trolkulturer blev inkluderet i hvert assay. På dag 3 efter virusinokulering blev toxi-20 citeten af stoffet over for SC-l-cellerne bestemt ved mikroskopisk undersøgelse af farvede celle- og stofkontrolduplikatkulturer. De tilbageværende test- og kontrolkulturer blev bestrilet med en ultraviolet lampe i 20 sekunder, og XC-celler blev sat til hver kultur (5 x 105 celler/brønd i 2,5 ml EMEM indeholdende 10% varme-inaktiveret FBS). På dag 3 efter UV-bestråling blev kulturerne fikseret med forma-25 lin og farvet med krystalviolet. Plaquene blev talt ved hjælp af et dissektionsmikroskop.

Antiviral aktivitet i CAS-BR-M plaquereduktionen blev udtrykt som reduktionen i det gennemsnitlige antal plaques talt i de stofbehandlede, virusinficerede kulturer 30 sammenlignet med det gennemsnitlige antal plaques talt i de ubehandlede, virus-inficerede kontrolkulturer (procent af kontrol). Forbindelsen fra eksempel 10 havde en EDso på 1,1 ng/ml.

42 DK 175131 B1 (D) Aktivitet mod aberetrovirus SAIDS (SRV-2)

Antiviral screening mod SAIDS-viruset (D/Washington) blev udført ved et syncy-tia-inhiberingsassay på Raji-celler. Stoffet blev fortyndet i komplet Iscove’s me-5 dium, hvorefter 100 μΙ af hver fortynding blev sat til de relevante brønde på en 96*brøndes plade. Aktivt voksende Raji-celler, 5 x 10V43 celler i 50 μΙ komplet Iscove's medium, blev derefter sat til hver brønd. Dette blev efterfulgt af tilsætning af 50 μΙ klaret supernatant fra en SRV-2/Raji-celle co-kultur. DDC blev inkluderet i dette assay som det positive kontrolstof. Plader blev inkuberet ved 37°C i 10 en befugtet atmosfære indeholdende 5% C02. Syncytia blev talt på dag 7 efter infektion. Stoftoxicitet blev fastslået ved at sammenligne tællinger af levedygtige celler for den uinficerede, stofbehandlede prøve med levedygtigheden af den uin-ficerede, ubehand-lede kontrol. Forbindelsen fra eksempel 10 havde en ED50 på 2,8 Mg/ml.

15 (E) Aktivitet mod Visna Maedi Virus

Den antivirale aktivitet mod Visna Maedi Virus (VMV), stamme WLC-1, blev bestemt ved at måle reduktionen af virusspecifik immunohistokemisk farvning. Mo-20 nolag af choroid plexus celler fra får blev inficeret med VMV og overlagt med serielle fortyndinger af testforbindelser. Efter inkubering i 5 dage blev monolagene inkuberet yderligere med virusspecifikke antisera konjugeret til peberrodsperoxi-dase (Horse Radish Peroxidase, HRP). Efterfølgende inkubering af monolagene med et kromogent substrat fra HRP indfarver områder med virusreplikation. Disse 25 diskrete punkter blev talt, og koncentrationen af testforbindelse, som var nødvendig til at reducere antallet af punkter til 50% af antallet for stofubehandlede kontroller, blev beregnet.

Forbindelsen fra eksempel 13 havde en EDs0 på 0,2 pg/ml.

30

Claims (11)

1. 5 Forbindelserne fra eksemplerne 5, 7 og 8 udviste cytotoxisk aktivitet ved afprøvning mod P388 museleukæmicellekulturassay som beskrevet af R .G. Alonquist og R. Vince, J. Med. Chem, 16, 1396 (1973). De opnåede EDS0-vaerdier pg/ml var: Eksempel 5 12
2. 10 Eksempel 7 40 Eksempel 8 3 15 1. 4-(9H-Purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinoler med den almene formel I ! ·. 20 /γ\ i ! > i / w / \ / Z N N H0-CH2 hvor X er hydrogen, NRR\ SR, OR eller halogen; 30. er hydrogen, OR2 eller NRR1; R, R1 og R2 kan være ens eller forskellige og er valgt blandt hydrogen, Ci-4-alkyl og aryl; og farmaceutisk acceptable derivater deraf, eller farmaceutisk acceptable estere deraf valgt blandt DK 175131 B1 carboxysyreestere, i hvilke ikke-carbonyldelen af estergruppen er hydrogen, Ci-ie-alkyl, Ci-ie-alkoxy-Cj-ie-alkyl, aryl-Ci.4-alkyl, aryloxy-CWalkyl eller eventuelt med halogen, Q-4-alkyl eller C^-alkoxy substitueret aryl; Cj-ie-alkyl- eller aryl-Ci-4-alkylsulfonylestere; 5 aminosyreestere eller triphosphatestere, eller farmaceutisk acceptable salte af sådanne estere.
3. 2. Forbindelse med formlen I ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 2 er H, OH eller NH2, fortrinsvis NH2. 10
4. 3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at X er hydrogen, chlor, NH2, SH eller OH, fortrinsvis NH2, især OH.
5. 4. Forbindelse valgt blandt (la,4a)-4-(6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(6-mercapto-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol; 20 (la,4a)-4-(2-diamino-9H-purin-9-yl)-2-cydopentenylcarbinol; (la,4a)-4-(2-amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; og (la,4a)-4-(2-amino-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol. 5. (la,4a)-4-(2-Amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-2-cyclopentenylcarbinol; 25
6. 6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at den er i form af i det væsentlige en racemisk blanding. 1
7. 7. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at den består i det væsentlige af én optisk isomer, fortrinsvis D-isomeren. DK 175131 B1
8. 8. Forbindelse med formlen I som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-7 eller et farmaceutisk acceptabelt derivat deraf til anvendelse som aktivt terapeutisk middel.
9. 9. Forbindelse med formlen I som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-7 ved fremstilling af et lægemiddel til behandling af en viral infektion.
10. 10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse som defineret i et hvilket 10 som helst af kravene 1-7 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer derfor.
11. 11. Forbindelse med den almene formel II ί 15 Λ Λ N · I i ΛΛ. 20 \_y hvor X er hydrogen, NRR1, SR, OR, halogen eller beskyttende former deraf; Y er OH eller en beskyttet form deraf; 25. er hydrogen, OR2, NRR1 eller beskyttede former deraf; R, R1 og R2 kan være ens eller forskellige og er valgt blandt hydrogen, Ci-4-alkyl og aryl; og farmaceutisk acceptable derivater deraf, eller farmaceutisk acceptable estere deraf valgt blandt 30 carboxysyreestere, i hvilke ikke-carbonyldelen af estergruppen er hydro gen, Ci-ie-alkyl, Ci-ie-alkoxy-Ci-ie-alkyl, aryl-Ci-4-alkyl, aryloxy-Ci-4-alkyl eller eventuelt med halogen, Ci-4-alkyl eller Ci-4-alkoxy substitueret aryl; Ci-ie-alkyl- eller aryl-Ci.4-alkylsulfonylestere; aminosyreestere eller triphosphatestere, 35 eller farmaceutisk acceptable salte af sidanne estere.