DK175248B1 - Et förste og andet oligonukleotid og anvendelse deraf til eksponentiel multiplicering ved polymerase-kædereaktion af en specifik nukleinsyresekvens indeholdt i en enkelt- eller dobbeltstrenget nukleinsyre eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer - Google Patents

Description

i DK 175248 B1

Den foreliggende opfindelse angår et første og et andet enkeltstrenget oligonukleotid, der tillader eksponentiel multiplikation af eksisterende nukleinsyresekvenser og vedhæftning af en promotorsekvens ved polymerase-kædereaktion. Opfindelsen angår nærmere bestemt oligonukleotider der er anvendelige i en fremgangsmåde til at frembringe 5 en hvilken som helst bestemt nuklemsyresekvens ud fra en given sekvens af DNA eller RNA i mængder, som er store sammenlignet med den oprindeligt tilstedeværende mængde. DNA'et og RNA'et kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget og kan være forholdsvis rene former eller en komponent af en blanding af nukleinsyrer. Oligonukleotiderne udnytter en gentagen reaktion for at udføre multiplikationen af 10 den ønskede nukleinsyresekvens og vedhæftningen af en promotorsekvens.

Navnlig til diagnostiske anvendelser kan mål-nukleinsyresekvensen bare være en lille mængde af det DNA eller RNA, som er på tale, således at det kan være vanskeligt at påvise dets tilstedeværelse under anvendelse af ikke-isotopisk mærkede eller 15 endemærkede oligonukleotidprober. Der udfoldes store anstrengelser for at forøge følsomheden hos probedetektionssystememe, men der er udført liden forskning vedrørende multiplikation af målsekvensen, således at den er til stede i mængder, som er tilstrækkelig til let at blive påvist under anvendelse af nuværende tilgængelige metoder.

20

Der er blevet beskrevet adskillige metoder i litteraturen til syntese af nukleinsyrer de novo eller ud fra en eksisterende sekvens. Med disse metoder er man i stand til at frembringe store mængder af en given nukleinsyre med en fuldstændig specificeret sekvens.

25 Én kendt metode til syntetisering af nukleinsyrer de novo involverer organisk syntese af en nukleinsyre ud fra nukleosidderivater. Denne syntese kan udføres i opløsning eller på et fast bæremateriale. En type organisk syntese er phosphotriestermetoden, som er blevet anvendt til at fremstille genfragmenter 30 eller korte gener. I phosphotriestermetoden fremstilles oligonukleotider, som kan knyttes sammen til dannelse af længere nukleinsyrer. For en beskrivelse af denne metode se Narang, S.A. et al., Meth. Enzvmol.. 68. 90 (1979) og US patent nr.

4.356.270. I patentbeskrivelsen omtales syntesen og kloningen af somatostatingenet. 1

En anden type organisk syntese er phosphodiestermetoden, som er blevet anvendt til at fremstille et tRNA-gen. Se Brown, E. L. et al., Meth. Enzymoi.. 68f 109 (1979) for en beskrivelse af denne metode. Som ved phosphotriestermetoden

I 2 DK 175248 B1 I

I involverer phosphodiestermetoden syntese af oligonukleotider, som derefter knyttes I

sammen til dannelse af den ønskede nukleinsyre. I

I Skønt de ovenfor nævnte metodertil de novo syntese kan anvendes til at syntetisere lange I

I 5 strenge af nukleinsyre, er de ikke særligt praktiske at anvende til syntese af store mængder I

afen nukleinsyre. Begge processer er arbejdskrævende og tidsrøvende, kræver dyrt I

I udstyr og dyre reagenser og har en lav samlet effektivitet. Den lave samlede effektivitet I

I kan skyldes ineffektiviteten i syntesen af oligonukleotiderne og sammenføjnings- I

I reaktionerne. Ved syntesen af en lang nukleinsyre eller endog ved syntesen af en stor I

I 10 mængde af en kortere nukleinsyre vil det være nødvendigt at syntetisere mange I

I oligonukleotider, og der er behov for mange sammenføjningsreaktioner. Følgelig ville disse I

I metoder ikke være praktiske til syntetisering af store mængder af en hvilken som helst I

I ønsket nukleinsyre. I

I 15 Der findes også metoder til fremstilling af nukleinsyrer i store mængder ud fra små I

I mængder af den oprindeligt eksisterende nukleinsyre. Disse metoder involverer kloningen af I

I en nukleinsyre I et hensigtsmæssigt værtssystem, hvor den ønskede nukleinsyre indsættes i I

I en egnet vektor, som anvendes til at transformere værten. Nar værten dyrkes, replikeres I

I vektoren, og dermed frembringes flere kopier af den ønskede nukleinsyre. For en I

I 20 kort beskrivelse af subkloning af nukleinsyrefragmenter se Maniatis T. et al., Molecular I

I Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, s. 390-401 (1982). I

I Se også de metoder, der er beskrevet i beskrivelsen til US patenterne nr. 4.416.988 og I

I nr. 4.403.036. I

25 En tredie metode til syntetisering af nukleinsyrer, som er beskrevet i US patent nr. I

I 4.293.652, er en hybrid af den ovenfor beskrevne organiske syntese og molekylær I

I kloning. Ved denne fremgangsmåde fremstilles det hensigtsmæssige antal oligonukleotider til I

I at udgøre den ønskede nukleinsyresekvens ved organisk syntese og indsættes sekventielt i I

I en vektor, som multipliceres ved dyrkning forud for hver efterfølgende indføjelse. I

I 30 I

I The Pharmacia Catalog "Molecular Biologicals" (1984) beskriver "Gene Cartridges", dvs. I

dobbeltstrengede restriktionsfragmenter, der indeholder en trp-promotor/operator. Dette I

I dokument beskriver imidlertid ikke anvendelsen af disse fragmenter til multiplikation af en I

I nukleinsyresekvens, og selv hvis fragmenterne blev anvendt til multiplikation, tillader I

35 fragmenterne ikke vedhæftning af en promotorsekvens i den ene ende af den multiplicerede I

I nukleinsyre. I

3 DK 175248 B1

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har nogen lighed med den molekylære kloningsmetode; den involverer imidlertid ikke opformering af nogen organisme og undgår derved de mulige risici, der er forbundet hermed, eller den ulejlighed, som dette giver. Ved den foreliggende opfindelse kræves ej heller syntese af nukleinsyre-5 sekvenser, som ikke er beslægtede med den ønskede sekvens, og man undgår dermed med den foreliggende opfindelse behovet for en omfattende oprensning af produktet fra en kompliceret biologisk blanding.

Den foreliggende opfindelse angår et første og et andet enkeltstrenget oligonukleotid 10 (primer), der tillader eksponentiel multiplikation ved polymerase-kædereaktion af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser til stede i en nukleinsyre, eller i en blanding deraf, og vedhæftning afen promotorsekvens. Forlængelsesproduktet af én primer bliver, når den hybridiseres til den anden, en template for fremstillingen af den ønskede specifikke nukleinsyresekvens og vice versa, og fremgangsmåden gentages så ofte 15 som nødvendigt for at frembringe den ønskede mængde af sekvensen. Det forventes, at denne fremgangsmåde er mere effektiv end metoder, der er beskrevet ovenfor, til fremstilling af store mængder af nukleinsyre ud fra en mål-sekvens og til at frembringe en sådan nukleinsyre i en tidsperiode, der til sammenligning er kort.

Den foreliggende fremgangsmåde er navnlig nyttig til multiplikation af sjældne 20 nukleinsyrer til stede i en blanding af nukleinsyrer til effektiv påvisning af sådanne former.

I Kleppe et al., J. Mol. Biol. 56: 341 (1971), beskrives en fremgangsmåde til syntetisering af DNA under anvendelse af primer-igangsættende, template-ledende repair replikation, og 25 det foreslås at replikationscykler kan gentages ved hver gang at tilføre en frisk dosis DNA-polymerase. Der er imidlertid ingen antydning af at primer-forlængelsesprodukter skal være komplette nok til at være i stand til at danne stabile primer-template-komplekser med henblik på at fungere som templates for primere i efterfølgende runder af primerforlængelse, og at eksponentiel in vitro-multiplication kun er mulig 30 ved at danne danne sådanne komplekser, som fungerer som komplette templates i efterfølgende runder.

Nærmere bestemt tilvejebringer den foreliggende opfindelse et første og et andet enkeltstrenget oligonukleotid, der tillader eksponentiel multiplikation ved polymerase-35 kædereaktion af en specifik nukleinsyresekvens indeholdt i en enkeltstrenget eller dobbeltstrenget nukleinsyre, eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer, hvor:

I DK 175248 B1 I

4 I

(a) det første enkeltstrengede oligonukleotid er i det væsentlige komplementært til I

I den enkeltstrengede nukleinsyre eller til den ene streng i den dobbeltstrengede I

I nukleinsyre; I

I (b) det andet enkeltstrengede oligonukleotid er i det væsentlige komplementært til I

I 5 et komplement af den enkeltstrengede nukleinsyre eller til den anden streng i I

I den dobbeltstrengede nukleinsyre; I

I (c) det ene af de enkeltstrengede oligonukleotider yderligere indeholder en I

I sekvens, som er ikke-komplementær til nukleinsyren, hvilken sekvens er en I

I promotorsekvens; og I

I 10 (d) de dele af oligonukleotiderne, der er i det væsentlige komplementære, I

I afgrænser enderne af den specifikke nukleinsyresekvens, der skal I

I multipliceres. I

I Europæisk patent nr. 200 362 beskriver fremgangsmåder til påvisning og I

I 15 kloning af multiplicerede nukleinsyresekvenser, hvor disse sekvenser er blevet I

multipliceret ved at anvende fremgangsmåden i den foreliggende ansøgning, I

I og den foreliggende ansøgning er en afdelt ansøgning af europæisk ansøgning I

I nr. 86 30 2299.2. I

20 Oligonukleotiderne i den foreliggende opfindelse kan være nyttige til ikke bare at I

frembringe store mængder af en eksisterende nukleinsyre med fuldstændig I

specificeret sekvens, men også til fremstilling af nukleinsyresekvenser, som vides I

at eksistere, men som ikke er fuldstændig specificerede, og til efterfølgende I

I transkription af den multiplicerede nukleinsyre skal en begyndelseskopi af I

I 25 sekvensen, som skal multipliceres, være tilgængelig i hvert tilfælde, omend det ikke I

I behøver at være et rent eller et særskilt molekyle. I

I Fig.l viser en 94 basepar lang sekvens af human β-globin, som ønskes I

multipliceret. Den enkeltbasepar-ændring, som er forbundet med seglcelleanæmi, er I

I 30 afbildet under 94-meren. I

I Fig. 2 viser et autoradiogram af polyacrylamidgelelektroforese, som viser I

I multiplikation af 94-meren indeholdt i human vildtype-DNA og i et plasmid, der I

I indeholder et 1,9 kb langt BamHI fragment af det normale β-globingen {betegnet I

I 35 pBR328:HbA). I

I Fig. 3 viser et autoradiogram af polyacrylamidgelelektroforese demonstrerende I

I multiplikation af en hvilken som helst af den specifikke 94-mere målsekvens til I

5 DK 175248 B1 stede i pBR328:HbA, et plasmid, indeholdende, et 1,9 kb langt BamHI-fragment af seglcelleallelet af β-globin (betegnet pBR328:HbS), pBR328:HbA, hvor den sekvens, der skal multipliceres, er spaltet med MstH. og pBR328:HbS, hvor den sekvens, som skal multipliceres, er blevet behandlet med, men ikke spaltet med 5 Mitll.

Fig. 4 viser i detaljer trinnene og produkterne fra polymerasekædereaktionen til multiplikation af den ønskede 94-mere sekvens af human β-globin i 3 cyklusser under anvendelse af to oligonukleotidprimere.

10

Fig. 5 viser et autoradiogram af polyacrylamidgelelektroforese, som viser multiplikation efter 4 cyklusser af en 240-mer sekvens i pBR328:HbA, hvor delprøverne er fordøjet med [Mcol (bane 3), MstH (bane 4) eller Hinfl (bane 5). Bane 1 er molekylvægtsstandarden, og bane 2 indeholder det intakte 240 bp lange 15 produkt.

Fig. 6 viser sekvensen af det normale (βΑ) β-globingen og seglcelle (βδ) β-globingen i området med Ddel og Hinfl restriktionssteder, hvor den enkelte understregning for βΑ markerer positionen af Ddel-restriktionsstedet (CTGAG), og dobbeltunder-20 stregningen for βΑ og β" markerer positionen for Hinfl-restriktionsstedet (GACTC).

Fig. 7 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af normal β-globin under anvendelse afen 40-merprobe og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af Hinfl-restriktionsenzvmet.

Fig. 8 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af seglcelle β-globin under anvendelse af 25 den samme 40-mere probe som i fig. 7 og Ddel-restriktionsenzvmet efterfulgt af Hinfl-restriktionsenzymet.

Fig. 9 viser et autoradiogram af polyacrylamidgelelektroforese, som viser anvendelsen af den samme 40-mere probe som i fig. 7 til specifik at karakterisere beta-globinallelerne til stede 30 i prøver af hel, human DNA, som er blevet udsat for multiplikation ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Fig. 10 viser et fotografi af en 6% NuSieve agarosegel visualiseret ved anvendelse af ethidiumbromid og UV-lys. Dette fotografi demonstrerer multiplikationen af et sub-fragment af 35 et 110-bp langt multiplikationsprodukt, hvilket sub-fragment er et indre indskudt sæt i det 110-bp lange fragment.

I DK 175248 B1 I

6 I

I Udtrykket "oligonukleotid" som anvendt her under reference til primere, prober, I

oligomerfragmenter, som skal påvises, oligomerkontroller og umærkede blokerende I

I oligomerer, defineres som et molekyle, der omfatter 2 eller flere deoxyribonukleotider eller I

I ribonukleotider, fortrinsvis flere end tre. Dets nøjagtige størrelse vil afhænge af I

I 5 mange faktorer, som igen anhænger af den endelige funktion eller anvendelse af I

I oligonukleotidet. I

I Som anvendt her refererer udtrykket "primer” til et oligonukleotid, hvad enten dette I

I forekommer naturligt som i en oprenset restriktionsfordøjelse eller er produceret I

10 syntetisk, som er i stand til at fungere som et initieringspunkt for syntese, når den I

anbringes under betingelser, hvorved syntesen af et primerforlængelsesprodukt, som er I

komplementært til en nukleinsyrestreng, induceres, dvs. i tilstedeværelse af nukleotider I

og et induceringsmiddel, såsom DNA-polymerase, og en egnet temperatur- og pH-værdi. I

I Primeren er fortrinsvis enkeltstrenget for at opnå maximal effektivitet ved multiplikation, I

15 men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis primeren er dobbeltstrenget, skal den først I

I behandles for at separere dets strenge forud for at den anvendes til at frembringe I

I forlængelsesprodukter. Primeren er fortrinsvis et oligodeoxyribonukleotid. Primeren må I

I være tilstrækkelig lang til at prime syntesen af forlængelsesprodukter i nærværelse af I

I induceringsmidlet. De nøjagtige længder af primerne vil afhænge af mange faktorer, I

I 20 inklusiv temperatur, primerkilde og anvendelse af metoden. Til f.eks. diagnostiske I

I formål indeholder oligonukleotidprimeren afhængig af kompleksiteten af målsekvensen I

I typisk 15-25 eller flere nukleotider, skønt den kan indeholde færre nukleotider. For de I

andre anvendelser er oligonukleotidprimeren typisk kortere, f.eks. 7-15 nukleotider. I

I Sådanne korte primermolekyler kræver almindeligvis lavere temperaturer til at danne I

I 25 tilstrækkeligt stabile hybridkomplekser med templaten. I

Her udvælges primerne til at være "i alt væsentligt" komplementære til de I

I forskellige strenge af hver specifik sekvens, som skal multipliceres. Dette betyder, I

I at primerne skal være tilstrækkeligt komplementære til at hybridisere med deres I

I 30 respektive strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke at afspejle den I

I nøjagtige sekvens af templaten. I

I En af primerne der anvendes til multiplikation indeholder yderligere en I

I promotorsekvens, som er ikke-komplementær til den sekvens der ønskes I

I 35 multipliceret. Ikke-komplementære baser eller længere sekvenser være fordelt i I

primeren, forudsat at primersekvensen har tilstrækkelig komplementaritet med I

I sekvensen af den streng, der skal multipliceres, til at hybridisere hermed og I

DK 175248 B1 derved danne en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer.

Som anvendt her refererer udtrykkene "restriktionsendonukleaser" og 5 "restriktionsenzymer'' til bakterieenzymer, som hver skærer dobbeltstrenget DNA ved eller nær en specifik nukleotidsekvens.

Som anvendt her refererer udtrykket "DNA-polymorfi" til den tilstand, i hvilken to eller flere forskellige nukleotidsekvenser kan eksistere på et bestemt sted i 10 DNA'et.

Udtrykket "restriktionsfragmentlængdepolymorfi" ("RFLP") refererer til forskellene hos individer i længderne af restriktionsfragmenter dannet ved fordøjelse med en bestemt restriktionsendonuklease.

15

Anvendelsen af den foreliggende opfindelse involverer enkeltstrengede oligonukleotider, der er anvendelige i en fremgangsmåde til eksponentiel multiplikation ved polymerase-kædereaktion af enhver af én eller flere ønskede specifikke nukleinsyresekvenser, som er at finde i en nukleinsyre, og til vedhæftning af en 20 promotorsekvens. Eftersom store mængder af en specifik sekvens kan fremstilles ved den foreliggende fremgangsmåde, kan den foreliggende opfindelse anvendes til at forbedre effektiviteten af kloning af DNA eller mRNA og til multiplikation af en målsekvens for at lette påvisningen af denne. Den foreliggende opfindelse er også nyttig til opnåelse af store mængder af den ønskede sekvens ud fra en 25 blanding af nukleinsyrer fremkommende ved en ikke-perfekt kemisk syntese.

Generelt kan de enkeltstrengede oligonukleotider ifølge den foreliggende opfindelse anvendes i en fremgangsmåde, som involverer en kædereaktion til i eksponentielle mængder i forhoid til antallet af de involverede reaktionstrin at frembringe i det 30 mindste én specifik nukleinsyresekvens forudsat at (a) enderne af den krævede sekvens er kendte i tilstrækkelige detaljer til, at der kan syntetiseres oligonukleotider, som vil hybridisere hertil, (b) at en lille mængde af sekvensen er tilgængelige til at initiere kædereaktionen. Produktet fra kædereaktionen vil være en særskilt nukleinsyreduplex med termini svarende til enderne af de anvendte 35 specifikke primere.

Der kan anvendes en hvilken som helst kilde af nukleinsyre, i renset eller ikke-renset form, som udgangsnukleinsyren eller -syrerne, forudsat at den indeholder

I DK 175248 B1 I

8 I

eller mistænkes for at indeholde den ønskede, specifikke nukleinsyresekvens. I

I Der kan således ved fremgangsmåden f.eks. anvendes DNA eller RNA, inklusiv I

mRNA, hvilket DNA eller RNA kan være enkeltstrenget- eller dobbeltstrenget. I

Ydermere kan der anvendes en DNA-RNA-hybrid, som indeholder en streng af I

5 hver. Der kan også anvendes en blanding af hvilke som helst af disse I

nukleinsyrer, eller der kan også anvendes nukleinsyrer frembragt ved en I

I tidligere multiplikationsreaktion som her beskrevet under anvendelse af den I

I samme eller forskellige primere. Den specifikke nukleinsyresekvens, som skal I

I multipliceres, kan være blot en fraktion af et større molekyle eller kan være til I

I 10 stede i begyndelsen som et særskilt molekyle, således at den specifikke sekvens I

I udgør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendigt, at den sekvens, der skal I

I multipliceres, er til stede initielt i en ren form; den kan være en mindre fraktion af I

I en kompleks blanding, såsom en del af β-globingenet indeholdt i hel, human DNA, I

I eller en del af nukleinsyresekvensen hidrørende fra en bestemt mikroorganisme, I

I 15 hvilken organisme måske blot udgør en meget lille fraktion af en bestemt biologisk I

I prøve. Udgangsnukleinsyren kan også indeholde flere end den ønskede, I

specifikke nukleinsyresekvens, som kan være den samme eller forskellig. De I

I foreliggende oligonukleotider er derfor ikke blot nyttig til frembringelse til store I

mængder af en specifik nukleinsyresekvens, men også til samtidig multiplikation I

I 20 af flere end én forskellig, specifik nukleinsyresekvens lokaliseret på den I

I samme eller forskellige nukleinsyremolekyler. I

I Nukleinsyren eller-syrerne kan opnås fra en hvilken som helst kilde, f.eks. fra plasmider I

I såsompBR322, fra klonet DNA eller RNA, eller fra naturlig DNA eller RNA fra enhvilken I

I 25 som helst kilde, inklusiv bakterier, gær, vira eller højere organismer, såsom planter I

I eller dyr. DNA eller RNA kan ekstraheres fra blod, vævsmateriale, såsom chorion-villi, I

I eller fra amniumceller ved en række metoder, såsom beskrevet af Maniatis et al., I

I Molecular Cloning. (1980), 280-281. I

I 30 Enhver specifik nukleinsyresekvens kan frembringes med oligonukleotiderne ifølge den I

I foreliggende opfindelse. Det er kun nødvendigt, at et tilstrækkeligt antal baser ved begge I

I ender af sekvensen er kendt i tilstrækkelige detaljer, således at der kan fremstilles to I

I oligonukleotider, som vil hybridisere til forskellige strenge af den ønskede sekvens I

I og ved relative positioner langs sekvensen, således at et forlængelsesprodukt I

I 35 syntetiseret ud fra en primer, kan, når den er separeret fra dens template (komplement), tjene I

som en template for forlængelse af den anden primer til en nukleinsyre med en defineret I

I længde. Jo større kendskabet til baserne i begge ender af sekvensen er, des større kan I

specificiteten for primerne for målnukleinsyresekvensen være, og des større er I

9 DK 175248 B1 effektiviteten af fremgangsmåden. Det vil forstås, at ordet "primer", som anvendt her, kan referere til mere end en primer, navnlig i det tilfælde, hvor der er nogen flertydighed vedrørende informationen med hensyn til den terminale sekvens (de terminale sekvenser) af det fragment, som skal multipliceres. F.eks. i det tilfælde, hvor en nukleinsyre-5 sekvens udledes fra proteinsekvensinformation, vil en samling af primene indeholdende sekvenser, som repræsenterer alle mulige codonvariationer baseret på degenereringen af den genetiske kode blive anvendt for hver streng. En primer fra denne samling vil være 100% homolog med enden af den ønskede sekvens, som skal multipliceres.

10 Oligonukleotidprimeme kan fremstilles under anvendelse af en hvilken som helst egnet metode, såsom f.eks. phosphotriestermetoden eller phosphodiestermetoden beskrevet ovenfor eller automatiserede udførelsesformer heraf. I én sådan automatiseret udførelsesform anvendes diethylphosphoramiditer som udgangsmaterialer og kan syntetiseres som beskrevet af Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981), 22: 1859-1862. En 15 fremgangsmåde til syntetisering af oligonukleotider på et modificeret, fast bæremateriale omtales i US patent nr. 4.458.066. Det er også muligt at anvende en primer, som er blevet isoleret fra en biologisk kilde (såsom en restriktionsend o n u kleasefordøjelse).

20 Den specifikke nukleinsyresekvens frembringes ved at anvende den nukleinsyre, som indeholder denne sekvens, som en template. Hvis nukleinsyren indeholder to strenge, er det nødvendigt at separere strengene af nukleinsyren, før den kan anvendes som template, enten i et separat trin eller samtidigt med syntesen af primerforlængelsesprodukterne. Denne strenge-separation kan opnås ved en 25 hvilken som helst egnet metode, inklusiv fysiske, kemiske eller enzymatiske metoder. En fysisk fremgangsmetode til separation af strengene af nukleinsyren involverer opvarmning af nukleinsyren, indtil den er fuldstændig (>99%) denatureret.

Typisk varmedenaturering kan involvere temperaturer liggende fra ca. 80 til 105*C i tidsperioder på fraca. ltil 10 minutter. Strenge-separation kan også 30 induceres af et enzym fra den klasse af enzymer, der er kendt som helicaser, eller enzymet RecA, som har helicaseaktivitet, og som i tilstedeværelse af riboATP vides at denaturere DNA. De reaktionsbetingelser, som er egnede til separation af nukleinsyrestrengene med helicaser, er beskrevet af Kuhn Haffmann-Berling, CSH-Ouantitative Bioloav. 42: 63 (1978) og metoder til anvendelse af RecA er opsummeret i 35 C. Radding, Ann. Rev. Genetics.. 16: 405-37 (1982).

Hvis den oprindelige nukleinsyre, der indeholder den sekvens, der skal multipliceres, er enkeltstrenget, syntetiseres dens komplement ved at tilsætte en

I 10 DK 175248 B1 I

I eller flere oligonukleotidprimerne hertil. Hvis en hensigtsmæssig enkelt-primer I

tilsættes, syntetiseres et primerforlængelsesprodukt i nærværelse af primeren, en I

I inducer eller katalysator for syntesen og de nedenfor beskrevne 4 nukleotider. I

I Produktet vil være delvis komplementært til den enkeltstrengede nukleinsyre og vil I

I 5 hybridisere med nukleinsyrestrengen til dannelse af en duplex af ulige lange I

I strenge, som derefter kan separeres i enkeltstrenge, som beskrevet ovenfor til I

I frembringelse af to enkelte, separerede komplementære strenge. Alternativt kan to I

hensigtsmæssige primere tilsættes til den enkeltstrengede nukleinsyre, og reak- I

I tionen kan udføres. I

I 10 I

I Hvis den oprindelige nukleinsyre udgør den sekvens, der skal multipliceres, vil I

I det primerforlængelsesprodukt (de primerforlængelsesprodukter), som produceres, I

I være fuldstændig komplementære til strengene af den oprindelige nukleinsyre og I

I vil hybridisere hermed til dannelse af en duplex af strenge med lige stor længde, som I

I 15 kan adskilles til enkeltstrengede molekyler. I

I Nar de komplementære strenge af nukleinsyren eller -syrerne er separeret - er strengene I

I hvad enten nukleinsyren oprindelig var dobbeltstrenget eller enkeltstrenget - parate til at I

I blive anvendt som en template for syntesen af yderligere nukleinsyrestrenge. Denne I

I 20 syntese kan udføres under anvendelse af en hvilken som helst egnet metode. Generelt set I

I foregår det i en puffret vandig opløsning, fortrinsvis ved et pH pi 7-9, mest fortrinsvis ca. I

I 8. Der tilsættes fortrinsvis et molært overskud (for klonet nukleinsyre sædvanligvis ca. I

I 1000:1 primer: template, og for genomisk nukleinsyre sædvanligvis ca. 106:1 primer: I

I template) af de to oligonukleotidprimere til pufferen indeholdende de separerede I

I 25 templatestrenge. Det skal imidlertid forstås, at mængden af komplementær streng måske I

ikke er kendt, hvis den foreliggende fremgangsmåde anvendes til diagnostiske formål, I

således at mængden af primer i forhold til mængden af komplementær streng ikke kan I

fastlægges med sikkerhed. Som en praktisk forholdsregel vil mængden af tilsat primer I

imidlertid almindeligvis være i molært overskud i forhold til mængden af komplementær I

30 streng (template), når den sekvens, der skal multipliceres, er indeholdt i en blanding af I

komplicerede, langkædede nukieinsyrestrenge. Der foretrækkes et stort molært overskud I

for at forbedre effektiviteten af fremgangsmåden. I

I Deoxyribonukleosidtriphosphaterne dATP, dCTP, dGTP og TTP tilsættes også til I

I 35 synteseblandingen i hensigtsmæssige mængder, og den fremkomne opløsning opvarmes I

I til ca. 90-100°C i fra ca. 1 til 10 minutter, fortrinsvis fra 1 til 4 minutter. Efter denne I

opvarmningsperiode får opløsningen lov at afkøle til stuetemperatur, hvilket er at I

I foretrække af hensyn til primerhybridisering. Til den afkølede blanding tilsættes et egnet I

11 DK 175248 B1 middel til induktion eller katatysering af primerforlængelsesreaktionen (her kaldet induceringsmiddel), og reaktionen får lov til at forløbe under betingelser, som er kendte inden for fagområdet. Denne syntesereaktion kan finde sted ved fra stuetemperatur op til en temperatur, over hvilken induceringsmidlet ikke længere fungerer effektivt. Hvis DNA-5 polymerasen således f.eks. anvendes som induceringsmiddel, vil temperaturen almindeligvis ikke være større end ca. 40eC. Det er mest hensigtsmæssigt at reaktionen finder sted ved stuetemperatur.

Induceringsmidlet kan være en hvilken som helst forbindelse eller et hvilket som helst 10 system, som vil fungere til udførelse af syntesen af primerforlængelsesprodukter, inklusiv enzymer. Egnede enzymer til dette formål inkluderer f.eks. E.coli DNA-polymerase I, Klenow-fragment af E.coli DNA-polymerase I, T4-DNA-polymerase eller andre tilgængelige DNA-polymeraser, revers transkriptase og andre enzymer, inklusiv varmestabile enzymer, som vil lette kombinationen af nukleotiderne på den rette måde til dannelse af 15 de primerforlængelsesprodukter, som er komplementære ti I hver nukleinsyrestreng.

Syntesen vil generelt blive initieret ved 3'-enden af hver primer og forløbe i 5’-retningen langs templatestrengen, indtil syntesen stopper, under frembringelse af molekyler med forskellige længder. Der kan imidlertid væreinduceringsmidler, som initierer syntese ved 5'-enden, og syntesen forløber i den anden retning under anvendelse af den samme proces 20 som beskrevet ovenfor.

Den nyligt syntetiserede streng og dens komplementære nukleinsyrestreng danner et dobbeltstrenget molekyle, som anvendes i de efterfølgende trin i fremgangsmåden. I det næste trin separeres strengene fra det dobbeltstrengede molekyle under anvendelse af en hvilken 25 som helst af de ovenfor beskrevne metoder til frembringelse af enkeltstrengede molekyler.

Ny nukleinsyre syntetiseres på de enkeltstrengede molekyler. Yderligere induceringsmiddel, nukleotider og primere kan om nødvendigt tilsættes for at processen fortsætter under de ovenfor beskrevne betingelser. Syntesen vil igen blive initieret ved 30 en ende af oligonukleotidprimerne og vil forløbe langs de enkelte strenge af templaten til frembringelse af yderligere nukleinsyre. Efter dette trin vil halvdelen af forlængelsesproduktet bestå af den specifikke nukleinsyresekvens afgrænset af de to primere.

Trinnene med strengeseparation og forlængelsesproduktsyntese kan gentages så ofte, som 35 der er behov herfor til frembringelse af den ønskede mængde af den specifikke nukleinsyresekvens. Som det vil blive beskevet i yderligere detaljer nedenfor, vil mængden af den specifikke nukleinsyresekvens, der produceres, akkumulere på eksponentiel måde.

I 12 DK 175248 B1 I

I Når det ønskes at frembringe mere end én specifik nukleinsyresekvens ud fra den første I

I nukleinsyre eller en blanding af nukleinsyrer, anvendes det hensigtsmæssige antal af I

I forskellige oligonukleotidprimere. Hvis der f.eks. skal fremstilles to forskellige, I

I 5 specifikke nukleinsyresekvenser, anvendes 4 primere. To af primerne er specifikke I

I for en af de specifikke nukleinsyresekvenser og de to andre primere er specifikke for den I

I anden specifikke nukleinsyresekvens. På denne måde kan hver af de to forskelige I

I specifikke sekvenser fremstilles eksponentielt ved den foreliggende fremgangsmåde. I

10 Oligonukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i en eksponentiel I

I multiplikationsfremgangsmåde, som udføres på en trinvis måde, hvor der efter hvert I

trin tilsættes nye reagenser, eller hvor alle reagenser samtidig tilsættes i I

begyndelsestrinnet eller delvis trinvis og delvis samtidig, hvor frisk reagens I

I tilsættes efter et givet antal trin. Hvis man til strengeseparation anvender en I

I 15 metode, såsom varme, som vil inaktivere det inducerende middel, hvilket er I

I tilfældet med varmelabilt enzym, er det nødvendigt at supplere op med det I

I inducerende middel efter hver strengeseparationstrin. Når der til strenge- I

I separationstrinnet anvendes enzymatiske midler, kan den samtidige metode I

I anvendes. I den samtidige procedure kan reaktionsblandingen ud over I

I 20 nukleinsyrestrengen (-strengene) indeholde den ønskede sekvens, strenge- I

I separationsenzymet (f.eks. helicase), en egnet energikilde for strengeseparations- I

enzymet såsom rATP, de 4 nukleotider, oligonukleotidprimerne i molært overskud I

I og det inducerende middel, f.eks. Klenow-fragment fra E.coli DNA polymerase I. I

Hvis varme anvendes til denaturering i en samtidig proces, kan et varmestabilt I

I 25 induceringsmiddel, såsom en termostabil polymerase, anvendes, hvilken I

polymerase vil fungere ved en hævet temperatur, fortrinsvis 65-90*C afhængig af I

I induceringsmidlet, ved hvilken temperatur nukleinsyren vil bestå af enkelte og I

I dobbelte strenge i ligevægt. Til mindre længder af nukleinsyre kan lavere I

I temperaturer på ca. 50°C anvendes. Den øvre temperatur vil afhænge af den I

I 30 temperatur, ved hvilken enzymet vil nedbrydes eller den temperatur, ved hvilket I

et utilstrækkeligt niveau af primerhybridisering vil finde sted. Et sådant I

I varmestabilt enzym beskrives i f.eks. A.S. Kaledin et al., Biokhimiva. 45, 644-651 I

I (1980). Hvert trin i processen vil ske sekventielt på trods af, at alle reagenserne er I

I til stede i begyndelsen. Yderligere materiale kan tilsættes efter behov. Efter at I

I 35 der er gået en passende tid til frembringelse af den ønskede mængde af den I

I specifikke nukleinsyresekvens, kan reaktionen stoppes ved at inaktivere I

I enzymerne på kendt måde eller separere komponenterne i reaktionen. I

13 DK 175248 B1

En fremgangsmåde, der anvender oligonukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse, kan udføres kontinuerligt. I en udførelsesform for en automatiseret fremgangsmåde kan reaktionen foregå i cykler gennem et denatureringsområde, et reagenstilsætningsområde og et reaktionsområde. I en anden udførelsesform kan 5 det enzym, der anvendes til syntese af primerforlængelsesprodukterne, immobiliseres på en søjle.

De andre omsætningskomponenter kan ved hjælpaf en pumpe cirkuleres kontinuerligt gennem søjlen og en opvarmningsspiral i serie, således at de producerede nukleinsyrer 10 gentagne gange kan denatureres uden at inaktivere enzymet.

En fremgangsmåde, der anvender oligonukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse, vises i diagram nedenfor, hvor dobbeltstrenget DNA, som indeholder den ønskede sekvens [S] bestående af komplementære strenge [S+] og [S'], anvendes som 15 nukleinsyren. Under den første og hver efterfølgende reaktionscyklus vil forlængelse af hver oligonukleotidprimer på den oprindelige template producere et nyt ssDNA-molekyleprodukt med ikke-defineret længde, som terminerer med kun en af primerne. Disse produkter, der herefter vil blive omtalt som "lange produkter", vil akkumulere på liniær måde; dvs. at den mængde, der er til stede efter ethvert antal cyklusser, vil være 20 proportional med antallet af cyklusser.

De således frembragte lange produkter vil fungere som templater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimeme under efterfølgende cyklusser og vil frembringe molekyler med den ønskede sekvens [S+] eller [S']. Disse molekyler vil også fungere som templater for den ene 25 eller den anden oligonukleotidprimer under frembringelse af yderligere [S+] og [S'], og således kanen kædereaktion gennemføres, som vil resultere i akkumuleringen af [S] med en eksponentiel hastighed i forhold til antallet af cyklusser.

Andre biprodukter frembragt ved oligonukleotidhybridiseringer end de, der ønsket, er 30 ikke selv-katalytiske (undtagen i sjældne tilfælde) og akkumulerer således med en liniær hastighed.

Den specifikke sekvens, der skal multipliceres, [S], kan afbildes i diagram som følger: 35 [Sf] 5’ AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3’ [S] 3 ΎΤΤΤΤΤΤΤΤΤΥΥ YYYY YY YY GGGGGGGGGG51

De egnede oligonukleotidprimere ville være:

I DK 175248 B1 I

14

I Primer 1: GGGGGGGGGG I

| Primer 2: AAAAAAAAAA I

I således at hvis DNA indeholdende [S] I

Is I

I ... zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz ... I

I ... ZZZZZZ2ZZZZZZZZZI 11 I I I I 111 YYYYYVYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz... I

I separeres i enkeltstrenge, og enkeltstrengene hybridiseres med primerne 1 og 2, kan I

I 10 følgende forlængelsesreaktioner katalyseres af DNA-polymerase i nærværelse af de fire I

I deoxyribonukleosidtriphosphater: I

I 3' 5' I

I forlængelse <------------------------------------G03QQGQQQG primer 1 I

I 15 I

I .... zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

I oprindelig template-streng+ I

I oprindelig template-streng' I

I 20 ....ZZZZZZZZZZZZZZZZl I I I I I I I I IVYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

I primer 2' AAAAAAAAAA....................................> forlængelse I

I 5 3 I

25 Ved denaturering af de to dannede duplexer er produkterne: I

I 3’ 5' I

I ....zzzzzzzzzzzzzzzzi I ΓΙ Ι I l ΠI mYYYYYYYGGGGGGGGGG I

nylig syntetiseret langt produkt 1 I

I 30 I

I I

I .... zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

oprindelig templatestreng+ I 1

35 3’ I

I ....zzzzzzzzzzzzzzzzi 11111 π i ifYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

oprindelig templatestreng' I

15 DK 175248 B1 5’ 3' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... nylig syntetiseret langt produkt 2 5 Hvis disse 4 strenge får lov at rehybridisere med primere 1 og 2 i den næste cyklus, vil induceringsmidlet katalysere følgende reaktioner:

Primer 2 5' AAAAAAAAAA----------------------> forlænges her 10 3 ‘.. .zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’ nyligt syntetiseret langt produkt 1 forlængelse <-------------------------GGGGGGGGGG 5’ primer 1 oprindelig templatestreng*

Primer 2 5’ AAAAAAAAAA....................> forlænges 20 3’...zzzzzzzzzzzzzzzzI ΓΓΤΊΊ I I 11 YYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz.... 5’ oprindelig templatestreng" forlængelse her <.......................GGGGGGGGGG 5’ primer 1 25 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... 31 nyligt syntetiseret langt produkt 2

Hvis strengene af ovennævnte fire duplexer separeres, findes følgende strenge: 30 5’AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3’ nyligt syntetiseret [S+] 3' ....zzzzzzzzzzzzzzzzI I I I II I I I IyYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' første-cyklus-syntetiseret langt produkt 1 35 3’ ....zzzzzzzzzzzzzzzz ΓΠ I I I I I I I YYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5' nyligt syntetiseret langt produkt 1

I DK 175248 B1 I

16 I

I 5' —zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz—3' I

I oprindelig templatestreng* I

I 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... 3’ I

I 5 nyligt syntetiseret langt produkt 2 I

3'....ζζζζζζζζζζζζζζζζΊ I I I I I 1111 YYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz.... 5’ I

I oprindelig templatestreng' I

I 10 3'I I I ITTTI'I IYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’ I

I nyligt syntetiseret [S'] I

I 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... 3' I

første-cyklus-syntetiseret langt produkt 2 I

I 15 I

Det fremgår, at hver streng, som terminerer med oligonukleotidsekvensen af en primer og den I

I komplementære sekvens af den anden, er den specifikke nukleinsyresekvens [S], som det et I

I ønsket at fremstille. I

I 20 Trinnene i denne fremgangsmåde kan gentages uendeligt, idet de kun er begrænset af I

I mængden af primere 1 og 2, induceringsmiddel og tilstedeværende nukleotider. I

I Mængden af oprindelig nukleinsyre forbliver konstant i hele processen, fordi det ikke I

I bliver replikeret. Mængden af lange produkter forøges liniær, fordi de kun produceres ud I

fra den oprindelige nukleinsyre. Mængden af specifik sekvens forøges eksponentielt. I

I 25 Således vil den specifikke sekvens blive den dominerende form. Dette illustreres i den I

efterfølgende tabel, som angiver de relative mængder af de former, der teoretisk er til stede I

I efter n cyklusser, under antagelse af 100% effektivitet i hver cyklus.: I

17 DK 175248 B1

Antal dobbeltstreng efter 0 til n cyklusser

Cvklus antal Template Lange produkter Specifik sekvens [S] 5 0 1 - 111 0 2 12 1 3 13 4 5 15 26 10 10 1 10 1013 15 1 15 32.752 20 1 20 1.048.555 η 1 n (2n-n-l) 15 Hvis der anvendes en enkeltstrenget nukleinsyre som template dannes der kun 1 langt produkt pr. cyklus.

Oligonukleotideme (primere) i den foreliggende opfindelse kan anvendes til at klone en speciel nukleinsyresekvens til indsættelse i en egnet ekspressionsvektor. Vektoren kan derefter 20 anvendes til at transformere en egnet værtsorganisme, saledes at den producerer genproduktet af sekvensen ved standardmetoder inden for rekombinant DNA teknologi.

Ydermere kan oligonukleotideme anvendestil in vitro mutagenisering. Oligodeoxyribonukleotidprimerne behøver ikke at være nøjagtig komplementære til den 25 DNA-sekvens, som skal multipliceres. Det er kun nødvendigt, at den er i stand til at hybridisere til sekvensen på tilstrækkelig måde til at blive forlænget af polyméraseenzymet eller hvilket andet induceringsmiddel, der nu anvendes.

Produktet fra en polymerasekædereaktion, hvor de primere, der anvendes, ikke er nøjagtig komplementære til den oprindelige template, vil indeholde sekvensen af 30 primeren snarere end af templaten, hvorved der indføres en in vitro mutation. I

yderligere cyklusser vil denne mutation blive multipliceret med en uformindsket effektivitet, fordi der ikke kræves yderligere fejlparredé primeringer. Den således frembragte mutant kan derefter indsættes i en egnet vektor ved hjælp af molekylærbiologiske standardmetoder og kan give mutantegenskaber på denne 35 vektor, således som potentialet til frembringelse af et ændret protein.

Fremgangsmåden til fremstilling af en ændret DNA-sekvens, som ovenfor beskrevet, kan gentages på det ændrede DNA under anvendelse af forskellige primere, således I 18 DK 175248 B1

at der induceres yderligere sekvensændringer. På denne måde kan der gradvis I

H frembringes en serie af muterede sekvenser, hvor hver tilføjelse i serierne kun I

vil adskille sig fra den sidste i mindre grad, men fra den oprindelige DNA- I

kildesekvens i stigende grad. På denne måde kan man i sidste ende foretage I

5 ændringer, som ikke var hensigtsmæssige i et enkelt trin, på grund af, at en I

meget alvorlig fejlparrende primer ikke kan fungere. I

Ydermere kan en af oligonukleotiderne i den foreliggende opfindelse, som en del af dens I

sekvens indeholde en ikke-komplementær sekvens, forudsat at tilstrækkelige mængder I

10 af primeren indeholder en sekvens, som er komplementær til den streng, der I

skal multipliceres. I

Efter at forlængelsesprimeren er tilsat foretages tilstrækkeligt mange cyklusser til at I

opnå den ønskede mængde af den nye template, som indeholder den ikke- I

15 komplementære nukleotidindføjelse. Dette tillader produktionen af store mængder af I

kombinerede fragmenter på forholdsvis kort tid (f.eks. 2 timer eller mindre) under I

I anvendelse af en simpel teknik. I

I De heri beskrevne oligonukleotider kan også anvendes til at gøre det muligt at påvise I

20 og/eller karakterisere specifikke nukleinsyresekvenser forbundet med infektiøse I

sygdomme, genetiske sygdomme eller cellulære sygdomme, såsom cancer. Multiplikation I

I er nyttig, når mængden af nukleinsyre, som er tilgængelig for analyse, er meget lille, I

såsom f.eks. ved prænatal diagnose af seglcelleanæmi under anvendelse af DNA I

I opnået fra føtale celler. Multiplikation er navnlig nyttig, hvis en sådan analyse I

25 skal foretages på en lille prøve under anvendelse af ikke-radioaktive I

detekteringsmetoder, som kan være iboende ufølsomme, eller hvor radioaktive I

metoder anvendes, men hvor hurtig påvisning er ønskelig. I

I relation tii den foreliggende opfindelse kan genetiske sygdomme inkludere I

30 specifikke deletioner og/eller mutationer i det genomiske DNA fra en hvilken som I

helst organisme, såsom f.eks. en person, der lider af seglcelleanæmi, cystisk

fibrose, a-thalassæmi, β-thalassæmi og lignende. Seglcelleanæmi kan let påvises ved I

hjælp af oligomerrestriktionsanalyse eller en RFLP-lignende analyse efterfulgt af I multiplikation af den hensigtsmæssige DNA-sekvens ved hjælp af den foreliggende 35 fremgangsmåde. α-Thalassæmi kan påvises ved fraværet af en sekvens, og β-thalassæmi I kan påvises ved tilstedeværelsen af et polymorft restriktionssted tæt knyttet til en mutation, som fremkalder sygdommen.

19 DK 175248 B1

Alle disse genetiske sygdomme kan påvises ved multiplikation af den hensigtsmæssige sekvens og analyse af den ved hjælp af Southern blot teknik uden brug af radioaktive prober. Ved en sidan fremgangsmåde multipliceres f.eks. en lille prøve af DNA fra f.eks. amnionvæske indeholdende et meget lavt niveau af den ønskede 5 sekvens, skæres med et restriktionsenzym og analyseres ved hjælp af en Southern blotting teknik. Anvendelsen af ikke-radioaktive prober gøres lettere ved hjælp af det høje niveau af det multiplicerede signal.

I en anden udførelsesform kan en lille prøve af DNA multipliceres til et egnet 10 niveau, og derefter kan der udføres en yderligere cyklus af forlængelsesreaktioner, hvor nukleotidderivater, som let kan påvises (såsom 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11P-mærket eller biotinmærket nukleosidtriphosphat) inkorporeres direkte i det endelige DNA-produkt, som kan analyseres ved restriktionsanalyse og elektroforetisk separation eller ved en hvilken som helst anden egnet metode. Et eksempel på denne teknik i et 15 modelsystem vises på figur 5.

I en yderligere udførelsesform, vist i et modelsystem på figur 3, kan nukleinsyren udsættes for en bestemt restriktionsendonuklease for multipliceringen. Eftersom en sekvens, der er blevet skåret, ikke kan multipliceres, betyder tilstedeværelsen af et 20 multipliceret fragment, på trods af forudgående restriktion af DNA-prøven, fravær af et genkendelsessted for endonukleasen i den multiplicerede sekvens. Tilstedeværelsen eller fraværet af en multipliceret sekvens kan påvises med en egnet metode.

En praktisk anvendelse af denne teknik kan illustreres ved dens anvendelse til at 2 gøre det lettere at påvise seglcelleanæmi ved hjælp af oligomerrestriktionsteknik 3 beskrevet herefter og af R.Saiki et al., Bio/Technoloav 3:1008-1012 (1985).

4

Seglcelleanæmi er en hæmoglobinsygdom, som skyldes et enkelt baseparskift i den 6.

5 codon af β-globingenet. Figur 6 viser sekvenserne af normale β-globingener og 6 seglcelle^-globingener i området for deres polymorfi, hvor en enkelt 7 understregning markerer lokaliseringen af et Ddel genkendelsessted, som kun er til 8 stede i det normale gen, og hvor dobbeltunderstregningen markerer lokaliseringen af 9 et Hinfl-genkelndelsessted, som ikke er polymorfisk og således er til stede i 10 både det normale allel og seglcelleallelet. Figur 7 viser oligomerrestrik- 11 tionsprocessen af normal β-globin DNA under anvendelse af en probe; der spænder over begge restriktionssteder, og mærket, hvor der er angivet en stjerne. DNA'et, der er multipliceret som tilvejebragt heri, denatureres og anneales til den mærkede probe. Enzymet Ddel spalter DNA'et ved det gendannede

I 20 DK 175248 B1 I

Ddel-qenkendelsessted. og skaber en mærket octamer. Under de anvendte I

I betingelser i prøven er octameren kort nok til at dissociere fra duplexen. En I

I efterfølgende tilsætning af enzymet Hinfl har ingen virkning på den nu enkelt- I

I strengede octamer. Figur 8 viser den samme proces anvendt overfor I

5 seglcelleallelet af β-globin DNA. Enzymet Ddel kan ikke spalte den duplex, der er I

I dannet af det multiplicerede DNA og den markede probe, på grund af en A-A I

I baseparfejlparring. Enzymet Hinfl spalter imidlertid hybriden, og der produceres I

I en mærket trimer. I praksis kan metoden diagnosticere DNA’et hos et individ som I

enten er homozytisk for vildtypen, homozygotisk for seglcelletypen eller hetero- I

I 10 zygotisk bærer af seglcelleanlægget, eftersom et specifikt signal er forbundet med I

I tilstedeværelsen af begge alleler. Anvendelse af den ovenfor beskrevne metode I

I til at multiplicere den relevante sekvens tillader hurtig analyse af et gen i enkelt I

kopi under anvendelse af en probe med blot et enkelt 32P-mærkning. I

15 Forskellige infektiøse sygdomme kan diagnosticeres ved at der i kliniske prøver findes I

I specifikke DNA-sekvenser, som er karakteristiske for den sygdomsfremkaldende I

I mikroorganisme. Disse inkluderer bakterier, såsom Salmonella, Chlamydia, Neisseria, I

vira, såsom hepatitisvira, og protozoparasitter, såsom Plasmodium, der forårsager I

I malaria. I beskrivelsen til US patent nr. 4.358.535 udstedt til Falkow omtales I

20 anvendelsen af specifikke DNA-hybridiseringsprober til diagnosticering af infektiøse I

sygdomme. Et iboende problem i Falkowproceduren er, at der kan være et I

forholdsvis lille antal pathogene organismer til stede i en klinisk prøve fra en I

inficeret patient, og DNA’et, der ekstraheres fra disse, kan udgøre blot en I

H kun meget lille fraktion af det totale DNA i prøven. Specifik multiplicering af I

H 25 mistænkte sekvenser forud for immobiliserings- og hybridiseringspåvisning af DNA- I

prøverne ville i høj grad forbedre disse procedurers følsomhed og specificitet. I

Rutinemæssige, kliniske anvendelser af DNA-prober til diagnosticering af infektiøse I

sygdomme ville blive betragteligt simplificeret, hvis der kunne anvendes ikke- I

30 radioaktivt mærkede prober som beskrevet i EP 63.879 til Ward. I denne I

I fremgangsmåde påvises biotinholdige DNA-prober ved hjælp af chromogene I

enzymer bundet til avidin eller biotinspecifikke antistoffer. Denne påvisningstype I

I er bekvem, men forholdsvis ufølsom. Kombinationen af specifik DNA-multiplikation I

ved hjælp af den foreliggende fremgangsmåde og anvendelsen af stabilt mærkede I

I 35 probér tilvejebringer den bekvemme og følsomme metode, som er påkrævet for at gøre I

Falkow- og Wardprocedurerne nyttige i et rutinemæssigt klinisk opsæt. I

----- —~ - —=—· -1- 21 DK 175248 B1

Oligonukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes til at frembringe tilstrækkelige mængder af DNA fra et humant enkeltkopigen, således at påvisning med en simpel, ikke-specifik DNA-farve, såsom ethidiumbromid, kan anvendes til frembringelse af en direkte DNA-diagnose.

5

Ud over til påvisning af infektiøse sygdomme og patologiske abnormaliteter i organismernes genom kan oligonukleotiderne ifølge opfindelsen også anvendes til at påvise DNA-polymorfi, som måske ikke er forbundet med en patologisk tilstand.

10 De efterfølgende eksempler angives til illustration og har ikke til hensigt at begrænse opfindelsen på nogen made. I disse eksempler er alle procenter angivet i vægtprocenter for faste stoffer og i volumenprocenter for væsker, og alle temperaturer er i grader Celcius med mindre andet angives.

15

Eksempel 1

En 25-basepar lang sekvens med nukletidsekvensen 20 5'CCTGGGCACCGTCACCCTGGATGCT 3’ 3'GGAGGGGTGGCAGTGGGACCTACGA 5* indeholdt i et 47 basepar langt Fokl-restriktionsfraoment af pBR322, som var opnået fra ATCC, blev fremstillet som følger. En Fokl-fordøjelse af pBR322 25 indeholdende det 47 bp lange fragment blev fremstillet ved at fordøje pBR322 med Fokl i overensstemmelse med de betingelser, der foreslås af leverandøren, New England Biolabs Inc. De anvendte primere var 5’ d(CCTCGGCACCG) 3' og 5' d(AGC-ATCCAGGGTG) 3’, og de blev fremstillet ved at anvende traditionelle metoder. Følgende bestanddele blev tilsat til 33 μΙ puffer, som var sammensat af 25 mM 30 kaliumphosphat, 10 mM magnesiumchlorid og 100 mM natriumchlorid ved pH 7,5: 2433 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere, 2,4 pmol af det Fokl-fordøjede pBR322, 12 nmoldATP, 22 nmol dCTP, 19 nmol dGTP og 10 nmol TTP.

Blandingen blev opvarmet til 85*C i 5 minutter og fik lov at afkøle til 35 omgivelsestemperatur. Der blev tilsat 5 enheder Klenow fragment fra E.coli DNA polymerase I, og temperaturen blev holdt i 15 minutter. Efter denne tid blev blandingen igen opvarmet til 85*C i 5 minutter og fik lov til at afkøle. Der blev igen tilsat 5 enheder Klenow-fragment, og reaktionen fik lov at forløbe i 15

I 22 DK 175248 B1 I

minutter. Trinnene med opvarmning, afkøling og syntese blev gentaget endnu li I

I gange. I

Efter den sidste gentagelse blev en 5 μΙ delprøve udtaget fra reaktions- I

5 blandingen. Denne blev opvarmet til 85°C i 3 minutter og fik lov at afkøle til I

omgivelsestemperatur. 12,5 pmol a-P32-deoxycytidintriphosphat og 5 enheder I

Klenow-fragment blev tilsat, og reaktionen fik lov at forløbe i 15 minutter. De I

mærkede produkter blev undersøgt ved polyacrylamidgelelektroforese. Fokl- I

I fordøjelsen blev mærket på lignende måde og tjente som en kontrol og molekyl- I

10 vægtmarkører. Det eneste stærkt mærkede bånd, der var synligt efter de 13 cyklusser, I

I var den tilsigtede 25-basepar lange sekvens. I

I Eksempel 2 I

I I

Den ønskede sekvens, der skulle multipliceres, var en 94 basepar lang sekvens I

indeholdt i det humane β-globingen og strækkende sig over MstH-stedet. der er I

involveret i seglcelleanæmi. Sekvensen har den på figur 1 viste nukleotidsekvens. I

20 1. Syntese af primere I

Følgende to oligodeoxyribonukleotidprimere blev fremstillet ved den nedenfor I

beskrevne metode: I

I 25 5' CACAGGGCAGTAACG 3' Primer A I

I og

I 5' TTTGCTTCTGACAGA 3' Primer B

Automatiseret synteseprocedure: Diethyl phosphoramiditer, der er syntetiseret I

I 30 ifølge Beaucage og Caruthers (Tetrahedron Letters (1981) 22:1859-1862) blev I

H sekventielt kondenseret til et nukleosidderivatiseret glasbæremateriale med styret porestørrelse under anvendelse af en Biosearch SAM-1. Proceduren inkluderede detritylering med trichloreddikesyre i dichlormethan, kondensation under anven- I delse af benzotriazol som aktiverende protondonor og afdækning (eng: capping) 35 med eddikesyreanhydrid og dimethylaminopyridin i tetrahydrafuran og pyridin.

I Cyklustid var ca. 30 minutter. Udbytte ved hvert trin var stort set kvantitativt og blev bestemt ved opsamling og spektroskopisk undersøgelse af den dimethoxytritylalkohol, der blev frigjort under detrityleringen.

23 DK 175248 B1

Fjernelse af oligodeoxyribonukleotidbeskyttelse og oprensningsprocedure: Det faste bæremateriale blev fjernet fra søjlen og udsat for 1 ml koncentreret ammoniumhydroxid ved stuetemperatur i 4 timer i et lukket glas. Bærematerialet blev derefter 5 fjernet ved filtrering, og opløsningen, der indeholdt det delvis beskyttede oligodeoxynukleotid, blev opvarmet til 55eC i 5 timer. Ammoniak blev fjernet, og resten blev påsat en præparativ polyacrylamidgel. Der blev udført elektroforese ved 30 volt/cm i 90 minutter, hvorefter båndet, der indeholdt produktet, blev identificeret ved UV-skygning af en fluorescensplade. Båndet blev udskåret og 10 elueret med 1 ml destilleret vand natten over ved 4*C. Denne opløsning blev påsat en Altech RP18 søjle og elueret med en 7-13% gradient af acetonitril i 1% ammo-niumacetatpuffer ved pH 6,0. Elueringen blev målt ved UV-absorption ved 260 nm, og den hensigtsmæssige fraktion blev opsamlet, kvantificeret ved UV-absorbans i et fastlagt volumen og inddampet til tørhed ved stuetemperatur i en 15 vakuumcentrifuge.

Karakterisering af oligodeoxyribonukleotider: Testprøver af de oprensede oligonukleotider blev 32P-mærket med polynukleotidkinase og γ-32Ρ-ΑΤΡ. De mærkede forbindelser blev undersøgt ved autoradiografi af 14-20% polyacrylamidgeler efter 20 elektroforese i 45 minutter ved 50 volt/cm. Denne procedure verificerede molekylvægten. Basesammensætningen blev bestemt ved fordøjelse af oligodeoxyribo-nukleotidet til nukleosider under anvendelse af gift-diesterase og bakteriel, alkalisk phosphatase og efterfølgende separation og kvantificering af de afledte nukleosider under anvendelse af en HPLC-søjle med omvendt fase og en mobil fase af 25 10% acetonitril, 1% ammoniumacetat.

II. DNA-kilde.

A. Ekstraktion af hel, human vildtvpe-DNA

30 Human, genomisk DNA, der er homozygotisk for normal β-globin, blev ekstraheret fra cellelinien Molt4 (opnået fra Human Genetic Mutant Cell Repository og identificeret, som GM2219c) under anvendelse af teknikken beskrevet af Stetler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1982), 79:5966-5970. 1 B. Konstruktion af klonede alobinaener

Et 1,9 kb langt BamHI-fraoment af det normale P-globingen isoleredes fra cosmidet pFCll og indsattes i BamHI-restriktionsstedet af pBR328 (Soberon et al., Gene (1980) 2:287-305). Dette fragment, som omfatter det område, som hybridiserer til den I DK 175248 B1

Η 24 I

I syntetiske 40-mer probe, inkluderer den første og den anden exon, den forste I

intron og de 5’-flan.kerende sekvenser af genet (Lawn et al., Cell (1978), I

15:1157-1174). Denne klon betegnedes pBR328:HbA og blev deponeret under ATCC I

I nr. 39.698 25.maj 1984. I

I I

Det tilsvarende 1,9 kb lange BamHI-fraqment af sealcelleallelet af B-globin I

isoleredes fra cosmidet pFC12 og klonedes som ovenfor beskrevet. Denne klon I

I blev betegnet pBR328:HbS og deponeredes under ATCC nr. 39.699 25. maj, I

1984. I

I 10 I

Hver rekombinantplasmid blev transformeret ind i og opformeret i E.coli MM294 I

I (ATCC nr. 39.607). I

I C. Fordøjelse af klonede olobinoener med Mstll I

I 15 Ialt 100 μg af hver af pBR328:HbA og pBR328:HbS blev individuelt fordøjet med 20 I

I enheder Mstll (New England Biolabs) i 16 timer ved 37°C i 200 μΙ 150 mM Naa, 12 mM I

I Tris Ha (pH 7,5), 12 mM MgCI2,1 mM dithiothreitol (DTT) og 100 μg/ml I

I bovinserumalbumin (BSA). Produkterne blev betegnet pBR328:HbA/Mstll I

I henholdsvis pBR328: HbS/Mstll. I

I 20 I

III. Polymerasekædereaktion I

Til 100μ! buffer bestående af 60 mM natriumacetat, 30mM Trisacetat og 10 mM I

magnesiumacetat ved pH 8,0 tilsattes 2 μΙ af en opløsning indeholdende 100 picomol I

25 Primer A (med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG)), 100 picomol af Primer B (med I

sekvensen d(TTTGCTTCTGACACA)) og 1000 picomol af hver af dATP, dCTP, I

dGTP og TTP. Desuden tilsattes en af følgende ovenfor beskrevne DNA-kilder: I

10 μς hel, human, vildtype DNA (reaktion I ) I

I 30 0,1 picomol pBR328:HbA (reaktion II). I

I 0,1 picomol pB R328:.HbS (reaktion III). I

I 0,1 picomol pBR328:HbA/MstII (reaktion IV). I

I 0,1 picomol pBR328:HbS/Mstll (reaktion V).

I Intet mål-DNA (reaktion VI) I 35

Hver af de fremkomne opløsninger blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov I at afkøle til stuetemperatur i 2 minutter, hvorefter 1 μΙ indeholdende 4 enheder

Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase tilsattes. Hver reaktion fik lov at 25 DK 175248 B1 forløbe i 10 minutter, hvorefter cyklussen med tilsætning af primere, nukleotider og DNA, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og omsætning blev gentaget 19 gange for reaktion I og 4 gange for reaktionerne II-VI.

5 4 mikroliter delprøver af reaktionerne I og II, der var fjernet før den første cyklus og efter den sidste cyklus af hver reaktion, blev påsat en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, blev overført til en nylonmembran, der tjente som fast-fase-bæremateriale og probebehandlet med et 10 syntetisk 5’-32P-mærket 40 bp langt fragment, der var fremstillet ved standardteknik, med sekvensen: 5'd(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG)3' 15 i 30% formamid, 3 x SSPE, 5 x Denhardt's, 5% natriumdodecylsulfat ved pH 7,4. Figur 2 er et autoradiogram af den probebehandlede nylonmembran for reaktionerne I og II. Bane 1 er 0,1 picomol af en 58 bp lang syntetisk fragmentkontrol, hvor 1 streng er komplementær til den ovennævnte probe. Bane 2 er 4 μΙ reaktion I forud for den forste multiplikationscyklus. Bane 3 er 4 μΙ reaktion I efter den 20.

20 multiplikationscyklus. Bane 4 er 4 μΙ reaktion II efter fem multiplikationscyklusser. Bane 5 er en molekylvægtstandard, der består af en Fokl (New England Biolabs) fordøjelse af pBR322 (New England Biolabs) mærket med a-32P-dNTP'er og polymerase. Bane 3 viser, at efter 20 cyklusser indeholdt reaktionsblanding I en stor mængde af den specifikke sekvens med den rigtige molekylvægtog ingen andre påviselige 25 produkter. Reaktionsblanding II indeholdt efter 5 cyklusser også dette produkt, såvelsom udgangsnukleinsyren og andre produkter, som vist ved bane 4.

Til 5,0 μΙ delprøve af reaktionerne II-VI tilsattes efter den 4. cyklus 5 pmol af hver af de ovenfor beskrevne primere. Opløsningerne blev opvarmet til 100*C i 4 minutter og fik 30 lov at ækvilibrere til stuetempeatur. Der tilsattes 3 pmol af hver af a-32P-dATP, a-32P-dCTP, a-32P-dGTP, a-32P-dTTP og 4 enheder Klenow-fragment. Reaktionen fik i et slutvolumen på 10 μΙ og ved de ovenfor angivne saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved 60* C. 4 μΙ delprøver af reaktionerne II-VI blev ladet på en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-35 borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, hvorefter autoradiografi blev udfort.

I DK 175248 B1 I

Η 26 I

I Figur 3 er et autoradiogram af elektroforesen. Bane 1 er en molekylvægtstandard, bane 2 er I

I reaktion II, bane 3 er reaktion III, bane 4 er réaktion IV og bane 5 er reaktion V. En anden I

I bane for reaktion VI som kontrol og uden tilsat DNA havde ingen markeringer i nogen af I

I banerne. Det kan ses ud fra tegningen, at det 94 bp lange fragment, som var I

I 5 forudsagt ud fra mål-DNA, kun var til stede, hvor intakt β-globin-DNA-sekvenser var I

I tilgængelige for multiplicering, dvs. pBR328: HbA (bane 2), pBR328: HbS (bane 3) og I

I pBR328:HbS/Mstll (bane S). Mstll-fordøielse skærer pBR328:HbA i den 94-mere sekvens, og I

I gør den derved ude af stand til at blive multipliceret, og det 94-mere bånd viser sig ikke i bane I

I 4.1 modsætning hertil udskæres den 94-mere sekvens i pBR328:HbS ikke, når I

I 10 plasmidet fordøjes med Mstll. og er således tilgængelig for multiplikation som vist i bane 5. I

Figur 4 viser kædereaktionen for 3 cyklusser ved multiplicering af den 94 bp lange I

I sekvens. PCOl og PC02 er primere A og B. Tallene på hojre side indicerer cyklusserne, I

I hvorimod tallene på venstre side indicerer cyklustallene, i hvilke et specielt molekyle blev I

I 15 frembragt. I

I Eksempel. 3 I

I Dette eksempel viser multiplikationen af en 110 bp lang sekvens, der spænder over I

I 20 det allele Mstll-genkendelsessted i det humane hæmoglobingen. I

I Ialt 1,0 mikrogram hel, human DNA, 100 picomol d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) og I

I 100 picomol d(CAACTTCATCCACGTTCACC), hvor primerne var blevet fremstillet I

I ved metoden ifølge eksempel 2, blev opløst i 100 μΙ af en opløsning, som bestod I

I 25 af: I

1,5 mM af hver af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater I

I 30 mM Trisacetatbuffer ved pH 7,9 I

I 60 mM natriumacetat I

I 30 10 mM magnesiumacetat I

I 0,25 mM dithiothreitol. I

I Opløsningen opvarmedes til 100*C i 1 minut og bragtes hurtigt til 25°C i 1 minut, I

I hvorefter der tilsattes 2,5 enheder Klenow-fragment af DNA-polymerase. I

I 35 Polymerasereaktionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25*0, hvorefter cyklussen med I

I opvarmning, afkøling, tilsætning af Klenow-fragment og omsætning blev I

I gentaget så ofte som ønsket. I

2? DK 175248 B1

Med en effektivitet pi 70% ved hver cyklus resulterede 15 cyklusser i syntese af 1,4 femtomol af det ønskede 110 bp fragment af β-globingenet.

Eksempel 4 5

Dette eksempel viser multiplikationen af en 240 bp lang sekvens, der spænder over det allele Mstll-genkendelsessted i det humane hæmoglobingen. Denne sekvens indeholder Ncol. Hinfl oq Mstll restriktionsstederne.

10 Til 100 μΙ af en blanding af 60 mM natriumacetat, 30 mM Trisacetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 indeholdende 0,1 pmol pBR328:HbA tilsattes 2 μΙ opløsning A, der indeholdt: 100 picomol d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) primer.

15 100 picomol d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) primer 1000 pmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP.

De to primere blev fremstillet ved metoden beskrevet i eksempe 2. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle i omgivelsesluft i 2 minutter, 20 hvorefter der tilsattes 1 μΙ indeholdende fire enheder Klenow fragment af E.coli DNA polymerase. Reaktionen fik lov at forløbe i 10minutter, hvorefter cyklussen bestående af tilsætning af opløsning A, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 3 gange. Til en delprøve på 5,0 μΙ af reaktionerne tilsattes 5 picomol af hver af ovennævnte oligonukleotidprimere.

25 Opløsningen blev opvarmet til 100eC i 4 minutter og fik lov at indstille sig til omgivelsestemperatur, hvorefter 3 picomol af hver af de a-32P-mærkede deoxyribonukleosidtriphosphater og 4 enheder Klenow-fragment tilsattes. Reaktionen fik i en slutvolumen på 10 μΙ og ved de ovenfor givne saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 30 minutter ved 60“C. 2 μΙ delprøver blev fordøjet med Ncol. Mstl eller Hinfl og sat på en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, og autoradiografi blev udført. Figur 5 viser autoradiogrammet af elektroforesen, hvor bane 1 er den molekylvægtstandard, bane 2 er uden fordøjelse med enzym (240 35 bp intakt), bane 3 er fordøjelse med Ncol (131 og 109 bp), bane 4 er fordøjelse med

Mstll (149 og 91 bp), og bane 5 er fordøjelse med Hinfl (144 og 96 bp). Autoradiogrammet er i overensstemmelse med multiplikationen af den 240 bp lange sekvens.

I DK 175248 B1 I

28 I

I Eksempel 5 I

I Dette eksempel viser anvendelsen af fremgangsmåden beskrevet heri til påvisning af I

I seglcelleanæmi ved sekventiel fordøjelse. I

Is I

I Syntese oq phosphorvlering af oliaodeoxvribonukleotider I

I En mærket DNA-probe, RS06, med sekvensen I

I 10 5'*CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 3’ I

I hvor * indicerer mærkningen, og en umærket, blokerende oligomer, RS10, med I

I sekvensen: I

I 15 3'GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAATGACGGGACACCC 5' I

I som har 3 basepar fejlparrede med RS06, blev syntetiseret ifølge I

I fremgangsmåderne, som angivet i eksempel 2(1). Proben RS06 blev mærket ved at I

I kontakte 5 pmol heraf med 4 enheder T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs) I

I 20 og 50 pmol γ-32Ρ-ΑΤΡ (New England Nuclear, ca. 7200 Ci/mmol) i et 40 pi I

I reaktionsvolumen indeholdende 70 mM Tris-buffer (pH 7,6), 10 mM MgCI 2, 1,5 mM I

I spermin og 2,5 mM dithiothreitol i 90 minutter ved 37°C. Det totale volumen blev I

I derefter indstillet til 100μΙ med25mM EDTA og oprenset ifølge fremgangsmåden af I

I Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 464-465 over en 1 ml Bio Gel P-4 I

I 25 spindialysesøjlefra BioRad ækvilibreret med Tris-EDTA (TE) puffer (10 mM Tris- I

I puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Den mærkede probe blev yderligere oprenset ved I

I elektroforese på en 18% polyacrylamidgel (19:1 acrylamid.BIS, BioRad) i Tris-borsyre- I

I EDTA (TBE) puffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) i 500 vhr. I

I Efter lokalisering ved autoradiografi blev den del af gelen, der indeholdt den I

I 30 mærkede probe, udskåret, knust og elueret i 0,2 ml TE-puffer natten over ved I

I 4*C. TCA-præcipitation af reaktionsproduktet indicerer, at den specifikke aktivitet I

var 4,9 Ci/mmol, og slutkoncentrationen var 20 pmol/ml. I

Den umærkede RS10 blokerende oligomer blev anvendt ved en koncentration på 200 I

I 35 pmol/ml. I

29 DK 175248 B1

Isolering af human, aenomisk DNA fra cellelinier

Genomisk DNA med høj molekylvægt blev isoleret fra lymfoidcellelinierne Molt4, SC-1 og GM2064 under anvendelse af i alt væsentligt den metode, der beskrives af 5 Stetler et al. i PNAS (1982) 79, 5966-5970 (for Molt4) og Maniatis et al. i Molecular Cloning (1982), 280-281.

Molt4 (Human Mutant Cell Repository, GM2219C) er en T-cellelinie, der er homozygot for normal β-globin, og SC-1, deponeret hos ATCC 19. marts 1985, er en 10 EBV-transformeret B-cellelinie, der er homozygot for seglcelleallelet. GM2064 (Human Mutant Cell Repository, GM2064) blev oprindeligt isoleret fra et individ, der er homozygot med arvelig persistens af føtalhæmoglobin (HPFH) og indeholder ingen beta- eller deltaglobingensekvenser. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 med 10% føtal kalveserum.

15

Isolering af human, oenomisk DNA fra kliniske blodprøver

En klinisk blodprøve, betegnet CH12, fra en kendt seglcellebærer (AS) blev opnået fra Dr. Bertram Lubin fra Children’s Hospital i Oakland, Californien.

20 Genomisk DNA blev fremstillet ud fra "buffy-coat"-fraktionen, som primært består af perifer blodlymfocytter, under anvendelse af en modifikation af den fremgangsmåde, der beskrives af Nunberg et al. i Proc.Nat.Acad.Sci. 75. 5553-5556 (1978).

25 Cellerne blev resuspenderet i. 5 ml Tris-EDTA-NaC! (TEN) puffer (10 mM Tris puffer pH 8, 1 mM EDTA, 10 mM NaCI) og indstillet til 0,2 mg/ml proteinase K, 0,5% SDS, og inkuberet natten over ved 37°C. Natriumperchlorat blev derefter tilsat til 0,7 M, og lysatet blev forsigtigt rystet i 1-2 timer ved stuetemperatur. Lysatet blev ekstraheret med 30 ml phenol/chloraform (1:1), derefter med 30 ml chloraform 30 og efterfulgt af ethanol præcipitering af nukleinsyrerne. Pelleten blev resuspenderet i 2 ml TE-puffer, og RNase A blev tilsat til 0,005 mg/ml. Efter fordøjelse i 1 time ved 37°C blev DNA’et ekstraheret en gang med et lige volumen af phenol, phenol/chloraform og chloraform og blev ethanol præcipiteret. DNA'et blev resuspenderet i 0,5 ml TE-puffer, og koncentrationen blev bestemt ved absorbtion ved 260 nm.

Polvmerasekædereaktion til selektiv multiolicerina af ft-alobinsekvenser 35 I DK 175248 B1

30 I

I To mikrogram genomisk DNA blev multipliceret i et initielt 100 μΙ reaktionsvolumen I

indeholdende 10 mM Tris-puffer (pH 7,5), 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 150 pmol Primer A I

I med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG) og 150 pmol af Primer B med sekvensen I

I d(CTTTGCTTCTGACACA) og blev dækket med ca. 100 μΙ mineralolie for at for- I

5 hindre fordampning. I

Hver DNA-prøve undergik 15 multiplikationscyklusser, hvor en cyklus bestod af I

3 trin: I

10 1) denaturering i et varmebloksæt ved 95°C i 2 minutter, I

2) umiddelbar overføring til et varmebloksæt ved 30eC i 2 minutter for at I

tillade primere og genomisk DNA at anneale, I

3) tilsætning af 2 μΙ af en opløsning indeholdende 5 enheder Klenow- I

fragment af E.coli DNA-polymerase I (New England Biolabs), 1 nmol af hver af I

I 15 dATP, dCTP, dGTP og TTP i en puffer, der er sammensat af 10 mM Tris (pH 7,5), 50 I

mM NaCI, 10mMMgCl2 og4mM dithiothreitol. Denne forlængelsesreaktion fik I

H lov at forløbe i 10 minutter ved 30‘C. I

Efter slutcyklussen blev reaktionen afsluttet ved opvarmning ved95°C i 2 I

20 minutter. Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloraform og bortkastet. I

Slutreaktionsvolumenet var 130 μΙ. I

Hvbridiserino/fordøielse af multmliceret. oenomisk DNA med prober οα Ddel/Hinfl I

25 45 μΙ af det multiplicerede, genomiske DNA blev ethanol præcipiteret og I

resuspenderet i samme volumen TE-puffer. 10 μΙ (indeholdende den præ- I

multiplicerede ækvivalent til 154 ng genomisk DNA) blev overført til et 1,5 ml I

Micrafuge-glas og 20 μΙ TE-puffer til et slutvolumen på 30 μΙ. Prøven blev dækket I

med mineralolie og denatureret ved 95°C i 10 minutter. 10 μΙ 0,6 M NaCI I

30 indeholdende 0,02 pmol mærket R306-probe blev tilsat til glasset, der blev I

I blandet let, og glasset blev straks overført tit en 56°C varm varmeblok i 1 time. I

I Der blev tilsat 4 μΙ umærket RS10-blokerende oligomer (0,8 pmol), og I

hybridiseringen fortsattes, i yderligere 10 minutter ved samme temperatur. Der I

I tilsattes 5 μΙ 60 mM MgCI7/0,l% BSA οα 1 μ I Ddel (10 enheder, New England I

I 35 Biolabs), og det reannealede DNA blev fordøjet i 30 minutter ved S6eC. Derefter I

I tilsattes 1 μΙ Hinfl (10 enheder, New England Biolabs), og blandingen I

H inkuberedes i yderligere 30 minutter. Reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 4 I

μΙ 75 mM EDTA og 6 μΙ sporfarve til et slutvolumen på 61 μΙ. I

DK 175248 B1

Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og 18 μΙ af reaktionsblandingen (45 ng genomisk DNA) blev sat på en 30% polyacrylamid-minigel (19:1, Bio Rad) i et Hoeffer SE200 apparat. Gelen blev elektroforesebehandlet 5 ved ca. 300 volt i. 1 time, indtil bromphenolblå-farvefronten havde vandret 3,0 cm fra påsætningsstedet. De øverste 1,5 cm af gelen fjernedes, og den resterende gel blev eksponeret i 4 dage med en følsomhedsforstærkende skærm ved -70°C .

Diskussion af autoradioorafi ffia.9) 10

Hver bane indeholder 45 ng multipliceret, genomisk DNA. Bane A indeholder Mo!t4 DNA.; bane B, CH12; bane C, SC-1 og bane D, GM2064. Molt4 repræsenterer genotypen af et normalt individ med 2 kopier af pA'genet pr. celle (AA), CH12 er en klinisk prøve fra en seglcellebærer med et βΑ- og et ps-gen pr. celle (AS), 15 og SCI repræsenterer genotypen for et seglcelleindivid med to kopier af ps-genet pr. celle (SS). GM2064, som ikke indeholder beta- eller deltaglobinsekvenser, ér til stede som en negativ kontrol.

Som det ses på autoradiogrammet er den Ddgl-spaltede, pA-specifikke octamer kun til 20 stede i de DNA’er, der indeholder pA-genet (baner A og B) og den Hinfl-spaltede, ps-specifikke trimer er kun til stede i de DNA’er, der indeholder ps-genet (banerne B og C). Tilstedeværelsen af både trimer og octamer (bane B) er diagnostisk for en seglcellebærer og kan skelnes fra et normalt individ (bane A) med octameren alene og fra et seglcelleplaget individ (bane C) med trimer alene.

. -25

Gentagelsen af det ovenfor beskrevne forsøg under anvendelse af ikke-multipliceret, genomisk DNA viste til sammenligning, at multiplikationen forøgede påvisningsfølsomheden mindst 1000 gange.

30 Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer direkte påvisning af et fuldstændigt uoprenset, enkeltgenkopi i hel, human DNA på geler uden behov for en mærket probe. 1

Under anvendelse af den i eksempel 3 beskrevne metode blev et 110 bp langt fragment fra en sekvens i det første exonområde af betaglobingenet multipliceret ud fra 10 mikrogram hel, human DNA efter 20 cyklusser: Dette 110

I DK 175248 B1 I

32 I

I bp fragment, der var frembragt efter 20 cyklusser, kunne let ses på geler, der I

I var farvet med ethidiumbromid. I

I Sekvensen multipliceredes ikke, når det først var skåret med restriktionsenzymet I

I 5 Ddel. undtagen hvis sekvensen, som i betaglobin-S-alleles, ikke indeholdt I

I restriktionsstedet som enzymet genkender. I

I Eksempel 7 I

I 10 A. Ialt 100 fmol pBR328, der indeholdt et 1,9 kb langt indsat stykke fra det humane I

I beta-globin A allet, 50 nmol af hver af ct-32P-dNTP ved 500 Ci/mol og 1 nmol af hver af I

primerne, der anvendtes i eksempel 3, blev opløst i en opløsning indeholdende 100 μΙ I

30 mM Tris-acetat ved pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 100 mM dithiothreitol og 10 mM I

I magnesiumacetat. Opløsningen bragtes til 100°C i 2 minutter og afkøledes til 25*C i 1 I

I 15 minut. Ialt 1 μΙ indeholdende 4,5 enheder Klenow-fragment af E.coli- DNA polymerase I I

I og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase tilsattes for at forhindre den mulige I

I ophobning af pyrophosphat i reaktionsblandingen, og reaktionen fik lov at I

I forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen med opvarmning, afkøling, I

I enzymtilsætning og reaktion blev gentaget 9 gange. 10 μΙ delprøver udtoges og I

I 20 tilsattes til 1 μΙ 600 mM EDTA efter hver syntesecyklus. Hver blev analyseret på I

I en 14% polyacrylamidgel i 90 mM Tris-borat og 2,5 mM EDTA ved pH 8,3 og 24 I

volt/cm i 2,5 timer. Den færdige gel blev opblødet i 20 minutter i den samme puffer I

I med tilsætning af 0,5 pg/ml ethidiumbromid, vasket med det oprindelige puffer og I

I fotograferet i UV-lys under anvendelse af et rødt filter. I

I 25 I

I Det fremstillede llObp lange fragment blev udskåret fra gelen under ultraviolet lys, og det I

I inkorporerede 32P måltes ved Cerenkovbestråling. Et forsøg på at indpasse resultaterne i I

I ligningen med formen:pmol/10 μΙ = 0,01 [(l+y)N-yl\l - 1], hvor N angiver antallet I

af cyklusser og y er fraktionsudbyttet pr. cyklus, var optimal med y = 0,619. Dette I

I 30 indicerer, at en signifikant multiplicering opnåedes. I

I B. Det ovenfor angivne forsøg gentoges med undtagelse af, at 100 nmol af hver dNTP I

I tilsattes til en 100 μΙ reaktion, ingen radioaktiv mærkning blev anvendt og delprøver I

I blev ikke fjernet efter hver cyklus. Efter 10 cyklusser afsluttedes reaktionen ved I

I 35 kogning i 2 minutter, og rehybridiseringen blev udført ved 57*Ci 1 time. Sekvensen I

I af det 110 bp lange produkt blev bekræftet ved at udsætte 8 μΙ delprøver for I

I restriktionsanalyse ved tilsætning af 1 μΙ bovinserumalbumin (25 mg/ml) og 1 μΙ af det I

33 DK 175248 B1 passende restriktionsenzym (HinfI, Mnll. Mstll. NcoH og ved omsætning ved 37'C i 15 timer.

PAGE blev udført som ovenfor beskrevet.

Eksempel 8 5

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af forskellige primere til multiplicering af forskellige fragmenter af pBR328 og 322.

A. Det i eksempel 7Abeskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes 10 følgende primere: d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) og d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC) til fremstilling af et 130 bp langt fragment af pBR328.

B. Det i eksempel 7A beskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes 15 følgende primere: d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d(TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG) til fremstilling af et 262 bp langt fragment af pBR328. Omsætningstiden var 20 minutter pr. cyklus.

C. Det i eksempel 8B beskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at 100 fmol afen 20 Mstll-fordøielse af pBR328 indeholdende en 1,9 kb lang indføjelse fra det humane beta- globin 5 allel blev anvendt som initiel template. Dette plasmid blev spaltet flere gange med Mstll, men ikke inden i sekvensen, der skulle multipliceres. Desuden var de anvendte primere folgende: 25 d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) til dannelse af et 240 bp langt fragment.

30 D. Det i eksempel 7Bbeskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at 100 ffnol af enNrul-fordøjelse af pBR328 blev anvendt som template, 200 nmol af hver dNTP blev anvendt i 100 μ I reaktion og primerne var: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og 35 d(CTTCCCCATCGGTGATGTCG)

I DK 175248 B1 I

I 34 I

I til dannelse af et 500 bp langt fragment fra pBR328. Omsætningstider var 20 minutter pr. I

B cyklus ved 37°C. Slut-rehybridisering var 15 timer ved 57*C. Elektroforese skete på I

B en 4% agarosegel. I

B 5 Fksemæl 9 I

B Dette eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvorved der introduceres en I

B in vitro mutation i det multiplicerede segment. I

B 10 A. Ialt 100 fmol pBR322 lineariseret med Nrul, 1 nmol af hver af primerne: I

I d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og I

B d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) I

B 15 udformet til frembringelse af et 75 bp langt fragment, 100 nmol af hver dNTP i 100 μΙ 40 I

I mM Tris ved pH 8, 20 mM i MgCI2, 5 mM i dithiothreitol og 5 mg/ml bovinserumalbumin blev I

I kombineret. Blandingen blev bragt til 100°C i 1 minut, afkølet i 0,5 minutter i et I

I vandbad ved 23°C, hvorefter der tilsattes 4,5 enheder Ktenow-fragment og 0,09 enheder I

I uorganisk pyrophosphatase og reaktionen fik lov at forløbe i 3 minutter. Cyklussen med I

B 20 opvarmning, afkøling, tilsætning af enzymer og omsætning blev gentaget 9 gange. Den 10. I

B omsætningscyklus blev stoppet ved nedfrysning og en 8 μΙ delprøve af I

B reaktionsblandingen blev sat på en 4% agarosegel visualiseret med ethidiumbromid. I

B B. Det i eksempel 9A beskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte I

B 25 oligonukleotidprimere var: I

I d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og I

B d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT). I

B 30 Disse primere er udformet til at producere et 101 bp langt fragment, hvoraf 26 nukleotider (i I

B den primer, der er angivet som nummer to), ikke er til stede i pBR322. Disse nukleotider I

B repræsenterer sekvensen i T7-promotoren, som blev tilføjet til den 75 bp lange I

B sekvens fra pBR322 ved at anvende primeren med 20 komplementære baser og en 26 base lang I

B S'-forlængelse. Proceduren krævede mindre end 2 timer, og der frembragtes 2 picomol I

B 35 relativt rent 101 bp lange fragment fra 100 fmol pBR322. I

B T7-promotoren kan anvendes til at initiere RNA-transkription. T7-polymerase kan tilsættes til I

B det 101 bp lange fragment til frembringelse af enkeltstrenget RNA. I

35 DK 175248 B1 C. Det i eksempel 8D beskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte oligonukieotidprimere var som følger: 5 d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d (CCAGCAAGACGTAGCCCAGC) til frembringelse af et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

10 D. Det i eksempel 9C beskrevne forsøg blev gentaget med undtagelse af, at de anvendte oligonukieotidprimere var som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d( AATT AATACG ACT CACT AT AGGG AGAT AGGCGTATCACGAGGCCCT) 15 for således at frembringe et 1026 bp langt fragment, hvoraf 26 nukleotider (i den primer, der er angivet som nummer to) ikke er til stede i pBR322 og repræsenterer den ovenfor beskrevne T7-promotor. Promotoren er blevet indføjet naboliggende til et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

20

Resultaterne indicerer, at en primer, som ikke er en perfekt parring til templatesekvensen, men som ikke desto mindre er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt til at blive enzymatisk forlænget, producerer et langt produkt, som snarere indeholder sekvensen af primeren end den tilsvarende sekvens af den oprindelige template. Det lange produkt tjener som template 25 for den anden primer til introducering af en in vitro mutation. Denne mutation multipliceres i yderligere cyklusser med en uformindsket effektivitet, fordi ingen yderligere fejlparrede priminger kræves. I dette tilfælde blev en primer, som bærer en ikke-komplementær forlængelse på dets 5'-ende anvendt til indføjelse af en ny sekvens i produktet, der er naboliggende til templatesekvensen, der kopieres.

30 E. Fordi reaktionen med polymerase udvikler pyrophosphat og er teoretisk reversibel (Kornberg, A., DNA Replication, W.H.Freeman, San Francisco, 1980) blev effekten af at tilsætte en uorganisk pyrophosphatase for at undgå potentiel pyrophosphorolyse af produktet undersøgt. Kvalitativ polyacrylamidgelelektroforeseundersøgelse afreaktioner 35 plus og minus pyrophosphatase viste en mindre, men signifikant forøgelse i produktets homogenitet som et resultat af at tilsætte dette enzym.

Eksempel 10

I DK 175248 B1 I

I 36 I

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af indskudte sætafprimere for at nedsætte baggrunden I

i multiplikationen af enkeltkopigener. I

5 Hel, human DNA, som er homozygotisk for vildtype β-globinallelet, blev udsat for 20 I

multiplikationscyklusser pi følgende mide: Ialt 10 Mg DNA, 200 pmolaf hver af primerne: I

I d( ACACAACTGTGTTCACTAGC) og . I

I d(CAACTTCATCCACGTTCACC) I

I 10 I

og 100 nmol af hver dNTP i 100 μΙ af 30 mM Tris-acetat pH 7,9, 60 mM natriumacetat, I

10 mM dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat blev opvarmet til 100°C i 1 minut, afkølet I

I til 25*C i 1 minut og behandlet med 2 enheder Klenow-fragment i 2 minutter. Cyklussen med I

opvarmning, afkøling og tilsætning af Klenow-fragment blev gentaget 19 gange. En delprøve I

15 pi 10 μΙ blev fjernet fra reaktionsblandingen og udsat for yderligere 10 multiplikations- I

cyklusser under anvendelse af hver af primerne: I

I d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG)og I

I d(CCCCACAGGGCAGTA ACGGCAGACTTCTCC), I

20 I

som multiplicerer et 58 bp langt fragment indeholdt i det ovenfor fremstillede 100 bp I

lange fragment. Disse sidste 10 muftiplikationscyklusser blev udført ved at fortynde I

10 μ I delprøven i 90 μ I frisk Tris-acetatpuffer beskrevet ovenfor indeholdende 100 nmol af I

hver dNTP og 200 pmol af hver primer. Reaktionsbetingelserne var som ovenfor I

25 anført. Efter 10 cyklusser blev en 10 μΙ delprøve (svarende til 100 ng af det oprindelige I

DNA) påsat en 6% NuSieve (FMC Corp.) agarosegel og blev visualiseret under anvendelse af I

ethidiumbromid. I

Figur 10 illustrerer denne gel belyst med UV-lys og fotograferet gennem et rødt filter, I

30 hvilket er kendt inden for fagområdet. Bane 1 er molekylvægtsmarkører. Bane 2 er en - I

delprøve af den ovenfor beskrevne reaktionsblanding. Bane 3 er en delprøve identisk I

med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at det oprindelige vildtype-DNA blev spaltet I

med Ddel forud for multiplikationen. Bane 4 er en delprøve af en reaktion identisk med den I

ovenfor beskrevne med undtagelse af, at human DNA, som er homozygot for I

35 seglcellebetaglobinallelet blev behandlet med Ddel forud for multiplikation (seglcelleallelet I

indeholder ikke et Ddel-restriktionssted i det fragment, som multipliceres her). Bane 5 er en I

delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at I

laksesperm-DNA blev anvendt i stedet for human DNA. Bane 6 er en delprøve af en reaktion I

identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at delprøven blev behandlet med Ddel I

37 DK 175248 B1 efter multiplikation (Ddel skulle omdanne det 58 bp lange vildtypeprodukt til 27 og 31 bp lange fragmenter). Bane 7 er en delprøve af materialet fra bane 4 behandlet med Ddel efter multiplikation (det 58 bp lange seglcelleprodukt indeholder intet Ddel-oenkendelsessted).

5 Påvisning af et 58 bp langt fragment, som er repræsentativt for et enkeltkopigen fra 1 mikrogram human DNA under anvendelse af udelukkende ethidiumbromidfarvning afen agarosegel kræver en multiplikation på ca. 500.000 gange. Dette blev opnået ved at anvende de to indskudte sæt af oligonukleotidprimere, som er beskrevet her. Det første set multiplicerer det 110 10 bp lange fragment, og det i det indre indskudte sæt multiplicerer et subfragment af dette produkt op til et niveau, som er hensigtsmæssigt til påvisning, som vist på figur 10. Denne fremgangsmåde med at anvende primere, som multiplicerer en lille sekvens indeholdt i den sekvens, som er multipliceret i den tidligere multiplikationsproces, og som er indeholdt i forlængelsesprodukter af de andre 15 primere, gør det muligt at skelne mellem vildtypen og seglcelleallelet ved β-globinlocusset uden at ty til hverken radioisotopiske eller andre besværlige metoder, såsom beskrevet af Conner et al., PNAS (USA), 8£):278 (1983) og Leary et al., PNAS (USA), 80:4045 (1983).

20 Eksempel 11

Det forventes, at den foreliggende fremgangsmåde er nyttig til i en patient DNA-prøve at påvise en specifik sekvens associeret med en infektiøs sygdom, såsom f.eks. Chlamydia, under anvendelse af en biotinyleret hybridiseringsprobe, som 25 spænder over den ønskede, multiplicerede sekvens og under anvendelse af den i beskrivelsen til US patent nr. 4.358.535, se ovenfor, beskrevne fremgangsmåde.

Den biotinylerede hybridiseringsprobe kan fremstilles ved interkelering og bestråling af et delvis dobbeltstrenget DNA med en 4'-methylensubstitueret 4,5’-8-trimethylpsoralen knyttet ti! biotin via en afstandsarm med formlen: 30 R R" * ii(CH2)2-0-[(CH2)x01y-CH2CH2-N- hvor R betegner -H eller en -CHO-gruppe, R" betegner -H, x er et tal på fra 1 til 35 4, og y er et tal på fra 2 til 4, som beskrevet i EP 156.287. Påvisning af biotinylgrupper på proben kan opnås ved at anvende et streptavidin - sur phosphatase - kompleks, som kan opnås kommercielt fra Enzo Biochemical under anvendelse af de påvisningsmetoder, som foreslås af leverandøren i dennes brochure. Den hybridiserede prøve ses som en plet af udfældet farve på grund afbindingen på påvisningskomplekset

I DK 175248 B1 I

I 38 I

I og den efterfølgende reaktion katalyseret af sur phosphatase, hvilket frembringer en I

I udfældelig farve. I

I Cellelinien SC-1 (CTCC nr. 0082) blev deponeret 19. marts 1985 hos American Type I

I 5 Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA med I

I ATCC deponeringsnummer CRL nr. 8756. I

Opsummerende angår den foreliggende opfindelse oligonukleotider (primere) der I

H tillader eksponentiel multiplikation ved polymerase-kædereaktion af en eller flere I

H 10 specifikke nukleinsyresekvenser og vedhæftning af en promotorsekvens, hvorved I

H primerforlængelsesprodukter frembringes, som efterfølgende kan fungere som I

I templater for yderligere primerforlængelsesreaktioner. Oligonukleotiderne er især I

I anvendelig til påvisning af nukleinsyresekvenser, som i begyndelsen kun er til stede i I

I meget små mængder. I

Claims (8)

1. 39 DK 175248 B1
2. 1. Et første og et andet enkeltstrenget oligonukleotid, der tillader eksponentiel multiplikation ved polymerase-kædereaktion af en specifik nukleinsyresekvens indeholdt i 5 en enkeltstrenget eller dobbeltstrenget nukleinsyre, eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer, kendetegnet ved, at (a) det første enkeltstrengede oligonukleotid er i det væsentlige komplementært til 10 den enkeltstrengede nukleinsyre eller til den ene streng i den dobbeltstrengede nukleinsyre; (b) det andet enkeltstrengede oligonukleotid er i det væsentlige komplementært til et komplement af den enkeltstrengede nukleinsyre eller til den anden streng i den dobbeltstrengede nukleinsyre; 15 (c) det ene af de enkeltstrengede oligonukleotider yderligere indeholder en sekvens, som er ikke-komplementær til nukleinsyren, hvilken sekvens er en promotorsekvens; og (d) de dele af oligonukleotiderne, der er i det væsentlige komplementære, afgrænser enderne af den specifikke nukleinsyresekvens, der skal 20 multipliceres.
3. 2. Oligonukleotider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at promotoren er T7-promotoren.
4. 3. Oligonukleotider ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den specifikke nukleinsyresekvens er indeholdt i en større sekvens.
5. 4. Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af krav 1-3, 30 kendetegnet ved, at nukleinsyren er DNA eller RNA, herunder mRNA, hvilket DNA eller RNA er enkelt- eller dobbeltstrenget eller er en DNA-RNA-hybrid. 1 2 Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af krav 1-4, kendetegnet ved, at nukleinsyren er genomisk DNA. 35 2 Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af krav 1-5, kendetegnet ved, at de dele af oligonukleotiderne, der er i det væsentlige komplementære, indeholder fra mindst ca. 7 til 25 nukleotider. I 40 DK 175248 B1 I
6. 7. Anvendelse af oligonukleotiderne ifølge et hvilket som helst af krav 1-6 til eksponentiel I multiplicering ved polymerase-kædereaktion af en specifik nukleinsyresekvens indeholdt i I I en enkelt- eller dobbeltstrenget nukleinsyre eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer. I
7. 8. Anvendelse ifølge krav 7 til at muliggøre multiplikation, detektering og/eller karak- I terisering af specifikke nukleinsyresekvenser, der er associeret med infektiøse sygdomme, I såsom de der forårsages af bakterier, vira og protozoparasitter; genetiske lidelser, såsom I I de der forårsages af specifikke deletioner og/eller mutationer i genomisk DNA; eller cellu- I I lære lidelser, såsom cancer. I 10
8. 9. Anvendelse ifølge krav 7 til at muliggøre RNA-transkription.