DK175425B1

DK175425B1 - Cytochrom P-450-enzymer, Fremgangsmåde til fremstilling heraf samt Fremgangsmåde til hydroxylering af milbemycin eller ML-236-substrat

Info

Publication number: DK175425B1
Application number: DK198800534A
Authority: DK
Inventors: Tatsuji Matsuoka; Shunichi Miyakoshi
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1987-02-02
Filing date: 1988-02-02
Publication date: 2004-10-18
Also published as: KR880010123A; CA1313637C; FI880458A0; IE880278L; EP0281245B1; AU605543B2; DK53488D0; FI880458L; EP0281245A3; IE63843B1; KR960011917B1; EP0281245A2; FI94647C; DE3850589T2; DE3850589D1; FI94647B; HK1005747A1; ATE108483T1; DK53488A; ES2059499T3

Description

= .....—— Μ ··«' --r —Ta=-· ·Μ ·Ι I I ---· - ' - *· DK 175425 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte cytochrom P-450-enzymer, en fremgangsmåde til fremstilling heraf samt en fremgangsmåde til hydroxylering af milbemy-cin eller ML-236-substrat.

Enzymet cytochrom P-450 er blevet fundet hos dyr, planter og 5 mikroorganismer. Det cytochrom P-450-afhængige monooxygenase-system katalyserer biosyntesen af vigtige fysiologiske forbindelser og deltager i metabolismen af udefra kommende stoffer, xenobiotika. Det kan som substrat anvende et bredt udvalg af naturlige produkter og lægemidler, 10 ΤΠ dets enzymatiske virkning kræver cytochrom P-450 et coen-zym, såsom NAD(P)'H, et elektrontransportprotein, såsom ferre-doxin, og molekylært oxygen. Der postuleres følgende reaktionsforløb for metabolismen af et substrat S til opnåelse af 15 et produkt SOH, idet Fe angiver det aktive sted på cytochrom P-450: P-450-Fenm* SH . e“

S0H>/ P-450-FeflD-SH

20 I \0t tP-450-WV)=0SHJ j

”**>1 P-lio-FedDSH

“Λ / 2 5 P-450-feOni-SH P-W-FeO®·» 4,»

^ P-450- Fe OD · SH

0?

Ifølge dette reaktionsforløb tilvejebringes elektronerne, som 30 . .

bevirker reduktionen, fra NAD(P)H gennem elektrontransportproteinets formidlende virkning.

Almindeligvis er cytochrom P-450-enzymer hovedsageligt blevet isoleret fra eukaryoter, og de er uopløselige i vand.

Cytochrom P-450-enzymer, som er isoleret fra prokaryoter, er også kendt, indbefattet P-450cam fra Pseudomonas putida [J.

35

I DK 175425 B1 I

i 2 I

I Biol. Chem. (1974), 249, 94]; Ρ-450βμ..ι og P-450g^_3 begge fra I I Bacillus megaterium ATCC 14581 [beskrevet -i henholdsvis I I Biochim. Biophys. Acta (1985), 838, 302 og J. Biol. Chem. I I (1986), 261, 1986, 7160]; P-450a, P-450b og P-450c fra Rhizo- I I 5 bi uro japonicum [Biochim. Biophys. Acta (1967) 147, 399]; og I I p~450npd fra Nocardia NHI [Microbios (1974), 9, 119]. I

I Cytochroro P-450-enzymer, som er oprenset fra Streptomyces- I I mikroorganismer, forbliver relativt ubeskrevne. Induktionen af I I 10 et cytochrom P-450 i Streptomyces griseus via soyabønneroel er I I beskrevet i Biochem. and Biophys. Res. Comm. (1986), 141, 405. I I Isoleringen og egenskaberne hos to former af en 6-deoxyery- I I thronolid-B-hydroxylase fra Saccharopolyspora erythraea I I (oprindeligt klassificeret som Streptomyces erythraeus) er be- I I 15 skrevet i Biochemistry (1987), 26, 6204. I

I I EP-patentskrift nr. 215.665 er der beskrevet en enzymatisk I I hydroxy1 er ing. Hydroxyler i ngen udføres med et hydroxylerings- I I enzym, som fremstilles af en mikroorganisme af slagten Strep- I I 20 tomyces eller af slægten Nocardia. I

I Fire nyligt isolerede stammer af Streptomyces, som producerer I I egnede hydroxyleringsenzymer, er beskrevet i EP-patentskri ft I I nr. 215.665, indbefattet Streptomyces sp SANK 62585. I I 25 I

I Streptomyces sp SANK 62585 blev deponeret hos the Fermentation I I Research Institute, Japan den 5. september 1985 med depone- I I ringsbetegnelsen FERM P-8440 og gendeponeret under Budapest- I I traktaten den 13. august 1985 med deponeringsbetegnelsen FERM I I 30 BP-1145. I

I Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilveje- I bringe hidtil ukendte cytochrom P-450-enzymer. Det er også et I I formål med denne opfindelse at tilvejebringe en ny fremgangs- I I 35 måde til fremstilling af cytochrom P-450-enzymer og fremgangs- I I måder til fremstilling af hydroxy 1erede forbindelser under an- I I vendelse af sådanne enzymer. I

^~__-.:gr--.T -\ rr-^r ^Tyiwa^' : :·, -·- " — _i -. · .y, DK 175425 B1 3

Den foreliggende opfindelse anviser hidtil ukendte hydroxyleringsenzymer som angivet i krav l, 2 og 3. Den foreliggende opfindelse anviser endvidere en fremgangsmåde som angivet i krav 4 til fremstilling af hydroxyleringsenzymeme ifølge opfindelsen.

Endelig anviser den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde som angivet i krav 5-7 5 til hydroxylering af et milbemycin eller ML-236-substrat.

Mere præcist tilvejebringer den foreliggende opfindelse de hidtil ukendte enzymer cytochrom P-450sca_i, P-450sca_2 og

P-450sca-3· Når ét eller flere af disse enzymer forenes med I

10 passende komponenter til opnåelse af et effektivt system, kan dette system omdanne et substrat for enzymet til et hydroxy-leret derivat.

Enzymerne cytochrom P-450sca_i, cytochrom P-450sca_2 og/eller 15 cytochrom P-450sca_3 kan ekstraheres og oprenses fra den kendte Streptomyces SANK 62585 FERM BP-1145, som nu identificeres som værende af arten Streptomyces carbophilus.

Som beskrevet i EP-patentskrift nr. 215.665 vides det, at 20 Streptomycesstammen SANK 62585 hører til slægten Streptomyces af Act inomyceterne. Oer henvises til EP-patentskri ft nr.

215.665, der inkorporeres heri ved denne henvisning.

De morfologiske og fysiologiske egenskaber hos Streptomyces-25 stammen SANK 62585 blev bestemt under anvendelse af konventionelle medier og metoderne beskrevet af Shirling og Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology (1966), 16, 313-340] sammen med flere supplerende prøver. Der blev foretaget observationer af kulturen efter inkubering ved 28eC i 14 30 dage. De anvendte farvenavne blev tildelt i overensstemmelse med "Guide to Colour Standard" (en håndbog udgivet af Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo, Japan). Kulturernes karakteristika blev sammenlignet med forskellige kendte act inomycetesorters, som er beskrevet i overensstemmelse med ISP (International 35 Streptomyces Project) -standarder og i "The Actinomycetes,

Volume 2" af Waksman, "The ISP Report" af Shirling og Gottlieb, "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", 8. udgave, og anden nyere litteratur angående actinomyceternes taksonomi .

I DK 175425 B1

I I

I 1. Morfologiske egenskaber I

I De vegetative hyfer hos stammen SANK 62585 var, når de blev I

I observeret under et mikroskop og under et elektronmikroskop, I

I 5 fuldt udviklede med forgrening, og lufthyferne var monopodialt I

I forgrenede. I

I Sporekæden hos stammen SANK 62565 er sædvanligvis lige eller I

I bugtet men undertiden spiralformet, og sporeoverfladerne er I

I 10 glatte. Der kan ikke observeres nogle særlige organer, såsom I

I hvirvler, sclerotier, basal hyfefragmentering eller sporangier I

I hos SANK 62585. I

I 2. Vækst på taksonomiske medier I

I 15 I

Stammens vækst på forskellige medier er vist i næste tabel, I

hvor følgende forkortelser anvendes: I

I G; vækst I

I 20 AM: luftmycelium I

I R: bagside I

SP: opløseligt pigment. I

Medium Emne Egenskaber hos stamme SANK 62585 I

I 25 I

I Saccharose- G Ikke så god, bleg gulligorange (2-9-9) I

nitratagar I

I AM Normalt, pulveragtigt, grålighvidt (N-9) I

30 I

I R Bleg gulligorange (2-9-9) I

I SP Intet I

35 Glucose/ G Ikke så god, gulliggrå til brunlig grå I

I asparagin- [(2-5-9) til (1-9-10)] I

I agar I

I AM Spor,grålighvidt(N-9) I

DK 175425 B1 I

R Gullig grå til brunliggrå [(2-5-9) til I

(1-9-10)] I

SP Intet I

Glycerol/ G Ikke så god, bleg gulligbrun (2-7-9) I

asparaginagar I

(ISP 5) ‘ I

AM Normalt, puIveragt igt, grålighvidt (N-9) I

10 I

R Bleg gulligbrun (4-8-9) I

SP Intet I

I 15 Stivelse/ G Meget god, brunliggrå (2-6-9) I uorganisk I saltagar AM Kraftig, pulveragtigt, gulliggråt til I (ISP 4) klart olivengråt [(1-9-10) til (2-8-12)] I 20 R Blegbrun til brunliggrå [(2-8-9) til I (2-4-9)] I SP Intet I 25 Tyrosinagar G God, mørk gulligbrun (4-4-9) I (ISP 7) I AM Meget kraftigt, pulveragtigt, gulliggrå I til klart olivengråt [(1-9-10) til I (2-8-11)] I 30 I R Mørk brunliggrå (2-3-9) I SP Intet I 35 Pepton-gær- G God, gulligbrun (4-6-9) I jernagar I (ISP 6) AM Intet I DK 175425 B1 R Gulligbrun (4-6-9) SP Intet 5 Næringsagar G Ikke så god, klar olivengrå (4-8-10) H (Difco) AH Intet R Klar olivengrå (4-8-10) SP Intet Gær-mal tagar G Meget god, gulligbrun (6-7-9) I (ISP 2) 15 AM Meget kraftigt, pulveragtigt, klart oli- vengråt (2-8-11) H R Gulligbrun (6-5-9) 20 SP Intet

Havremels- G Meget god, grålig gulbrun (4-5-9) agar I (ISP 3) AM Meget kraftigt, pulveragtigt, klar oliven- 25 gråt (2-8-12) I R Mørk brunliggrå (2-3-9) I SP Intet I 30 I Kartoffel/ G Dårlig, gulliggrå til mat orange ((1-9-10) I gulerodseks- til (6-8-6)] I trakt AM Normalt, pulveragtigt, blegt gulligorange I 35 (2-9-9) I R Blegbrun (3-8-6)

DK 175425 B1 I

SP Intet I

3. Fysiologiske egenskaber I

5 Oe fysiologiske egenskaber hos stamme SANK 62585 er vist i den I

næste tabel, hvor medierne, som er anført som medium 1 til 4, I

er*. I

Medium 1: Gærekstrakt-ma 1tekstraktagar (ISP 2) I

10 Medium 2: Trypton-gærekstraktsuppe (ISP 1) I

Medium 3: Pepton-gærekstrakt-jernagar (ISP 6) I

Medium 4: Tyrosinagar (ISP 7) I Egenskaber hos stamme SANK 62585 I 15 I Hydrolyse af stivelse positiv I Flydendegørelse af gelatine negativ I Reduktion af nitrat positiv I Koagulering af mælk positiv I 20 Peptonisering af mælk positiv

I Væksttemperaturinterval (medium 1) 4-45°C

I Optimal vækst temperatur (medium i) 15-33°C

I Melanoiddannelse (medium 2) negativ I (medium 3) pseudopositiv* I 25 (medium 4) tvivlsom I * pseudopositiv: der findes visse tilfælde af melanrndan- I nelse henimod dyrkningens afslutning I 30 Under anvendelse af Pridham-Gott1ieb-agar blev assimilering af I forskellige carbonkilder undersøgt efter dyrkning i 14 dage.

I Eftersom stammen SANK 62585 vokser godt på sådanne kontrolme- dier uden en carbonkilde, er det vanskeligt at bedømme den ek- sakte assimileringskapacitet. Derfor viser den følgende tabel, I 35 som reference, stammens relative assimileringskapacitet på et I reference-kontrolmedium (det vil sige en bedømmelse af for- I skellen i vækst på kontrolmedier med og uden den tilsatte I carbonkilde).

I DK 175425 B1 H Carbonassimilering H D-glucose udnyttet L-arabinose ikke udnyttet 5 D-xylose udnyttet

Inositol udnyttet D-mannitol ikke udnyttet 0-fructose ikke udnyttet

Saccharose ikke udnyttet 10 Raff i nose udnyttet H Cellobiose udnyttet H Trehalose udnyttet

Kontrol ikke udnyttet 15 4. Cel 1ekomponenter H Cellevæggen hos stamme SANK 62585 blev analyseret ved metoden ifølge B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421-423 (1964)]. Idet L,L-diaminopime1 i nsyre og glycin blev identifi- 20 ceret i cellevæggene hos alle stammerne, anses cellevæggene for at være af type I. Mikroorganismernes hele cellers sukker- komponenter blev bestemt ved metoden ifølge M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (1968)].

Oer kunne ikke observeres noget karakteristisk mønster.

I EP-patentskrift nr. 215.665 angives ikke arten for stammen SANK 62585. Yderligere betragtninger i overensstemmelse med de I sædvanlige standarder [ISP (The International Streptomyces

Project); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.

Η 30 udgave; The Actinomycetes af S.A. Maksman; og andre nyere re- ferencer med hensyn til actinomycetes] viser, at de morfolo- I g i ske og fysiologiske egenskaber var praktisk taget identiske med de hos Streptomyces carbophilus.

35 Af disse årsager er Streptomycesstamme SANK 62585, som frem- stiller cytochrom P-450-enzymerne, blevet identificeret som

Streptomyces carbophilus SANK 62585. Som nævnt er denne stamme I blevet deponeret i overensstemmelse med forholdsreglerne i DK 175425 B1 9

Budapest-traktaten den 13. august, 1985, hos the Fermentation Research Institute, Japan, og har fået deponer ingsnummeret FERM BP-1145. Prever af stammen er tilgangelige under de relevante forholdsregler i Budapest-traktaten.

5

Actinomyceter, indbefattet Streptomyces carbophilus SANK 62585, muteres let både af naturlige årsager og som resultat af kunstige behandlinger, såsom UV-bestråling, strålingsbehandling og kemisk behandling. Til brug for den fore-l o liggende opfindelse er alle produktive mutanter af samme SANK 62585 indbefattet.

Disse mutantstammer indbefatter også enhver stamme, som er opnået ved genmanipulation, såsom genetisk rekombination, transduk t ion og transformation. Det er også vel kendt, at act i nomy-ceters egenskaber ændres i en vis grad selv inden for den 15 samme stamme efter gentagne dyrkninger. Derfor kan stammer ikke altid skelnes taksonomisk på grund af små forskelle i dyrkningsegenskaber.

Til brug for denne opfindelse er alle stammer, som kan fremstille ét eller flere af cy-20 tochrom P-450-enzymeme, og især stammer, som ikke kan adskilles tydeligt fra stamme SANK 62585 eller dens mutanter, indbefattet.

Dyrkning af Streptomyces carbophi1usstamme 62585 til fremstil-25 ling af P-450-enzymerne udføres hensigtsmæssigt ved podning af et konventionelt dyrkningsmedium indeholdende næringsstoffer, der er velkendte til anvendelse sammen med sådanne mikroorganismer. Således indeholder dyrkningsmediet assimiler-bare carbonkilder og assimi1 erbare nitrogenkilder og Ofte 30 uorganiske salte. Eksempler på assi mi 1 erbare carbonkilder indbefatter glucose, saccharose, stivelse, glycerol, hirsegelé, melasse og soyabønneo1ie. Eksempler på assirailerbare nitrogenkilder indbefatter faste stoffer fra soyabønner, (såsom groftmalede soyabønner eller soyabønnemel), hvedekim, kødeks-35 trakter, pepton, majsstøbevæske, tørret gær og ammoniumsalte, såsom ammoniumsulfat. Om nødvendigt kan uorganiske salte såsom natriumchlor id, kaliumchlorid, calciumcarbonat og forskellige phosphater, også indbefattes. Mediet steriliseres

I DK 175425 B1 I

I I

sædvanligvis og har en pH-værdi, soro er indstillet til 5 til I

i I

Den særlige anvendte dyrkningsteknik er ikke afgørende for op- I

5 findelsen, og enhver teknik, som er almindeligt anvendt til I

dyrkningen af Streptomyces, kan ligeledes anvendes i forbin- I

I delse med den foreliggende opfindelse. Generelt vil de an- I

vendte teknikker blive valgt roed hensyn til industriel I

I effektivitet. Således foretrækkes sædvanligvis flydende dyrk- I

10 ning, og den neddykkede dyrkningsmetode er roest hensigtsmæssig I

I fra et industrielt synspunkt. Oyrkningen udføres fortrinsvis I

under aerobe betingelser. I

Enzymerne ifølge opfindelsen er inducerbare enzymer, og de I

I 15 fremstilles ikke, med mindre der er et induktionsmiddel til I

I stede. Fortrinsvis vælges induktionsmidlet til at være det I

I samme som det isolerede enzyms påtænkte substrat. Når der er I

I gået fra 4 timer til 3 dage efter podningen tilsættes for- I

I trinsvis 1 til 5 mM, mere foretrukket 2 roM induktionsmiddel, I

20 hvorefter dyrkningen fortsætter i 2 timer til 1 uge, fortrins- I

I vis i cirka 1 dag. Dyrkn i ngstemperaturen er typisk 20 til I

I 45eC, fortrinsvis 25 til 30eC, optimalt cirka 28*C. Ryste- I

I dyrkning eller iltningsteknikker kan anvendes. I

25 De celler, som opnås ved dyrkningen, kan sønderdeles ved ul- I

tralydbehandling i pufferopløsning, og derefter giver den su- I

pernatant, som opnås ved centrifugering, en rå enzymopløsning. I

I Enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse er til stede i I

I den supernatant, som opnås ved centrifugering ved 105.000 gi I

I 30 l time. I

For at opnå elektroforetisk rene P~450sca_j, P-450sca_2 og I

P-450sca_3 kan råenzymopløsni ngen, som opnås efter sønderde- I

I ling af cellerne, oprenses ved dialyse, ionbytningssøjlekroma- I

35 tografi, gelfi 1 trering, hydroxyapatitsøjlekromatografi eller I

I en kombination deraf. I

En illustrativ fremgangsmåde til oprensning er vist i den føl- I

I gende tabel . I

_ - ~ - -·γ '· —...aj 'jpnF- Τ' ΓΤ...-*'·- '' ' ·Τ7?. 7"··., :": .' · _’» -τ»1 »" · ; :.τ DK 175425 B1 η

Tabel A

Dyrket suppe 5000 ni i 5 Høst af celler 8000 omdr./min., 15 minutter ; Sønderdeling af celler Ultralyd, 10 minutter i

Udvinding af supernatant 14000 omdr./min. 30 minutter 10 i

Dialyse pH 7,4 med 0,1 M Tris-saltsyre- pufferopløsni ng i DEAE Toyopearl (handelsnavn, 0 til 0,30 M NaCl-gradient, elu-15 Toyo Soda Industries Inc.) eret ved cirka 0,10 M NaCl søjlekromatografi i DEAE Toyopearl-søjlekroma- 0 til 0,20 M NaCl-gradient, el u- tografi eret ved cirka 0,10 M NaCl 20 i

Cellurofin (handelsnavn,

Chisso Inc.) søjlekromatografi i

Dialyse pH 7,4 under anvendelse af 0,01 M

25 phosphatpuffer i

Hydroxylapatit-(Bio-Rad 0,01 M til 0,20 M phosphatpufferine.) søjlekromatografi koncentrationsgradient 4

30 p-450sca-l» p"^50sca-2 °S

P-450sca_ 3

Ved hydroxy1 apat itkromatografi en, hvor der anvendes en koncentrationsgradient af phosphatpuffer, elueres cytochrom 35 P-450sca_j iørst (ved cirka 0,05 M phosphatpuffer), cytochrom P-450sca>2 elueres som nummer to (ved cirka 0,08 M phosphat-puffer) og cytochrom p-450sca_3 elueres som det tredje (ved cirka 0,10 M phosphatpuffer).

I DK 175425 B1 H Hvert oprenset cytochrom P-450-enzym, som opnås på denne måde, I bevæger sig som et enkelt bånd mod anoden i SDS-polyacrylamid- H elektroforese.

5 Cytochrom P~450sca_i, cytochrom p-450sca_2 og cytochrom P-450sca_3» som er tilvejebragt i overensstemmelse med den fo- religgende opfindelse, er forskellige fra andre cytochrom P-450-enzymer.

10 Hvert enzym ifølge den foreliggende opfindelse har en molekyl- vægt på 46.000 ± 1000, baseret på målinger under anvendelse af SDS-polyacry1 ami delektroforese. Den maksimale UV-absorption sker ved 417 nm. I et reduceret CO-spektrum contra reduceret differensspektrum har cytochrom P-450sca_i en maksimal absorp- 15 tion ved 449 nm, og cytochrom p-450sca_2 og cytochrom P-450sca.3 har begge en maksimal absorption ved 448 nm.

Hvert enzym har en unik aminosyresaramensætning. Der gives føl- gende data: I 20

Aminosyrerester Rester per molekyle I P~450sca_j P"^®0sca-2 I Asx 39,1 36,9 I 25 Thr 30,9 30,0 I Ser 22,4 21,1 6lx 41,8 39,6 I Pro 26,8 26,7 I Gly 28,7 25,9 I 30 Ala 48,0 45,4

Cys 3,1 1,9 I Val 31,4 30,0 I Het 7,8 8,1 I Ilo 18,2 18,0 35 Leu 49,7 49,1

Tyr 4,9 5,0 I Phe 15,2 15,0

His 13,6 13,8 . . .11 - - -, .'..« ! · .T?73i^Egac: jg-gr J ·°τ··.^Ηί....jji.5^;L .T.jm... - ...t.yMuaWPliPS- · JT- - '. nr DK 175425 B1 13

Lys 9,0 8,4

Arg 34,0 34,2

Trp 1,0 1.1 5 Total 425,6 410,2

Enzymerne ifølge opfindelsen er anvendelige som hydroxyle-ringsenzymer. De kan hydroxylere en rakke forskellige forbindelser. Derfor anviser den foreliggende opfindelse endvidere 10 en fremgangsmåde til hydroxylering af et substrat, som indbefatter anvendelse af et enzym ifølge denne opfindelse til indførelsen af én eller flere hydroxygrupper.

Enzymet bringes fortrinsvis i kontakt med substratet i et van-15 digt medium, for eksempel i en phosphatpufferopløsning, ved en pH-værdi i intervallet fra 5 til 9, mere foretrukket 6,5 til 8,0, mest foretrukket omkring 7,4. Reaktionstemperaturen er fortrinsvis i intervallet fra 20 til 45®C, mere foretrukket fra 25 til 30®C. Den optimale temperatur er omkring 30“C. Sub-20 stratkoncentrationen i reaktionsmediet er fortrinsvis i intervallet fra 0,01 til 5,0 vægt%. Tidsrummet for reaktionen er normalt fra 1 minut til 5 dage, mere almindeligt fra 1 dag til 5 dage, selv om dette kan variere, afhængigt af substratkoncentrationen i reaktionsblandingen, reaktionstemperaturen og 25 andre faktorer.

Efter afslutning af omdannelsesreaktionen kan den hydroxyle-rede forbindelse isoleres ved anvendelse af konventionelle fremgangsmåder, for eksempel filtrering, opløsningsmiddeleks-30 traktion, kromatografi, krystallisation og andre isoleringsfremgangsmåder. Sådanne fremgangsmåder vil blive valgt ud fra hensyn til produktets identitet. Før, under eller efter isoleringen kan produktet om ønsket derivatiseres. 1

Den foreliggende opfindelse vil blive illustreret yderligere under henvisning til to substratklasser med tydeligt forskellig struktur, nemlig makrolidforbindelser, såsom milbemyciner, og ML-236B-forbindel ser.

I DK 175425 B1 14

H Der er adskillige klasser af kendte forbindelser med en struk- I

tur, som er baseret på en Ιβ-leddet makrolidring. De opnås ved H fermentering af forskellige mikroorganismer eller semisynte- tisk ved kemisk der ivatisering af sådanne naturlige fermente- I 5 ringsprodukter og udviser acaricid, insekticid, anthelmin- tisk virkning og andre antiparasitiske virkninger. Milbemyci- nerne og avermectinerne er eksempler på to sådanne klasser af I kendte forbindelser, men der eksisterer også forskellige andre klasser, som identificeres ved forskellige navne eller kode- 10 numre. Disse forskellige macro!idforbindelsers navne er gene- relt taget fra navnene eller kodenumrene af de mi kroorgan i s- H mer, som fremstiller de naturligt forekommende medlemmer af hver klasse, og disse navne er derefter blevet udvidet til at dække de kemiske derivater fra samme klasse med det resultat 15 at der ikke er nogen standardiseret, systematisk nomenklatur til generel anvendelse for sådanne forbindelser.

For at undgå forvirring vil henvisningerne i denne beskrivelse være baseret på den hypotetiske moderforbindelse, som er re- 20 præsenteret ved formlen (C): I „CH3 22JL ^CH3 I $1

I I« I

2 5 ChCji I joSf <c> I o—LsJll I I"CH3

I 30 OH

I For at undgå tvivl viser formel (C) også nummereringen af de I carbonatomer, som er mest relevante for forbindelserne ifølge 35 den foreliggende opfindelse. Methylgruppen i 4-stillingen er I nummereret C-26.

I De naturligt fremstillede milbemyciner danner en serie af I forbindelser. Mi 1bemycin-A3 og -A4, blandt andre, er beskrevet DK 175425 Β1 15 i US-patentskrift nr. 3.950.360, og mi 1beraycin-D blev beskrevet i US-patentskrift nr. 4.346.171, selv ora den blev betegnet som "Forbindelse B-41D". Disse forbindelser kan repræsenteres ved den ovennævnte formel (C), hvor 25-stillingen er substi-5 tueret med henholdsvis en methylgruppe, en ethylgruppe eller en isopropylgruppe. Mi 1bemycinanal ogen, som er substitueret i 25-stillingen med en sec.-butyl, er beskrevet i US-patent-skri ft nr. 4.173.571 .

10 13-hydroxymilbemyciner er beskrevet i US-patentskri ft nr. 4.093.629 og i EP-patentskrift nr. 246.739. 13-hydroxy-5-keto-mi1bemycinderivater er beskrevet i US-patentskri ft nr.

4.423.209 samt i EP-patentskrift nr. 184.308 og JP-patentan-søgning Kokai 108785 (1984). Milbemycin-5-oxim-deri vater er 15 beskrevet i US-patentskrift nr. 4.547.520 og i EP-patentskrift nr. 203.832. I GB-patentskrift nr, 2.168.345 beskrives milbe-mycinderi vater, som har en carboxysubstituent eller en esteri-ficeret carboxysubstituent i 13-sti 11 i ngen i kombination med en hydroxysubstituent eller en esterificeret hydroxysubstitu-20 ent i 5-sti11 ingen.

14-hydroxymethylmilbemycinforbindelser kan fremstilles ved oxidation af et 5-ketomi1bemycin med selenoxid/t-butylhydro-peroxid efterfulgt af reduktion af ketogruppen i 5-stillingen 25 med natriumborhydrid som beskrevet i J. Am. Chem. Soc. (1977), 99, 5526.

24-hydroxymethylmilbemycinforbindelser kan fremstilles ved mikrobiel hydroxylering af en miIbeaycinforbindelse under anven-30 delse af Amycolata autotrophica-stammerne, som er deponeret hos the Fermentation Research Institute, Japan, som FERM P-6181, FERM P-6182 og FERM P-6183. Disse deponerede stammer blev på deponer ingstidspunktet kaldt henholdsvis Nocardia sp SANK 62781, Nocardia sp SANK 62881 og Nocardia sp SANK 62981.

35 Deres mykologiske egenskaber er beskrevet i JP-patentansøgning Kokai 58-89191. Som resultat af en taksonomisk betragtning er stammerne i øjeblikket placeret hos slægten Amycolata uafhængigt af slægten Nocardia, på grund af forskelle i cellevægs- I DK 175425 B1

I 16 I

I sammensatn i ngen [International Journal of Systematic Bacterio- I

logy (1986), 36, 29]. I

I Ligesom milbemycinerne er avermectinerne baseret på den samme I

5 16-leddede macroli dr ingforbindelse. Avermecti nerne er for ek- I

I sempel beskrevet i J. Antimicrob. Agents Chemother., 1979, 15, I

I 361 (1979) og J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 421$. Oisse for- I

I bindeiser kan repræsenteres ved ovennævnte formel (C), men I

I hvor 13-sti 11 i ngen er substitueret med en 4'-(α-1-oleandro- I

I 10 syl)-a-L-oleandrosyloxygruppe. 25-stillingen kan være substi- I

I tueret med en isopropylgruppe eller en see.-butylgruppe, og I

I der er enten en carbon-carbon-dobbeltbinding mellem 22- og I

I 23-sti11 i ngerne eller en hydroxygruppe i 23-sti11 ingen. I

I 15 Avermectinerne defineres som følger: I

I avermectin C22~C23 R25 R23 R5 I

I Aja db see.-Bu H OMe I

I 20 A|b db i-Pr H OMe I

I A2^ sb see.-Bu OH OMe I

I A2b sb i-Pr OH OMe I

I Bja db see.-Bu H OH I

I Bjb db i-Pr H OH I

I 25 B2a sb see.-Bu OH OH I

I B2b sb i-Pr OH OH I

I Kun i ovennævnte tabel er R25 en substituent i 25-stillingen; I

I R23 er en substituent i 23-sti 11 i ngen; og R5 er en substituent I

I 30 i 5-sti11 i ngen; "db” betegner en dobbeltbinding mellem 22- og I

I 23-sti 11 i ngen; og "sb" betegner en enkeltbinding mellem 22- I

I og 23-sti 11 i ngen. I

I 23-ketoderivaterne af avermectin A2a, A2b, B2a og B2b er kendt

I 35 fra US-patentskrift nr. 4.289.760. 22,23-dihydroavermecti ner I

I kan opnås ved reduktion af dobbeltbindingen mellem 22- og I

I 23-sti11 i ngen og beskrives i US-patentskri ft nr. 4.199.569. I

I Aglyconderivaterne af avermecti nerne, som er 13-hydroxymi1 be- I

""" ' "* T'" .....|Γ’ . . '-ag·"^ fi-Mi·1· J A^PPjji-. -. ,,--·1. ' ,. .^α,ι*,'. » .-.,L _ α , n|t 17 DK 175425 B1 myeinanaloger, har været beskrevet i litteraturen. De er sommetider blevet benævnt som C-076-forbindelser. Forskellige derivater er kendte: for eksempel beskrives i US-patentskrift nr. 4.201.861 sådanne derivater, som er substituerede med en 5 lavere alkanoylgruppe i 13-sti 11 i ngen.

I EP-patentsegning nr. 170.006 beskrives en familie af bioaktive forbindelser, som er fremstillet ved fermentering, og som identificeres kollektivt ved kodenummeret LL-F28249. Nogle af 10 disse har en 16-leddet marcrolidstruktur, som svarer til den ovenfor stående formel (C), substitueret med hydroxy i 23-sti11 i ngen og med en 1-methyl-1-propenyl, 1-methyl-l-butenyl eller 1,3-dimethyl-l-butenyl i 25-sti11 i ngen, I disse forbindelser kan hydroxygruppen i 5-stillingen også erstattes 15 af methoxy.

De samme eller lignende forbindelser, som er identificeret soo S-541-forbindelser, er kendt fra GB-patentskrift nr.

2.166.436. 23-ketoderivaterne og 23-deoxyderivaterne af S-541 20 er kendt fra BE-patentskrift nr. 904.709. S-541-derivaterne med en carbon-carbon-dobbeltbinding i 22- og 23-sti11 i ngen blev beskrevet i EP-patentskrift nr. 215.654. 26-hydroxy- og 26-Ci_4-alkanoyloxyderivaterne af S-541 og af 23-keto- og 23-deoxyderivaterne af S-541 er kendt fra EP-patentskrift nr.

25 237.341.

I GB-patentskrift nr. 2.176.182 beskrives endnu en gruppe ma-crol idantibiotika, som svarer til den ovenstående formel (C), med en hydroxygruppe eller en substitueret hydroxygruppe i 30 5-stillingen, en hydroxygruppe, en substitueret hydroxygruppe eller ketogruppe i 23-stillingen og en α-forgrenet alkenyl-gruppe i 25-sti 11 ingen.

Endnu en gruppe af beslægtede macrolidderivater beskrives i 35 JP-patentansøgning Kokai 62-29590. Oisse har en struktur, som svarer til den ovenfor stående formel (C), med en hydroxy-eller methoxygruppe i 5-stillingen. 13-sti 11 i ngen i ringen kan substitueres med en 4,-(cc-l-oleandrosyl)-α-1-oleandrosyloxy- I DK 175425 B1 I 18 gruppe som i avermectinerne, og der kan være en carbon-carbon- dobbeltbinding mellem 22- og 23-sti11 ingen, eller alterna- I tivt kan 23-sti11 i ngen være substitueret med en hydroxygruppe.

Substituenten i 25-sti 11 i ngen er af en type, som ikke findes i 5 de naturligt fremstillede milbemyciner og avermectiner, og indbefatter forskellige α-forgrenede alkyl-, alkenyl-, alkynyl-, a 1koxya1ky1 -, alkylthioalkyl- og cykloalkylalkyl- grupper, eller cykloalkyl-, cykloalkenylgrupper eller hetero- cykliske grupper. Denne 25-substituent indføres ved at 10 tilsætte den tilsvarende carboxylsyre eller derivat deraf til en avermectinproducerende mikroorganismes fermenteringssuppe.

De forskellige klasser af miIbemycinbeslægtede macrolidforbin- delser beskrevet ovenfor siges alle at have én eller flere 15 virkningstyper som antiobioti ske, anthelmintiske, ektoparasi- H ticide, akaricide eller andre pesticide midler. Imidlertid er der et fortsat behov for at tilvejebringe sådanne macrolid- forbindelser med modificeret virkning over for én eller flere paras itklasser. Der er også et fortsat behov for at udvikle 20 forbedrede veje til de kendte forbindelser.

Ved anvendelse af enzymerne ifølge opfindelsen kan opnås hid- til ukendte hydroxylerede macrolidforbindelser . Endvidere kan fremstilles kendte hydroxy1erede macrolider.

Den foreliggende opfindelse omfatter således en fremgangsmåde til fremstilling af en macrolidforbindel se med formlen (I)s 19 DK 175425 B1

I T

5 ch3II i

L °vo ]1ohT

10 0 i ch3

Y

hvor Ri betegner en methyl gruppe, en ethylgruppe, en isopro-15 pylgruppe, en see.-butylgruppe eller en gruppe med formlen -C(CH3)=CHR5, hvor R5 betegner en methyl gruppe, en ethylgruppe eller en isopropylgruppe, forudsat at, når Ri er en hydroxy-gruppe, betegner R3 en methylgruppe, en ethylgruppe, en iso-propylgruppe eller en see.-butylgruppe; og 20 -X{-Y)- betegner -CHOH- eller -C(=N-0H)-.

Fremgangsmåden til fremstilling af macrolidforbindelserne (I) involverer enzymatisk hydroxylering af en forbindelse med 25 formlen (II): CH3 f~YCH3 30 CH3ll

v °vo Jl ohT

·· “ p™,

Y

I DK 175425 B1 I 20 (hvor Ri og -X(-Y)- er som defineret ovenfor) ved anvendelse af et enzym ifølge opfindelsen.

Udgangsmaterialerne med formlen (II) er kendte forbindelser, 5 eller de kan fremstilles ved fremgangsmåder, soro er beskrevet i litteraturen om macrolider som nævnt ovenfor og inkorporeret heri ved denne henvisning. Naturligt forekommende milbemyciner med formlen (II) dannes ved fermentering og forekommer ofte som blandinger. Sådanne blandinger kan adskilles før omsætning 10 eller kan anvendes som sådanne.

Efter afslutning af omdannelsesreaktionen kan den ønskede for- H bindelse opnås fra reaktionssystemet, opsamles, isoleres og H oprenses ved konventionelle metoder. Eksempelvis filtreres re-

15 aktionsproduktet, og filtratet ekstraheres med et ikke-vand- I

blandbart, organisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet fra ekstrakten kan den tilbage- værende hydroxy lerede macrolidråforbindelse oprenses ved at udsætte den for søjlekromatografi under anvendelse af silica- 20 gel eller aluminiumoxid og ved eluering med et passende elueringsmiddel. Hvis udgangsmaterialet er en blanding, kan produktet isoleres som en blanding af hydroxylerede forbin- delser, som om ønsket kan adskilles ved anvendelse af kroma- I tografi eller andre egnede metoder.

Generelt har forbindelserne med formlen (I) parasiticid virk- ning, som omfatter insekticid, akaricid og anthelmintisk virk- ning, og/eller er anvendelige som mellemprodukter til syntese af andre forbindelser, især 13-esterificerede derivater med 30 forskellige insekticide, akaricide og anthelmintiske virknin- I ger.

Især har forbindelserne (I) akaricid virkning over for voksne I individer, larver og æg af Tetranychus, Panonychus og rustmi- 35 der, som er snyltere på frugttræer, grøntsager og blomstrende I planter, og over for Ixodidae, Germanyssidae, Sarcoptidae og så videre, som er snyltere på dyr.

. ' »«™—γττ-ι-γ ,., ·, . --fim· ---- ..:y. .ijn jgt x -gw«»---: ^T^Wi:^^rsr-,...T. r aal r: -- - V. :·% τίπρ,ΐμΐ ΜΒΜΑ . -Ji--i. ,^L HJUWtg.

DK 175425 B1 21

De virker også over for Oestrus, Lucilia, Hypoderma, Gautro-philus og så videre; lopper, lus og så videre, som er ektopa-rasittiske på dyr og fugle; husinsekter, såsom kakerlakker, husfluer og så videre; og forskellige skadelige insekter for 5 landbrug og havebrug, såsom bladlus og larver af Lepidoptera. Endvidere virker de over for Meloidogyne i jord, Bursaphelen-chus, Rizoglyphus og så videre.

Forbindelserne (1) er også virksomme over for insekter, som er 10 skadelige for planter, især insekter såsom fytophage insekter.

Endvidere har forbindelserne (I) parasiticid virkning og kan anvendes som et anthelmintisk middel til dyr og mennesker. De er især virksomme over for nematoder, som snylter på husdyr og 15 fjerkræ samt kæledyr, såsom grise, får, geder, kvæg, heste, hunde, katte og høns.

Til landbrugsmæssige og havebrugsmæssige formål kan forbindelserne (I) fremstilles i forskellige sammensætningstyper, som 20 allerede er kendt inden for disse områder, såsom pulvere, be-fugtelige pulvere, emulgerbare koncentrater og så videre. Sådanne sammensætninger kan fortyndes med vand til en koncentration af aktiv bestanddel på 1 til 10 ppm.

25 Til anvendelse som et anthelmintisk middel til dyr kan forbindelserne (I) fremstilles i forskellige tilberedningsformer, som allerede er kendt inden for dette område, såsom pulvere, tabletter, kapsler og injektioner. Når de administreres oralt, foretrækkes en dosis på 0,01 til 100 mg, fortrinsvis 0,5 til 30 50 mg af bestanddelen per 1 kg legemsvægt.

Den anden illustrative anvendelse af hydroxyleringsenzymerne ifølge opfindelsen er til hydroxyleringen af ML-235B-forbin-delser.

I US-patentskrift nr. 4.346.227 beskrives den enzymatiske hy-droxylering af en forbindelse, ML-236B, ML-236B-carboxylsyre eller et salt eller en ester deraf.

35 I DK 175425 B1 I 22 ML-236B er en lacton med strukturen (D):

Is 0 I “ϊΛλΛ I ie H son kan eksistere i en ringåben form Som en carboxylsyre med H strukturen (E):

I 15 OH

HOOC-^V^

HO J

o

I S

Hydroxylering giver typisk en blanding af to forbindelser, 25 hvor produktet af interesse (på lactonform) har strukturen

Oy/y/OH

I i L

I h3c/vy^so y I CH3AX^CH3

35 HO

I I US-patentskrift nr. 4.346.227 benævnes denne forbindelse Η M-4-1acton. Natriumsaltet af M-4 er nu kendt som natrium- DK 175425 B1 23 pravastatin. Således er natriumsaltet af ββ-hydroxyderivatet af ML-236B-carboxylsyre natriumpravastatin.

Hvert enzym ifølge opfindelsen hydroxylerer i det mindste 5 6-sti11 ingen i ML-236B-forb inde 1 ser i nærværelse af ferredoxin, ferrodoxin-NAOP+-reductase, NADPH og opløst oxygen, i overensstemmelse med det følgende reaktionsskema:

Η,/ν. M

C00HO 0» H,0 10 9 V __ 0 nOn h 3 ^ιί^'ί'ιΐ^ * Ftrrwtaan Fendnun

C I li (reduceret) (oxideret) J

w V j firreiloxifrNADP’- reduCa»

( . 'N

HADP NMDPH

15 + H.. ..

„HO'J tOONo 0 Hv.^1 [Mj 20 f ΧΧ ho , Således isoleres for eksempel natr i um-60-hydroxy-ML.-236B-car-boxylat som hovedprodukt sammen med natrium-6a-hydroxy-ML-236B-carboxy1 at som biprodukt.

25 Når hvert cytochrom P-450-enzym ifølge opfindelsen reagerer med natrium Ml-236B-carboxylat som substrat ved pH 7,4 i 5 minutter sammen med (a) ferredoxin, (b) ferredoxin-NADP+-reduc-tase, (c) NADP+, (d) NAOPH-regenereringssystem og (e) opløst 30 oxygen, ligger virkningstemperaturén i det mindste fra 4eC til 60“C. Den optimale pH-v*rdi for hvert cytochrom ligger i området fra 6,5 til 8,0. Hvert cytochrom er stabilt, når det opbevares i 24 timer ved 4°C i pH-interval 1 et mellem 6,0 og 9,0.

Anvendelsen af ferredoxin, ferrodoxin-NADP+-reductase, oxygen og NADPH er ikke afgørende. Alle komponenter, som kan aktivere cytochrom P-450, kan anvendes.

35 I DK 175425 B1

I 24 I

I Endvidere er substratet ikke begrænset til ML-236B-carboxy1 - I

I syrens natriumsalt. ML-236B-udgangsforbindel sen kan være den I

frie carboxylsyre, dens tilsvarende lacton eller et salt deraf I

I (for eksempel et metalsalt, et aminosyresalt eller et amin- I

I 5 salt), Cytochrom P-450-enzymet ifølge opfindelsen har i sig I

I selv ingen virkning på ML-236B-forbindel sens carboxygruppe. I

I Uafhængigt af andre faktorer giver ML-236B-1acton derfor en I

hydroxy-ML-236B-lacton, ML-236B-carboxylsyre giver en hydroxy- I

I ML-236B-carboxylsyre, og et salt af ML-236B-carboxy1 syre giver I

I 10 det samme salt af hydroxy-ML-236B-carboxyIsyren. Imidlertid I

I kan produktets identitet påvirkes af andre faktorer, især I

I reaktionsblandingens pH-værdi, på en måde, som er forudsigelig I

I ifølge kemiens almindelige love. Udgangsmaterialet og de andre I

I faktorer vælges fortrinsvis således, at det letter produktio- I

15 nen af natriumpravastati η. I

I Af de som udgangsmaterialer anvendte ML-236B-forbindelser er I

I alkalimetalsaltene, for eksempel natrium- eller kaliumsaltene, I

I særligt foretrukne, og natriumsaltet er det mest foretrukne, I

I 20 idet dette giver den bedste omdannelse af udgangsforbindelsen I

I til den ønskede, hydroxy lerede forbindelse, natriumpravasta- I

I t i η. I

I Cytochrom P-450-enzymet ifølge opfindelsen, som anvendes til I

I 25 hydroxylering af en ML-236B-forbindel se som substrat, er for- I

I trinsvis et, der fremstilles ud fra Streptomyces carbophilus I

I SANK 62585 under anvendelse af en ML-236B-forbindelse som I

I induktionsmiddel, især natrium-ML-236B-carboxylat. I

30 Måling af enzymaktiviteten udføres normalt på én ud af to må- I

der: I

(i) Måling på cytochrom P-450sca_^, cytochrom P-450sca_2 og I

cytochrom P-450sca_3 I

35 I

Målingen udføres i henhold til metoden af Omura og Sato et I

al., (J. Biol. Chem., 239, 1964, 2370). Det vil sige cytochrom I

P-450sca_i, cytochrom P-450sca_2 og cytochrom P*450sca_3 ana- I

25 DK 175425 B1 lyseres kvantitativt under anvendelse af den følgende formel, som er baseret på forskellen i absorbans af det reducerede CO kontra det reducerede differensspektrum ved 450 nm og 490 nm.

5 cytochrom P-450 (nmol/ml) = {0.0. 450 nm - O.D. 490 nm) x 1.000/91 (nmol/ml) (ii) Måling af dannelseshastighed af natriumpravastatin ud fra natrium-ML-236B-carboxy1 at 10

Den følgende blanding af komponenter anvendes:

Enzymopløsning indeholdende P-450 0,14 ml NADPH-regenerat i onssystem:

15 ΝΑ0Ρ+ 0,26 mM

GIucose-6-phosphat 14,0 mM

Glucose-6-phosphatdehydrogenase 0,2 enheder

Nicotinamid 10,0 mM

MgCl2 2,5 mM

20 Ferredoxin-NADP+-reductase (spinat) 0,04 enheder

Ferredoxin (spinat) 320,0 pg

Natrium-ML-236B-carboxy1 at 0,233 mM

Samlet volumen 0,20 ml 25

Komponenterne i tabellen blandes, opløsningen omrystes ved 30®C i 5 minutter, derefter tilsættes 10 pi 6 N NaOH, og reaktionen standses. Den mængde natriumpravastatin, som dannes af enzymsystemet, bestemmes med HPLC.

30

Ved anvendelse af testmetoderne til bestemmelse af aktivitet kan aktivitetstabet ved ændring i temperatur og pH bestemmes.

i

For eksempel inaktiveres hvert cytochrom fuldstændig ved pH 35 7,4 og 70eC i 60 minutter i nærværelse af 20% glycerol og 2 mM

dithiothreitol. Hvert cytochrom inaktiveres ved pH 3 eller et mere surt pH, og ved pH 11 eller et mere basisk pH (ved behandling ved 4eC i 24 timer i nærværelse af 20% glycerol og 2 mM dithiothreitol).

I DK 175425 B1 I

I 26 I

Virkningen af mulige inhibitorer over for cytochrom I

P-450sca_j, p'450sca_2» p-^50sca_3 og virkningen af metalioner I

I på aktiviteten af cytochrom P-450 kan bedømmes kvantitativt I

I ved anvendelse af metoden (ii). I

I I

Oer opnås typisk følgende resultater. I

Tilsat forbindelse Restaktivitet af enzym I

I p‘450sca-l p“450sca-2 p~*50sca-3 I

I 10 I

I 1 mM CoCl2 65,0% 67,5% 60,1% I

I 1 mM MnCl2 20,0% 18,7% 17,5% I

I 1 mM QUCI2 0% 0% 0% I

I 1 mM CaCI2 100,0% 100,0% 100,0% I

I 15 2 mM SKF-525A* 25,8% 22,8% 24,1% I

I 2 mM Cimetidin 58,7% 45,7% 43,8% I

I CO boblet ind i 1 minut 50,0% 55,0% 60,4% I

I *SKF-525A: 2-di ethy1 aminoethy1-2,2-dipheny1val erathydroch1 or id I

I 20 I

I Hvert cytochrom blev inhiberet af Co2+, Mn2+ og Cu2+. Hvert I

cytochrom blev også inhiberet af de typiske inhibitorer for I

cytochrom P-450-enzymer, såsom SKF-525A (2-diethy1aminoethyl- I

I 2,2-diphenylvalerathydrochlorid), cimetidin og carbonmonoxid. I

I 25 I

I Eksempler på opfindelsen I

I Oen foreliggende opfindelse illustreres ved de følgende ikke- I

I begrænsende eksempler. I

30 I

I Eksempel 1 I

I Et dyrkningsmedium indeholdende 2% glucose, 1% pepton og 0,1% I

I gsrekstrakt blev fremstillet og indstillet til pH 7,0. Ti Er- I

I 35 lenmeyerkolber med et volumen på 100 ml, som hver indeholdt 20 I

ml medium, blev steriliseret ved 121°C i 15 minutter. Hver I

kolbe blev derefter podet med en platinløkke af Strepto- I

I myces carbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145) , hvorefter dyrk- I

DK 175425 B1 27 ning ned omrystning ved 220 omdr/min blev fortsat ved 28eC i 3 dage, hvilket gav en podekultur.

100 ml aliquoter af mediet blev haldt i 500 ml Erlen-5 meyerkolber og steriliseret ved 121eC i 15 minutter. 0,5 ml podekultur blev sat til hver 500 ml kolbe, og der udførtes dyrkning af 50 kolber i fuld skala. Efter én dags dyrkning i fuld skala blev natrium-ML-236B-carboxylat sat til hver kolbe til et niveau på 0,1% og yderligere dyrkning blev fortsat i 1 10 dag.

Efter dyrkning blev cellerne indsamlet ved centrifugering, hvilket gav 190 g celler. Cellemassen blev suspenderet i to gange dens volumen 80 mM Tris-saltsyrepufferopløsning, som indeholdt 15 2 mM dithiothreitol og 20% glycerol, hvorefter cellerne blev sønderdelt med ultralyd. En rSenzymopløsning blev opnået som supernatant ved adskillelse ved centrifugering.

Fra råenzymopløsningen blev cytochrom P-450sca_i, cytochrom 20 p-450sca-2 °9 cytochrom P-450sca_3 oprenset i henhold til de fremgangsmåder, som blev vist i den foregående tabel A. Efter dialyse af råenzymopløsningen blev DEAE-Toyopear1-kromatografi udført to gange, hvorefter ge1fi 1 trer ingskromatografi blev udført med Cellurofin. Til sidst udførtes hydroxy1 apat itkromato-25 graf i, og enzymerne blev elueret med phosphatpuffer. Cytochrom P-450SCa-l blev elueret med cirka 0,06 M phosphatpuffer, cytochrom P-450sca>2 blev elueret med cirka 0,08 M phosphatpuffer, og cytochrom P-450sca_3 blev elueret med cirka 0,10 M phos-phatpuffer. Hvert enzym blev opnået som et elektroforetisk 30 rent P-450-enzym. Resultaterne af oprensningen er vist i den følgende tabel.

35 I . DK 175425 B1 I 28

Oprensningstrin Total- Total- p-450/ Udvinding protein P-450 protein af P-450 I (mg) (nmol) (nmol/kg) (*) 5 Råenzymopløsning 34268,0 1439 0,04 100,0 I DEAE Toyopear1 650 S 660,1 1439 2,18 100,0 I DEAE Toyopear! 650 S 55,3 466 8,43 32,4

Cellurofin GCL 2000 m 27,7 302 10,90 21,0

Hydroxylapatit* I 10 P-450sca-i 8,4 110 13,05 7,6 I P-450sca_2 9/5 121 12,74 8,4 I P-450sca>3 1/9 24,1 12,80 1,7

*Hydroxy1 apat it: ONA-kvalitet Bio-gel HTP

15

Derefter udførtes aminosyreanalyse.

Bortset fra Cys og Trp blev am i nosyrerne fremstillet ved hy- drolyse med 6 N HCl ved 110°C i 24 timer ifølge fremgangsmåden H 20 beskrevet af J.W. Eveleigh og G.0. Winter (1970) i Protein Se- quence Determination, red. S.B. Needleman, Springer-Verlag, I 92.

Aminosyren Cys blev undersøgt ved anvendelse af oxidation med 25 H2O2/HCOOH og efterfølgende hydrolyse med HCl til opnåelse af cysteinsyre i overensstemmelse med metoden beskrevet af E.

Schrau et al. i Biochem. J., (1954) 57, 33. Mere præcist op- løstes 80 μΐ prøveopløsning i 100 μΐ 99% myresyre og 20 μΐ methanol. I mellemtiden blev 10 μΐ H2O2 og 190 μΐ 99% myresyre 30 opbevaret i et forseglet rør ved 25°C i 2 timer. Begge opløs- I ningerne blev afkølet til -10eC i 30 minutter og derefter sammenblandet. Blandingen blev holdt ved -10°C i 2,5 timer, hvorefter 160 μΐ af reaktionsblandingen blev inddampet til tørhed og 1yophi 1 i seret. Den lyophi1iserede prøve blev dernæst I 35 udsat for hydrolyse med 6 N HCl ved 110eC i 24 timer på samme måde som for andre aminosyrer.

I Aminosyren Trp blev fremstillet ved hydrolyse med 3 N mercap- I toethansulfonsyre ved 110°C i 24 timer ifølge fremgangsmåden

.. . .. . . r ; · -. . t. ’Τι· to. Jfciytt. >iit ι;ριιρκ7_. i·1 f F. ^iw .' _ . .ι..:~·.~Γι-·· _„ v -’T^;1" - _ ·-·~·~?τ ^ '« ---s——i.T-”.r~ · »' 'ί',.Ι—.i . ‘ ~a^T. _ _T7. .:_ ' ..«'IX.';. ' ..-TJM

DK 175425 B1 29 beskrevet af B. Penke et al. i Anal. Biochem. (1974) 60, 45.

Undersøgelsen blev udført ned en "Hitachi Amino Acid Analyzer"

Mode! 835.

5

Der opnåedes følgende data:

Ami nosyredata 10 Aminosyrerest Rester per molekyle P-450sca-l P-450sca_2

Asx 39,1 36,9

Thr 30,9 30,0 15 Ser 22,4 21,1 61X 41.8 39,6

Pro 26,8 26,7

Gly 28,7 25,9

Ala 48,0 45,4 20 Cys 3,1 1,9

Val 31,4 30,0

Met 7,8 8,1

Ile 18,2 18,0

Leu 49,7 49,1 25 Tyr 4,9 5,0

Phe 15,2 15,0

His 13,6 13,8

Lys 9,0 8,4

Arg 34,0 34,2 30 Trp 1,0 1,1

Total 425,6 410,2

Fejl i analysen menes at være i området omkring ± 5% i til-35 fældet med hydrolyse i 24 timer, forudsat at prøven er relativt ren. Fejlen reduceres til cirka ± 2%, hvis hydrolysen udføres periodisk, for eksempel 24 timer, 48 timer, 72 timer og så videre.

I DK 175425 B1 I 30

I Pålideligheden afhænger af to faktorer. Den ene er modstands- I

I dygtighed over for hydrolyse. Det er empirisk kendt, at bin- I

I dinger, såsom Val-Val, Val-Gly og så videre, er modstandsdyg- I

I tige over for hydrolyse. Fejl, soro forårsages af denne faktor, I

I 5 kan minimeres ved at forlænge hydrolyseringsperioden. I

I Den anden faktor er således fremstillede aminosyrers modtage- I

I lighed over for hydrolyse. For eksempel er det kendt, at Ser I

I Thr er følsomme over for hydrolyse med HC1. Fejl kan forøges I

I 10 ved den forlængede hydrolyseringsperiode, hvad angår disse I

I aminosyrer. I

Eksempel 2 I

I 15 13-hydroxymi1bemycin-A4 I

I Reaktionen blev udført ved 30°C i 1 time ved anvendelse af I

mi 1bemycin-A^ som substrat i henhold til den følgende bian- I

I ding: I

I 20 I

p-450 {oprenset enzym) se nedenfor I

I NADPH-regenerationssystem: I

I NADP+ 0,26 mM I

GIucose-6-phosphat 14,0 mM I

25 01ucose-6-phosphatdehydrogenase 0,2 enheder I

I N icot i naro i d 10,0 mM I

I MgCl2 2,5 mM I

I Ferredoxin-NADP+-reductase (spinat) 0,04 enheder I

I Ferredoxin (spinat) 320,0 pg I

I 30 Milbemycin-A4 0,92 mM I

1,4-dioxan 1,0 μΐ I

Samlet volumen 0,2 ml I

I 35 Mængden af P-450 var 0,431 nmol i tilfældet med P-45Dsca_j, I

I 0,646 nmol i tilfældet med P-450sca_2 og 0,188 nmol i tilfæl- I

I det med P-450sca-3· I

^---Τ',Γ-Ί ·» · - - -^3ΓΓ^τ ', · -. - - "'" : -rmuiEPSn DK 175425 B1 31

Resultaterne er vist i den følgende tabel.

13-hydroxymilbemycin-A^ (MS/ral) 5 P-450sca_i-systen 3,605 P-450sca-2"System 5,035 P*450sca-3*’sysfeni 2,451 10 Systen uden P-450-enzym 0 HPLC-data var som følger: søjle: Senshu Pack 00S-1251-P (4,6 mm x 250 mm) 15 opløsningsmiddel: 65% acetonitril strømningshastighed: 5 μΐ detektor: UV 240 nm retentionstid: 4,97 minutter 20

Massespektret faldt sammen med det for en autentisk prøve.

Eksempel 3 25 i3-hydroxy-5-ketomi Tbemyci n-A^-S-oxim

Fremgangsmåden fra eksempel 2 blev gentaget ved anvendelse af 5-ketomilbemycin-A4-5-oxim som substrat, hvilket gav 13-hydro-xy-5-ketomi1bemycin-A4-5-oxim.

30 HPLC-data var som følger: søjle: Senshu Pack 0DS-1251-P (4,6 mm x 250 mm) opløsningsmiddel: 65% acetonitril 35 strømningshastighed: 5 μΐ detektor: UV 240 nm retentionstid: 5,747 minutter

I DK 175425 B1 I

I 32 I

I Massespektret faldt sammen med det for en autentisk prøve. I

I Eksempel 4 I

I 5 Natriumpravastati η I

I Reaktionen blev udført ved 30°C i 1 time ved anvendelse af I

I natrium-Ml-236B-carboxylat som substrat i den følgende blån- I

I ding·. I

I 10 I

I P-450 (oprenset enzym) se nedenfor I

I NADPH-regenerationssystem: I

I NADP+ 0,26 mM I

I GIucose-6-phosphat 14,0 mM I

I 15 Glucose-6-phosphatdehydrogenase 0,2 enheder I

I Nicotinamid 10,0 mM I

I MgCl2 2.5 mM I

I Ferredox i n-NA0P+-reductase (spinat) 0,04 enheder I

I Ferredoxin (spinat) 320,0 pg I

I 20 Natrium-ML-236B-carboxylat 2,33 mM I

I Total 0,2 ml I

I Mængden af P-450 var 0,862 nmol i tilfældet med P-450sca_i, I

I 25 1,292 nmol i tilfældet med P-45Qsca_2 og 0,377 nraol i tilfæl- I

I det med P-450sca_3. I

I Resultaterne er vist i den følgende tabel. I

I 30 I

I 35 I

^- πτιτιη ι i it i ι·τ am r-=·· ^. ' DK 175425 B1 33

Na-pravastatin Na-6a-hydroxy- (pg/ml) ML-236B-carboxy1at (pg/ml) 5 P-450sca_i-system 29,4 2,9 P-450sca_2~system 50,3 6,3 P-450sca_3-system 17,11 2,99

System uden P-450-enzym 0 0 10 HPLC-data var som følger: søjle: Radial-PAK kassette C}g (5,0 mm x 100 mm) opløsningsmiddel: 65% acetonitril/ 15 0,1% triethylaminphosphorsyre (pH 3,2) strømningshastighed: 5 μΐ detektor: UV 240 nm retentionstid: 10,89 minutter 20

Massespektret faldt sammen med det for en autentisk prøve.

Resultaterne viser, at natriumpravastatin er blevet fremstillet med høj selektivitet ud fra natrium-ML-236B-carboxylat.

25

Spinatferredoxinet kan erstattes af ferrodoxin fra Chlostridi-um pasteurianum. 1 ------------- — 35

Claims

1. Hydroxyleringsenzym, der kan opnås ud fra Streptomvces carbophilus SANK I Η I 5 62585 (FERM BP-1145). hvilket enzym er et cytochrom P-450 enzym, har en mole- I I kylvægt på 46.000 ± 1.000 ifølge bestemmelse ved elektroforese med SDS-polyacryl- I I amidgel og en maksimal absorption ved 449 nm i et reduceret CO-spektrum contra re- I duceret differensspektrum, og hvilket enzym ved chromatografi på hydroxylapatit elue- I I res fra et dyrkningsmedium, der kan opnås ved dyrkning af Streptomvces carbophilus I I 10 SANK 62585 (FERM BP-11451. med en ca. 0,06 M phosphatpuffer. I

2. Hydroxyleringsenzym, der kan opnås ud fra Streptomvces carbophilus SANK I I 62585 (FERM BP-11451. hvilket enzym er et cytochrom P-450 enzym, har en mole- I kylvægt på 46.000 ± 1.000 ifølge bestemmelse ved elektroforese med SDS-polyacryl- I I 15 amidgel og en maksimal absorption ved 448 nm i et reduceret CO-spektrum contra re- I I duceret differensspektrum, og hvilket enzym ved chromatografi på hydroxylapatit elue- I I res fra et dyrkningsmedium, der kan opnås ved dyrkning af Streptomvces carbophilus I I SANK 62585(FERM BP-11451. med en ca. 0,08 M phosphatpuffer. I

3. Hydroxyleringsenzym, der kan opnås ud fra Streptomvces carbophilus SANK I 62585 (FERM BP-1145). hvilket enzym er et cytochrom P-450 enzym, har en mole- I kylvægt på 46.000 ± 1.000 ifølge bestemmelse ved elektroforese med SDS-polyacryl- I I amidgel og en maksimal absorption ved 448 nm i et reduceret CO-spektrum contra re- I I duceret differensspektrum, og hvilket enzym ved chromatografi på hydroxylapatit elue- I I 25 res fra et dyrkningsmedium, der kan opnås ved dyrkning af Streptomvces carbophilus ' I I SANK 62585 (FERM BP-11451. med en ca. 0,10 M phosphatpuffer. I

4. Fremgangsmåde til fremstilling af et hydroxyleringsenzym som defineret i et I I hvilket som helst af kravene 1-3, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af Strep- I I 30 tomvces carbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145) i et dyrkningsmedium, tilsætning I I til dyrkningsmediet af et induktionsmiddel, som er i stand til at inducere enzymproduk- I DK 175425 B1 tion, videredyrkning af Streptomvces carbonhilus SANK 62585 (FERM BP-1145) og isolering af hydroxyl er i ngsenzymet.

5. Fremgangsmåde til hydroxylering af et milbemycin eller ML-236-substrat under r 5 anvendelse af et enzym, kendetegnet ved, at mindst et hydroxyleringsenzym ' som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 3 tilvejebringes; et milbemycin eller ML-236-substrat for enzymet tilvejebringes; substratet hydroxyleres under anvendelse af hydroxyleringsenzymet, og et hydroxyleret substrat opnås.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor hydroxyleringsenzymet fremstilles ved følgende trin: dyrkning af Streptomvces carbonhilus SANK 62585 (FERM BP-1145) i et dyrkningsmedium, tilsætning til dyrkningsmediet af et induktionsmiddel, som er i stand til at inducere enzymproduktionen, videredyrkning af Streptomvces carbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145) og isolering af hydroxyleringsenzymet. 15

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor induktionsmidlet og substratet er den samme forbindelse. 1