DK175433B1

DK175433B1 - Baculovirus overföringsvektor samt fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant baculovirus inkorporerende et fremmed gen

Info

Publication number: DK175433B1
Application number: DK198804785A
Authority: DK
Inventors: Martin John Page; Brian Colin Rodgers
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1988-05-06
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 2004-10-18
Also published as: DE3882522T2; US5147788A; CA1331155C; IE882565L; DK478588D0; JPH02167088A; EP0340359A1; PT88362B; GB8810808D0; DK478588A; AU2156988A; IE62490B1; ZA886338B; AU620041B2; ATE91719T1; PT88362A; ES2058294T3; EP0340359B1; JPH0813275B2; NZ225946A

Description

I DK 175433 B1 I Opfindelsen angår baculovirus overføringsvekto- I rer og anvendelse deraf.

I Man har benyttet baculovirus vektorsystemet til I at eksprimere både prokaryotiske og eukaryotiske gener.

I 5 Ekspressionen af disse gener kontrolleres af polyhe- I drinpromotoren fra en baculovirus, især fra Autoqrapha I californica nukleær polyhedrosisvirus (AcNPV). De frem- I mede gener eksprimeres i dyrkede insektceller, der in- I ficeres med rekombinant baculovirus, der indeholder det I 10 fremmede gen.

I Til opnåelse af en rekombinant baculovirus be- I nytter man en baculovirus overføringsvektor. Denne vek- I tor inkluderer polyhedrinpromotoren. Der tilvejebringes I baculovirus DNA, der flankerer polyhedringenet. Resten I 15 af vektoren består typisk af DNA fra et bakterieplas- I mid. Man indsætter et fremmed gen i overføringsvekto- I ren efter polyhedrinpromotoren på en måde, så eksprime- I ringen deraf kontrolleres af denne promotor.

I Overføringsvektoren, der indeholder det fremmede I 20 gen, og en baculovirus cotransficerer derefter insekt- I celler, der er modtagelige for baculovirusinfektion.

I Man benytter typisk cellekulturer af Spodoptera frugi- I

I perda. Der forekommer derved en homolog rekombination, I

I der involverer viral DNA i overføringsvektoren både før I

I 25 og efter det fremmede gen, og det tilsvarende DNA fra I

I baculovirus. Det fremmede gen og dets polyhedrinpromo- I

tor overføres på denne måde til baculovirus. Man dyrker I

det rekombinante baculovirus til opnåelse af eksprime- I

ring af det fremmede gen. I

30 Der findes to typer baculovirus overføringsvek- I

torer. Først eksisterer der overføringsvektorer, der

indeholder et gennemskæringssted, hvori man kan klone I

et fremmed gen efter polyhedrin ATG startkodonet for

translation. Sådanne overføringsvektorer fører til fu- I

35 sionsproteiner, hvori produktet af det fremmede gen er I

fusioneret med en N-terminal del af polyhedrinpepti- I

det. I

I DK 175433 B1 I 2 I For det andet findes der overføringsvektorer, I hvori den 5'-ikke translaterede leader fra polyhedrin- I genet ender før det naturligt forekommende ATG trans- I lationskodon for polyhedrin, og der derefter forekommer I 5 et gennemskæringssted. En sådan overføringsvektor er I pAc373, hvori den 5'-ikke translaterede leader ender 8 I baser før det naturligt forekommende polyhedrin ATG.

H Gener klonede i gennemskæringsstedet eksprimeres som I færdige proteiner, hvis de indeholder et ATG fulgt af 10 en åben læseramme, der koder for det ønskede produkt.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en baculovirus overføringsvektor, der indeholder et gennemskæringssted i hvilket et fremmed gen kan klones, kort efter N-ter- minus for polyhydringenområdet, og hvori det naturligt 15 forekommende ATG translationsstartkodon for polyhedrin- genet ikke forefindes, idet den N-terminale polyhedrin- kodende sekvens før gennemskæringsstedet bevares, men ikke kan translateres.

I baculovirus overføringsvektoren ifølge opfin- 20 delsen tilvejebringes således en ikke kodende sekvens i stedet for det naturligt forekommende ATG translations- kodon for polyhedrin. Den N-terminale del af den koden- de sekvens for polyhedrin translateres ikke nu, men virker som en forlænget leadersekvens. Der tilvejebrin- 25 ges derfor en nyttig alternativ baculovirus overfø- ringsvektor, der opretholder DNA sekvensinformation, der kan være nyttig til eksprimering af færdige protei- ner, og som hører til den N-terminale del af den koden- de sekvens for polyhedrin. Man har fundet, at et frem- 30 med gen forsynet med et ATG translationsstartkodon kan eksprimeres med højt udbytte, når det klones i gennem- skæringsstedet på overføringsvektoren. Det er en for- del, at det eksprimerede produkt ikke er på form af et fusionsprotein, der indeholder rester af N-terminale 35 polyhedrinaminosyrer.

Der tilvejebringes et gennemskæringssted i bacu- lovirus overføringsvektoren efter og i kort afstand fra 3 DK 175433 B1 N-terminus af polyhedrinområdet. Gennemskæringsstedet kan tilvejebringes efter de første 24-50 baser, f.eks. efter de første 27-39 baser af den N-terminale region i polyhedringenet. Især tilvejebringes stedet efter ca.

5 de første 33 baser. Man kan f.eks. indsætte en BamHl linker.

Det naturligt forekommende ATG polyhedrin trans-lationsstartkodon ændres til ikke kodende information.

Man kan ændre startkodonet til en hvilken som helst an-10 den triplet af nukleotider. Man foretager foretrukket en enkelt baseændring i det naturligt forekommende ATG kodon, mere foretrukket i den tredie base i kodonet.

Man kan således ændre ATG til ATA, ATT eller især til ATC. Som et resultat deraf vil den N-terminale del af 15 polyhedringenet ikke blive eksprimeret, men i stedet for vil ekspressionen begynde ved det første ATG, man møder i en sekvens, der er indført ved gennemskæringsstedet. På denne måde kan DNA-sekvensinformation, der findes i den N-terminale del af polyhedringenet i sig 20 selv bidrage til en høj ekspression af et fremmed gen.

En foretrukket overføringsvéktor er pAc36C. Den^ ne blev konstrueret fra overføringsvektoren pAc360 (Summers og Smith, 1987, "A Manual of methods for Bacu-lovirus vectors and Insect cell culture procedure") ved 25 positionsrettet mutagenese, hvori ATG translationskodo-net for polyhedrin i pAc360 blev omdannet til ATC.

pAc360 TATAAAT ATG CCG GAT TAT TCA TAC CGT CCC ACC ATC GGG (Barn Hl) 30 translateret N-terminal del af polyhedringen

pAc36C

TATAAAT ATC CCG GAT TAT TCA TAC CGT CCC ACC ATC GGG (Bam H1) .

35

Man kan konstruere en baculovirus overføringsvektor ifølge opfindelsen ved at mutere det naturligt

I DK 175433 B1 I

I 4 I

I forekommende ATG translationsstartkodon for polyhedrin I

I i en baculovirus overføringsvektor hvori der tilveje- I

I bringes et gennemskæringssted, i hvilket et fremmed gen I

I kan klones, kort efter N-terminus i polyhedringenområ- I

I 5 det, til en ikke-kodende sekvens. Dette opnås typisk I

I ved positionsrettet mutagenese. Man kan indføre en mu- I

I tation, især en punktmutation under anvendelse af et I

I syntetisk oligonukleotid, der omfatter den ønskede se- I

I kvens. Man afleder en rekombinant baculovirus, der in- I

I 10 deholder et fremmed gen, fra overføringsvektoren, idet I

I man: I

I (a) kloner et fremmed gen forsynet med et trans- I

I lationsstartkodon i baculovirus overføringsvektoren ved I

I det tilvejebragte gennemskæringssted; og I

I 15 (b) co-transficerer insektceller, der er mod- I

I tagelige for baculovirusinfektion, med den rekombinante I

I baculovirus overføringsvektor fra trin (a) og med in- I

I takt vild-type baculovirus DNA. I

I Det fremmede gen klones i trin (a) i baculovirus I

I 20 overføringsvektoren, så det er under transkriptionskon- I

I trol af polyhedrinpromotoren. Man co-transficerer ty- I

I pisk celler af Spodoptera fruqiperda insektcellelinien I

I i trin (b). Efter homolog rekombination overføres det I

I fremmede gen og flankerende dele af viral DNA til bacu- I

I 25 lovirus AcNPV. Man gennemsøger rekombinant baculovirus, I

I f.eks. ved plakassay, og renser det. I

I Til opnåelse af det produkt, det fremmede gen I

I koder for, inficerer man celler, der er modtagelige for I

I baculovirusinfektion, med den rekombinante baculovirus I

I 30 og dyrker dem. Igen anvender man her typisk celler af I

I Spodoptera frugiperda insektcellelinien. Da det fremme- I

I de gen er under transkriptionskontrol af polyhedrinpro- I

I motoren, kan man opnå et stort udbytte af genproduktet. I

I Et hvilket som helst fremmed gen, prokaryotisk I

I 35 eller eukaryotisk, kan eksprimeres på denne måde. I

I F.eks. kan man eksprimere en intracellulær færdig form I

i-ί». ^,ί·- 'Τ,.' ' . ^ · ·.'__' .rff^» "y ;_ - ν'Γ·?*·. mt?! DK 175433 B1 5 for human y-interferon eller cytomegalovirus umiddelbart tidlig protein. Man har også med held eksprimeret kimæreproteiner, der i det væsentlige består af: (i) ved N-terminus for kimæreproteinet, en sig-5 nalsekvens for precursoren til de vigtigste merozoit overfladeantigener (PMMSA) fra P. falciparum; (ii) eventuelt i det mindste én epitop fra cir-cumsporozoitproteinet (CSP) fra P. falciparum; og (iii) et C-terminalt fragment fra PMMSA fra P_^ 10 falciparum med eller uden den C-terminale ankersekvens.

Der kan tilvejebringes korte sammenbindende sekvenser på op til 30 aminosyrerester mellem disse komponenter. Disse kimæreproteiner, der er nyttige som vacciner, blev eksprimeret med den korrekte information.

15 CSP epitop(erne) (ii) bestod foretrukket af 3-50, f.eks. 16-30 gentagelser af tetrapeptidsekvensen Asn-Ala-Asn-Pro.

De følgende eksempler illustrerer opfindelsen.

På tegningen visr: 20 figur 1 PMMSA og CSP generne dele deraf benyttet i eksemplerne og syntetiske linkere anvendt i eksemplerne, idet følgende gennemskæringssteder er opmærket: A-Alul, B-BamHl, H-HindIII, P-PstI, T-TthIII og X-XhoII, A betegner ankersekvensen og S betegner signal-25 sekvensen;

Figur 2 strukturelle gener, der benyttes til opnåelse af rekombinante overføringsvektorer og rekombi-nant baculovirus fra eksemplerne 2 og 3;

Figur 3 autoradiogrammer frembragt ved 3^S-me-30 thioninmærkning i eksempel 5;

Figur 4 resultatet af Coomassie blåfarvning i eksempel 5; og

Figur 5 resultatet af Coomassie blåfarvning i eksempel 6.

35

I DK 175433 B1 I

I 6 I

I Eksempel 1 I

I Konstruktion af overfåringsvektor pAc36C I

I Man afledte overføringsvektoren pAc36C fra I

I 5 pAc360 (Summers og Smith, 1987, "A Manual of methods I

I for baculovirus vectors and insect cell culture I

I procedures") ved positionsrettet mutagenese under an- I

I vendelse af udstyr fra Anglian Biotech og Amersham I

I International. Man underklonede et 852 bp cDNA for hu- I

I 10 man γ-interferon som et BamHl fragment i BamHl stedet I

I på pAc36 0. Fra dette underklonede man et lkb Dral frag- I

I ment, der strakte sig fra ca. 700 bp før polyhedrin ATG I

I translationskodonet til 300 bp inden i 5’-enden af y- I

I interferon cDNA indsætningsstykket, i Smal stedet på I

I 15 M13K19 (Anglian Biotech). Man benyttede RF formen af I

I konstruktionen til at bekræfte ligeringen og afledte en I

I enkeltstrenget skabelon og muterede den med den 19 I

I mere: I

I 20 GAATAATCCGGGATATTTA. I

I Det understregede G vil omdanne ATG i polyhe- I

I drintranslationskodonet til ATC. Man bekræftede muta- I

I tionen ved DNA sekvensopdeling og benyttede et 136 bp I

I 25 EcoRV-BamHl fragment, der indeholdt mutationen, til at I

I erstatte det samme fragment i pAc360 med det mutageni- I

I serede fragment til opnåelse af pAc36C. I

I Eksempel 2 I

I 30 Konstruktion af rekombinante overførinqsvektorer afledt I

I fra pAc36C I

I Man konstruerede den rekombinante overførings- I

I vektor pS42 i tre trin. Først fremstillede man pAc36C42 I

ved at klone det 1,46 kb lange XhoII/Bglll fragment fra I

I 35 pPfcl028 (Holder et al, Nature, 317, 270-273, 1985) i I

I BamHl stedet på pAc36C. Derefter udskar man et 120 ba- I

7 i DK 175433 B1 separfragment fra N-terminus af PMMSA fra pPfcl017 {Holder et al, 1985) ved fordøjelse med Hindlll og Alui. Dette fragment indeholder en kort 12 basepar leader, et translationsinitiatieringskodon, det 18 amino-5 syrer lange PMMSA signalpeptid og 15 yderligere aminosyrer fra N-terminus af PMMSA. Dette blev underklonet i pUC9 fordøjet med Hindlll og Hindu og blev derefter udskåret som et Hindlll/BamHl fragment, idet man tilvejebragte BamHl stedet ved hjælp af en pUC9 polylinker.

10 I det sidste kloningstrin klonede man dette 120 basepar BamHl/Hindlil fragment i det unikke BamHl sted på p36-C42 med en syntetisk 10 basepar Hindlll/BamHl linker, der også anbragte fusionen i den korrekte læseramme. Denne linker ses i figur 1. Genet er indført i 15 pS42 under kontrol af polyhedrinpromotoren, og det vises i figur 2.

En anden rekombinant overføringsvektor pSC2642 blev konstrueret ved ligering af tre fragmenter: det 1,15 kb lange BamHl/Pstl fragment benyttet til kon-20 struktion af pPC2g42, et 2,2 kb xhol/BamHl fragment og et 7 kb Xhol/Pstl fragment udskåret af pS42 og xhol fordøjelse og delvis BamHl fordøjelse. Man konstruerede PPC2642 På følgende måde: (i) Man konstruerede en rekombinant overføringsvek-25 tor pP42, idet man omdannede Hindlll stedet i pPfcl028 til Bglll ved fordøjelse ved Hindlll, afstumpning med Klenowpolymerase og ligering af Bglll linkere. Fordøjelse med XhoII gav et 1,46 kb XhoII/Bglll fragment, der blev klonet i det unikke BamHl sted i pAc360 til 30 opnåelse af fusion i læseramme af de første 10 aminosyrer fra polyhedrin med de C-terminale 293 aminosyrer fra PMMSA. Genet, der er inkorporeret i pP42, vises i figur 2. Dette gen står under kontrol af polyhedrinpromotoren.

35 (ii) Til konstruktion af pPC2642 klonede man 26 kopier af CSP tetrapeptidgentagelsesstykket ved polyhe-

I DK 175433 B1 I

i 8 I

I drin/PMMSA sammenføjningen i pP42 ved erstatning af det I

I lille BamHl/Pstl fragment i pP42 med et 1,15 kb frag- I

I ment opnået ved Pstl fordøjelse og delvis BamHl fordø- I

I jelse af den bakterielle ekspressionsvektor I

I 5 p750/CSPa/P195 (EP-A-0250261) . I

I To yderligere rekombinante overføringsvektorer I

I blev konstrueret med et syntetisk oligonukleotid til I

I forhindring af ekspression af den C-terminale anker- I

I sekvens fra PMMSA. Disse konstruktioner uden ankersek- I

I 10 vens, pS42AA og pSC26AA, blev fremstillet ved konstruk- I

tion af en syntetisk 26 basepar Pstl linker, der inde- I

holdt dobbeltrettede translationsstopkodoner i alle I

I læserammer. Denne linker vises i figur 1. Man klonede I

linkeren i det unikke Pstl sted, både på pS42 og I

I 15 pSC2g42 lige før de antagne membranankersekvenser. Ge- I

I nerne i pS42AA og pSC2642AA under kontrol af polyhe- I

I drinpromotoren vises i figur 2. I

I Alle kloningerne blev udført ved kendt teknik I

I (Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Laboratory I

I 20 Manual", New York: Cold Spring Harbor Laboratory, I

I 1982). Man analyserede for korrekt ligering og oriente- I

I ring af fragmenterne ved en detaljeret restriktionsen- I

I zymkortlægning. Man oprensede plasmider til transfice- I

I ring fra bakteriekulturer ved cæsiumchlorid gradient- I

I 25 centrifugering. I

I Eksempel 3 I

I Fremstilling af rekombinante vira I

I 30 Man dyrkede Spodoptera frugiperda (Sf) celler I

I (IPLB Sf 21) (Vaughn et al. In vitro, 13, 213-217, I

I 1977) i suspensionskultur ved 22°C eller 27°C i TC100 I

medium (Flow Labs) supplementeret med 10% kalvefoster- I

serum (Gibco). Man propagerede AcNPV (stamme E2) i Sf I

I 35 celler, dyrket ved 27°C i suspensionskulturer. Man I

I frembragte rekombinante vira, der indeholdt P. falci- I

gglf Aj' .....^ f"'” "· ~Γ~ ' -1 ___ -../4 - DK 175433 B1 9 parum gensekvenser, som vist i figur 2, ved cotransfi-cering i molforholdet 20:1 af de rekombinante overføringsvektorer, fremstillet i eksempel 2, med AcNPV DNA, oprenset fra ekstra cellulære (ECV) viruskulturer i SF-5 celler. Fremgangsmåden til rensning af AcNPV DNA var som beskrevet (Summers og Smith, 1987), idet man dog inficerede kulturerne med 1 pfu pr. celle og indhøstede efter 6 dage og udelod trinet med sucrosegradient. Co-transficeringen var som beskrevet (Summers og Smith, 10 1987, metode l).

De opnåede ECV blev gennemsøgt for rekombinanter ved plakassay tre dage efter transficeringen. Man udførte plakassays i det væsentlige som beskrevet (Brown og Faulkener, J. Gen. Virol., 36, 361-364, 1977) under 15 anvendelse af fortyndinger i række af supernatanten fra transficeringskulturen. Efter farvning med neutralrødt udvalgte man mulige rekombinante plakker på visuel basis på baggrund af fravær af polyhedra, udprikkede dem i 0,5 ml dyrkningsmedium og rensede dem ved gentagne 20 plakassay. Man mangedoblede rekombinante vira fra plakker eller monolagskulturer og dyrkede dem i større skala i suspension eller i rulleflasker. Det opnåede rekombinante virus vises i figur 2.

25 Eksempel 4

Analyse af proteiner fra celler inficeret med rekombinante vira

Man undersøgte mulige rekombinante vira, frem-30 bragt i eksempel 3, for eksprimering af P. falciparum sekvenser ved dot blot assay. Man udprikkede polyhe-drinnegative plakker i 0,5 ml kulturmedium og lod dem undergå diffusion der i det mindste en time. 100 yl af dette medium blev benyttet til at inficere 2 x 105 35 celler i en 35 mm petriskål, og man inkuberede ved stuetemperatur i en time. Inokulatet blev derefter er-

I DK 175433 B1 I

I 10 I

I stattet med l ml dyrkningsmedium og man inkuberede pla- I

I derne 3-4 dage ved 27°C. Cellerne blev vasket én gang i I

I phosphatpufret saltvand (PBS) og fracentrifugeret. Cel- I

I lebundfaldet blev lyseret i 1% natriumdodecylsulfat I

I 5 (SDS) og anbragt på nitrocellulosefiltre under vakuum I

I ved anvendelse af et dot blot apparat. I

Til påvisning af udskilte proteiner erstattede I

I man mediet med 0,5 ml serumfrit medium 3 dage efter in- I

I fektionen og satte 100 yl direkte på nitrocellulosen I

I 10 efter 24 timers inkubering ved 27°C. Man undersøgte I

I filtrene med et kanin polyklonalt antiserum dyrket mod I

I nativ PMMSA og derefter med et alkalisk phosphatasekon- I

I jugeret antikanin IgG antistof (Sigma). Man påviste I

I binding af antistoffer med et kromogent substrat. I

I 15 Man benyttede til mere detaljeret analyse af I

I cellelysater og supernatanter fra kulturerne SDS/poly- I

I acrylamid gelelektroforese (PAGE) under reducerende og I

ikke reducerende betingelser, hvorefter man farvede med I

I Coomassie blåt eller udførte Western blot med en række I

I 20 specifikke antisera og monoklonale stoffer. Herved be- I

I nyttede man to polyklonale kaninantisera, det ene, (Pas I

I PMMSA), dyrket mod nativ PMMSA, og det andet, (Pas I

I NANP), dyrket mod et syntetisk peptid, der svarede til I

I tetrapeptidgentagelsen (NANP) fra CSP, bundet til ser- I

I 25 umalbumin fra kvæg, og adskillige musemonoklonale anti- I

I stoffer imod nativ PMMSA, og som genkendte konformatio- I

I nelle reduktionsfølsomme epitoper ved C-terminus (Mab I

I 111.4, Mab 117,2 og Mab 111,2). I

I Dot blot analyse tydede på, at antigene produk- I

30 ter, der blev genkendt af Pas PMMSA, blev eksprimeret I

I af begge de rekombinante vira vS42 og vSC2g42 i infice- I

rede Sf celler. Celler inficeret med vS 42 producerede I

I nyt protein, der ikke kunne ses på geler farvet med I

I Coomassie blåt, men uden videre kunne påvises ved Wes- I

I 35 tern blot som et 36-38kd protein, der forekom som tre I

I adskilte bånd, der blev genkendt af Pas PMMSA, og mere I

Igsy τ tyggR·.· · · ·--r-·'" y*- - ^.n· eb DK 175433 B1 11 tydeligt af Mab 111.4 under ikke reducerende betingelser. vSC2642 inficerede celler producerede også et nyt protein på ca. 50 kd, der også vandrede som tre tætliggende bånd. Dette 50kd protein kunne tydeligt ses ved 5 Coomassiefarvning ved samme ekspressionsniveau som for produktet fra vP42 og blev kraftigt genkendt af Pas PMMSA, Pas NANP, Mab 111.4, Mab 111.2 og Mab 117.2. De monoklonale stoffer genkendte som ventet kun proteinerne under ikke reducerende betingelser og genkendelsen 10 af begge af Pas PMMSA var stærkere med det ikke reducerede protein. Begge de rekombinante produkter var uopløselige i Nonidet P40 (NP40), Rennex (RX) og desoxy-cholat (DOC), men kunne opløses i cetyltrimethylammoni-umbromid (CTAB) og SDS. Udbyttet af fusionsproteinerne 15 var < 1 yg/ml og 10-20 yg/ml for henholdsvis vS42 og vSC2642 *

Por begge rekombinante vira vS42AA og vSC2ø42AA viste dot blot analyse, at både cellerne og supernatan-ten fra inficerede kulturer indeholdt antigene produk-20 ter, der blev genkendt af Pas PMMSA. Analyse ved SDS/PAGE viste nye proteiner på 36-38 kd for vS42AA og på ca. 50kd for vSC2$42AA eksprimeret i niveauer, der let kunne ses fire dage efter infektionen i geler farvet med Coomasie blåt ved cellelysatet (ca. 1-2 yg i 1 25 x 105 celler) og også i supernatanten fra kultur ved tilsvarende niveauer.

Både de udskilte og ikke udskilte former af de rekombinante proteiner udviste flerdobbelte bånd ved PAGE> som man så for produkterne eksprimeret af vS42 og 30 vSC2g42, og begge kunne genkendes af Pas PMMSA, Mab 111.4, Mab 111.2 og Mab 117.2; og 50kd produktet fra vSC2g42AA kunne også genkendes af Pas NANP. Man så kun genkendelse ved Mabs under ikke reducerende betingelser, og genkendelsen af Pas PMMSA var kraftigere i ikke 35 reduceret tilstand. Begge de rekombinante produkter blev fundet i den opløselige fraktion af celleekstrak-

I DK 175433 B1 I

I 12 I

I ten, og de udskilte former var fuldstændig opløselige. I

I Udbyttet af fusionsproteinerne var 7,5 \ig/ml og 10 I

I pg/ml for henholdsvis vS42AA og vSC2642AA. I

I 5 Eksempel 5 I

I Ekspression af det store umiddelbare tidlige (IE) gen I

I fra human cytomegalovirus (HCMV) i forskellige baculo- I

I virusvektorer I

I 10 Det vigtige umiddelbare tidlige gen fra HCMV ko- I

I der for et sammensplejset molekyle på 1736 nukleotider, I

I der omfatter 4 exoner og giver et protein med en mole- I

I kylvægt ifølge SDS-PAGE på 72-76K. Man gennemskår umid- I

I delbart tidlig cDNA klonet i pUC9 (Akrigg et al, 1985, I

I 15 virus Research, 2, 107-121) med BamHI til frigivelse af I

I et fragment, der indeholdt hele den kodende sekvens I

I plus ca. I45bp af 5'-ikke translateret ledersekvens og I

I 90bp af 3'-ikke translateret sekvens. Dette fragment I

I blev gelrenset og klonet i BamHI fordøjet phosphatase- I

I 20 behandlet DNA fra baculovirus overføringsvektorerne I

I pAc373 og pAc36C. I

I Man fremstillede rekombinante baculovirus ved I

I cotransficering af plasmid og vild-type AcNPV DNA i I

I Spodoptera frugiperda celler. Man isolerede rekombinan- I

I 25 te baculovira, der stammede fra homolog rekombinering I

I ved visuel gennemsøgning for inklusionsnegative plakker I

I og rensede dem derefter to gange ved plak-rensning. I

I Man analyserede sammenlignelige ekspressions- I

I niveauer ved 35S-methioninmærkning, SDS-PAGE, Western I

I 30 Blot og ELISA. I

I i) 35S-methioninmærkning: Man inficerede Spodop- I

I tera frugiperda celler (2 x 10^ celler/3 cm skål) med I

I en m.o.i. (multipel infektion) på 2 og inkuberede ved I

I 28°C. Efter 24 timers forløb rensede man cellerne 2 I

I 35 gange med PBS og mærkede dem i 1 time i methioninfrit I

I TC100 med indhold af 10 pCi/ml 3^S-methionin. Efter I

13 DK 175433 B1 mærkningen vaskede man cellerne 3 gange i PBS og analyserede totale cellelysater ved SDS-PAGE (106 celler/ spor) og autoradiogrammer.

Resultaterne vises i figur 3. I figur 3 refere-5 rer tidspunkterne 24, + 4 og + 24 til en første 24 timers puls med 35S-methionin fulgt af en 4 timers og 24 timers efterbehandling med ikke mærket methionin. Tidspunktet 48 refererer til en 48 timers puls med 3^S-me-thionin. U betegner ikke inficerede celler.

10 Densitometrisk analyse viser, at niveauerne for methionininkorporering i rekombinante produkter er 4-5 gange større med pAc36C {36C-IE) end med pAc373 (373-IE).

ii) SDSPAGE/Coomassie blåt farvning: Man farvede 15 også gelen fra (i) til undersøgelse af total proteinindhold under anvendelse af Coomassie blåt. Resultaterne vises i figur 4. Det kan ses, at mængden af re-kombinant protein i pAc36C sporet (36C-IE) er meget større end i pAc373 sporet (373-IE).

20

Eksempel 6

Ekspression af en færdig intracellulær form for human y-interferon 25 Man udskar et 852 bp Avall-Ncol fragment fra pIFNy-G4 (Nishi et al, J. Biochem. 97, 153-159, 1985) og modificerede det i begge ender med BamHI linkere.

Dette fragment blev underklonet i det unikke BamHI sted på pAc36C til dannelse af pAc36C-ll. Fra dette udskar 30 man hele y-interferon cDNA som et 2,74kb Sal l-Hind III fragment og klonede det i de homologe steder i polylin-keren på RF Mi3mpl8. De 2,74kb Sal I-Hind III steder var fra Sal 1 stedet ca. 820 bp før det muterede ATG , til ATC translationsinitieringskodon for polyhedringe-35 net til Hind III stedet, ca. 500bp efter translations-termineringskodonet for polyhedringenet. Man benyttede I DK 175433 B1

I 14 I

den rekombinante Ml3 klon til at danne enkeltstrengs- I

I skabelonen. Denne blev fæstet til en 33mere oligonu- I

I kleotid roed sekvensen I

I 5 TACATATGGGTCCTGCATCCCGATGGTGGGACG I

I Man benyttede dette oligonukleotid til præcist I

at sammensmelte 5'-polyhedrinsekvensen fra pAc36C til I

I et ATG translationsinitieringskodon fulgt af sekvensen I

10 for den færdige, ikke udskilte form for human γ-inter- I

I feron. Dette illustreres nedenfor med det 33mere slet- I

ningsoligonukleotid understreget: I

Polyhedrin- N-terminus for polyhedringenområdet I

I 15 leader nu som forlænget leader I

I ACCTATAAAT ATCCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGG I

I Færdig form for I

I 20 y-interferon I

I atcTcaggac cca tat gta I

I Man benyttede et mutagenesesæt fra Amersham In- I

I 25 ternational til at udføre sletningsmutagenesen. Man I

I identificerede rekombinante Ml3 plakker ved hybridise- I

I ring med det 33mere oligonukleotid, der var kinaseret I

I med [32P]-y-ATP. Man udprikkede positive plakker, plak- I

I rensede dem og benyttede dem til fremstilling af en- I

30 keltstrengsskabeloner til DNA sekvensopdeling til be- I

I kræftelse af, at den korrekte sletning havde fundet I

I sted. Man benyttede RF formen for en positiv klon til I

I at udskære et 135bp EcoRV-Nde 1 fragment, der omfattede I

I sletningen. Dette blev derefter benyttet i en 3 frag- I

I 35 mentligering, der bestod af det store EcoRV-BamHl frag- I

I ment fra pAc373, det 135bp EcoRV-Nde 1 fragment, be- I

15 DK 175433 B1 skrevet ovenfor og et 585bp Nde 1-Bam Hl fragment, der udgjorde resten af y-interferongenet.

Man benyttede den således frembragte rekombinan-te overføringsvektor (benævnt pl81) til at fremstille 5 en rekombinant AcNPV som beskrevet i eksempel 3. Efter infektion af Sf celler med en m.o.i. på 5 pfu pr. celle, indhøstede man cellerne 48 timer efter infektionen, vaskede med PBS puffer, lyserede og kørte på en SDS po-lyacrylamidgel, hvorefter man farvede med Coomassie 10 blåt. De farvede spor på gelen vises i figur 5, hvor spor 1: ikke inficerede celler; spor 2: celler inficeret med vild-type AcNPV; spor 3: celler inficeret med rekombinant AcNPV afledt fra pl81; og spor 4: protein-molekylvægtmarkører. En densitometrisk gennemsøgning 15 gav, at det intracellulære humane y-interferonbånd havde 14% af total celleprotein i disse celler.

Claims

4. Vektor ifølge et hvilket som helst af de for- I I 20 rige krav, kendetegnet ved, at gennemskæ- I I ringsstedet er et BamHl-sted. I
5. Vektor ifølge et hvilket som helst af de for- I I rige krav, kendetegnet ved, at der er en en- I I kelt baseændring i den tredie base i det naturligt fo- I I 25 rekommende ATG translationsstartkodon for polyhedringe- I I net. I
6. Vektor ifølge krav 5,kendetegnet I I ved, at ATG-kodonet er ændret til ATC. I
7. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekombi- I I 30 nant baculovirus, der inkorporerer et fremmed gen, " I I hvorved man I I (a) kloner et fremmed gen forsynet med et translations- I I startkodon i en baculovirus overføringsvektor i et I I gennemskæringssted kort efter N-terminus for poly- I I 35 hedringenomområdet; og I I (b) cotransficerer insektceller, der er modtagelige for I DK 175433 B1 —ί - - ___ '· .•argg···,1 -.. : -- . . t’n»3r"i,iiKiu I·» · . . baculovirusinfektion, med den rekombinante baculovirus overføringsvektor opnået i trin (a) og med intakt vild-type baculovirus DNA, kendetegnet ved, at man som baculovirus 5 overføringsvektor benytter en vektor ifølge et hvilket som helst af de forrige krav.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det fremmede gen er et prokaryo-tisk gen.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende tegnet ved, at det fremmede gen er et eukaryotisk gen.
10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9, kendetegnet ved, at man yderli-15 gere dyrker celler, der er modtagelige for baculovirusinfektion, og som er inficeret med den således producerede rekombinante baculovirus, til opnåelse af ekspri-mering af det produkt, det fremmede gen koder for.